Udział bakteryjnych homologów dioksygenazy AlkB w naprawie egzocyklicznych uszkodzeń zasad DNA

Transkrypt

1 UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ WYDZIAŁ BIOLOGII I NAUK O ZIEMI Joanna Wrona Kierunek BIOLOGIA Specjalność Biochemia Udział bakteryjnych homologów dioksygenazy AlkB w naprawie egzocyklicznych uszkodzeń zasad DNA (The role bacterial homologues of AlkB dioxygenase in repair of exocyclic DNA bases damage) Promotor: prof. dr hab. Jarosław Kuśmierek Część doświadczalna pracy wykonana pod opieką dr Agnieszki Maciejewskiej w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN LUBLIN 2010

2 2

3 Streszczenie Gen alkb jest częścią systemu odpowiedzi adaptacyjnej na środki alkilujące bakterii Escherichia coli. Sam gen znany jest od wielu lat, jednak biochemiczna funkcja białka AlkB została odkryta dopiero w 2002 roku. Białko AlkB to zależna od 2-oksoglutaranu i jonów Fe(II) dioksygenaza, która usuwa grupy metylowe z 3-metylocytozyny i 1-metyloadeniny przez utlenienie ich do formaldehydu i tym samym odtwarza nieuszkodzoną cytozynę i adeninę w DNA. Homologi alkb znaleziono u wielu innych bakterii i organizmów wyższych, także u człowieka. Dodatkowo odkryto, że białka typu AlkB usuwają mostki etenowe z cytozyny i adeniny przez utlenienie ich do glioksalu. Addukty tego typu generowane są w DNA przez metabolity chlorku winylu, znanego kancerogenu przemysłowego, a także endogennie pod wpływem produktów peroksydacji lipidów (LPO). LPO jest procesem związanym ze stresem oksydacyjnym prowadzącym do powstania całej gamy wysoce reaktywnych związków (m. in.: akroleina, aldehyd krotonowy, dialdehyd malonowy, 4-hydroksynonenal) uszkadzających różne komponenty komórki, w tym DNA. Badano rekombinowane homologi białka AlkB z E. coli u następujących bakterii: Streptomyces coelicolor białka SC-1A i SC-2B oraz Xanthomonas campestris XC-1B i XC-2B. Białko SC-1A, w przeciwieństwie do SC-2B, XC-1B i XC-2B, wyraźnie naprawia uszkodzenia zasad DNA spowodowane związkami modyfikującymi, takimi jak aldehyd chlorooctowy (CAA) i akroleina (ACR). Przy pomocy opracowanej metody ustalone zostały optymalne warunki aktywności SC-1A w naprawie różnych adduktów w zależności od ph buforu, stężenia -ketoglutaranu i jonów żelaza. Optymalne warunki dla naprawy poszczególnych uszkodzeń przez białko SC-1A były zbliżone do wyników z udziałem EcAlkB, co świadczy o pokrewieństwie (homologii) tychże białek. Jak wynika z przeprowadzonych doświadczeń, białko AlkB jest w stanie naprawiać egzocykliczne addukty zasad, jak nienasycone etenoaddukty: etenoadeninę (εa) i etenocytozynę (εc), ale także nasycone hydroksyalkanopochodne: hydroksyetanocytozynę (HEC) i hydroksypropanocytozynę (HPC). Zatem specyficzność substratowa białek typu AlkB może być szeroka i białka te mogą odgrywać istotną rolę w naprawie różnego typu modyfikacji, również w komórkach ssaków. 3

4 Pragnę serdecznie podziękować prof. dr hab. Jarosławowi Kuśmierkowi za promotorską opiekę i cenne wskazówki udzielone w czasie pisania niniejszej pracy dr Agnieszce Maciejewskiej za opiekę naukową, teoretyczne i praktyczne zapoznanie mnie z tematem, życzliwość, cierpliwość, wyrozumiałość oraz wsparcie na jakie zawsze mogłam liczyć 4

5 Praca została zrealizowana w ramach polsko-norweskiego grantu nr PNRF-143-AI-1/07. The AlkB protein and its eukaryotic homologues the role in DNA repair and the possible role in cancer etiology and target in cancer therapy (Białko AlkB i jego eukariotyczne homologi rola w naprawie DNA i potencjalny udział w etiologii nowotworów oraz jako cel w terapii przeciwnowotworowej) 5

6 Spis treści I. Wstęp... 9 I.1. Czynniki uszkadzające DNA I.1.1. Czynniki fizyczne I.1.2. Czynniki biologiczne I.1.3. Czynniki chemiczne I.1.4. Chlorek winylu I.1.5. Peroksydacja lipidów I Egzocykliczne uszkodzenia DNA I.2. Sposoby naprawy DNA I.2.1. AlkB I Mechanizm działania I Struktura przestrzenna AlkB I Rodzina bakteryjnych białek AlkB I Homologi AlkB I Znaczenie badań nad białkami AlkB II. Cel pracy III. Materiały i metody III.1. Materiały III.1.1. Odczynniki III.1.2. Bufory III Bufory stosowane do oczyszczania białka III Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka III.1.3. Pentamery III.1.4. Enzymy III.1.5. Antybiotyki III.1.6. Pożywki III.1.7. Aparatura III Aparatura do oczyszczania białek III Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka III.1.8. Inne materiały III.2. Metody III.2.1. Sporządzanie buforów III.2.2. Elektroforeza białkowa III.2.3. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii III Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pet28a/alkb III Ekspresja białka SC-1A w szczepie E. coli BL21 (DE3) III Dysrupcja komórek III.2.2. Oczyszczanie białka SC-1A III.2.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford III.2.4. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka III Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT i TT(εC)TT w reakcji pentameru TTCTT z aldehydem chlorooctowym (CAA)

7 III Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksypropanocytozynę TT(HPC)TT w reakcji pentameru TTCTT z akroleiną (ACR) III Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT w reakcji pentameru TTATT z aldehydem chlorooctowym (CAA) III.2.5. Badanie aktywności białek i wykonanie zależności III Zależność od ph III Zależność od stężenia jonów Fe(II) III Zależność od stężenia αkg IV. Wyniki IV.1. Oczyszczanie białka SC-1A IV.2. Modyfikacja pentametrów zwierających cytozynę IV.2.1. Uzyskanie pentameru zawierającego hydroksypropanocytozynę IV.2.2. Uzyskanie pentamerów zawierających hydroksyetanocytozynę i etenocytozynę IV.3. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-1A IV.3.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od ph reakcji IV.3.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w reakcji IV.3.3. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia αkg w reakcji IV.4. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-2B IV.4.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od ph reakcji IV.4.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w reakcji IV.5. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białka XC-1B i XC-2B. 71 V. Wnioski VI. Dyskusja Literatura

8 Spis używanych skrótów dr deoksyryboza VC (ang. vinyl chloride) chlorek winylu CEO (ang. chloroethylene oxide) tlenek chloroetylenu CAA (ang. chloroacetaldehyde) aldehyd chlorooctowy CRA (ang. crotonaldehyde) aldehyd krotonowy ACR (ang. acrolein) akroleina HNE (ang. trans-4-hydroxy-2-nonenal) 4-hydroksynonenal MDA, MA (ang. malondialdehyde) dialdehyd malonowy ROS (ang. reactive oxygen species) reaktywne formy tlenu (RFT), wolne rodniki tlenowe (WRT) TT(HEC)TT, THEC 3,N 4 -α-hydroksyetanocytozyna (HEC) TT(HPC)TT, THPC 3,N 4 -α-hydroksypropanocytozyna (HPC) TT(εC)TT, TεC, εc 3,N 4 -etenocytozyna (3,N 4 -εc) TT(εA)TT, TεA, εa 1,N 6 -etenoadenina (1,N 6 -εa) EcAlkB białko pochodzące od E. coli, podstawowe dla rodziny białek AlkB SC-1A homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces coelicolor SC-2B homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces coelicolor XC-1B homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Xanthomonas campestris XC-2B homolog biłka EcAlkB pochodzący od bakterii Xanthomonas campestris SA-1A homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces avermitilis SA-2B homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces avermitilis HPLC (ang. high performance / high pressure liquid chromatography) wysokosprawna / wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa MeOH metanol TEAA trójetyloamina IPTG izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozyd SDS dodecylosiarczan sodu TEMED N,N,N,N - tetrametylenodiamina DTT ditiotreitol 8

9 I. Wstęp Kwas deoksyrybonukleinowy (deoxyribonucleic acid, DNA) jest podstawowym nośnikiem informacji genetycznej, która determinuje budowę, metabolizm, a także behawioral organizmów żywych. DNA narażone jest nieustannie na działanie czynników zaburzających, mających tym samym wpływ na jego strukturę. Jeżeli nastąpi zmiana w budowie chemicznej DNA wzrasta prawdopodobieństwo błędnego parowania się zasad lub braku zdolności do tworzenia par komplementarnych. Takie nieprawidłowości mogą uniemożliwić replikację i/lub transkrypcję powodując skutek mutagenny, a nawet letalny. Dlatego też tak ważnym jest aby wszystkie uszkodzenia DNA komórkowego zostały jak najszybciej usunięte w celu zapobieżenia utrwaleniu się danej mutacji w przyszłych pokoleniach. DNA ani o niczym nie wie, ani o nic nie dba, DNA po prostu jest, a my tańczymy tak jak nam zagra." Richard Dawkins Budowa DNA DNA ma postać heliksu ( podwójnej helisy ) i zbudowany jest z deoksyrybonukleotydów. Na deoksyrybonukleotyd składa się zasada azotowa: adenina lub guanina (dwupierścieniowa puryna), cytozyna lub tymina (jednopierścieniowa pirymidyna), 2-deoksyryboza (pentoza), a także reszta kwasu ortofosforowego. Zasada azotowa łączy się z pierścieniem pentozowym cukru wiązaniem N-glikozydowym, deoksyrybonukletydy zaś połączone są ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi, między pozycjami 3 i 5. Deoksyryboza jest pochodną rybozy, w której grupa hydroksylowa, połączona z węglem 2' zastąpiona jest grupą wodorową. Z atomem 5' reszty cukrowej związana jest grupa fosforanowa. Deoksyryboza dobrze rozpuszcza się w wodzie o ph obojętnym, w przeciwieństwie do zasad azotowych, które nie są rozpuszczalne. Z tego też powodu cząsteczki DNA tworzą taką strukturę, gdzie na zewnątrz obecne są elementy rozpuszczalne (cukier i reszta fosforanowa), natomiast wewnątrz nierozpuszczalne w wodzie. W warunkach fizjologicznych kwas deoksyrybonukleinowy ma postać regularnego 9

10 heliksu, który składa się z dwóch antyparalelnie ułożonych łańcuchów polinukleotydowych, zwiniętych wokół wspólnej osi. W obrębie heliksu dochodzi do oddziaływań hydrofobowych między zasadami, ponadto w każdej parze cytozyna - guanina tworzą się trzy wiązania wodorowe, zasady w parze adenina - tymina są związane dwoma wiązaniami wodorowymi. W helisie B wyróżnia się rowek mniejszy i większy. Na dnie rowka białka wiążące DNA rozpoznają sekwencję nukleotydową, gdyż tam "wystają" grupy chemiczne zasad azotowych. Zatem zmiany konformacji w obrębie DNA mogą być mechanizmem regulującym ekspresję genów. I.1. Czynniki uszkadzające DNA Możliwe są przynajmniej dwa podziały czynników modyfikujących kwasy nukleinowe. Ze względu na pochodzenie wyodrębnić można czynniki egzogenne i endogenne. Czynniki egzogenne Do czynników egzogennych zaliczamy promieniowanie UV, promieniowanie jonizujące, substancje wywołane działalnością człowieka (chlorek winylu), związki alkilujące (np. etanosulfonian metylu EMS, etylonitrozomocznik ENU, metanosulfonian metylu MMS) czy substancje naturalnie występujące w środowisku (np. aflatoksyna B1). Wiele związków ulega w organizmie przemianom prowadzącym do ich detoksykacji lub wręcz przeciwnie, do aktywacji. Np. przemiany, jakim przy udziale cytochromów P450 podlega aflatoksyna AFB1, prowadzą do jej detoksykacji, albo do powstania wysoce reaktywnej formy epoksydowej, która tworząc addukty w DNA zapoczątkowuje proces mutagenezy i kancerogenezy. Najczęściej występującymi zmianami w DNA są chemiczne modyfikacje zasad purynowych i pirymidynowych, w których wyróżnić można dwie podgrupy: cytotoksyczne i mutagenne. Uszkodzenia cytotoksyczne prowadzą do opóźnienia bądź zatrzymania widełek replikacyjnych blokując polimerazy DNA. Mutagenne uszkodzenia zaś są nieprawidłowo odczytywane w czasie replikacji, generując tym samym powstawanie mutacji w nowopowstałej nici DNA. 10

