Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Rolnictwa i Biologii. Beata Krowisz Numer albumu

Transkrypt

1 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Rolnictwa i Biologii Beata Krowisz Numer albumu Udział bakteryjnych dioksygenaz z rodziny AlkB w naprawie egzocyklicznych uszkodzeń DNA The role of bacterial AlkB dioxygenases in repair of exocylic DNA adducts Praca magisterska na kierunku Biologia Praca wykonana pod kierunkiem dr Agnieszki Maciejewskiej Zakład Biologii Molekularnej IBB PAN Warszawa, rok 2010

2 2

3 Pragnę serdecznie podziękować dr Agnieszce Maciejewskiej za promotorska opiekę, teoretyczne i praktyczne zapoznanie mnie z tematem, pomoc i wsparcie podczas pisania niniejszej pracy magisterskiej prof. dr hab. Jarosławowi Kuśmierkowi za wsparcie naukowe i umożliwienie mi wykonania części doświadczalnej w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB PAN 3

4 Praca została zrealizowana w ramach polsko-norweskiego grantu nr PNRF-143-AI- 1/07. The AlkB protein and its eukaryotic homologues the role in DNA repair and the possible role in cancer etiology and target in cancer therapy (Białko AlkB i jego eukariotyczne homologi rola w naprawie DNA i potencjalny udział w etiologii nowotworów oraz jako cel w terapii przeciwnowotworowej). 4

5 Oświadczenie promotora pracy Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego. Data... Podpis promotora pracy.... Oświadczenie autora pracy Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni. Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. Data... Podpis autora pracy.... 5

6 6

7 Streszczenie Udział bakteryjnych dioksygenaz z rodziny AlkB w naprawie egzocyklicznych uszkodzeń DNA Gen alkb jest częścią systemu odpowiedzi adaptacyjnej na środki alkilujące bakterii Escherichia coli. Białko AlkB jest dioksygenazą zależną od α-ketoglutaranu i Fe (II). Usuwa grupy metylowe z m 3 C i m 1 A oraz mostki etenowe z cytozyny i adeniny, pozostawiając natywne DNA. Homologi genu alkb znaleziono u wielu organizmów, także u człowieka. Badano właściwości naprawcze białka AlkB i jego homologów: SA-1A i SA-2B, występujących u Streptomyces avermitilis. Ustalono optymalne warunki naprawy 3,N 4 -α-hydroksyetanocytozyny i 3,N 4 -α-hydroksypropanocytozyny przez AlkB i SA-1A. Stwierdzono, że SA-1A nie naprawia 1,N 6 etenoadeniny i 3N 4 etenocytozyny natomiast SA-2B nie wykazuje aktywności wobec żadnego z badanych adduktów. Słowa kluczowe dioksygenaza, AlkB, modyfikacje DNA, addukty egzocykliczne, naprawa DNA Summary The role of bacterial AlkB dioxygenases in repair of exocylic DNA adducts The AlkB gene is a part of the system of adaptive response to alkylating agents in Escherichia coli. AlkB is a member of the superfamily of α-ketoglutarate- and irondependent dioxygenases. AlkB removes methyl groups from m 3 C and m 1 A, and etheno bridges from εc and εa, restoring native DNA structure. Analogous alkb genes were found in various organisms including humans. Repair activity of AlkB and its homologues from Streptomyces avermitilis: SA-1A and SA-2B was studied. Optimal conditions for AlkB and SA-1A repair of 3,N 4 -α-hydroxyethanocytosine and 3,N 4 -α-hydroxypropanocytosine were established. SA-1A does not repair 3,N 4 -ethenocytosine and 1,N 6 -ethenoadenine. SA-2B activity against the studied adducts was not observed. Keywords dioxygenase, AlkB, DNA modifications, exocyclic adducts, DNA repair 7

8 8

9 Spis treści I Wstęp I.1 Czynniki uszkadzające DNA I.1.1. Chlorek winylu i produkty jego metabolizmu I.1.2. Czynniki alkilujące I.1.3. Czynniki oksydacyjne I.1.4. Produkty peroksydacji lipidów I.1.5. Egzocykliczne addukty zasad DNA I Etenoaddukty I Propanoaddukty I.2. Naprawa uszkodzonego DNA I.2.1. Rola białka AlkB w naprawie uszkodzeń DNA I Budowa białka AlkB I Mechanizm działania I Bakteryjne homologi AlkB I Homologi AlkB występujące u ssaków II Cel pracy III.1. Materiały III.1.1. Odczynniki III.1.2. Bufory III Bufory stosowane do oczyszczania białka III Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka III.1.3. Pentamery III.1.4. Enzymy III.1.5. Antybiotyki III.1.6. Pożywki III.1.7. Aparatura III Aparatura do oczyszczania białek III Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka III.1.8. Inne materiały III.2. Metody III.2.1. Sporządzanie buforów III Bufory stosowane do oczyszczania białka III Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka III Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej III.2.2. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pet28a/psa III.2.3. Ekspresja białka SA-2B w szczepie E. coli BL21 (DE3) niosącym plazmid pet28a/psa III.2.4. Dysrupcja komórek III.2.5. Oczyszczanie białka SA-2B III.2.6. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym III.2.7. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford III.2.8. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka

10 III Otrzymywanie pentamerów zawierających etanocytozynę TT(εC)TT oraz hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT...36 III Otrzymywanie pentamerów zawierających hydroksypropanocytozynę TT(HPC)TT...37 III Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT...37 III.2.9. Badanie aktywności białka AlkB, SA-1A i SA-2B...38 III Zależność naprawy od ph...38 III Zależność naprawy od stężenia α-kg...39 III Zależność naprawy od stężenia jonów Fe (II)...40 III Zależność naprawy od czasu...40 IV Wyniki...42 IV.1. Oczyszczanie białka SA-2B...42 IV.2. Chemiczna modyfikacja pentamerów TTCTT i TTATT...43 IV.2.1. Modyfikacja pentamerów zawierających cytozynę (TTCTT)...43 IV.2.2. Modyfikacja pentamerów zawierających adeninę (TTATT)...45 IV.3. Badanie naprawy modyfikowanych oligomerów przez białko AlkB in vitro...46 IV.3.1. Naprawa TT(HEC)TT...47 IV Zależność naprawy od ph...47 IV Zależność naprawy od stężenia Fe (II)...48 IV Zależność naprawy od stężenia α-kg...49 IV Zależność naprawy od czasu...50 IV.3.2. Naprawa TT(HPC)TT...51 IV Zależność naprawy od ph...51 IV Zależność naprawy od stężenia Fe (II)...52 IV Zależność naprawy od stężenia α-kg...53 IV Zależność naprawy od czasu...54 IV.4. Badanie naprawy in vitro modyfikowanych oligomerów przez bakteryjne homologi białka AlkB: SA-1A i SA-2B...55 IV.4.1. Białko SA-1A...55 IV Zależność naprawy od ph...57 IV Zależność naprawy od stężenia α-kg...58 IV Zależność naprawy od stężenia Fe (II)...59 IV.4.2. Białko SA-2B...60 V Dyskusja...61 Aneks...69 Spis literatury...71 Spis rysunków...79 Spis tabel