11 Czynniki endogenne Poza czynnikami środowiskowymi na zmianę struktury DNA wpływają procesy metaboliczne przebiegające we wszystkich żywych komórkach. Do czynników endogennych możemy zaliczyć naturalną reaktywność DNA (spontaniczna deaminacja hydrolityczna cytozyny prowadząca do powstania uracylu), jak również związki naturalnie powstające w komórkach (reaktywne formy tlenu). Przykładem innej spontanicznej reakcji hydrolitycznej, polegającej na zerwaniu wiązania N-glikozydowego między C-1 deoksyrybozy a N-9 zasady purynowej, jest depurynacja, która prowadzi do utraty zasady purynowej z cząsteczki DNA. Do depirymidynacji może także dochodzić, lecz z mniejszą częstotliwością. Najczęściej obserwowanymi endogennymi modyfikacjami DNA są miejsca apurynowe, produkty dezaminacji, uszkodzenia oksydacyjne i alkilacja zasad, jak też różne aldehydopochodne addukty egzocykliczne (np. produkty peroksydacji lipidów). Addukty takie prowadzą do zniekształceń DNA, dających w rezultacie spowolnienie albo blokowanie replikacji. Wzrasta wówczas prawdopodobieństwo zatrzymania podziałów komórkowych lub pojawienia się aberracji chromosomowych. Bardziej precyzyjnym kryterium podziału jest rodzaj modyfikacji, który pozwala wyróżnić czynniki fizyczne, chemiczne i biologiczne. I.1.1. Czynniki fizyczne Spośród czynników fizycznych uszkadzających DNA znaczną rolę odgrywają promieniowania - jonizujące i ultrafioletowe. Promieniowanie jonizujące charakteryzuje się znaczną przenikliwością i jest powodem wybijania elektronów z zajmowanych przez nie orbitali. Działanie promieniowaniem o wysokiej energii prowadzi do jonizacji nie tylko kwasów nukleinowych, ale również innych składników komórki i może przyczyniać się do powstawania form wolnorodnikowych, które utleniają zasady azotowe kwasu deoksyrybonukleinowego oraz inicjują powstawanie wiązań krzyżowych pomiędzy dwoma nićmi DNA, jak też pomiędzy DNA a białkami. Wybicie elektronów zmniejsza także siłę wiązania między atomami i jest przyczyną pęknięć w cząsteczce DNA i jego fragmentacji (Schemat 1.). 11

12 PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE jonizacja składników komórki (DNA, RNA, białek) radioliza wody i powstawanie reaktywnych form tlenu (RFT) i azotu (RFA) uszkodzenia oksydacyjne wiązania krzyżowe DNA-DNA i DNA-białko pękanie nici DNA (niszczenie cukrów i wiązań fosfodiestrowych) Schemat 1. Wpływ promieniowania jonizującego na funkcjonowanie komórek Źródło: Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka Promieniowanie ultrafioletowe wykazuje mniejszą przenikliwość w porównaniu z promieniowaniem jonizującym ze względu na większą długość fali ( nm) i mniejszą energię. Wprowadza w strukturę DNA dimery pirymidynowe z udziałem cytozyny i tyminy, głównie dimery tyminowe, pomiędzy C5 i C6. Tworzy się wtedy pierścień cyklobutanowy między pirymidynami, który powoduje odkształcenie cząsteczki i zbliżenie nukleotydów. Rysunek 1. Struktura dimeru tyminowego Źródło: Opracowanie własne na podstawie Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka 12

13 Pod wpływem promieniowania UV powstają także fotoprodukty pirymidyno (6-4) pirymidynowe. Rysunek 2. Struktura fotoproduktu pirymidyno (6-4) pirymidynowego Źródło: Opracowanie własne na podstawie Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka I.1.2. Czynniki biologiczne Do tej grupy czynników należą patogeny - wirusy i grzyby. Wirus HIV Jeden z retrowirusów, wirus HIV (ang. human immunodeficiency virus), będący przyczyną zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS) potrafi specyficznie wintegrowywać w genom komórki gospodarza przez pośrednią formę, jaką jest DNA. Aflatoksyna B 1 Aflatoksyna B1 (AFB1) jest naturalnym produktem (mikotoksyną) wytwarzanym przez grzyby Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus. Mutagenność i kancerogenność AFB1 jest wynikiem powstawania AFB 1-8,9- epoksydu, reagującego bezpośrednio z DNA. Wiązanie z DNA zachodzi gwałtownie i powstaje trwały addukt 8,9-dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroksy AFB 1 (AFB 1 - guanina) (Pierzynowska J, Grzesiuk E, 1999). 13

14 Rysunek 3. Struktura trwałego adduktu aflatoksyny B 1 Źródło: Opracowanie własne na podstawie Smart RC, Hodgson E, 2008 Enzymami odpowiedzialnymi za metabolizm fazy II AFB-8,9-epoksydu są: mikrosomalna hydrolaza epoksydowa (meh) i S-transferaza glutationu (GST), prowadzące do detoksyfikacji (Plant N, 2003). I.1.3. Czynniki chemiczne Związki chemiczne stanowią niewątpliwie najobszerniejszą grupę czynników uszkadzających DNA. Zaliczamy tutaj nie tylko czynniki chemiczne prowadzące do oksydacji, alkilacji i hydrolizy zasad (deaminacja, depurynacja, depirymidynacja), ale także produkty peroksydacji lipidów oraz działanie chlorku winylu i jego pochodnych. Czynniki oksydacyjne Uszkodzenia oksydacyjne DNA odgrywają istotną rolę w mutagenezie, kancerogenezie i w procesie starzenia (Ames BN i in., 1995). Nadtlenek wodoru, tlen atomowy czy rodnik hydroksylowy są produktami ubocznymi wielu procesów metabolicznych, takich jak utlenianie w peroksyzomach, oddychanie tkankowe w mitochondriach czy metabolizm substancji egzo- i endogennych w retikulum endoplazmatycznym przy udziale cytochromu P450. Reaktywne formy tlenu są także bronią stosowaną przez makrofagi w obronie przed inwazją patogenów. W procesach zapalnych powstają również aktywne formy azotu. Tlenek azotu pełni w komórce 14

15 funkcję przekaźnika sygnałów, ale też może poprzez interakcję z lipidami uszkadzać DNA (Burcham PC, 1998). Najgroźniejsze implikacje dla organizmów niosą ze sobą reakcje wolnych rodników tlenowych z DNA. Interakcje takie mogą prowadzić do utworzenia pojedynczych i podwójnych pęknięć DNA, wiązań poprzecznych i modyfikacji zasad azotowych. Oksydacyjne modyfikacje zasad azotowych można podzielić na dwie grupy ze względu na ich biologiczne właściwości: a) potencjalnie mutagenne oraz b) blokujące proces replikacji DNA. Typowym przykładem oksydacyjnego uszkodzenia DNA prowadzącego do bloku replikacyjnego jest glikol tyminy. Prawdopodobnie również obecność w cząsteczce DNA produktów częściowego rozpadu pierścienia purynowego, to znaczy FapyA i FapyG, może prowadzić do zahamowania procesu replikacji (Wallace SS, 1994). Pośród reaktywnych form tlenu zdolnych do uszkadzania DNA występują: anionorodnik ponadtlenkowy O 2, nadtlenek wodoru H 2 O 2, rodnik hydroksylowy OH i tlen singletowy 1 O 2. Formy te łatwo utleniają zarówno cząsteczki zasad jak i cukrów budujących DNA (glikol tyminy, 8-oksyG, FapyG), a często prowadzą też do jednoniciowych i dwuniciowych pęknięć DNA. Modyfikacje w obrębie zasad obejmują wprowadzenie do cząsteczki grupy OH, co zmienia właściwości kodujące danego nukleotydu (np. 8-oksyG może tworzyć parę z A co wywołuje substytucję G do T, jak i z C co nie skutkuje mutacją), ułatwia pękanie pierścieni pirymidyn (mocznik) i puryn (Fapy), które są nie tylko mutagenne, lecz również blokują polimerazy DNA i RNA, prowadząc w efekcie do śmierci komórki. 15

16 O glikol tyminy blokuje replikację i transkrypcję H 3 C HO HO H N NH O O NH 2 H deoksyryboza mocznik blokuje replikację i transkrypcję deoksyryboza FapyG blokuje replikację O H H N HN O N NH NH 2 O H N N O N NH NH 2 8-oksyG inicjuje błędy w kodowaniu G T deoksyryboza deoksyryboza Rysunek 4. Wybrane uszkodzenia oksydacyjne Źródło: Kaczmarska Z, 2009, praca magisterska Jeżeli w procesie replikacji DNA naprzeciwko 8-oksyG włączona zostanie adenina, to po dwóch rundach replikacyjnych pojawi się transwersja G T. Z wolnymi rodnikami reagują nie tylko zasady wchodzące w skład DNA, ale również obecne w trójfosfodeoksynukleotydach. 8-oksodGTP jest dobrym substratem dla polimeraz DNA, a możliwość błędnego parowania zmodyfikowanej oksydacyjnie guaniny może doprowadzić do jej inkorporacji naprzeciwko adeniny i do substytucji A C po trzech rundach replikacyjnych (Oliński R, Jurgowiak M, 1999). Czynniki alkilacyjne Do czynników alkilujących zaliczamy mutageny i kancerogeny, które modyfikują DNA i RNA poprzez alkilację (van den Born E i in., 2009), potrafią wprowadzać różne szkodliwe uszkodzenia do kwasów nukleinowych, a także produkowane są endogennie, jako produkt uboczny metabolizmu komórkowego (Falnes PØ, Rognes T, 2003). Uszkodzenia alkilacyjne zasad mogą zatrzymywać replikację, przerywać transkrypcję czy sygnalizować aktywację apoptozy. W komórkach ssaków mogą być zaangażowane w kancerogenezę, schorzenia neurodegeneracyjne czy procesy starzenia (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Obecne w tych związkach reaktywne grupy metylowe i etylowe wywołują alkilację zasad azotowych i grup fosforanowych 16

17 nukleotydów. Rodzaj wywoływanych przez nie zmian zależy od ich właściwości chemicznych i struktury przestrzennej DNA (Sedgwick B, Lindahl T, 2002). Główne modyfikacje zasad wprowadzane do dwuniciowego DNA (dsdna) przez czynniki alkilujące to: 7-metyloguanina (7-meG), 3-metyloadenina (3-meA) i O 6 -metyloguanina (O 6 -meg), natomiast w znacznie mniejszym stopniu: 1-metyloadenina (1-meA), 7-metyloadenina (7-meA), 3-metylocytozyna (3-meC), 3-metyloguanina (3-meG) i O 4 -metylotymina (O 4 -met). Przy czym, w jednoniciowym DNA (ssdna) 1-meA oraz 3-meC,występują częściej niż w dsdna (Falnes PØ, Rognes T, 2003). 7-metyloguanina O 6 -metyloguanina 3-metyloadenina Rysunek 5. Przykłady uszkodzeń alkilacyjnych Źródło: Opracowanie własne Pozycja N7 guaniny jest najbardziej podatna na alkilację i stanowi od 65 do 80% wszystkich alkilowanych zasad. Modyfikacja ta nie blokuje replikacji, ani transkrypcji, nie wpływa również na parowanie zasad, wydaje się więc być nieszkodliwa. Jednak 7-meG może stanowić źródło wtórnych uszkodzeń DNA o silnych właściwościach toksycznych, takich jak: miejsca apurynowe czy puryny z otwartym pierścieniem imidazolowym, tzn. Fapy. Z kolei 3-meA blokuje większość polimeraz DNA, a ponadto jest źródłem miejsc apurynowych (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Donorem grup metylowych dla rozmaitych metylotransferaz jest S-adenozylometionina (SAM), która może nieenzymatycznie metylować DNA, ale w innych pozycjach niż w reakcjach enzymatycznych. Ponieważ metylacja odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych, takich jak ekspresja informacji genetycznej, 17

18 zmiana poziomu SAM w komórce może wpływać na jej funkcjonowanie, a nieprawidłowości związane z metabolizmem SAM mogą być przyczyną chorób wątroby, schorzeń neurologicznych czy kancerogenezy (Lutz WK, 1990). SAM może również uczestniczyć w spontanicznej metylacji DNA generując powstawanie głównie 7-meG i 3-meA, a w mniejszym stopniu także O 6 -meg. Metylosulfonian metylu (MMS) jest czynnikiem metylującym DNA, używanym w eksperymentach związanych z mutagenezą i rekombinacją (Beranek DT, 1990). MMS wywołuje zmiany w budowie zasad w postaci 1meA, 3meC i O 6 meg, które pojawiają się preferencyjnie w RNA i jednoniciowych cząsteczkach DNA, gdyż w przypadku dwuniciowego DNA metylowane atomy są zaangażowane w tworzenie wiązań pomiędzy zasadami, ich dostępność dla czynnika alkilującego jest zmniejszona. Zmiany takie mogą prowadzić do błędnego parowania zasad i zatrzymania replikacji (Duncan T i in., 2002). MMS czy jodek metylu (MeI) wprowadzają grupy alkilowe wyłącznie do atomów azotu oraz mają silne właściwości toksyczne (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Reaktywność SAM jest znacznie słabsza niż MMS (Rydberg B, Lindahl T, 1982). Do czynników metylujących należą również związki przyłączające grupy alkilowe zarówno do tlenu i azotu w cząsteczkach zasad oraz tlenu grupy fosforanowej (N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU) i N-metylo-N -nitro-n-nitrozoguanidyna (MNNG). Wykazują one silne właściwości mutagenne. I.1.4. Chlorek winylu Chlorek winylu używany jest do produkcji polimerów (polichlorek winylu, PCW) i kopolimerów (z octanem winylu, chlorkiem winylidenu, estrami kwasu akrylowego i maleinowego) wykorzystywanych w przemyśle tworzyw sztucznych. Należy do rodziny halogenowych pochodnych etylenowych. Ten prosty gaz o zapachu chloroformu po dostaniu się do organizmu jest przetwarzany w wątrobie przez cytochrom P450 II E 1 (Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994). Pierwotnym produktem utleniania chlorku winylu (VC) jest tlenek chloroetylenu (Barbin A i in., 1975; Gothe R i in., 1974). Tlenek chloroetylenu (CEO) jest związkiem nietrwałym i w roztworach wodnych ulega przegrupowaniu do aldehydu chlorooctowego (CAA) oraz hydrolizie do aldehydu glikolowego. Zarówno aldehyd 18