11 Spis używanych skrótów VC (ang. vinyl chloride) chlorek winylu CEO (ang. chloroethylene oxide) tlenek chloroetylenu CAA (ang. chloroacetaldehyde) aldehyd chlorooctowy CRA (ang. crotonaldehyde) aldehyd krotonowy ACR (ang. acrolein) akroleina HNE (ang. trans-4-hydroxy-2-nonenal) 4-hydroksynonenal MDA, MA (ang. malondialdehyde) dialdehyd malonowy ROS (ang. reactive oxygen species) reaktywne formy tlenu εa 1,N 6 -etenoadenina εc 3,N 4 -etenocytozyna HEC 3,N 4 -α-hydroksyetanocytozyna HPC 3,N 4 -α-hydroksypropanocytozyna TT(εA)TT, TεA pentamer zawierający 4 tyminy i 1,N 6 -etenoadeninę (εa) TT(εC)TT, TεC pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N 4 -etenocytozynę (εc) TT(HEC)TT, THEC pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N 4 -α-hydroksyetanocytozynę (HEC) TT(HPC)TT, THPC pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N 4 -αhydroksypropanocytozynę (HPC) EcAlkB dioksygenaza AlkB pochodząca z E. coli, główny przedstawiciel rodziny białek AlkB SA-1A homolog białka EcAlkB pochodzący z bakterii Streptomyces avermitilis SA-2B homolog białka EcAlkB pochodzący z bakterii Streptomyces avermitilis HPLC (ang. high performance / high pressure liquid chromatography) wysokosprawna / wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa MeOH metanol TEAA octan trójetyloaminy IPTG izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozyd SDS dodecylosiarczan sodu DTT ditiotreitol 11

12 12

13 I Wstęp Kwas deoksyrybonukleinowy jest podstawowym nośnikiem informacji genetycznej, determinującym budowę, metabolizm, a nawet zachowanie organizmów żywych. Uszkodzenia DNA odgrywają bardzo ważną rolę w procesach nowotworzenia i starzenia się, dlatego też integralność i stabilność DNA jest niezbędna dla prawidłowego funkcjonowania komórek. Wszystkie organizmy są wystawione na działanie czynników mutagennych, zarówno pochodzenia egzo- jak i endogennego. Do egzogennych czynników uszkadzających DNA zalicza się substancje występujące w środowisku naturalnym (np.: aflatoksyna B 1 ), substancje chemiczne powstałe podczas procesów przemysłowych (np.: chlorek winylu), promieniowanie UV i jonizujące, czynniki alkilujące (np.: metanosulfonian metylu - MMS), składniki dymu papierosowego. Wśród czynnikami endogennych można wyróżnić aktywne formy tlenu powstałe w procesie oddychania tlenowego w mitochondriach, czy też produkty peroksydacji lipidów (Śliwiński i Błasiak 2005). I.1 Czynniki uszkadzające DNA I.1.1. Chlorek winylu i produkty jego metabolizmu Chlorek winylu (VC) jest związkiem chemicznym stosowanym do produkcji polimerów i kopolimerów wykorzystywanych w przemyśle tworzyw sztucznych. Należy do rodziny halogenowych pochodnych etylenowych. U ludzi narażonych na długotrwałe działanie VC stwierdzono liczne zmiany naczyniowe i kostne. Już w latach czterdziestych ubiegłego wieku obserwowano przypadki powstawania nowotworów u ludzi wystawionych na długotrwałą ekspozycję chlorkiem winylu, dlatego też prowadzono badania w celu ustalenia mechanizmów kancerogennego i mutagennego działania VC i jego metabolitów (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994). Chlorek winylu jest metabolizowany w wątrobie przy udziale cytochromu P450 II E 1. Pierwotnym produktem utleniania chlorku winylu przez ten cytochrom jest tlenek chloroetylenu (CEO). Jest to związek wysoce nietrwały, szybko ulega przegrupowaniu do aldehydu chlorooctowego (CAA) oraz hydrolizie do aldehydu glikolowego, które są związkami trwałymi. CEO i CAA reagują z kwasami nukleinowymi i białkami. Posiadają dwie aktywne grupy funkcyjne. W przypadku CEO są to chlor i ugrupowanie epoksydowe, natomiast w przypadku CAA chlor i grupa aldehydowa. W wyniku reakcji z kwasami nukleinowymi oba te 13

14 związki tworzą etenopochodne oraz wiązania krzyżowe. Wśród adduktów zasad DNA powstałych w wyniku działania VC można wyróżnić 7-(2-oksoetylo)guaninę (7oeG), N 2,3-etenoguaninę (N 2,3-εG), 3,N 4 -etenocytozynę (3,N 4 εc, εc) oraz 1,N 6 -etenoadeninę (1,N 6 εa, εa) (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994). H Cl C C H H chlorek winylu (VC) [O] cytochrom P-450 2E1 HOCH 2 C O H hydroliza H Cl O C C H H przegrupowanie ClCH 2 C O H aldehyd glikolowy tlenek chloroetylenu ( CEO) aldehyd chlorooctowy ( CAA) Rys 1. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994) I.1.2. Czynniki alkilujące Do czynników alkilujących należy grupa mutagenów i kancerogenów, które modyfikują DNA poprzez alkilację. Niektóre z tych czynników są rozpowszechnione w środowisku, inne natomiast to produkty normalnego metabolizmu. Związki alkilujące mogą zakłócać replikację, transkrypcję czy też sygnalizować aktywację apoptozy. U ssaków mogą być zaangażowane w kancerogenezę, choroby neurodegeneracyjne, procesy starzenia (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Czynniki alkilujące mogą dołączać grupy metylowe i etylowe do wszystkich dostępnych atomów tlenu i azotu w zasadach DNA produkując dużą liczbę uszkodzeń. Dwie spośród 11 zidentyfikowanych modyfikacji DNA: 3-metyloadenina (m 3 A) oraz O 6 -metyloguanina (O 6 meg), są głównie odpowiedzialne za biologiczne efekty alkilacji (Singer 1976). Rodzaj wywoływanych uszkodzeń zależy od czynnika, mechanizmu reakcji i struktury drugorzędowej substratu (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007). Ze względu na mechanizm reakcji, czynniki alkilujące można podzielić na dwie podgrupy. Czynniki z podgrupy S N 1, takie jak N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU) i N-metylo-N -nitro-n-nitrozoguanidyna (MNNG), wykorzystują mechanizm 14

15 jednocząsteczkowy. Natomiast te z podgrupy S N 2 np.: metanosulfonian metylu (MMS), jodek metylu (MeI), bazują na mechanizmie dwucząsteczkowym. Czynniki alkilujące typu S N 1 przyłączają addukty do atomów tlenu i azotu, natomiast czynniki typu S N 2 alkilują tylko atom azotu. Głównymi modyfikacjami wywołanymi przez czynniki metylujące w dwuniciowym DNA są: m 7 G, m 3 A, O 6 meg, natomiast m 1 A, m 3 C, m 7 A i O 4 met występują rzadziej. W jednoniciowym DNA m 1 A i m 3 C występują częściej niż w dsdna. Wśród czynników metylujących najbardziej mutagenny jest O 6 meg. Modyfikacja ta w dsdna powoduje tranzycję GC AT (Falnes i Rognes 2003). Jak już wspomniano, czynniki alkilujące występują nie tylko w środowisku, mogą też mieć pochodzenie endogenne. Do takich związków można zaliczyć S-adenozylometioninę (SAM), która jest głównym biologicznym donorem grup metylowych oraz prekursorem grup aminopropylowych wykorzystywanych w biosyntezie poliamin (Lu 2000). Ponieważ metylacja odgrywa niezwykle ważną rolę w procesach odbywających się w komórce (np.: w ekspresji genów), każda zmiana stężenia SAM może powodować zaburzenia w funkcjonowaniu komórki. Nieprawidłowości w metabolizmie SAM mogą być przyczyną chorób wątroby, niektórych zaburzeń neurologicznych i kancerogenezy (Lutz 1990). SAM może spontanicznie metylować DNA. Wykorzystuje mechanizm typu S N 2 i powoduje powstawanie głównie m 7 G i m 3 A, rzadziej O 6 meg ( Nieminuszczy i Grzesiuk 2007). Wśród czynników alkilujących występujących w środowisku, bardzo duży wpływ na zdrowie ludzi mają nitrozoaminy będące składnikami dymu papierosowego. Do najbardziej kancerogennych należą 4-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)- 1-butanon (NNK), 4-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-1-butanol (NNAL) i N -nitrozonornikotyna (NNN) (Hecht 2002). I.1.3. Czynniki oksydacyjne W wyniku wielu procesów metabolicznych zachodzących w komórce powstają reaktywne formy tlenu takie jak: nadtlenek wodoru, tlen atomowy czy rodnik hydroksylowy. Związki te mogą reagować z DNA i powodować pęknięcia nici, uszkodzenia pojedynczej zasady, tworzenie adduktów objętościowych. Termin addukty objętościowe określa m.in.: wiązania krzyżowe oraz addukty pierścieniowe (Moller i Tallin 1998). Wśród modyfikacji zasad azotowych można wyróżnić takie, które są potencjalnie mutagenne oraz takie, które blokują proces replikacji. Jednym 15