19 chlorooctowy jak i aldehyd glikolowy są związkami względnie trwałymi (Barbin A i in., 1990). H Cl C C H H chlorek winylu (VC) [O] cytochrom P-450 2E1 HOCH 2 C O H hydroliza H Cl O C C H H przegrupowanie ClCH 2 C O H aldehyd glikolowy tlenek chloroetylenu ( CEO) aldehyd chlorooctowy ( CAA) Schemat 2. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu Źródło: Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994 CEO i CAA oddziałują z białkami oraz z DNA (reakcje z adeniną i cytozyną) w jądrach komórek (Osterman - Golkar S i in., 1977). Obecność w tych metabolitach dwóch aktywnych grup funkcyjnych (w CEO chlor i grupa epoksydowa, w CAA chlor i grupa formylowa) umożliwia tworzenie cyklicznych adduktów zasad (etenopochodne) i wiązań krzyżowych. Wykazano także tworzenie wiązań międzyniciowych w reakcji CAA z DNA (Spengler SJ, Singer B, 1988). I.1.5. Peroksydacja lipidów Peroksydacja lipidów jest ciągiem reakcji, które mogą wzmagać stres oksydacyjny rozpoczęty przez wolne rodniki i reaktywne formy tlenu (Blair IA, 2001). Jest to proces fizjologiczny obejmujący utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), stanowiących podstawowy składnik błon biologicznych. Aktywne chemicznie elektrofilowe związki, zawierające przeważnie α,β-nienasycone aldehydy, powstałe w rezultacie tych procesów, mogą przemieszczać się do jądra 19

20 komórkowego i reagować z DNA, jak również powstawać in situ w wyniku peroksydacji lipidów chromatynowych, tj. fosfolipidów (Matulewicz Ł, Przybyszewski WM, 2004). Schemat 3. Powstawanie propano- i etenoadduktów pod wpływem produktów peroksydacji lipidów Źródło: Przybyszewski WM i in., 2005 (zmodyfikowano) Peroksydacja lipidów przebiega z utworzeniem wielu reaktywnych produktów, zarówno na drodze nieenzymatycznej jak i w wyniku reakcji enzymatycznych (Porter NA, 1986). Substancjami powstałymi w różnych ilościach w zależności od budowy kwasów oraz warunków utleniania są związki epoksydowe (np. 2,3- epoksybutanal czy 2,3-epoksy-4-hydroksynonanal) oraz aldehydy nasycone (np. heksanal, pentanal) i α,β-nienasycone (np. akroleina, aldehyd krotonowy, 4- hydroksynonenal, 2-heksenal, 2-heptenal, 2-oktenal, 2-nonenal, 2,4-nonadienal, 2,4- dekadienal) (Dotan Y i in., 2004). Końcowymi produktami peroksydacji lipidów powstającymi w największych ilościach są α,β-nienasycone aldehydy o niskich masach cząsteczkowych, charakteryzujące się dłuższym czasem półtrwania niż reaktywne formy tlenu i zdolnością do dyfuzji do odległych nawet obszarów komórki względem miejsc ich powstawania. Przemieszczając się na swej drodze powodują uszkodzenie komórki, dzięki czemu można je traktować jako wtórne 20

21 przekaźniki peroksydacji lipidów (Dotan Y i in., 2004). Aldehydy te mogą reagować z grupami aminowymi i tiolowymi wielu innych związków ważnych biologicznie, takich jak białka i DNA. W reakcje z resztami aminokwasowymi białek łatwo wchodzi dialdehyd malonowy (MDA) oraz 4-hydroksy-2-nonenal (HNE), w wyniku czego wytwarzane są pochodne karbonylowe białek (Dotan Y i in., 2004). α,β-nienasycone aldehydy, jako związki karbonylowe dwufunkcyjne, są istotnymi czynnikami chemicznymi zanieczyszczającymi środowisko, jak również produktami metabolizmu człowieka. Należne ich dwufunkcyjnemu charakterowi (podwójne wiązanie skoniugowane z grupą formylową) zdolności chemiczne wykazują obfite modyfikacje DNA. Jedną z istotnych konsekwencji wysokiej reaktywność α,β-nienasyconych aldehydów w stosunku do zasad azotowych jest ich zdolność do tworzenia egzocyklicznych adduktów DNA (Pluskota-Karwatka D, 2008). W wyniku tych reakcji powstaje szereg połączeń prowadzących m.in. do hamowania replikacji i transkrypcji DNA (Dotan Y i in., 2004; Hemminki K i in., 1994). Należy też podkreślić, że aldehydy powstające w wyniku peroksydacji lipidów, wchodząc w reakcje z DNA i białkami, wykazują przy tym właściwości zarówno toksyczne jak i mutagenne (Dotan Y i in., 2004; Benamira M i in., 1995; Bartsch H i in., 2002). Stwierdzono, że najbardziej toksycznym produktem peroksydacji lipidów jest 4-hydroksy-2-nonenal (Esterbauer H i in., 1990). Właściwości mutagenne zarówno w stosunku do komórek bakteryjnych jak i zwierzęcych wykazuje akroleina (ACR), aldehyd krotonowy (CRA) jak też dialdehyd malonowy (MDA) (Eckl P, Esterbauer H, 1989), przy czym związkiem najbardziej mutagennym jest MDA (Esterbauer H i in., 1990). I Egzocykliczne uszkodzenia DNA Akroleina (ACR), aldehyd krotonowy (CRA) i 4-hydroksynonenal (HNE) przekształcają się oksydacyjnie do epoksyaldehydów. Epoksyaldehydy mają zdolność modyfikacji zasad DNA dając w rezultacie etenoaddukty. Jak wykazały badania, w wyniku oddziaływania epoksyaldehydów na DNA powstaje etenoguanina, etenoadenina i etenocytozyna, a epoksyd akroleiny powoduje powstanie 1,N 2 -etenoguaniny (Golding BT i in., 1996). Aldehyd krotonowy przekształca się w 2,3-epoksybutanal, który powoduje powstawanie podstawionych grupami alkilowymi zasad: 1,N 6 -etenoadenozyny, 3,N 4 -etenocytydyny, 21

22 1,N 2 -etenoadenozyny (Nair V, Offerman RJ, 1985). Pochodna HNE - 2,3-epoksy-4- hydroksynonenal (EH) powoduje podstawienie grup hydroksyheptanowych do guaniny i adeniny; powstają w ten sposób 1,N 2 - i N 2,3-etenoguanina oraz 1,N 6 -etenoadenina (Sodum RS, Chung FL, 1989 i 1991). Addukty tego rodzaju przyczyniają się do niestabilności genetycznej, odgrywając tym samym znaczącą rolę w procesach mutagenezy i kancerogenezy (Kowalczyk P i in., 2004). Produkty peroksydacji lipidów tworzą w reakcji z kwasem dezoksyrybonukleinowym dwa rodzaje egzocyklicznych adduktów: epoksydy dają pięcioczłonowe etenoaddukty, natomiast nie-epoksydowane α,β-nienasycone aldehydy dają sześcioczłonowe propanoaddukty. Propanoaddukty zasad DNA Scharakteryzowano i opisano propanoaddukty powstałe m.in. w reakcji akroleiny z deoksycytozyną. Jednym z nich jest hydroksyalkanoaddukt 3,N 4 -αhydroksypropanocytozyna. Rysunek 6. Wzór hydroksypropanocytozyny Źródło: Opracowanie własne Addukt ten jest alkalilabilny co powoduje, że oligonukleotyd pęka w miejscu modyfikacji w środowisku zasadowym. HPC jest efektywnie usuwana przez Mug w zakresie ph Uważa się, że słabe wycinanie HPC w warunkach niskiego ph związane jest z faktem, że HPC jest czwartorzędową zasadą i przy niskim ph przechodzi w formę uprotonowaną, co skutkuje zmniejszonym powinowactwem do enzymu (Borys-Brzywczy E i in., 2005). 22

23 Propanoaddukty powstają również pod wpływem aldehydu krotonowego i 4-hydroksynonenalu (HNE). Przeważającym ilościowo produktem bezpośredniej reakcji HNE z DNA jest propanowy addukt guaniny podstawiony łańcuchem alifatycznym (Douki T i in., 2004). Rysunek 7. Struktura adduktu HNE do guanozyny Źródło: Opracowanie własne Wyniki badań in vitro wykazały, że HNE oddziałuje z deoksynukleozydami, co prowadzi do powstania propano- i etenocyklicznych adduktów z bocznym łańcuchem hydroksyalkilowym, które powodują wzrost częstości mutacji oraz hamują syntezę DNA in vitro u E. coli (Kowalczyk P i in., 2004). Etenoaddukty zasad DNA Etenoaddukty są egzocyklicznymi związkami powstałymi poprzez uformowanie się dodatkowego pierścienia imidazolowego w cząsteczce zasady DNA. Możemy wyróżnić cztery etenoaddukty: 1,N 6 -etenoadenina (εa), 3,N 4 -etenocytozyna (εc), N 2,3-etenoguanina (N 2,3εG), 1,N 2 -etenoguanina (1,N 2,εG) (Kochetkov NK i in., 1971). 23

24 N HO N N N O N O N 3,N 4 -etenocytozyna 3,N 4 - hydroksy-etano (3,N 4 - C) cytozyna (HEC) O N N + N CHO N H N O N O N N N N N N HN O HO N O N N N N N N N N N HO N N N N N 1,N 2 -etenoguanina N 2,3-etenoguanina 1,N 6 -etenoadenina (1,N 2 - G) (N 2,3- G) (1,N 6 - A) Rysunek 8. Wzory chemiczne etenoadduktów zasad DNA powstających pod wpływem aldehydu chlorooctowego (CAA) Źródło: Kochetkov NK i in., 1971 Tymina nie tworzy cyklicznych adduktów, ponieważ jako jedyna z zasad azotowych nie posiada egzocyklicznej grupy aminowej w cząsteczce. Historia badań nad etenoadduktami sięga początków lat 70-tych ubiegłego stulecia, kiedy Kochetkov wraz ze współpracownikami po raz pierwszy otrzymali etenoadeninę i etenocytozynę w reakcji aldehydu chlorooctowego z adeniną i cytozyną. Badania mechanizmu reakcji CAA z resztami adeniny i cytozyny wykazały, iż we wstępnym etapie następuje wytworzenie zasady Schiffa w reakcji grupy aldehydowej CAA z egzocyklicznymi grupami aminowymi 6-NH 2 adeniny lub 4-NH 2 cytozyny. Następnie zachodzi cyklizacja w wyniku alkilowania przez ugrupowanie CH 2 Cl endocyklicznego atomu azotu w najbliższym sąsiedztwie grupy NH 2. Aby powstała taka struktura związek chemiczny atakujący zasadę musi 24

25 posiadać dwie grupy funkcyjne zdolne do utworzenia nowego wiązania, jak również zasada powinna zawierać dwa reaktywne ugrupowania. Powstałe w ten sposób stosunkowo stabilne produkty przejściowe (hydraty) 1,N 6 εa H 2 O i 3,N 4 εc H 2 O w wyniku dehydratacji ulegają przekształceniu odpowiednio w 1,N 6 εa i 3,N 4 εc (Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994). Rysunek 9. Dehydratacja 3,N 4 -(N 4 α-hydroksyetano)cytozyny (3,N 4 εc H 2 O) Źródło: Opracowanie własne na podstawie Maciejewska AM i in., ,N 4 -etenodeoksycytozyna (3,N 4 -εc) jest jednym z egzocyklicznych etenowych uszkodzeń zasad DNA. Może powstawać zarówno w wyniku ekspozycji na niektóre kancerogeny środowiskowe, np. aldehyd chlorooctowy (CAA), jak i na skutek peroksydacji lipidów. W warunkach fizjologicznych połowiczny czas (t 1/2 ) dehydratacji 3,N 4 -αhydroksyetanocytozyny (HEC) w polinukleotydzie wynosi około 1 dobę (Kuśmierek JT, Singer B, 1982), co sugeruje, że addukt ten może odgrywać niezależną od 3,N 4 -εc rolę w mutagenezie i naprawie. 1,N 6 -etenoadenina (1,N 6 -εa) powstaje w reakcji, w której azot N1 pierścienia adeniny oraz azot egzocykliczny tworzą pięcioczłonowy pierścień, dzięki nasyceniu wiązania podwójnego przy azocie N1 (Frick LE i in., 2007). Tak jak inne etenoaddukty, etenoadenina powstaje w wyniku działania m. in. aldehydu chlorooctowego (metabolitu chlorku winylu) oraz produktów peroksydacji ω-6-wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na zasady DNA. Etenoadenina została wykryta w tkankach ludzi i gryzoni w bardzo zróżnicowanych ilościach, w przedziale od 0,043 do 31,2 cząsteczek etenoadeniny na 10 8 niezmodyfikowanych 25