16 z oksydacyjnych uszkodzeń hamujących replikację DNA jest glikol tyminy. Prawdopodobnie produkty częściowego rozpadu pierścienia purynowego (FapyA i FapyG) również mogą zablokować proces replikacji (Wallace 1994). I.1.4. Produkty peroksydacji lipidów Peroksydacja lipidów to proces fizjologiczny, podczas którego dochodzi do utlenienia wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), będących podstawowym składnikiem błon biologicznych. Powstałe wodoronadtlenki ulegają dalszym przemianom, w wyniku których powstają stabilne, nierodnikowe związki zawierające grupy funkcyjne: aldehydowe, ketonowe, hydroksylowe, karboksylowe, peroksylowe i epoksydowe oraz węglowodory m.in. alkany i alkeny (Marnett 1999). Aktywne chemicznie związki powstające w wyniku tych procesów, przeważnie o charakterze aldehydów, są w stanie przemieszczać się do jądra komórkowego, gdzie reagują z DNA. Mogą też powstawać in situ w wyniku peroksydacji lipidów chromatynowych, głównie fosfolipidów (Matulewicz i Przybyszewski 2004). Wśród związków powstałych w wyniku peroksydacji lipidów można wymienić dwualdehyd malonowy (MDA), akroleinę, aldehyd krotonowy, glioksal, tlenek etylenu, eten, propen, trans-4-hydroksy-2-nonenal (HNE), 4-hydroksyheksenal (HHE). Wszystkie działają mutagennie i kancerogennie (Matulewicz i Przybyszewski 2004, Pastoriza Gallego i Sarasin 2003, Plastaras i wsp. 2000). Wśród nich dużą toksycznością charakteryzuje się HNE. Najbardziej mutagenny jest MDA (Marnett 1999, Niederhofer i wsp. 2003). MDA jest czynnikiem mutagennym dla komórek bakterii i ssaków oraz kancerogennym dla szczurów (Przybyszewski i wsp. 2005). Reakcje MDA z zasadami DNA, prowadzące do powstawania adduktów, są złożone, m.in.: z powodu procesów polimeryzacji, którym ulega ten związek. W wyniku tych procesów w komórkach pojawiają się dimeryczne i trimeryczne postacie MDA, które również reagują z zasadami azotowymi. Reakcja MDA z deoksyguanozyną prowadzi do powstania struktury pirymidopurynonu, określanej symbolem M1dG. W wyniku reakcji MDA z deoksyadenozyną i deoksycytydyną powstają związki oksopropenylowe: N 6 -(3-oksopropenyl)deoksyadenozyny oraz śladowe ilości N 6 -(3- oksopropenyl)deoksycytydyny (Marnett 2002, Marnett i wsp. 2003). 16

17 Rys 2. Powstawanie eteno- i propanoadduktów pod wpływem produktów peroksydacji lipidów (Przybyszewski i wsp. 2005) Produkty peroksydacji lipidów: aldehyd krotonowy, akroleina i HNE są przekształcane do epoksyaldehydów, które modyfikują zasady DNA tworząc etenoaddukty. W wyniku reakcji epoksyaldehydów z DNA powstają: N 2,3 etenoguanina 1,N 2 etenoguanina, 1,N 6 etenoadenina i 3,N 4 etenocytozyna. Oddziaływanie akroleiny z zasadami azotowymi powoduje powstanie 1,N 2 -etenoguaniny (Golding i wsp. 1996). Pochodna aldehydu krotonowego, 3-epoksybutanal, prowadzi do powstania 1,N 6 - etenoadenozyny, 3,N 4 -etenocytydyny, 1,N 2 -etenoadenozyny (Nair i Offerman 1985). Natomiast pochodna HNE, 2,3-epoksy-4-hydroksynonenal (EH), w wyniku podstawienia grup hydroksyheptanowych do guaniny i adeniny tworzy 1,N 2 - i N 2,3- etenoguaninę oraz 1,N 6 -etenoadeninę (Sodum i Chung 1989, 1991). 17

18 I.1.5. Egzocykliczne addukty zasad DNA Egzocykliczne addukty zasad DNA charakteryzują się dodatkowym pierścieniem przy atomie azotu grupy aminowej. Uszkodzenia te, jeżeli nie są naprawione, mogą wywoływać u ssaków różnego rodzaju choroby chroniczne i nowotworowe. Wiele z adduktów egzocyklicznych ma pochodzenie endogenne, prawdopodobnie jako rezultat reakcji produktów peroksydacji lipidów z zasadami DNA (Borys-Brzywczy i wsp. 2005). I Etenoaddukty Etenoaddukty należą do grupy egzocyklicznych adduktów zasad DNA i są tworzone przez różne czynniki egzo- i endocykliczne takie jak chlorek winylu, aldehyd chlorooctowy, produkty peroksydacji lipidów (Maciejewska i wsp. 2010). Powstają w wyniku utworzenia dodatkowego pierścienia imidazolowego w strukturze cząsteczek zasad DNA. Możliwe jest utworzenie 4 etenoadduktów: 1,N 6 -etenoadeniny (εa); 3,N 4 -etenocytozyny (εc); N 2,3-eteonoguaniny (N 2,3-εG) oraz 1,N 2 -etenoguaniny (1,N 2 -εg) (Barbin 2000). W reakcjach aldehydu chlorooctowego lub tlenku chloroetylenu z adeniną i cytozyną zaobserwowano powstawanie uwodnionych form pośrednich takich jak 3,N 4 -α-hydroksyetanocytozyna (HEC) (Krzyżosiak i wsp. 1979, Kuśmierek i Singer 1982, Guengerich i Raney 1992). W DNA formy te są przekształcane do pochodnych etenowych. W dwuniciowym DNA etenopochodne są stosunkowo trwałe. εa może być jednak degradowane do 4-amino-5(-imidazol-2- yl)imidazolu (β) (Yip i Tsou 1973). Natomiast 1,N 2 -εg może być przekształcona do N 1-2-(oksoetyl)guaniny (Akasaka i Guengerich 1999). Pierwsze badania nad właściwościami mutagennymi etenoadduktów były prowadzone w 1981 roku w trzech niezależnych laboratoriach i wykazały, że εa może powodować błędy w przyłączaniu guaniny lub adeniny. Natomiast εc może wpływać na niewłaściwe przyłączanie tyminy lub adeniny (Barbin i wsp. 1981, Hall i wsp. 1981, Spengler i Singer 1981). Kolejne badania wykazały, że u Escherichia coli i w komórkach nerki małpy εa powoduje tranzycję A G oraz rzadziej transwersję A T i A C. εc wywołuje w tych komórkach substytucje C A i C T, rzadziej C G. Dodatkowo εc powoduje jedno- i dwuzasadowe delecje (Basu i wsp. 1993, Shibutani i wsp. 1996, Palejwala i wsp. 1993). HEC, podobnie jak εc, prowadzi do tranzycji C T u E.coli (Jacobsen i wsp. 1989, Borys i wsp. 1994). N 2,3-εG in vitro i w komórkach E.coli może wywoływać tranzycje G A (Singer i wsp. 1983), 18

19 natomiast 1,N 2 -εg powoduje transwersje GC TA oraz GC CG (Langouët i wsp.1997). Badania in vitro wykazały też, że 1,N 2 -εg silnie hamuje replikację i sprzyja powstawaniu delecji i mutacji punktowych (Akasaka i Guengerich 1999). Rys 3. Wzory chemiczne etenoadduktów powstałych pod wpływem aldehydu chlorooctowego (wg Maciejewska i wsp. 2010) I Propanoaddukty Propanoaddukty powstają w reakcjach produktów peroksydacji lipidów: aldehydu krotonowego (CRA), akroleiny (ACR) i 4-hydroksynonenalu (HNE) z DNA i obserwowane są w tkankach zawierających dużo tłuszczu, takich jak mózg, wątroba, okrężnica (Nath i wsp. 1996). Inkubacja aldehydu krotonowego z DNA sprzyja powstawaniu adduktów propanowych z guanozyną takich jak 1,N 2 -(1-hydroksy-3- metylopropano)-2 -deoksyguanozyna. (Hecht i wsp. 2001). Akroleina i aldehyd krotonowy tworzą też propanoaddukty z deoksycytozyną. Akroleina powoduje powstawanie 3,N 4 -α-hydroksypropano-deoksycytozyny (HPC). Natomiast aldehyd krotonowy w reakcji z deoksycytozyną tworzy 3,N 4 -α-hydroksy-γ-metylopropanodeoksycytozynę (mhpc). (Borys-Brzywczy i wsp. 2005). W wyniku bezpośredniej 19

20 reakcji HNE z DNA powstaje głównie propanowy addukt guaniny podstawiony łańcuchem alifatycznym (Douki i wsp. 2004). Badania in vitro wykazały, że HNE oddziałuje z deoksynukleozydami tworząc propano- i etenocykliczne addukty posiadające boczny łańcuch hydroksyalkilowy. Powodują one wzrost częstości mutacji oraz hamują syntezę DNA in vitro u E. coli (Kowalczyk i wsp. 2004). Rys 4. Wzory chemiczne propanoadduktów akroleiny i aldehydu krotonowego z deoksycytozyną (na podstawie Borys-Brzywczy i wsp. 2005) I.2. Naprawa uszkodzonego DNA DNA wszystkich żywych organizmów jest nieustannie modyfikowane przez związki pochodzenia endo- i egzogennego. Aby zachować prawidłowe funkcjonowanie komórek, wykształcone zostały różne mechanizmy naprawy DNA, które zapobiegają kumulacji szkodliwych mutacji w komórce. U bakterii Escherichia coli można wyróżnić cztery mechanizmy naprawy uszkodzeń kwasów nukleinowych spowodowanych przez związki alkilujące. Pierwszy z nich to BER (ang. base excision repair), czyli naprawa przez wycinanie zasad. Kolejnym jest NER (ang. nucleotide excision repair), który polega na wycinaniu uszkodzonych nukleotydów. Trzeci mechanizm, MMR (ang. mismatch repair), 20

21 naprawia błędnie sparowane zasady. Ostatni sposób to naprawa bezpośrednia przez odwrócenie np.: przez metylotransferazy (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007). Większość oksydacyjnych modyfikacji DNA np.: zmiany struktury chemicznej zasady, jest naprawiana z wykorzystaniem mechanizmu naprawy przez wycinanie zasad (BER) (Gros i wsp. 2003). Wycięcie zmodyfikowanej zasady polega na hydrolizie wiązania N-glikozydowego pomiędzy zmienioną chemicznie zasadą a cukrem. N-glikozylaza rozpoznaje uszkodzoną zasadę i przecina wiązanie β-n-glikozydowe między uszkodzoną zasadą a cząsteczką deoksyrybozy, tworząc miejsce apurynowe/pirymidynowe. Następnie endonukleaza AP rozpoznaje to miejsce i nacina DNA w kierunku 5' od miejsca AP tworząc wolny koniec 3'-OH. Polimeraza DNA, Pol I, wydłuża nić DNA od wolnego końca 3'-OH wykorzystując aktywność egzonukleazy do zastąpienia nukleotydu z uszkodzoną zasadą oraz kilku następnych. Na końcu nowa nić jest łączona ze starą za pomocą ligazy DNA (Roszkowski 2002, Krwawicz i wsp. 2007). Naprawa przez wycięcie nukleotydu (NER) jest bardziej złożonym procesem niż BER oraz wymaga ATP jako źródła energii. Jest też mniej specyficznym systemem niż BER (Wood 1996; Sancar 1996). Fragment DNA, który zawiera uszkodzenie jest nacinany po obu stronach przez nukleazę, a następnie usuwany. U bakterii jest to fragment składający się z nukleotydów. W komórkach eukariotycznych fragment ten ma długość nukleotydów (Pietrzykowska i Krwawicz 1999; Ma i wsp. 1995). System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych (MMR) usuwa głównie błędy, które powstały podczas replikacji DNA i nie zostały naprawione przez polimerazę DNA oraz niewłaściwe pary zasad tworzące się w wyniku rekombinacji DNA oraz spontanicznej lub indukowanej deaminacji, utleniania bądź metylacji zasad azotowych (Modrich i Lahue 1996). Do naprawy DNA, oprócz skomplikowanych kompleksów naprawczych, komórka może wykorzystywać także proste mechanizmy naprawy kwasów nukleinowych, które nie naruszają ich integralności. Należy do nich bezpośrednia naprawa przez odwrócenie, w której bierze udział wysoce specyficzne białko. Białko to eliminuje dodatkowe grupy atomów bezpośrednio w miejscu ich przyłączenia. Dzieje się tak na przykład w przypadku dioksygenazy AlkB naprawiającej 3-metylocytozynę oraz 1-metyloadeninę (Falnes i wsp. 2002). 21