26 adenin występujących w DNA. Traktowanie szczurów chlorkiem winylu powodowało wzrost ilości etenoadeniny w DNA ich wątroby, płuc, limfocytów i jąder (w wątrobie i płucach kilkukrotny). U bakterii polimeraza DNA rozpoznaje zwykle etenoadeninę jako niezmodyfikowaną adeninę, rzadko dając podstawienia AT TA (Moriya M i in., 1994). W komórkach E.coli i Saccharomyces cerevisiae zaobserwowano aktywność enzymatyczną identyfikowaną jako alkilo-n-puryno- DNA glikozylazy wycinające etenoadeninę, odpowiednio AlkA 1 i MAG 2 (Saparbaev M i in., 1995). Wykryto również aktywność enzymatyczną wycinającą etenoadeninę w ssaczym ekstrakcie komórkowym (Oesch F i in., 1986). Częściowo oczyszczono ludzkie białko ANPG 3 wiążące się do, i usuwające etenoadeninę (Saparbaev M i in., 1995; Singer B i in., 1992). Zaobserwowano, że ANPG jest zdecydowanie bardziej efektywnym białkiem niż alkilo-n-puryno-dna glikozydazy (Saparbaev M i in., 1995). I.2. Sposoby naprawy DNA Komórki wykształciły szereg systemów naprawczych mających na celu przeciwdziałanie efektom wpływu czynników mutagennych i cytotoksycznych. U Escherichia coli wyróżnia się cztery sposoby naprawy uszkodzeń kwasów nukleinowych spowodowanych przez związki alkilujące: 1) naprawa przez wycinanie zasad ang. base excision repair (BER), 2) naprawa przez wycinanie nukleotydów ang. nucleotide excision repair (NER), 3) naprawa błędnie sparowanych zasad ang. mismatch repair (MMR), 4) naprawa bezpośrednia przez odwrócenie, np. metylotransferazy (alkilotransferazy) lub oksydacyjne demetylazy (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Procesy naprawcze zmodyfikowanej adduktami molekuły DNA zapobiegają gromadzeniu się tych modyfikacji i ich przekształcaniu w mutacje. Większość 1 Białko AlkA jest 3-metyloadeninową glikozylazą II DNA indukowaną w odpowiedzi na alkilację DNA. Chroni komórki przed negatywnymi działaniem alkilowanych zasad DNA poprzez katalizę ich wycinania, włączając w to N-3 i N-7 addukty adenozyny i guanozyny oraz O 2 addukty tymidyny i cytydyny. 2 MAG białko drożdży Saccharomyces cerevisiae 3 ANPG ludzka 3-metyloadeninowa glikozylaza DNA, in. ludzka N-glikozylaza DNA alkilowanych zasad 26

27 oksydacyjnych modyfikacji DNA, takich jak zmiany struktury chemicznej zasady, reszty cukrowej oraz obecność miejsc apurynowych i pirymidynowych, jest naprawiana z wykorzystaniem mechanizmu wycięcia zasady (BER). Wykazano, że według tego mechanizmu usuwane są etenoaddukty: 1,N 6 -etenoadenina, 3,N 4 -etenocytozyna, N 2,3-etenoguanina i 1,N 2 -etenoguanina (Gros L i in., 2003). Najważniejszym elementem jest tu aktywność enzymatyczna glikozylaz DNA. Glikozylazy w procesie naprawy hydrolizują N-glikozydowe wiązanie pomiędzy zmienioną chemicznie zasadą a cukrem, a także eliminują zmodyfikowane zasady, np. alkilowane puryny czy glikol tyminowy oraz utlenioną 2 -deoksyrybozę. W zależności od rodzaju uszkodzenia obserwowano proces naprawczy z udziałem endonukleaz nacinających DNA w miejscu 5 oksydacyjnie zmienionej zasady, pozostawiając wolne końce 3 -hydroksylowe i 5 -fosforanowe, co określono mianem: naprawa przez nacięcie nukleotydu (nucleotide incision repair NIR) (Ishchenko AA, Saparbaev MK, 2002). Kolejnym mechanizmem naprawczym jest naprawa przez wycięcie nukleotydu (NER), który usuwa objętościowe addukty zmieniające konformację helisy DNA (Costa RMA i in., 2003). Częścią tego mechanizmu jest proces naprawczy połączony z transkrypcją (transcription coupled repair TCR). Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) jest procesem, w efekcie którego usuwane są uszkodzone nukleotydy. U bakterii E. coli proces taki odbywa się przy udziale białek UvrA, UvrB, UvrC i UvrD. Naprawa błędnie sparowanych zasad (MMR) dotyczy źle sparowanych zasad na potomnej nici utworzonych w czasie procesu replikacji, a które uniknęły poprawy polimerazy DNA. Oprócz skomplikowanych kompleksów naprawczych, komórka może wykorzystywać także proste mechanizmy naprawy DNA, nie naruszające jego integralności. Przykładem jest bezpośrednia naprawa przez odwrócenie, w której bierze udział pojedyncze, wysoce specyficzne białko, nie nacinające wiązania pomiędzy reszta cukrową a fosforanową, ani nie wycinające zmodyfikowanej zasady. Wprowadzone dodatkowe grupy atomów są eliminowane bezpośrednio w miejscu ich przyłączenia. Jednym z takich mechanizmów jest działanie fotoliazy reaktywowanej pod wpływem światła ultrafioletowego. Fotoliazy przekształcają cyklobutanowe dimery pirymidynowe z powrotem do monomerów. Białka te zawierają grupę prostetyczną absorbującą światło niebieskie i transportują energię na 27

28 pierścień cyklobutanowy powodując tym samym jego rozszczepienie. Należy zaznaczyć, że fotoliza nie występuje w komórkach wyższych eukariotów. Do kolejnej grupy białek naprawczych możemy zaliczyć alkilotransferazy (np. metylotransferaza O 6 -metyloguaniny). Białka te transportują grupy metylowe ze zmodyfikowanych zasad DNA na grupę tiolową cysteiny własnej cząsteczki. W DNA zostaje więc naprawiona zasada, natomiast metylotransferaza ulega nieodwracalnej inaktywacji poprzez zablokowanie reszty cysteinowej (Falnes PØ i in., 2004). Dioksygenazy AlkB odgrywają kluczową rolę w mechanizmie bezpośredniej naprawy przez odwrócenie. Białka te katalizują reakcję całkowitej naprawy uszkodzenia bez naruszenia ciągłości nici DNA, a do reakcji wymagają obecności łatwo dostępnych w komórce α-ketoglutaranu i tlenu jako kosubstratów oraz Fe (II) jako kofaktora. Uczestniczą one w usuwaniu uszkodzeń alkilacyjnych, takich jak: 1-meA czy 3-meC oraz egzocyklicznych etenoadduktów DNA, które mogą być również usuwane przez system naprawy przez wycinanie zasad (BER) (Lau AY i in., 2000; Aas PA i in., 2003). I.2.1. AlkB Gen alkb został odkryty w 1983 roku podczas izolowania mutantów Escherichia coli ze zwiększoną wrażliwością na czynniki alkilujące. Obecnie produkt tego genu białko AlkB u E. coli (EcAlkB) uważane jest za białko uczestniczące w naprawie alkilacyjnych uszkodzeń DNA (Kataoka H i in., 1983). Jego homologi występują też u innych organizmów, gdzie uczestniczą w naprawie uszkodzeń w DNA lub/i RNA, a także mogą pełnić funkcje nie związane z naprawą DNA (van den Born E i in., 2009). W 2002 roku dwie niezależne grupy badawcze potwierdziły eksperymentalnie udział białek AlkB w naprawie DNA (Falnes PØ i in., 2002; Trewick SC i in., 2002). Analiza bioinformatyczna wykazała, iż białka te należą do rodziny dioksygenaz zależnych od Fe(II) i α-ketoglutaranu (Aravind L, Koonin EV, 2001). Enzym AlkB wymaga Fe(II) jako kofaktora oraz α-ketoglutaranu i tlenu jako kosubstratów. I Mechanizm działania Białko AlkB usuwa zarówno alkilacyjne, jak i etenowe uszkodzenia zasad DNA. Mechanizm naprawy alkilowych modyfikacji można podzielić na dwa etapy. 28

29 W pierwszej kolejności następuje hydroksylacja wiązania C-H w dołączonej do zasady grupie alkilowej, co związane jest z oksydatywną dekarboksylacją α-ketoglutaranu, w wyniku której uwolnione zostają cząsteczki bursztynianu i dwutlenku węgla. Jeden z atomów cząsteczki tlenu wbudowany zostaje we fragment alkilowy jako grupa hydroksylowa, natomiast drugi stanowi część grupy karboksylowej bursztynianu (Prescott AG, Lloyd MD, 2000; Ryle MJ, Hausinger RP, 2002; Schofield CJ, Hang Z, 1999). Z wykorzystaniem tej drogi naprawy, białko AlkB bezpośrednio przekształca 1-metyloadeninę i 3-metylocytozynę odpowiednio w adeninę i cytozynę z jednoczesnym uwolnieniem utlenionej grupy metylowej w postaci formaldehydu (Trewick SC i in., 2002). Produktami przejściowymi są 1-hydroksymetyloadenina i 3-hydroksymetylocytozyna, które są niestabilne i spontanicznie rozkładają się regenerując nieuszkodzoną zasadę (Schemat 4). Schemat 4. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB Źródło: Begley TJ, Samson LD, 2003 Mechanizm naprawy uszkodzeń adduktów etenowych opiera się na podobnej zasadzie jak usuwanie grup alkilowych (Sedgwick B, Lindahl T, 2002). Najpierw mostek etenowy utleniany jest do epoksydu, który w wyniku addycji cząsteczki wody tworzy glikol. W dalszej kolejności powstały alkohol uwalnia się spontanicznie w postaci glioksalu (Delaney JC i in., 2005) z odtworzeniem wyjściowej zasady. 29

30 Schemat 5. Mechanizm naprawy etenowych uszkodzeń przez białko AlkB Źródło: Delaney JC i in., 2005 W celu potwierdzenia hipotezy naprawy εa przez AlkB skonstruowano trimer DNA T(εA)T, który traktowano białkiem AlkB E. coli. Po reakcji analiza HPLC wykazała całkowity zanik piku dla T(εA)T i pojawienie się nowego piku reprezentującego TAT. Trimer TAT został dodany do tej samej mieszaniny, która była analizowana na HPLC. Zwiększenie gęstości w nowym piku potwierdza, że TAT zostało uzyskane jako produkt ostateczny. Eksperyment sprawdzający został przeprowadzony w dokładnie takich samych warunkach z T(εA)T, Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2, α-ketoglutaranem i askorbinianem w buforze MES albo HEPES z wyłączeniem AlkB. Analiza HPLC tego roztworu pokazała, że żadna reakcja naprawcza nie wystąpiła przy braku AlkB. Swoistości TAT i T(εA)T w roztworze zostały następnie potwierdzone przy użyciu spektrometrii masowej MALDI (Mishina Y i in., 2005). Po przeprowadzonej reakcji białka AlkB zachowują aktywność enzymatyczną (Trewick SC i in., 2002; Falnes PØ i in., 2002). I Struktura przestrzenna AlkB Poznanie trójwymiarowej struktury białek AlkB w kompleksie z różnymi substratami pozwoliło na identyfikację kluczowych reszt aminokwasowych zaangażowanych w rozpoznanie substratu oraz ujawniło, że białko EcAlkB składające się z 216 aminokwasów zawiera trzy domeny. Są to: - N-terminalna domena (aa 1-45), - sekwencja NRL (ang. nucleotide-recognition lid) (aa 46-89), - C-terminalna domena dioksygenazowa, część katalityczna (aa ) (Yang CG i in., 2008; Yu B i in., 2006). 30

31 Bakteryjne białka AlkB są zbudowane z aminokwasów, zawierają silnie zakonserwowaną domenę dioksygenazową oraz słabiej zakonserwowany region N-terminalny. Przypuszczalnie domena N-terminalna zawiera reszty decydujące o specyficzności substratowej. Rysunek 10. Struktura krystaliczna kompleksu białka AlkB E. coli z Fe(II), 2OG i metylowanym trójnukleotydem. Kolorem pomarańczowym zaznaczono Fe, natomiast atomy w 2OG i dt-(1-me-da)-dt są zaznaczone zgodnie z atomową identyfikacja (węgiel-biały; tlen-czerwony; azot-niebieski; fosfor-pomarańczowy). Niezmienne łańcuchy Fe-2OG dioksygenazy zaznaczono kolorem czerwonym lub magenta (czerwono-fioletowym) w zależności od interakcji odpowiednio z Fe lub 2OG (Yu B i in., 2006) Źródło: I Rodzina bakteryjnych białek AlkB Na podstawie analizy sekwencji bakteryjnych białek AlkB opracowano drzewo filogenetyczne z wyodrębnieniem czterech grup: 1A, 1B, 2A, 2B. Rozproszone występowanie białek w obrębie królestwa bakterii wskazuje na horyzontalny transfer kodujących je genów (van den Born E i in., 2009). W białkach należących do grupy 1B w domenie N-terminalnej występują takie same konserwowane sekwencje, jak w białkach należących do grupy 2B. Podobnie, w obrębie domeny NRL, występuje kilka konserwowanych ewolucyjnie aminokwasów wspólnych dla białek grupy 1B oraz 2B. Natomiast, w przypadku 31

32 grup 1A i 2A, takie same konserwowane sekwencje występują wyłącznie w białkach należących do tej samej grupy. Badania nie ujawniły podobieństwa sekwencji pomiędzy N-terminalną domeną białek z grup 1A i 1B, jednak przypuszcza się, iż zawierają one kilka kluczowych reszt w obrębie domeny NRL, łącznie z resztami Trp69 i Tyr76, co jest związane ze specyficznością substratową (Yu B i in., 2006). Sekwencje domeny NRL białek grupy 1B wykazują homologię do białek z grupy 1A i 2B, co sugeruje, że białka tych trzech grup mogą rozpoznawać podobne substraty (van den Born E i in., 2009). Białka należące do grupy 1A, 2B oraz 1B mają kilka takich samych konserwowanych ewolucyjnie aminokwasów w rejonie odpowiadającym domenie NRL EcAlkB co pozwala przypuszczać, że te trzy grupy białek mogą oddziaływać z takim samym substratem (kwasem nukleinowym). Białka z grup 1A, 1B oraz 2B uczestniczą głównie w naprawie DNA, podczas gdy funkcją białek z grupy 2A jest przede wszystkim modyfikacja trna (van den Born E i in., 2009). Tabela 1. Rozmiary homologów białka AlkB wybranych (badanych) gatunków bakterii Białko Obecność/gatunek bakterii Wielkość (aa) MT-2B Mycobacterium tuberculosis 205 SA-1A Streptomyces avermitilis 222 SA-2B Streptomyces avermitilis 208 SC-1A Streptomyces coelicolor 216 SC-2B Streptomyces coelicolor 210 XC-1B Xanthomonas campestris 201 XC-2B Xanthomonas campestris 211 EcAlkB Escherichia coli 216 Źródło: Zmodyfikowano na podstawie van den Born E i in., 2009 Grupa 1A Białka należące do tej grupy są szeroko rozpowszechnione w królestwie bakterii, szczególnie u proteobacteria. Do grupy tej należy białko AlkB E. coli, także białka SA-1A i SC-1A; oba występują u bakterii z rodzaju Streptomyces, w 79% są identyczne na poziomie sekwencji aminokwasowej oraz mają podobne właściwości. Przypuszczalnie grupa 1A składa się z białek o funkcji podobnej do białka modelowego dla całej super rodziny AlkB EcAlkB (van den Born E i in., 2009). 32

33 Grupa 1B Białka z grupy 1B występują u β- i γ-proteobacteria, a także u cyanobacteria. Wykazują podobieństwo do białek ALKBH2/ALKBH3 występujących u kręgowców. Do grupy tej należy białko XC-1B, charakteryzujące się wysoką aktywnością naprawczą. Analiza bioinformatyczna oraz liczne badania doświadczalne wykazały, iż białka z grupy 1B to białka naprawcze o funkcji zbliżonej do AlkB u E. coli (van den Born E i in., 2009). Grupa 2A Białka tej grupy występują u α-proteobacteria, u takich rodzajów jak Agrobacterium, Rickettsia czy Rhizobium. Niektóre z tych bakterii są patogenami roślin, a geny kodujące białka tej grupy u niektórych bakterii, np. Roseobacter denitrificans, Roseobacter etli, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medicae występują częściej na plazmidach niż na chromosomach. Białka grupy 2A wykazują dużą homologię względem roślinnych oraz zwierzęcych białek ALKBH8 (Falnes PØ i in., 2009). Analizy bioinformatyczne sugerują, że białka tej grupy są zaangażowane raczej w modyfikację trna niż w naprawę DNA. Grupa 2B Białka tej grupy występują głównie u Actinobacteria, a także u niektórych patogenów roślinnych, np. Xanthomonas (γ-proteobacteria) i Burkholderia (β-proteobacteria), które mogły nabyć geny kodujące białka AlkB przez horyzontalny transfer genów z Actinobacteria, które większości są bakteriami glebowymi (Madigan MT i in., 2003). Analiza sekwencji wykazała, że białka z grupy 2B zawierają kilka takich samych konserwowanych reszt aminokwasowych w regionie NRL, co białka grupy 1B oraz uczestniczą w naprawie DNA. Białka należące do tej grupy: MT-2B, SA-2B, SC-2B oraz XC-2B ujawniają aktywność naprawczą, jednak specyficzność substratowa tych białek jest dość zróżnicowana, począwszy od białka MT-2B, z wysoką aktywnością w stosunku do uszkodzeń metylowych i niską w stosunku do etenoadduktów, co różni je od białka XC-2B (van den Born E i in., 2009). I Homologi AlkB Sekwencja aminokwasowa białka AlkB wykazuje konserwatyzm od bakterii po człowieka (Mishina Y i in., 2005). Homologi tegoż białka znaleziono m.in. 33

34 u niektórych gatunków Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria i Proteobacteria. Natomiast u Arche i Firmicutes nie udało się ich odnaleźć, co może świadczyć o zbyt odmiennej sekwencji aminokwasowej lub o braku białka o funkcji podobnej do AlkB. Organizmy wielokomórkowe posiadają kilka homologów białka AlkB (ALKBH). U ssaków zidentyfikowano dziewięć takich białek: ALKBH1- ALKBH8 (Drablos F i in., 2004; Aravind L, Koonin EV, 2001; Kurowski MA i in., 2003) oraz związane z otyłością białko FTO, które jest funkcjonalnym białkiem ALKBH (Gerken T i in., 2007). Najlepiej poznane są: habh2, habh3 i FTO. habh2, habh3 oraz FTO wykazują podobną do AlkB E. coli reaktywność i specyficzność substratową. Ponadto, EcAlkB oraz ALKBH3 uczestniczą w naprawie uszkodzeń alkilacyjnych w RNA (Aas PA i in., 2003; Falnes PØ i in., 2004) oraz ujawniają preferencje w stosunku do ssdna, a także dość efektywnie uczestniczą w demetylacji RNA, natomiast habh2 oddziałuje z dsdna i ma niskie powinowactwo do substratów RNA (Aas PA i in., 2003). Przypuszcza się, iż mogą one uczestniczyć w procesach innych niż naprawa DNA czy RNA (Falnes PØ i in., 2009; Sedgwick B i in., 2007). habh2 i habh3 mają różną lokalizację wewnątrzkomórkową. habh2 występuje wyłącznie w jądrze komórkowym i odgrywa rolę w naprawie DNA w pobliżu widełek replikacyjnych. Z kolei habh3 występuje zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie (Duncan T i in., 2002; Aas PA i in., 2003). Białko habh2 ma ogromne znaczenie w obronie przeciwko toksycznym uszkodzeniom alkilacyjnym DNA (Ringvoll J i in., 2006). Rolą ssaczego białka habh3, podobnie jak AlkB, może być naprawa RNA lub usuwanie pewnych naturalnych metylacji w różnego rodzaju RNA (Duncan T i in., 2002; Aas PA i in., 2003; Ougland R i in., 2004). Jądrowe białko FTO uczestniczy w naprawie 3-meT w ssdna. Zróżnicowane właściwości ssaczych homologów AlkB sugerują, że mogą one pełnić różne funkcje, a naprawa DNA może być jednym z kilku procesów, takich jak: naprawa RNA, metylacja i demetylacja RNA oraz demetylacja białek (Sundheim O i in., 2008). Wszystkie zidentyfikowane homologi mają trzy motywy powtarzające się w sekwencjach aminokwasowych LHXD, X, RXXXXXR. Odpowiadają one za formowanie centrum aktywnego enzymu i miejsc, z którymi oddziałuje Fe 2+ 34

35 i α-ketoglutaran (α-kg) (Mishina Y i in., 2005). Sekwencja AlkB ma postać H 131 XD 133 H 187, gdzie grupy His i Asp wiążą żelazo, a dodatkowo Asp oddziałuje z α-kg. Większość bakterii zawiera tylko jedno białko AlkB, ale niektóre gatunki, np. Streptomyces, posiadają więcej tego typu białek (Falnes PØ, Rognes T, 2003). Dlaczego Streptomyces coelicolor? W Zakładzie Biologii Molekularnej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie podjęto badania nad homologami AlkB ze szczepu Streptomyces coelicolor we współpracy z grupą badawczą kierowaną przez prof. P.Ø. Falnesa (University of Oslo) w ramach grantu The AlkB protein and its eukaryotic homologues the role in DNA repair and the possible role in cancer etiology and target in cancer therapy. Szczep ten jest interesującym obiektem ze względu na obecność przynajmniej dwóch stwierdzonych homologów białka EcAlkB. Stereptomyces coelicolor reprezentuje grupę bakterii zwaną promieniowcami (Actinomycetales). Promieniowce nie wytwarzają jądra komórkowego. Wykazują podobieństwo do bakterii właściwych składem ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej, jak również budową organelli komórkowych (Różalski A, 1998). Naturalnym środowiskiem ich życia jest gleba, rozkładająca się masa roślinna, wilgotne stogi siana, torfowiska, sterty odpadów organicznych, rzadziej zbiorniki wodne. Są przeważnie tlenowcami i chemoorganotrofami i należą do drobnoustrojów Gram-dodatnich. Ich optymalna temperatura wzrostu mieści się w granicach 25-30ºC (zakres 15-37ºC), a optymalne ph jest bliskie 7 (zakres 5-9). Tworzą pseudogrzybnie - powietrzne, powierzchniowe (podstawowe) i wgłębne obserwacja rozgałęziania których pozwala odróżnić bakterie od grzybów. Rozmnażają się przez podział, fragmentację pseudogrzybni oraz segmentację. U Streptomyces występują nitki konidioforowe, których podział prowadzi do powstania spor. Trzon kolonii właściwej tworzy pseudogrzybnia podstawowa, która składa się z silnie splecionych ze sobą strzępek. Pseudogrzybnię powietrzną stanowią strzępki uformowane w delikatną masę (zdjęcie). Na końcach tych nici powstają wyrostki sporonośne (mycelia), na których wytwarzane są spory (Różalski A, 1998). 35

36 Zdjęcie 1. Kolonie Stereptomyces coelicolor Źródło: molmicro/strept.html Stereptomyces coelicolor jest pierwszym organizmem tej glebo-zależnej grupy bakterii, którego genom (jego sekwencja) został całkowicie poznany. Składa się on z par zasad i najprawdopodobniej zawiera genów, w skład których wchodzi ponad 20 klasterów kodujących metabolity wtórne (Bentley SD i in., 2002). Wśród nich znajdują się substancje o różnorodnej aktywności biologicznej, np. zaangażowane w reakcje na bodźce zewnętrzne. Większość poznanych genów tego drobnoustroju jest podobna do opisanych wcześniej genów innych bakterii oraz genów regulatorowych. Pośród organizmów bakteryjnych unikalne i niezwykłe są geny odpowiedzialne za różnicowanie faz rozwoju szczepu Streptomyces (Bentley SD i in., 2002). Mikroorganizmy te odpowiedzialne są za biosyntezę antybiotyków stosowanych w medycynie i weterynarii. Spośród idiolitów produkowanych przez Streptomyces coelicolor na szczególną uwagę zasługują: aktynorodyna, metylenomycyna, undecylodigiosyna, przeciwgrzybowy antybiotyk polienowy (pochodna amfoterycyny B) oraz CDA (calcium-dependent peptide antibiotic). Związki te mogą 36

37 być wytwarzane przez kolonie S. coelicolor w różnych ilościach w zależności od zmieniających się warunków otoczenia (źródło takie samo jak zdjęcie). Szczepy Streptomyces wydzielają do środowiska tzw. egzopigmenty zmieniające barwę otoczenia. Większość wytwarza również endopigmenty, zabarwiające komórkę i kolonie (Różalski A, 1998). I Znaczenie badań nad białkami AlkB Bakteryjne białko AlkB posiada szerokie spektrum specyficzności substratowej i może brać udział w naprawie różnego typu adduktów zasad zarówno DNA, jak i RNA (Aas PA i in., 2003; Ougland R i in., 2004). Fakt ten sprawia, że białko to jest uniwersalnym komponentem systemów naprawy, które podczas stresu, zarówno alkilacyjnego, jak i oksydacyjnego, jest odpowiedzialne za utrzymanie wierności replikacji, transkrypcji i translacji w komórce. Tak ważna rola białka AlkB skłoniła wielu naukowców do wnikliwszych badań związanych z mechanizmem naprawy oraz warunkami, jakie muszą zaistnieć, by doszło do wydajnej rewersji uszkodzonej zasady. AlkB preferuje łączenie się z fragmentem cząsteczki DNA na odcinkach, gdzie tworzy ono formę jednoniciową. Wynika to faktu, że pojedyncza nić DNA jest znacznie bardziej elastyczna i dzięki temu dopasowuje się do narzuconej przez białko formy, czyli zagłębienia w strukturze proteiny, do której wsuwa się DNA. Problem z badaniami białek podobnych do AlkB polega na tym, że wiążą one docelową cząsteczkę bardzo słabo, przez co trudno jest obserwować ich strukturę w stanie odpowiadającym wykonywaniu swojego zadania. Z tego powodu przeprowadzono specjalny proces, w którym zmuszono DNA i AlkB do połączenia się ze sobą silnymi wiązaniami chemicznymi, przez co ustabilizowano ich wzajemne położenie. Połączone ze sobą cząsteczki poddano analizie krystalograficznej, tzn. określono dokładnie rozkład przestrzenny atomów wewnątrz cząsteczek. Udało się dzięki temu zdefiniować tzw. miejsca aktywne w strukturze AlkB, których zablokowanie powinno znacząco obniżyć aktywność proteiny. Białko AlkB uczestniczy w naprawie uszkodzeń, które są preferencyjnie generowane w ssdna. Enzym ten kontroluje materiał genetyczny podczas replikacji i transkrypcji (Begley TJ, Samson LD, 2003). Naprawia również 1-meA i 3-meC w RNA (Aravind L, Koonin EV, 2001), które prowadzą do śmierci komórek, 37

38 zarówno bakteryjnych, jak i ludzkich (Kataoka H i in., 1983; Chen BJ i in., 1994). Usuwaniu uszkodzeń przez białka AlkB towarzyszy generowanie formaldehydu w mieszaninie reakcyjnej, który może dodatkowo uszkadzać DNA (Lutz WK, 1990), co sugeruje, że podczas naprawy z udziałem białek AlkB mogą powstawać wtórne uszkodzenia. Komórki jednak wykształciły mechanizmy zapobiegające ich powstawaniu lub usuwające takie modyfikacje. Zarówno AlkB, jak i habh2, usuwają tzw. grupy alkilowe, powstające w wyniku reakcji z prostymi związkami organicznymi. Proces dołączania grup alkilowych jest niezwykle groźny dla stabilności genetycznej komórki. Stanowi zagrożenie nie tylko dla prawidłowo funkcjonujących komórek, ale także dla komórek nowotworu, które nie potrafią odtworzyć powstających uszkodzeń. Problem pojawia się gdy nowotwór jest wyposażony w skuteczny system naprawy DNA może się on wówczas skutecznie bronić przed chemioterapią. Z tego powodu trwają poszukiwania nad sposobami ograniczenia aktywności systemów naprawczych wewnątrz guza. Mogłoby to znacznie zwiększyć skuteczność leczenia chorób nowotworowych. 38