22 I.2.1. Rola białka AlkB w naprawie uszkodzeń DNA Gen alkb został odkryty ponad 20 lat temu podczas izolacji mutantów E. coli ze zwiększoną wrażliwością na czynniki alkilujące (Hataoka i wsp. 1983). Gen ten wchodzi w skład systemu odpowiedzi adaptacyjnej na czynniki alkilujące u E. coli wraz z genami ada, alka i aidb. Białka Ada, Alka i AlkB naprawiają uszkodzone zasady DNA przy użyciu różnych mechanizmów. Funkcja AidB nie została jeszcze ostatecznie ustalona (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007). Białko AlkB preferuje jednoniciowe DNA jako substrat (Falnes i wsp. 2004). Badania biochemiczne wykazały, że najlepszymi substratami dla AlkB są 3-metylocytozyna (m 3 C) oraz 1-metyloadenina (m 1 A) (Dinglay i wsp. 2000). Analiza bioinformatyczna wykazała, że białko AlkB należy do rodziny dioksygenaz zależnych od Fe(II) i α-ketoglutaranu (Aravind i Koonin 2001). I Budowa białka AlkB Badania nad strukturą przestrzenną białka AlkB wykazały, że składa się ono z 216 aminokwasów i zawiera trzy ważne domeny. Są to: C-terminalna domena dioksygenazowa, część katalityczna (aa ) Sekwencja NRL rozpoznająca nukleotyd (aa 46-89), N-terminalna domena (aa 1-45) (Yang i wsp. 2008; Yu i wsp. 2006). Rys 5. Struktura kompleksu białka AlkB z Fe(II), α-ketoglutaranem i metylowanym trójnukleotydem (Yu i wsp. 2006). Niebieskim kolorem oznaczona jest domena rozpoznająca nukleotyd, zielonym rdzeń katalityczny, a żółtym fragment N-końcowy. 22

23 Wszystkie homologi AlkB posiadają motywy i reszty niezbędne dla enzymatycznej aktywności (motyw HXD, pojedyncze H i motyw RXXXXR). U AlkB motywy te wyglądają następująco: H 131 XD 133 H 187 R 204 YNLTFR 210. Dwie histydyny i kwas asparaginowy biorą udział w wiązaniu żelaza, natomiast pierwsza arginina oddziałuje z α-kg (Wei i wsp. 1996; Aas i wsp. 2003; Kurowski i wsp. 2003). I Mechanizm działania Białko AlkB usuwa alkilacyjne oraz etenowe uszkodzenia zasad DNA. W obu przypadkach mechanizm naprawy odbywa się w dwóch etapach. W przypadku naprawy modyfikacji alkilowych pierwszy etap polega na hydroksylacji wiązania C-H w grupie alkilowej dołączonej do zasady. Wiąże się to z oksydatywną dekarboksylacją α-ketoglutaranu, w wyniku czego następuje uwolnienie cząsteczki bursztynianu i dwutlenku węgla. Jeden z atomów cząsteczki tlenu zostaje wbudowany we fragment alkilowy jako grupa hydroksylowa, drugi natomiast stanowi cześć grupy karboksylowej bursztynianu (Schofield i Hang 1999; Prescott i Lloyd 2000; Ryle i Hausinger 2002). W ten sposób białko AlkB bezpośrednio przekształca 3-metylocytozynę i 1-metyloadeninę w cytozynę i adeninę z jednoczesnym uwolnieniem utlenionej grupy metylowej w postaci formaldehydu. Produktami przejściowymi w tych reakcjach są niestabilne 3-hydroksymetylocytozyna i 1-hydroksymetyloadenina (Trewick i wsp. 2002) (Rys. 6). Rys 6. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB (Begley i Samson 2003) W podobny sposób naprawiane są uszkodzenia etenowe. W pierwszej kolejności mostek eteonowy utleniany jest do epoksydu, który w wyniku addycji cząsteczki wody 23

24 tworzy glikol. Następnie powstały alkohol uwalnia się spontanicznie w postaci glioksalu z odtworzeniem natywnej formy zasady (Delaney i wsp. 2005) (Rys. 6). Rys 6. Mechanizm naprawy uszkodzeń etenowych przez białko AlkB (Delaney i wsp. 2005) I Bakteryjne homologi AlkB Van den Born i współpracownicy na podstawie analizy sekwencji bakteryjnych białek AlkB opracowali drzewo filogenetyczne i wyodrębnili 4 grupy: 1A, 1B, 2A i 2B. Dowiedziono, że białka z grup 1A i 2B posiadają kilka tych samych konserwowanych ewolucyjnie aminokwasów co białka 1B, znajdujących się w regionie odpowiadającym domenie NRL. Pozwala to przypuszczać, że te 3 grupy białek mogą oddziaływać z tym samym substratem. (van den Born i wsp. 2009). W białkach grup 1B i 2B w domenie N-terminalnej występują takie same konserwowane sekwencje. Również w obrębie domeny NRL występują wspólne dla grup 1B i 2B konserwowane ewolucyjnie aminokwasy. Nie wykazano natomiast wspólnych konserwowanych sekwencji dla białek z grup 1A i 2A. W trakcie badań nie ujawniono podobieństwa sekwencji domeny N-terminalnej białek z grup 1A i 1B. Przypuszcza się jednak, że zawierają one kilka kluczowych reszt w obrębie domeny NRL, łącznie z resztami Trp69 i Tyr76. (Yu i wsp. 2006) Wykazano też, że białka z grup 1A, 1B oraz 2B uczestniczą głównie w naprawie DNA, podczas gdy funkcją białek z grupy 2A jest przede wszystkim modyfikacja trna (van den Born i wsp. 2009). Grupa 1A Białka z tej grupy są szeroko rozpowszechnione w królestwie bakterii, zwłaszcza u Proteobacteria. W grupie tej znajduje się białko AlkB E. coli, a także białka SA-1A i SC-1A występujące u bakterii z rodzaju Streptomyces. Białka te mają w 79% identyczne sekwencje aminokwasowe i wykazują podobne właściwości. Przypuszcza się, że grupa 1A zawiera białka o funkcji podobnej do białka modelowego dla rodziny AlkB EcAlkB (van den Born i wsp. 2009). 24

25 Grupa 1B Białka z grupy 1B występują u β- i γ-proteobacteria, a także u cyanobacteria. Wykazują podobieństwo do homologów AlkB występujących u kręgowców: ALKBH2 i ALKBH3, które posiadają podobną aktywność naprawczą do EcAlkB. W grupie tej znajduje się białko XC-1B, występujące u Xanthomonas campestris i wykazujące wysoką aktywność naprawczą. Analiza bioinformatyczna i badania doświadczalne wykazały, że białka z grupy 1B posiadają aktywność naprawczą, a ich funkcja jest zbliżona do EcAlkB (van den Born i wsp. 2009). Grupa 2B Białka z grupy 2B występują głównie u Actinobacteria. Wykazano również występowanie tych białek u kilku patogenów roślinnych z rodzaju Xanthomonas (γ-proteobacteria) i Burkholderia (β-proteobacteria). Bakterie te mogły nabyć geny kodujące białka AlkB przez horyzontalny transfer genów od Actinobacteria, będących w większości bakteriami glebowymi (Madigan i wsp. 2003). Analiza sekwencji wykazała, że białka z grupy 1B i 2B posiadają kilka takich samych zakonserwowanych reszt w regionie NRL. Białka z grupy 2B, takie jak: MT-2B, SC-2B, SA-2B i XC-2B wykazują aktywność naprawczą. Ich specyficzność substratowa jest jednak dość zróżnicowana. Białko MT-2B, w przeciwieństwie do XC-2B, wykazuje wysoką aktywność w stosunku do uszkodzeń metylowych i niską w stosunku do etenoadduktów (van den Born i wsp. 2009). Grupa 2A Białka z grupy 2A występują u proteobacteria takich jak: Agrobacterium, Rickettsia i Rhizobium. Część z tych bakterii to patogeny roślin, które podczas inwazji na gospodarza przenoszą fragmenty swojego DNA do komórek roślinnych. U niektórych bakterii np.: Roseobacter denitrificans, Roseobacter etli, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medicae, geny kodujące białka z grupy 2A znajdują się częściej na plazmidach niż na chromosomach, co sugeruje że być może zostały one uzyskane z genomu gospodarza (van den Born i wsp. 2009). Białka z grupy 2A wykazują dużą homologię względem zwierzęcych i roślinnych białek ALKBH8 (Falnes i wsp. 2009). Po analizach bioinformatycznych zasugerowano, że białka te są raczej zaangażowane w modyfikację trna niż w naprawę DNA (van den Born i wsp. 2009). 25