39 II. Cel pracy Celem pracy było zbadanie specyficzności substratowej homologów AlkB w stosunku do adduktów egzocyklicznych. Wykorzystano tu modyfikujące własności aldehydu chlorooctowego i akroleiny. Naprawa powodowanych przez nie uszkodzeń przebiega w sposób bezpośredni - bez naruszania ciągłości nici DNA. Przedmiotem badań były wyizolowane i oczyszczone białka SC-1A i SC-2B ze szczepu Streptomyces coelicolor oraz XC-1B i XC-2B ze szczepu Xanthomonas campestris, stanowiące homologi EcAlkB. Dzięki przeprowadzonym doświadczeniom wyznaczono optymalne warunki naprawy egzocyklicznych uszkodzeń zasad DNA przez białko SC-1A. 39

40 III. Materiały i metody III.1. Materiały III.1.1. Odczynniki Kwas octowy (CH 3 COOH, AcOH) POCh Octan sodu (NaCOOH) Chempur Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazino-1-etanosulfonowy (HEPES) Sigma Bis-Tris Sigma Ditiotreitol (DTT) Sigma Wodorotlenek sodu (NaOH) Stanlab Kwas solny (HCl) Chempur Trietyloamina (TEA, Et 3 N) Merck Metanol (CH 3 OH, MeOH) Lab-scan 2-oksoglutaran (α-ketoglutaran, αkg) Fluka Sześciouwodniony siarczan amonowo-żelazawy (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O Fluka Aldehyd chlorooctowy (CAA) Fluka Akroleina (ACR) Fluka Odczynniki do elektroforezy Żel rozdzielający (15%): 30% akrylamid - 2,5ml Fluka 1,5M Tris (ph 8.8) 1,3ml 10% SDS 0,05ml miliq H 2 O 1,1ml 10% nadsiarczan amonu (APS) - 0,05ml Bio-Rad N, N, N N - tetrametyletylenodiamina (TEMED) 0,002ml - Fluka Żel zagęszczający (4,5%): 30% akrylamid 0,17ml 1M Tris (ph 6,8) 0,13ml 10% SDS 0,01ml miliq H 2 O 0,68ml 10% nadsiarczan amonu (APS) 0,01ml 40

41 N, N, N N - tetrametyletylenodiamina (TEMED) 0,001ml Marker SigmaMarker Low Range (M.W. 6,500-66,000) Sigma Barwnik Coomasie Brillant Blue G 250 0,2 % Coomasie Brillant Blue G % metanol 10 % kwas octowy Odbarwiacz 25 % metanol 10 % kwas octowy III.1.2. Bufory III Bufory stosowane do oczyszczania białka Bufor sodowo-fosforanowy 160mM ph 7,4 Bufor do wiązania (BB) ph 7,4 Bufor do elucji (EB) ph 7,4 Bufor do przechowywania (ST) ph 7,4 Bufor do elektroforezy SDS-PAGE (ph 8,3) 0,125M Tris/HCl ph 8,3 0,96M glicyna 0,5% SDS Bufor Laemmli ego (ph 6,8) 0,25M Tris/HCl ph 6,8 50% glicerol 25% β-merkaptoetanol 10% SDS 0,05% błękit bromofenolowy Bufor do dializy (ph 7,4) 40mM Tris/HCl ph 7,4 200mM NaCl 10% glicerol 5mM DTT 1mM PMSF 41

42 III Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka 0,5M bufor octanowy w zakresie ph 4,2 5,6 0,5M HEPES w zakresie ph 6,8 7,8 0,5M Bis-Tris w zakresie ph 5,8 7,0 1,5M TEAB ph ok. 7-8 (węglan trietyloaminy) Bufor TE ph 7,8 (10mM Tris-HCl ph 7,8 + 1mM EDTA ph 8,0) Bufor kakodylanowy ph 6,5 (CH 3 ) 2 AsO 2 Na x 3H 2 O (BDH) Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej 1M TEAA (octan trietyloaminy) ph ok. 6,5 30% metanol w H 2 O III.1.3. Pentamery TTATT Metabion, Martinsried, Germany TTCTT Metabion, Martinsried, Germany III.1.4. Enzymy Preparaty oczyszczonych białek EcAlkB, SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B (His-tag) otrzymano w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB PAN wykorzystując plazmid pet28a. Plazmid niosący sklonowany gen alkb z E. coli otrzymano z pracowni prof. Seeberga (Uniwersytet w Oslo), natomiast plazmidy pet28a niosące sklonowane geny białek SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B z pracowni prof. Falnesa (Uniwersytet w Oslo). Plazmidem transformowano szczep E. coli BL21 (DE3). Białko SC-1A zostało oczyszczane z ekstraktu komórkowego poprzez chromatografię powinowactwa (zob 3.9.). Białko SC-2B zostało oczyszczone w Zakładzie Biologii Molekularnej przez dr Jadwigę Nieminuszczy, a XC-1B i XC-2B przez mgr Annę Domańską. III.1.5. Antybiotyki Kanamycyna Sigma 42

43 III.1.6. Pożywki Pożywka LB płynna 0,5 % NaCl 0,5 % ekstrakt drożdżowy 1 % trypton Pożywka LB stała Podłoże LB płynne z dodatkiem 1 % agaru III.1.7. Aparatura III Aparatura do oczyszczania białek Zestaw do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham) Kolumna niklowa HisTrap (Amersham) Spektrofotometr: Cary 3 UBV Visible Spectrophotometer Varian Spektrofotometr ULTROSPEC PLUS 4054 UV/VISIBLE Spectrophotometer LKB BIOCHROM Wytrząsarka Elektroporator: TransPorator Plus - BTX Wirówka J2-21M/E Beckman Wirówka minispin Eppendorf Sonikator Branson Sonifier 250 ph-metr - inolab III Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) firmy Knauer na bazie systemu podwójnego, zapewniającego gradient dwuskładnikowy, obsługiwany przez program EuroChrom Basic Edition (wersja 3.05) i wyposażony w detektor UV. Zarówno analityczny, jak i preparatywny rozdział próbek przeprowadzono na kolumnach: - Waters Nova-Pak C18, 60Å, 4μm, 4,6mm x 250mm, z prędkością przepływu 1 ml/min. - HR C18, 60Å, 6μm, 3,9mm x 300mm, z prędkością przepływu 1,75 ml/min. z użyciem liniowego gradientu 20mM octanu trietyloaminy o ph 6,5 x 30% MeOH w wodzie przez 30 minut i detekcją UV przy długości fali 270nm 43

44 Spektrofotometr: Cary 3 UBV Visible Spectrophotometer Varian Wirówka minispin Eppendorf ph-metr MeterLab III.1.8. Inne materiały kuwety do elektroporacji Bio-Rad kuwety do spektrofotometrii Medlab szyby 14cm x 16cm z przekładkami i grzebieniem 0,4mm bibuła 3mm Whatman folia spożywcza do przykrywania żeli papierki wskaźnikowe MERCK III.2. Metody III.2.1. Sporządzanie buforów Wszystkie bufory zostały wykonane na bazie wody dejonizowanej mq. W celu sporządzenia 400ml buforu wiążącego (BB) zmieszano 50ml buforu sodowo-fosforanowego z 2ml 10mM imidazolu i uzupełniono wodą miliq, stabilizując kwasem solnym ph do wartości 7,4. Bufor do elucji (EB) wykonano mieszając 12,5ml tego samego buforu sodowofosforanowego z 25ml 500mM imidazolu i uzupełniając wodą do 100ml, ph ustabilizowano również do wartości 7,4. Tak przygotowane bufory BB i EB schłodzono. Bufor do przechowywania (ST) uzyskano przez zmieszanie 40mM Tris/HCl, 200mM NaCl, 10% glicerolu i ustabilizowaniu ph do wartości 7,4. Z przygotowanych wcześniej 0,5M buforów: octanowego, HEPES i Bis-Tris sporządzono 0,2M bufory. Do każdego z nich dodano 5mM DTT w objętości 5μl/ml. Przygotowanie 1M octanu trójetyloaminy (TEAA) ph ~ 6,5 I Destylacja TEA: Do kolby (o objętości 500ml) z TEA ~ 300ml wrzucono kilka sit molekularnych ( porcelanek ) i ogrzano do wrzenia. Następnie obniżono temperaturę. Zebrano właściwy produkt TEA oraz przedgon (do ustabilizowania się temperatury niższej niż 90ºC) w objętości około 200ml. Wyłączono transformator i pozostawiono wszystko do wystygnięcia. 44

45 II Schłodzono 1 mol (139,2 ml) destylowanej trójetyloaminy (Et 3 N, TEA), 1 mol (57,5 ml) 17,4M kwasu octowego (AcOH) i 700 ml H 2 O mq. Zlewkę z wodą wstawiono w łaźni lodowej na mieszadło. Dodano TEA, który pływał po powierzchni jak olej. Kontrolowano ph powoli dodając AcOH aż do uzyskania wartości 6,5. Uzupełniono wodą do 1000 ml. Całość przesączono na sączku do HPLC. Do rozdziałów chromatograficznych używano 20mM TEAA. III.2.2. Elektroforeza białkowa Białka obecne we frakcjach zebranych podczas oczyszczania (osad bakterii nieidukowanych IPTG oraz supernatant przed nałożeniem na złoże, a także frakcje zebrane po dializie) zostały rozdzielone elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS-PAGE (warunki denaturujące). Zastosowano metodę według modyfikacji Laemmli ego, czyli w tzw. systemie nieciągłym, gdzie żel składa się z dwóch części górnej, o niższym stężeniu akrylamidu, 4,5% i ph 6,8, która służy do zagęszczenia białek oraz dolnej, zawierającej 15% akrylamid o ph 8,8, w której dochodzi do rozdziału białek w zależności od ich wielkości. Przed nałożeniem na żel do próbek o objętości 5µl dodano 5x stężony bufor Laemmli ego (1,5µl). Elektroforezę prowadzono w buforze do elektroforezy SDS- PAGE (1x) pod napięciem 200 V do momentu wyjścia barwnika z żelu. W celu oceny wielkości białka na żelu rozdziałowi poddano także marker wielkości białek SigmaMarker Low Range w zakresie 6,5-66 kda. Po rozdziale białka barwiono Coomassie Brillant Blue G-250. Po 30 minutach barwnik zlewano, a żel umieszczano w odbarwiaczu, który zmieniano kilkakrotnie, aż do całkowitego odbarwienia się tła. III.2.3. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii III Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pet28a/alkb Dwa eppendorfy zawierające po 100μl kompetentnych komórek bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) rozmrożono na lodzie. Jeden z nich stanowił kontrolę negatywną, do drugiego natomiast dodano 1μl plazmidu pet28a/psc. Tak przygotowaną mieszaninę transformacyjną przenoszono do schłodzonej w lodzie kuwety, którą następnie wstawiano do elektroporatora i poddawano działaniu 45

46 impulsu elektrycznego o napięciu 2,5 kv/cm. Następnie do mieszaniny transformacyjnej dodawano 1ml LB i inkubowano przez 1 godz. w 37ºC w celu wyrażenia genu oporności na kanamycynę. Mieszaninę bakteryjną po transformacji wysiano na płytki ze stałym podłożem LB zawierającym kanamycynę o końcowym stężeniu 50 μg/ml, inkubowano przez noc w temperaturze 37ºC, a następnie sprawdzano na płytkach obecność transformantów jak również brak wzrostu na kontroli negatywnej. III Ekspresja białka SC-1A w szczepie E. coli BL21 (DE3) W celu wyrażenia SC-1A pojedynczą kolonią szczepu E. coli BL21 (DE3) pet28a- SC-1A, niosącego plazmid kodujący białko AlkB pet28a-sc-1a zaszczepiano 100ml płynnej pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml). Bakterie hodowano w 37ºC z wytrząsaniem 200 rpm przez noc. Po tym czasie nastąpiło przeniesienie hodowli do świeżej pożywki (3 x 1 litr): do każdej kolby zawierającej 1 litr płynnej pożywki LB z kanamycyną dodano 20 ml hodowli nocnej, a zawartości kolb połączono. Całość wstawiono do 37ºC z wytrząsaniem na ok. 2,5 godziny do momentu osiągnięcia gęstości OD 600 =0,6. Z zawiesiny bakterii pobrano 1 ml co stanowiło kontrolę nieindukowaną. Pozostałą część chłodzono w 16ºC w chłodni, a następnie w celu zaindukowania ekspresji białka dodano izopropylo-βtiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,1mM. Po indukcji bakterie hodowano przez 16 godzin w 16ºC z wytrząsaniem 150 rpm. Po tym czasie hodowle wirowano (6000 rpm w 4ºC przez 15 min), supernatant odrzucono, a osady zamrożono w -20ºC. III Dysrupcja komórek Do osadu komórek bakteryjnych, w którym uzyskano nadekspresję rekombinowanego białka SC-1A, dodano β-merkaptoetanol (70μl/100ml) i PMSF (1ml/100ml). Całość następnie zawieszono w 60 ml buforu wiążącego ph 7,4 (20mM bufor fosforanowy, 0,5M NaCl, 10mM imidazol). Tak przygotowaną zawiesinę przeniesiono do falkonów i umieszczono w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia, a potem rozmrożono zimną, bieżącą wodą. W dalszej części (po przeniesieniu zawartości falkonów do dwóch zlewek i umieszczeniu w łaźni lodowej) komórki sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą ultradźwięków o energii 250 W, przy użyciu sonikatora Branson Sonifier 250. Po sonikacji próbki 46

47 zwirowano z prędkością x g/10 min w 4ºC (ultrawirówka Beckman J2-21M/E), natomiast supernatant zebrano i przefiltrowano przez filtr celulozowonitrowy 0,2μm (Milipore), a osad odrzucono. III.2.2. Oczyszczanie białka SC-1A Plazmid bakteryjny psc kodujący białko SC-1A (homolog AlkB) otrzymano od prof. Seeberga z Uniwersytetu w Oslo. Plazmid pet28a/sc zawierał wklonowaną sekwencję cdna kodującą białko SC-1A. Wszystkie etapy oczyszczania białka przebiegały w temperaturze 4ºC. Supernatant nakładano na kolumny ze złożem niklowym HisTrap (Amersham) z wykorzystaniem urządzenia Äcta Prime. Następnie białko eluowano w buforze elucyjnym gradientem stężenia imidazolu od 10mM do 0,5M. Zebrane frakcje zachowano do dalszej analizy, zaś frakcje, zawierające SC-1A zostały poddane dializie do buforu do przechowywania 2xST (storage buffer) ph 7,4 (40mM Tris- HCl, 200mM NaCl, 10% glicerol). Po dializie dodano glicerol do końcowego stężenia 50%. III.2.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford Wykonano trzy powtórzenia każdego pomiaru, a ostateczny wynik stanowił średnią arytmetyczną wszystkich wyników dla danej frakcji. Do pomiaru pobierano 5μl każdej z analizowanych frakcji, rozcieńczano w kuwetach zawierających po 795μl sterylnej wody miliq, dodawano 200μl odczynnika Bradford, mieszano i odstawiano na 10 minut w ciemności. Po tym czasie mierzono absorbancję roztworów przy długości fali 595 nm względem kontroli, którą stanowiła mieszania 800μl wody i 200μl odczynnika Bradford. Stężenie białka w poszczególnych frakcjach określano na podstawie krzywej wzorcowej. Oczyszczone białka przechowywano w temperaturze -80ºC. III.2.4. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka III Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT i TT(εC)TT w reakcji pentameru TTCTT z aldehydem chlorooctowym (CAA) Do 1,5M buforu TEAB ph ok. 7-8 w objętości 276,5μl dodano 12,5μl pentameru TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (555nmoli) oraz 29,75μl (180μmol) 45% roztworu aldehydu chlorooctowego (CAA). Całość wymieszano i inkubowano w 37 C przez 47

48 2,5 h. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną, zawierającą nieprzereagowany TTCTT oraz TT(HEC)TT i TT(εC)TT, oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. Zebrane frakcje zawierające TT(HEC)TT poddano pomiarowi absorbancji w celu określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano 1nmol substancji). Do frakcji zawierającej czysty TT(HEC)TT dodano 1M bufor kakodylanowy ph 6,5, zliofilizowano, następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500pmoli/μl i przechowywano w temp. - 20ºC. Natomiast frakcje zawierające mieszaninę TT(HEC)TT i TT(εC)TT poddano procesowi dehydratacji przez ogrzewanie 72 godz. w 37ºC w ph 6,5. III Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksypropanocytozynę TT(HPC)TT w reakcji pentameru TTCTT z akroleiną (ACR) Do 1M buforu octanowego (ph 4,5) w objętości 214μl dodano 5μl pentameru TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (222nmoli) oraz 39μl (1nmol) akroleiny (ACR). Całość inkubowano w 37 C przez 4 h. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. Zebrane frakcje zawierające TT(HPC)TT poddano pomiarowi absorbancji w celu określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano 1nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany produkt połączono i zliofilizowano, a w dalszej kolejności rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500pmoli/μl. III Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT w reakcji pentameru TTATT z aldehydem chlorooctowym (CAA) Substrat został zrobiony przez dr Agnieszkę Maciejewską z Zakładu Biologii Molekularnej IBB PAN. Po każdej modyfikacji wykonywano pomiar spektrofotometryczny zebranych w czasie rozdziału frakcji (1min. = 1000μl, bo przepływ 1ml/min.). I tak np. dla modyfikacji TTCTT x CAA maksymalne długości fal sześciu zmierzonych frakcji mieściły się w spodziewanym zakresie od λ max = 258,5 nm do λ max = 270 nm. 48

49 Absorbancja Absorbancja Modyfikacja TTCTT x CAA 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 Frakcja 1 Frakcja 2 Frakcja 3 Frakcja 4 Frakcja 5 Frakcja Długość fali Dla modyfikacji TTCTT x ACR maksymalne długości fal pięciu zebranych i zmierzonych frakcji zawierały się w zakresie od λ max = 267,0 do λ max = 267,5 nm. Modyfikacja TTCTT x ACR 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Frakcja 1 Frakcja 2 Frakcja 3 Frakcja 4 Frakcja Długość fali III.2.5. Badanie aktywności białek i wykonanie zależności Analogiczne zależności przeprowadzono z udziałem wszystkich badanych homologów EcAlkB, a więc u występujących u Streptomyces coelicolor białek SC-1A i SC-2B oraz u występujących u Xanthomonas campestris białek XC-1B i XC-2B. W tym celu przygotowano 0,2M bufory: Bis-Tris, HEPES i octanowy w różnych zakresach ph wraz z dodatkiem 1M DTT (5μl/ml). Reakcje prowadzono w zależności od ph buforu, stężenia jonów żelaza i stężenia α-ketoglutaranu. Doświadczenie z udziałem białek XC-1B i XC-2B przeprowadzono w stosunku do każdego z czterech rodzajów uszkodzeń zasad DNA. Aby sprawdzić czy i jak ilość 49

50 białka wpływa na stopień naprawy w reakcjach wykorzystano po 20pm i po 50pm każdego z tych dwóch białek. Objętości wszystkich mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. III Zależność od ph Reakcje startowano przyporządkowanym danemu substratowi buforem o odpowiednim ph. Reakcje z TT(HEC)TT przeprowadzone zostały w zakresie ph od 5,8 do 7,0; reakcje z TT(HPC)TT w ph od 6,8 do 7,8; natomiast z TT(εC)TT i TT(εA)TT w warunkach od 4,2 do 5,6. Skład i ilość pozostałych komponentów reakcji były identyczne. α-ketoglutaran i jony żelaza (II) w postaci (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O dodawano tuż przed reakcją ze względu na ich nietrwałość. Stężenia jonów Fe(II) i αkg wynosiły odpowiednio: dla TT(εA)TT i dla TT(εC)TT 3mM i 0,5mM; dla TT(HEC)TT 0,5mM i 0,5mM; dla TT(HPC)TT 0,05mM i 0,1mM. TT(HEC)TT Reakcje prowadzono w buforze Bis-Tris o pięciu wartościach ph: 5,8; 6,0; 6,2; 6,6 i 7,0. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu i świeżo przygotowanego żelaza (II) wynosiły po 0,5mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliq, substrat TT(HEC)TT (500pm) oraz białko SC-1A (20pm). Analogiczną zależność wykonano również z udziałem białka SC-2B. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(HPC)TT Reakcje prowadzono w buforze HEPES o pięciu wartościach ph: 6,8; 7,2; 7,4; 7,6 i 7,8. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu wynosiły 0,1mM, natomiast stężenia świeżo przygotowanego Fe (II) 0,05mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliq, substrat TT(HPC)TT (500pm) oraz białko SC-1A (50pm). Analogiczna zależność została przeprowadzona z udziałem białka SC-2B, 50

51 z tym że użyto go w ilości 20pm. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch różnych ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm na reakcję. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(εC)TT i TT(εA)TT Reakcje prowadzono w buforze octanowym o pięciu wartościach ph: 4,2; 4,6; 5,0; 5,4 i 5,6. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu wynosiły 0,5mM, natomiast stężenia świeżo przygotowanego żelaza (II) 3mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliq, substrat TT(εC)TT (500pm) oraz białko SC-1A (100pm). Białka SC-2B użyto w ilości 50pm. Dla substratu TT(εA)TT seria reakcji miała analogiczny skład i przebieg. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm na reakcję. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. III Zależność od stężenia jonów Fe(II) Szereg rozcieńczeń jonów żelaza (II) w postaci (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 6H 2 O przygotowywano z wyjściowego 100mM roztworu w celu porównania uzyskanych wyników i zminimalizowania błędu pipetowania. Pozostałe składniki były identyczne z używanymi wcześniej. TT(HEC)TT Dla białka SC-1A reakcje przeprowadzono w dwóch buforach: octanowym (ph 5,4) i Bis-Tris (ph 5,8; 6,2). Stężenia żelaza w każdej reakcji wynosiły odpowiednio 0,1mM, 0,5mM, 1mM i 3mM, przy 20pm białka. Gdy rezultat okazał się niezadowalający wówczas zależność tę przeprowadzono w buforze Bis-Tris (ph 5,8), zwiększając ilość białka SC-1A do 50pm. Pozostałe składniki stanowiły: 51

52 α-ketoglutaran (50μM), woda miliq i substrat TT(HEC)TT (500pm). W przypadku zaś białka SC-2B stężenia jonów żelaza (II) w poszczególnych reakcjach wynosiły: dla TT(HEC)TT 0,1; 0,25; 0,5; 1 i 2mM, stężenie α-ketoglutaranu we wszystkich reakcjach było równe 100μM, ilość użytego białka była także wynosiła 20pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(HPC)TT Podczas badania naprawy THPC z użyciem białka SC-1A połączono dwie zależności: od ph i stężenia Fe. Zastosowano bufor HEPES w następujących zakresach ph: 6,8; 7,4 i 7,6. Stężenie αkg było równe 100μM w każdej reakcji, natomiast stężenia żelaza wynosiły odpowiednio 10μM, 50μM, 100μM, 250 μm, 500μM i 750μM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat TT(HPC)TT (500pm) i enzym (100pm). Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(εA)TT Reakcje naprawy TεA przez białko SC-1A przeprowadzono w buforze octanowym o ph 5,0. Użyte stężenie αkg było równe 50μM, natomiast stężenia Fe (II) wynosiły 0,5mM, 1mM, 2mM, 3mM, 5mM i 7mM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat TT(εA)TT (500pm) i enzym (100pm). Dodanie enzymu stanowiło moment rozpoczęcia reakcji. Zależność od żelaza w przypadku białka SC-1B wykonano stosując następujące stężenia Fe (II): 0,5; 1; 2; 3 i 5mM. Stężenie αkg było równe 100μM i użyto 50pm białka. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 52

53 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(εC)TT Reakcje naprawy TT(εC)TT wykonane zostały dla białek: SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B. W przypadku SC-2B użyte stężenia jonów żelaza (II) w poszczególnych reakcjach wynosiły: 0,5; 1; 2; 3 i 5mM, stężenie αkg było równe 100μM, natomiast białka użyto 50pm. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. III Zależność od stężenia αkg Dla trzech substratów (TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT) przeprowadzona została niniejsza zależność w optymalnych pozostałych warunkach reakcji (oddzielnych dla każdego substratu), a więc dla THEC bufor Bis-Tris ph5,8, Fe(II) 0,5mM; dla THPC bufor HEPES ph 6,8 i 7,4 (celem ostatecznego rozstrzygnięcia optymalnego ph), Fe(II) 0,05mM oraz dla TεA bufor octanowy ph 5,0, Fe(II) 3mM. Stężenia α-ketoglutaranu w szeregu reakcji dla każdego z uszkodzeń wynosiły 0μM, 10μM, 25μM, 50μM, 100μM i 250μM. Pozostałe składniki dla poszczególnych mieszanin reakcyjnych były takie same: woda, substrat i białko SC-1A. Każdego z substratów zastosowano w ilości 500 pm na reakcję, natomiast białka SC-1A odpowiednio dla TT(HEC)TT 50 pm oraz dla TT(HPC)TT i TT(εA)TT po 100 pm. Reakcji tych nie przeprowadzono z użyciem białek: SC-2B, XC-1B i XC-2B. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. 53

54 IV. Wyniki IV.1. Oczyszczanie białka SC-1A Plazmid pet28a/psc wtransformowano do komórek elektrokompetentnych szczepu E. coli BL21 (DE3). Jedną z uzyskanych kolonii zaszczepiono w płynnej pożywce LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml). Namnożono hodowlę bakteryjną szczepu Streptomyces coelicolor niosącego plazmid pet28a/psc-1a, nadprodukujący białko SC-1A. Zebrany osad sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą ultradźwięków o energii 250 W przy użyciu sonikatora Branson Sonifier 250. Nałożono na kolumnę niklową HisTrap (Amersham), którą umieszczono w zestawie do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham). Analizę jakościową frakcji zebranych podczas oczyszczania białka SC-1A metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie niklowej HisTrap przeprowadzono poprzez poddanie otrzymanych próbek rozdziałowi elektroforetycznemu w buforze standardowym do SDS-PAGE: kda M ,1 6,5 Zdjęcie 2. Żel przedstawiający rozdział frakcji zebranych podczas oczyszczania białka SC-1A barwionego Coomasie Brilliant Blue G-250 M - Marker masy cząsteczkowej M3913-1VL 2 frakcja 13 SC-1A 3 frakcja 14 SC-1A 54