26 Tabela 1. Rozmieszczenie bakteryjnych białek AlkB w kompletnie zsekwencjonowanych genomach Liczba białek Grupa Liczba Przykłady rodzajów/gatunków bakterii AlkB gatunków A 1B 2A 2B Razem 1A 1A+1B 1A+2A 1A+2B 1B 1B+2A 1B+2B 2A 2A+2B 2B Razem 1A(2)+1B 1B Razem Escherichia, Salmonella, Bradyrhizobium Shewanella, Burkholderia, Xylella Agrobacterium, Rickettsia Mycobacterium, Nocardia Ralstonia metallidurans Pseudomonas fluorescens Sinorhizobium, Rhizobium, Roseobacter Streptomyces, Rhodococcus Acaryochloris marina - Xanthomonas, Burkholderia enovorans - - Frankia Burkholderia sp. 383 Flavobacterium johnsoniae Razem 164 I Homologi AlkB występujące u ssaków Geny kodujące homologi białka AlkB wykryto nie tylko u bakterii, ale również w DNA ssaków. U ssaków zidentyfikowano 9 homologów tego białka: ALKBH1- ALKBH8 (Drablos i wsp. 2004; Aravind i Koonin 2001) oraz białko FTO, które jest związane z otyłością (Gerken i wsp. 2007; Sanchez-Pulido i Andrade-Navarro 2007). Ekspresja poszczególnych genów kodujących homologi AlkB nie jest taka sama we wszystkich tkankach ludzkich i może wynikać z rozbieżności funkcji tych białek (Lee i wsp. 2005). Zaobserwowano wysoki poziom habh2 w nieproliferujących tkankach wątroby, natomiast wysoka ekspresja habh3 występowała w sercu, wątrobie, prostacie i jądrach (Sedgwick i wsp. 2007). Pierwszy ludzki homolog, habh1, wykazuje 52% podobieństwo i jest w 23% identyczne z EcAlkB (Mishina i He 2006). Jest funkcjonalnym mitochondrialnym homologiem AlkB, który naprawia m 3 C w jednoniciowym DNA i RNA, ale nie naprawia m 1 A, ani dsdna. Aktywność naprawcza habh1 jest niższa niż AlkB, habh2 i habh3, ale nie można wykluczyć, że białko to ma jeszcze inne substraty (Westbye 2008). habh1 wykazuje też aktywność liazy wobec miejsc AP w DNA (Muller i wsp. 2010). 26

27 Odkryto, że habh2 jest odpowiedzialny głównie za naprawę m 1 A, natomiast ta sama funkcja u habh3 pozostaje niejasna (Ringvoll i wsp. 2006). habh2 jako substrat bardziej preferuje dwuniciowe DNA (dsdna) niż jednoniciowe (ssdna) oraz ma niskie powinowactwo w stosunku do RNA. Tymczasem habh3 i AlkB jest bardziej aktywne w przypadku substratów ssdna i ssrna (Aas i wsp. 2003; Falnes i wsp. 2004). habh2 i habh3, oprócz tego że preferują różne substraty, mają też inną lokalizację w komórce. habh2 występuje tylko w jądrze komórkowym i uczestniczy w naprawie DNA w pobliżu widełek replikacyjnych. Natomiast habh3 występuje w jądrze komórkowym i w cytoplazmie (Duncan i wsp. 2002; Aas i wsp. 2003). W 2007 roku wielką niespodzianką było odkrycie, że związany z otyłością gen FTO koduje funkcjonalny homolog białka AlkB (Gerken i wsp. 2007; Sanchez-Pulido i Andrade-Navarro 2007). Wysoka ekspresja tego genu występuje w podwzgórzu, a defekt genu FTO powiązano ze zwiększeniem się ilości tkanki tłuszczowej w organizmie (Dina i wsp. 2007; Frayling i wsp. 2007, Scott i wsp. 2007). Białko FTO posiada homologiczną sekwencję do białek z rodziny AlkB. Wykazano, że enzym ten w obecności żelaza, α-kg i O 2 ma zdolność do demetylacji m 3 T w jednoniciowym DNA (Gerken i wsp. 2007). Zróżnicowanie właściwości występujących u ssaków homologów białka AlkB sugeruje, że mogą pełnić one różne funkcje w komórce (Sundheim i wsp. 2006). 27

28 II Cel pracy Celem pracy było ustalenie warunków naprawy HEC i HPC przez białko AlkB oraz określenie specyficzności substratowej homologów AlkB w stosunku do adduktów egzocyklicznych i wyznaczenie optymalnych warunki naprawy tych uszkodzeń w zależności od ph buforu, stężenia -ketoglutaranu i jonów żelaza. Wykorzystano tu modyfikujące własności aldehydu chlorooctowego i akroleiny. Naprawa powodowanych przez nie uszkodzeń przebiega w sposób bezpośredni - bez naruszania ciągłości nici DNA. Przedmiotem badań były wyizolowane i oczyszczone białka: AlkB oraz SA-1A i SA-2B, pochodzące od bakterii Streptomyces avermitilis. 28

29 III Materiały i metody III.1. Materiały III.1.1. Odczynniki α-ketoglutaran (α-kg) Fluka Akroleina (ACR) Fluka Aldehyd chlorooctowy (CAA) Fluka Bis-Tris Sigma Ditiotreitol (DTT) Sigma Kwas octowy (CH 3 COOH, AcOH) POCh Kwas solny (HCl) Chempur Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazino-1-etanosulfonowy (HEPES) Sigma Metanol (CH 3 OH, MeOH) Lab-scan Octan sodu (NaCOOH) Chempur Sześciouwodniony siarczan amonowo-żelazawy (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O Fluka Trietyloamina (TEA, Et 3 N) Merck Wodorotlenek sodu (NaOH) Stanlab Odczynniki do elektroforezy Żel rozdzielający (15%): 30% akrylamid - 2,5ml Fluka 1,5M Tris (ph 8.8) 1,3ml 10% SDS 0,05ml miliq H 2 O 1,1ml 10% nadsiarczan amonu (APS) - 0,05ml Bio-Rad N, N, N N - tetrametyletylenodiamina (TEMED) 0,002ml - Fluka Żel zagęszczający (4,5%): 30% akrylamid 0,17ml 1M Tris (ph 6,8) 0,13ml 10% SDS 0,01ml miliq H 2 O 0,68ml 10% nadsiarczan amonu (APS) 0,01ml N, N, N N - tetrametyletylenodiamina (TEMED) 0,001ml 29

30 Marker SigmaMarker Low Range (M.W. 6,500-66,000) Sigma Barwnik Coomasie Brillant Blue G 250 0,2 % Coomasie Brillant Blue G % kwas octowy 45 % metanol Odbarwiacz 10 % kwas octowy 25 % metanol III.1.2. Bufory III Bufory stosowane do oczyszczania białka Bufor sodowo-fosforanowy 160mM ph 7,4 Bufor do wiązania (BB) ph 7,4 Bufor do elucji (EB) ph 7,4 Bufor do przechowywania (ST) ph 7,4 Bufor do elektroforezy SDS-PAGE (ph 8,3) 0,125M Tris/HCl ph 8,3 0,96M glicyna 0,5% SDS Bufor Laemmli ego (ph 6,8) 0,25M Tris/HCl ph 6,8 50% glicerol 25% β-merkaptoetanol 10% SDS 0,05% błękit bromofenolowy Bufor do dializy (ph 7,4) 40mM Tris/HCl ph 7,4 200mM NaCl 10% glicerol 5mM DTT 1mM PMSF 30

31 III Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka 0,5M Bis-Tris w zakresie ph 5,8 7,0 0,5M bufor octanowy w zakresie ph 4,2 5,6 0,5M HEPES w zakresie ph 6,8 7,8 Bufor kakodylanowy ph 6,5 (CH 3 ) 2 AsO 2 Na x 3H 2 O (BDH) Bufor TE ph 7,8 (10mM Tris-HCl ph 7,8 + 1mM EDTA ph 8,0) 1,5M TEAB ph ok. 7-8 (węglan trietyloaminy) Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej 1M TEAA (octan trietyloaminy) ph ok. 6,5 30% metanol w H 2 O III.1.3. Pentamery TTATT Metabion, Martinsried, Germany TTCTT Metabion, Martinsried, Germany III.1.4. Enzymy Plazmid niosący sklonowany gen alkb z E. coli otrzymano z pracowni prof. Seeberga (Uniwersytet w Oslo). Plazmidy pet28a niosące sklonowane geny białek SA-1A i SA-2B otrzymano z pracowni prof. Falnesa (Uniwersytet w Oslo). Plazmidem transformowano szczep E. coli BL21 (DE3). Preparaty oczyszczonych białek EcAlkB, SA-1A, SA-2B (His-tag) zostały otrzymane w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB PAN wykorzystując plazmid pet28a. Białka EcAlkB i SA-1A zostały otrzymane przez dr Jadwigę Nieminuszczy, natomiast białko SA-2B zostało otrzymane przeze mnie. III.1.5. Antybiotyki Kanamycyna Sigma III.1.6. Pożywki Pożywka LB płynna 0,5 % NaCl 0,5 % ekstrakt drożdżowy 1 % trypton 31

32 Pożywka LB stała Podłoże LB płynne z dodatkiem 1 % agaru III.1.7. Aparatura III Aparatura do oczyszczania białek Zestaw do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham) Kolumna niklowa HisTrap (Amersham) Spektrofotometr: Cary 3 UBV Visible Spectrophotometer Varian Spektrofotometr ULTROSPEC PLUS 4054 UV/VISIBLE Spectrophotometer LKB BIOCHROM Elektroporator: TransPorator Plus - BTX Wirówka J2-21M/E Beckman Wirówka minispin Eppendorf Sonikator Branson Sonifier 250 ph-metr - inolab III Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) firmy Knauer na bazie systemu podwójnego, zapewniającego gradient dwuskładnikowy, obsługiwany przez program EuroChrom Basic Edition (wersja 3.05) i wyposażony w detektor UV. Analityczny i preparatywny rozdział próbek prowadzono na kolumnach: - Waters Nova-Pak C18, 60Å, 4μm, 4,6mm x 250mm, z prędkością przepływu 1 ml/min, - HR C18, 60Å, 6μm, 3,9mm x 300mm, z prędkością przepływu 1,75 ml/min, z użyciem liniowego gradientu 20mM octanu trietyloaminy o ph 6,5 x 30% MeOH w wodzie przez 30 minut i detekcją UV przy długości fali 270nm Spektrofotometr: Cary 3 UBV Visible Spectrophotometer Varian Wirówka minispin Eppendorf ph-metr MeterLab III.1.8. Inne materiały bibuła 3mm Whatman 32

33 folia spożywcza do przykrywania żeli kuwety do elektroporacji Bio-Rad kuwety do spektrofotometrii Medlab papierki wskaźnikowe MERCK szyby 14cm x 16cm z przekładkami i grzebieniem 0,4mm III.2. Metody III.2.1. Sporządzanie buforów Wszystkie bufory zostały wykonane na bazie wody dejonizowanej mq. III Bufory stosowane do oczyszczania białka Bufor wiążący (BB) 400ml buforu wiążącego uzyskano poprzez zmieszanie 50ml buforu sodowofosforanowego z 2ml 10mM imidazolu i uzupełnienie wodą miliq. Mieszaninę stabilizowano kwasem solnym do ph o wartości 7,4. Bufor do elucji (EB) W celu sporządzenia buforu do elucji zmieszano 12,5ml buforu sodowofosforanowego z 25ml 500mM imidazolu i uzupełniono wodą do 100ml. ph ustabilizowano również do wartości 7,4. Tak przygotowane bufory BB i EB schłodzono. Bufor do przechowywania (ST) Aby przygotować bufor do przechowywania zmieszano 40mM Tris/HCl, 200mM NaCl, 10% glicerolu. ph ustabilizowano do wartości 7,4. III Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka Sporządzono 0,2M bufory z przygotowanych wcześniej 0,5M buforów: octanowego, HEPES i Bis-Tris. Do każdego dodano DTT do końcowego stężenia 5mM. III Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej 1M octan trójetyloaminy (TEAA) o ph ~ 6,5 przygotowano w dwóch etapach. I etap: Destylacja TEA Kilka sit molekularnych wrzucono do kolby (o objętości 500ml) z TEA ~ 300ml i ogrzano do wrzenia. Następnie obniżono temperaturę do C. Przedgon zbierano do 33

34 momentu ustabilizowania się temperatury na termometrze (była nieco niższa niż 90ºC). Następnie zebrano ok. 200ml destylatu TEA. Wyłączono transformator i pozostawiono wszystko do wystygnięcia. II etap Schłodzono 1 mol (139,2 ml) świeżo destylowanej trójetyloaminy (Et 3 N, TEA), 1 mol (57,5 ml z 17,4M) kwasu octowego (AcOH) i 700 ml H 2 O mq. Zlewkę z wodą wstawiono w łaźni lodowej na mieszadło. Dodano TEA, który pływał po powierzchni jak olej. Następnie powoli dodawano AcOH aż do uzyskania ph 6,5. Uzupełniono wodą do 1000 ml i całość przesączono na sączku do HPLC. Do rozdziałów chromatograficznych używano 20mM TEAA. III.2.2. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pet28a/psa Dwie porcje zawierające po 100μl komórek elektrokompetentnych bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) rozmrożono na lodzie. Do jednego z nich dodano 1μl plazmidu pet28a/psc, niosącego sklonowany gen białka SA-2B z Streptomyces avermitilis, drugi natomiast stanowił kontrolę negatywną. Przygotowaną mieszaninę transformacyjną przenoszono następnie do schłodzonej w lodzie kuwety. Kuwetę wstawiono do elektroporatora i poddawano działaniu impulsu elektrycznego o napięciu 2,5 kv/cm. Do mieszaniny transformacyjnej dodawano następnie 1ml LB i inkubowano przez 1 godz. w 37ºC w celu wyrażenia genu oporności na kanamycynę. Po transformacji mieszaninę bakteryjną wysiano na płytki ze stałym podłożem LB zawierającym kanamycynę o końcowym stężeniu 50 μg/ml. Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37ºC. Następnie sprawdzano na płytkach obecność transformantów oraz brak wzrostu na kontroli negatywnej. III.2.3. Ekspresja białka SA-2B w szczepie E. coli BL21 (DE3) niosącym plazmid pet28a/psa 100ml płynnej pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml) zaszczepiano pojedynczą kolonią szczepu E. coli BL21 (DE3), niosącego plazmid kodujący białko AlkB pet28a-sa-2b. Bakterie hodowano przez noc w 37ºC z wytrząsaniem 200 rpm. Następnie hodowlę przeszczepiano na świeżą pożywkę (3 x 1 litr). 20 ml hodowli nocnej dodano do każdej kolby zawierającej 1 litr płynnej pożywki LB z kanamycyną, zawartość kolb połączono. Całość hodowano w 37ºC z wytrząsaniem do momentu 34