55 4 frakcja 15 SC-1A 5 osad 6 ekstrakt 7 frakcja 3 wyciek 8 frakcja 8 płukanie 9 frakcja frakcja 17 Otrzymane w wyniku oczyszczania frakcje białka SC-1A charakteryzowały się różną czystością. Dlatego w doświadczeniach wykorzystano najbardziej czystą frakcję 15 (pozycja nr 4 na zdjęciu żelu), posiadającą sekwencję aminokwasową pełnej długości. Białko w tej frakcji migruje na wysokość 25 kda, czyli dokładnie tak, jak miało to miejsce w pracy van den Born E i in., W celu zmierzenia zawartości białka dokonano pomiaru absorbancji przy długości fali λ=595 nm z zastosowaniem odczynnika Bradford. Stężenie białka w poszczególnych frakcjach określono na podstawie krzywej wzorcowej. Uzyskano 2 ml białka SC-1A o gęstości 7 µg/µl (7000 ng/µl, 292,9 pm/µl). IV.2. Modyfikacja pentametrów zwierających cytozynę W pierwszej kolejności uzyskano dwie pochodne pentameru zawierającego cytozynę (TTCTT). Były to pochodne hydroksyetenocytozyny (HEC) i hydroksyporpanocytozyny (HPC), powstałe odpowiednio w reakcjach z aldehydem chlorooctowym (CAA) i akroleiną (ACR). Kolejny etap polegał na oczyszczeniu interesujących produktów za pomocą preparatywnego rozdziału na HPLC, w wyniku którego otrzymano czyste pochodne. Do pochodnej pentameru zawierającej cytozynę zaliczyć można również etenocytozynę (εc), która powstaje w wyniku dehydratacji HEC, a która używana była także jako substrat dla badanych białek. IV.2.1. Uzyskanie pentameru zawierającego hydroksypropanocytozynę TTCTT + ACR TT(HPC)TT (hydroksypropanocytozyna) Po reakcji TTCTT z akroleiną w 1M buforze octanowym o ph 4,6 i 3,5 godz. inkubacji w temperaturze 37 C otrzymano całkowite przekształcenie cytozyny do hydroksypropanocytozyny (HPC). Wydajność reakcji wynosiła 100% (Rysunek 11). 55

56 4,10 1 7, , , , , ,58 3 Absorbance 24, , ,45 3 Absorbance 13, ,78 2 Do monitorowania postępu reakcji oraz czystości otrzymanej pochodnej zastosowano technikę HPLC. Na kolumnę analityczną nałożono 1nmol mieszaniny reakcyjnej. [mau] TC5 x ACR 1nmol Time [min.] Rysunek 11. Rozdział analityczny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną. Pik 13,35 min akroleina; 25,78 min uzyskany produkt, pentamer TT(HPC)TT; 27,45- niezidentyfikowany, uboczny produkt reakcji W celu sprawdzenia uzyskanego produktu dodano 500 pm substratu TTCTT i poddano rozdziałowi na HPLC. [mau] TCxACR reakcja +TC5 po 500pm18-lis Time [min.] Rysunek 12. Kontrola mieszanina reakcyjna wraz z substratem TTCTT. Pik 14,58 min akroleina; 24,47 min substrat TTCTT (TC 5 ); 25,18 min TT(HPC)TT; pozostałe piki stanowią uboczne produkty reakcji 56

57 16, , , , , ,37 11 Absorbance 27, , , , ,33 3 Następnie całość mieszaniny reakcyjnej nałożono na kolumnę preparatywną. [AU] TC5 x ACR calosc ,5 1,0 0,5 0, Time [min.] Rysunek 13. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną. Zebrano jedną frakcję min zawierającą TT(HPC)TT. IV.2.2. Uzyskanie pentamerów zawierających hydroksyetanocytozynę i etenocytozynę TTCTT + CAA TT(HEC)TT/TT(εC)TT (hydroksyetanocytozyna/etenocytozyna) Po potraktowaniu TTCTT aldehydem chlorooctowym w 1,5M buforze TEAB o ph ok. 7-8 przez 3,5 godz. w temperaturze 37 C uzyskano głównie hydroksyetenocytozynę (HEC), natomiast etenocytozyna (εc) jest produktem wtórnym powstającym wskutek spontanicznej dehydratacji HEC. Modyfikacja ta miała na celu wygenerowanie uszkodzeń: etenocytozyny i jej prekursora hydroksyetanocytozyny. Po 3,5 godz. inkubacji uzyskano modyfikację na poziomie 72,3%. 57

58 Absorbance 27, , ,83 2 Przeprowadzono rozdział 1,5 nmola mieszaniny reakcyjnej na kolumnie półpreparatywnej HR. Chromatogram miał następujący obraz: [mau] TCxCAA 1,5nmola 27-sty Time [min.] Rysunek 14. Rozdział reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem chlorooctowym. Pik 24,95 min niezmodyfikowana cytozyna w formie pentameru TTCTT; 25,83 min zmodyfikowana TT(HEC)TT; 27,13 min TT(εC)TT W wyniku reakcji substytucji nukleofilowej aldehydu chlorooctowego z cytozyną powstaje HEC. Półokres jej dehydratacji w temperaturze 37 C i w ph 6,5 wynosi 72 godz. Egzocykliczny mostek hydroksyetanowy po dehydratacji zmienia się w ugrupowanie etenowe. Obie dodatkowe grupy blokują tworzenie prawidłowych wiązań wodorowych, przez co mogą prowadzić do mutacji. 58

59 30,83 7 Absorbance 27, , , , , ,53 4 W tym wypadku również dokonano rozdziału preparatywnego całości próbki: [AU] TCxCAA całość prep 27-sty ,5 1,0 0,5 0, Time [min.] Rysunek 15. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem chlorooctowym. Zebrano frakcje zawierające TT(HEC) i TT(εC)TT. IV.3. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-1A W celu zbadania aktywności naprawczej bakteryjnych homologów EcAlkB przeprowadzono szereg doświadczeń na substratach DNA zawierających cztery rodzaje uszkodzeń: 3,N 4 -α-hpc, 3,N 4 -α-hec, 1,N 6 -εa oraz 3,N 4 -εc. Reakcje prowadzono przez 30 min. wykorzystując różne ilości białek, tzn. 20, 50 i 100 pm. Po inkubacji bakteryjnych homologów EcAlkB z substratami zawierającymi egzocykliczne addukty, konieczne było odróżnienie oligomerów naprawionych od uszkodzonych. W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystano technikę rozdziału substancji wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Przed wykonaniem właściwych doświadczeń sprawdzono czy przechowywanie białka SC-1A ma wpływ na jego aktywność. W tym celu obydwu białek użyto w ilości 100 pm, a wszystkie reakcje prowadzono w 0,5mM stężeniu αkg. Stężenia jonów Fe(II) i ph dobrano odpowiednio do poszczególnych substratów: dla TT(HEC)TT 0,5mM Fe(II), ph 6,0; dla TT(εC)TT 3mM Fe(II), ph 4,6; dla TT(εA)TT 3mM Fe(II), ph 4,6 oraz dla TT(HPC)TT 100mM Fe(II), ph 7,5. 59

60 % naprawy % naprawy Aktywność SC-1A (próba pierwsza) substrat 5 0 THEC TεC TεA THPC substrat (uszkodzenie) Wykres 1. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A Po 3-miesięcznym przechowywaniu białka w -80ºC, a substratów w -20ºC reakcje powtórzono zachowując poprzednie warunki. Aktywność spadła tylko w przypadku TT(εC)TT, wzrosła zaś przy naprawie TT(HPC)TT, przy pozostałych substratach utrzymuje się na w miarę stałym poziomie. Aktywność SC-1A (próba druga) substrat 5 0 THEC TεC TεA THPC substrat (uszkodzenie) Wykres 2. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A trzy miesiące później 60

61 Absorbance 24, ,03 2 % naprawy IV.3.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od ph reakcji TT(εA)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie ph od 4,2 do 5,6. W reakcjach użyto 3mM stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αkg i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano w ph 5,0. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 3. SC-1A - zależność naprawy TεA od ph TεA 5 0 4,2 4,6 5 5,4 5,6 ph Wykres 3. Zależność naprawy TT(εA)TT od ph (białko SC-1A) [mau] SC1 O 5,0 ea Fe 3mM 10-gru Time [min.] Rysunek 16. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT przez białko SC-1A. Pik 24,38 min reprezentuje produkt naprawy: TTATT, pik 25,03 min nienaprawiony TT(εA)TT. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 85,9% TT(εA)TT, po reakcji jest go 56,3% 61

62 Absorbance 24, ,37 2 % naprawy TT(HEC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie ph od 5,8 do 7,0. W reakcjach użyto 0,5mM stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αkg i 20 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano w ph 5,8. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 4. SC-1A - zależność naprawy THEC od ph ,8 6 6,2 6,6 6,8 7 ph THEC Wykres 4. Zależność naprawy TT(HEC)TT od ph (białko SC-1A) [mau] 20 SC1 BT 5,8 HEC Fe 0.5mM 09-gru Time [min.] Rysunek 17. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HEC)TT przez białko SC-1A. Pik 24,40 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 25,37 min nienaprawiony TT(HEC)TT, a ostatni pik to TT(εC)TT. 62

63 % naprawy TT(HPC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie ph od 6,8 do 7,8. W reakcjach użyto 0,05mM steżęnia jonów Fe(II), 0,1mM stężenia αkg i 50 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano w ph 7,4. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 5. SC-1A - zależność naprawy THPC od ph THPC 2 0 6,8 7,2 7,4 7,6 7,8 ph Wykres 5. Zależność naprawy TT(HPC)TT od ph (białko SC-1A) IV.3.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w reakcji TT(εA)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,5mM do 7mM. Reakcje przeprowadzono w ph 5,0, 50μM stężenia αkg, i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 3mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 6. 63

64 % naprawy SC-1A - zależność naprawy TeA od stężenia Fe TεA , stężenie Fe [mm] Wykres 6. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) Rysunek 18. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT przez białko SC-1A. Pik 24,97 min reprezentuje produkt naprawy: TTATT, pik 25,62 min nienaprawiony TT(εA)TT. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 85,9% TT(εA)TT, po reakcji jest 64,9% TT(εA)TT TT(HEC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,05mM do 3mM. Reakcje przeprowadzono w ph 5,8, przy 50μM stężeniu αkg i 50 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 0,5mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 7. 64

65 % naprawy SC-1A - zależność naprawy THEC od stężenia Fe THEC 5 0 0,05 0,1 0, stężenie Fe [mm] Wykres 7. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) Rysunek 19. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HEC)TT przez białko SC-1A. Pik 23,93 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 24,92 min nienaprawiony TT(HEC)TT, a pik 26,32 min TT(εC)TT, powstały z dehydratacji TT(HEC)TT podczas trwania reakcji i rozdziału. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 72,3% TT(εC)TT, po reakcji jest 58,2% TT(εC)TT Wynik ten okazał się być adekwatny do przeprowadzonego wcześniej doświadczenia z użyciem 25pm EcAlkB (Wykres 8). 65

66 % naprawy % naprawy AlkB - naprawa THEC w zależności od stężenia Fe ,05 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 2,5 3 stęż. Fe [mm] THEC ph 5.8 THEC ph 6.0 THEC ph 6.2 THEC ph 6.6 Wykres 8. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB) TT(HPC)TT Postępując tym samym tropem wykonano najpierw zależność naprawy hydroksypropanocytozyny z zastosowaniem białka AlkB E.coli. Reakcje przeprowadzone zostały nie tylko w zależności od stężenia jonów Fe(II) lecz także w zależności od ph. W tym przypadku ilość EcAlkB wynosiła również 25pm. Wyniki doświadczenia przedstawiono na wykresie 9. AlkB - zależność naprawy THPC od ph i od stężenia Fe stężenie Fe [um] Wykres 9. Zależność naprawy TT(HPC)TT od ph i od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB) 66

67 % naprawy Analogiczne wykonanie i przeprowadzenie reakcji naprawy THPC przez białko SC-1A pozwoliło uzyskać porównywalne wyniki (Wykres 10). Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 10μM do 750μM. Reakcje przeprowadzono w następujących zakresach ph: 6,8; 7,4 i 7,6, 100μM stężenia αkg, i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 50μM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 10. SC-1A - zależność naprawy THPC od ph i stężenia Fe ph 6.8 ph 7.4 ph stężenie Fe [um] Wykres 10. Zależność naprawy TT(HPC)TT od ph i od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) IV.3.3. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia αkg w reakcji TT(εA)TT, TT(HEC)TT, TT(HPC)TT W celu naprawy TεA, THEC, THPC reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń αkg od 0 μm do 250μM. Pozostałe warunki reakcji dla substratów: TT(εA)TT - ph 5,0, 3mM Fe(II) i 100pm SC-1A; TT(HEC)TT - ph5,8, 0,5mM Fe(II) i 50pm SC-1A; TT(HPC)TT - ph 6,8 i 7,4 (celem rozstrzygnięcia optymalnego ph), 0,05mM Fe (II) i 100pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 10μM stężeniu αkg. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie

68 % naprawy SC-1A - zależność naprawy THEC THPC TeA od stężenia akg stężenie akg [um] THEC ph 5.8 THPC ph 6.8 THPC ph 7.4 TeA ph 5.0 Wykres 11. Zależność naprawy TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT od stężenia α- ketoglutaranu (białko SC-1A) Rysunek 20. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HPC)TT przez białko SC-1A. Pik 24,28 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 26,00 min - nienaprawiony TT(HPC)TT. IV.4. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-2B Białko SC-2B jest drugim z homologów EcAlkB występującym u Streptomyces coelicolor. Przeprowadzono analizę aktywności tego białka w naprawie TT(HEC)TT, TT(HPC)TT, TT(εC)TT i TT(εA)TT. 68