35 osiągnięcia gęstości OD 600 =0,6 (ok. 2,5 godziny) Z zawiesiny bakterii pobrano 1 ml (kontrola nieindukowana). Resztę przeniesiono do 16ºC i hodowano przez 1 godzinę w celu schłodzenia hodowli. Następnie indukowano ekspresję białka poprzez dodanie izopropylo-β-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,1mM. Po indukcji bakterie hodowano przez 16 godzin w 16ºC z wytrząsaniem 150 rpm. Po tym czasie hodowle wirowano (6000 rpm w 4ºC przez 15 min). Supernatant odrzucono, a osady zamrożono w -20ºC. III.2.4. Dysrupcja komórek Do osadu komórek bakteryjnych dodano β-merkaptoetanol (70μl/100ml) i PMSF (1ml/100ml). Całość zawieszono w 60 ml buforu wiążącego ph 7,4 (20mM bufor fosforanowy, 0,5M NaCl, 10mM imidazol). Zawiesinę przeniesiono do falkonów i umieszczono w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia, następnie rozmrożono pod zimną, bieżącą wodą. Po przeniesieniu zawartości falkonów do dwóch zlewek i umieszczeniu w łaźni lodowej komórki sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą ultradźwięków o energii 250W, używając sonikatora Branson Sonifier 250. Kolejnym etapem było zwirowanie próbek z prędkością x g/10 min w 4ºC (ultrawirówka Beckman J2-21M/E). Osad odrzucono, a supernatant zebrano i przefiltrowano przez filtr celulozowo-nitrowy 0,2μm (Milipore). III.2.5. Oczyszczanie białka SA-2B Plazmid bakteryjny psa kodujący białko SA-2B (homologi AlkB) otrzymano od prof. Falnesa z Uniwersytetu w Oslo. Plazmid pet28a/psa zawierał wklonowaną sekwencję cdna kodującą białko SA-2B. Wszystkie etapy oczyszczania białka odbywały się w temperaturze 4ºC. Supernatant nakładano na kolumny ze złożem niklowym HisTrap (Amersham) z wykorzystaniem urządzenia Äcta Prime. Białko eluowano w buforze elucyjnym gradientem stężenia imidazolu od 10mM do 0,5M. Zebrane frakcje zachowano do dalszej analizy, natomiast frakcje, które zawierały białko SA-2B zostały poddane dializie do buforu do przechowywania 2xST (storage buffer) o ph 7,4 (40mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 10% glicerol). Na koniec dodano glicerol do końcowego stężenia 50%. Oczyszczone białka przechowywano w temperaturze -80ºC. 35

36 III.2.6. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Białka obecne w zebranych frakcjach (osad bakterii nieidukowanych IPTG, supernatant przed nałożeniem na złoże, frakcje zebrane po dializie) zostały rozdzielone elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS-PAGE (warunki denaturujące). Zastosowano metodę według modyfikacji Laemmli ego, czyli w tzw. systemie nieciągłym. W metodzie tej żel składa się z dwóch części. Część górna zawiera 4,5% akrylamid o ph 6,8 i służy do zagęszczenia białek. Natomiast część dolna zawiera 15% akrylamid o ph 8,8. Dochodzi w niej do rozdziału białek w zależności od ich wielkości. Zanim próbki o objętości 5µl nałożono na żel, dodano do nich 1,5µl 5x stężonego buforu Laemmli ego. Elektroforezę prowadzono w buforze do elektroforezy SDS-PAGE (1x) pod napięciem 200 V do momentu wyjścia barwnika z żelu. Rozdziałowi poddano też marker wielkości białek SigmaMarker Low Range w zakresie 6,5-66 kda, służący do oceny wielkości białka. Po rozdziale białka barwiono Coomassie Brillant Blue G-250 przez 30 minut. Następnie barwnik zlewano, a żel umieszczano w odbarwiaczu, który zmieniano kilkakrotnie, aż do całkowitego odbarwienia się tła. III.2.7. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford Każdy pomiar wykonano w trzech powtórzeniach, ostateczny wynik stanowił średnią arytmetyczną wszystkich wyników dla danej frakcji. 5μl każdej z analizowanych frakcji rozcieńczano w kuwetach zawierających po 795μl sterylnej wody miliq, dodawano 200μl odczynnika Bradford, mieszano i odstawiano na 10 minut w ciemności. Po tym czasie mierzono absorbancję roztworów przy długości fali 595 nm względem kontroli (mieszanina 800μl wody i 200μl odczynnika Bradford). Stężenie białka w analizowanych frakcjach określano na podstawie krzywej wzorcowej. III.2.8. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka III Otrzymywanie pentamerów zawierających etanocytozynę TT(εC)TT oraz hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT Do 276,5μl 1,5M buforu TEAB ph ok. 7-8 dodano 12,5μl pentameru TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (555nmoli) oraz 29,75μl (180μmol) 45% roztworu aldehydu 36

37 chlorooctowego (CAA). Całość inkubowano przez 2,5h w 37 C. Następnie mieszaninę reakcyjną (nieprzereagowany TTCTT oraz TT(HEC)TT i TT(εC)TT) oczyszczono i rozfrakcjonowano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. W celu określenia stężenia oligomeru zebrane frakcje poddano pomiarowi absorbancji, po czym rozdzielono je za pomocą rozdziału analitycznego na HPLC w celu sprawdzenia ich składu (nakładano po ok. 1nmol substancji). Następnie frakcje zawierające modyfikowane pentamery liofilizowano do sucha i zawieszono w buforze TE ph 8 w końcowym stężeniu 500pm/μl. Frakcje zawierające czysty THEC umieszczono w temp. - 20ºC. Do frakcji zawierających mieszaninę TεC i THEC dodano 1M bufor kakodylanowy ph 6,5 i poddano procesowi dehydratacji przez ogrzewanie w 37ºC w ph 6,5 przez 72h. III Otrzymywanie pentamerów zawierających hydroksypropanocytozynę TT(HPC)TT Do 214μl 1M buforu octanowego o ph 4,5 dodano 5μl pentameru TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (222nmoli) oraz 39μl (1nmol) akroleiny (ACR). Całość inkubowano przez 4h w 37 C. Następnie mieszaninę reakcyjną oczyszczono za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. W celu określenia stężenia oligomeru zebrane frakcje zawierające TT(HPC)TT poddano pomiarowi absorbancji, po czym rozdzielono je za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano po ok. 1nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany produkt połączono, zliofilizowano, a następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500pmoli/μl. III Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT Do 442,4μl 0,5 M buforu octanowego o ph 4,6 dodano 5μl pentameru TTATT o stężeniu 2 OD/μl (222 nmole) oraz 47,6 μl (288 μmol) 45 % roztworu aldehydu chlorooctowego (CAA). Całość inkubowano przez 24 h w 37 C. Następnie mieszaninę reakcyjną oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie, nakładając całkowitą objętość reakcji. Zebrane frakcje zawierające TTεATT poddano pomiarowi absorbancji w celu określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano po ok. 1 nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany produkt połączono, zliofilizowano, a następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500 pmoli/μl. 37