D r n. m e d. A l d o n a S i e n n i c k a

Transkrypt

1 AUTOREFERAT Z a ł ą c z n i k 2 a D r n. m e d. A l d o n a S i e n n i c k a Zakład Analityki Medycznej Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie Szczecin 2018

2 1. Imię i Nazwisko: Aldona Siennicka 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. dyplom magistra biologii, Uniwersytet Szczeciński w Szczecinie, Wydział Nauk Przyrodniczych, r., na podstawie pracy magisterskiej, pt.: Amplifikacja DNA Borrelia burgdorferi izolowanego z kleszczy z terenu rekreacyjnego Szczecina, promotor: prof. dr hab. Bogumiła Skotarczak dyplom doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej, Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie, Wydział Lekarski, r., na podstawie rozprawy doktorskiej, pt.: Wpływ krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na stymulowaną zmodyfikowanymi oksydacyjnie LDL ekspresję śródbłonkowych cząstek adhezyjnych, promotor: dr hab. Danuta Zapolska- Downar tytuł zawodowy diagnosty laboratoryjnego, r. dyplom specjalisty w dziedzinie laboratoryjna diagnostyka medyczna, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, r. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: , słuchacz Studium Doktoranckiego, Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Profilaktyki Metabolicznych Chorób Cywilizacyjnych Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Profilaktyki Metabolicznych Chorób Cywilizacyjnych Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie (pracownik inżynieryjno-techniczny) Zakład Analityki Medycznej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie (asystent) Od Zakład Analityki Medycznej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, Wydział Lekarsko- Biotechnologiczny i Medycyny Laboratoryjnej (adiunkt) - 2 -

3 4. Wskazanie osiągnięcia naukowego wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): A) Tytuł osiągnięcia naukowego Cykl publikacji powiązanych tematycznie pod tytułem: Aktywność procesów krzepnięcia/fibrynolizy i procesów proteolitycznych w cienkich i grubych zakrzepach przyściennych oraz przylegających ścianach tętniaka aorty brzusznej; potencjalna rola homocysteiny. B) Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego: Oświadczenia wszystkich współautorów znajdują się w załączniku 6. Lp. autorzy publikacji i jej tytuł czasopismo, rok, vol., strony IF pkt wg MNiSW 1. Siennicka A, Drożdżyńska M, Chełstowski K, Cnotliwy M, Jastrzębska M. Haemostatic factors and intraluminal thrombus thickness in abdominal aortic aneurysm. Is secondary fibrinolysis relevant? J. Physiol. Pharmacol. 2013: 64(3); Wkład własny w publikację: 80% Koncepcja i plan badań, gromadzenie materiału biologicznego do badań, przeprowadzenie oznaczeń, opracowanie i interpretacja wyników badań, napisanie i wysłanie manuskryptu do czasopisma oraz jego korekta na podstawie uwag recenzentów 2. Siennicka A, Żuchowski M, Kaczmarczyk M, Cnotliwy M, Clark JS, Jastrzębska M. Spatial differences of MMP-2 and MMP-9 within abdominal aortic aneurysm wall and intraluminal thrombus J. Physiol. Pharmacol. 2016: 67(6); Wkład własny w publikację: 85% Koncepcja i plan badań, gromadzenie materiału biologicznego do badań, przeprowadzenie procesu homogenizacji, dobór metod badań, wykonanie oznaczeń analitycznych, opracowanie i interpretacja wyników badań, napisanie i wysłanie manuskryptu do czasopisma oraz jego korekta na podstawie uwag recenzentów 3. Siennicka A, Żuchowski M, Kaczmarczyk M, Cnotliwy M, Clark JS, Jastrzębska M. Tissue factor levels and the fibrinolytic system in thin and thick intraluminal thrombus and underlying walls of abdominal aortic aneurysms. Wkład własny w publikację: 85% J. Vasc. Surg. 2018: 68; 30S-37S

4 Koncepcja i plan badań, gromadzenie materiału biologicznego do badań, przeprowadzenie procesu homogenizacji, dobór metod badań, wykonanie oznaczeń analitycznych, opracowanie i interpretacja wyników badań, napisanie i wysłanie manuskryptu do czasopisma oraz jego korekta na podstawie uwag recenzentów 4. Siennicka A, Zuchowski M, Chełstowski K, Cnotliwy M, Clark JS, Jastrzębska M. Homocysteine-enhanced proteolytic and fibrinolytic processes in thin intraluminal thrombus and adjacent wall of abdominal aortic aneurysm: study in vitro. Biomed Res. Int. 2018: vol. 2018, article ID , 10 p Wkład własny w publikację: 85% Koncepcja i plan badań, gromadzenie materiału biologicznego do badań, zaprojektowanie i przeprowadzenie eksperymentu, przeprowadzenie procesu homogenizacji i wykonanie oznaczeń analitycznych, opracowanie i interpretacja wyników badań, napisanie i wysłanie manuskryptu do czasopisma oraz jego korekta na podstawie uwag recenzentów Suma IF i liczba punktów MNiSW łącznie C) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Wstęp Tętniaki aorty brzusznej (abdominal aortic aneurysm, AAA) stanowią poważny problem medyczny, ze względu na ryzyko wystąpienia powikłań, z których najpoważniejszym jest pęknięcie, będące bezpośrednim zagrożeniem życia pacjenta. Patogeneza AAA to złożony proces, w którym uczestniczy wiele biochemicznych, genetycznych i środowiskowych czynników [1]. Jednym z kluczowych etapów w procesie formowania się AAA jest degradacja zewnątrzkomórkowej macierzy na skutek działania wyspecjalizowanych enzymów proteolitycznych, m.in.: elastazy neutrofilowej, tkankowego aktywatora plazminogenu (t-pa), aktywatora plazminogenu typu urokinazy (u-pa) oraz plazminy [2]. Istotną rolę w degradacji zewnątrzkomórkowej macierzy w AAA odgrywają również metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej (matrix metalloproteinase, MMP) głównie MMP-9 i MMP-2, wydzielane jako nieaktywne zymogeny, które wymagają aktywacji w przestrzeni pozakomórkowej. Latentną postać MMP aktywują cytokiny, rodniki tlenowe, ale również plazmina, która jest generowana przez tkankowe i urokinazowe aktywatory plazminogenu z nieaktywnego prekursora plazminogenu [3, 4]. Plazmina może także bezpośrednio przyczyniać się do niszczenia macierzy pozakomórkowej aorty. Aktywacja metaloproteinaz przez plazminę jest głównym elementem wiążącym procesy krzepnięcia krwi i fibrynolizy z proteolizą elastyny i kolagenu w ścianie tętniaka aorty - 4 -

5 brzusznej [5]. Nie można pominąć w tym procesie roli czynnika tkankowego (tissue factor,tf), który bierze udział w inicjacji i progresji stanu nadkrzepliwości, generuje duże ilości trombiny, która z kolei może wpływać na poziom t-pa [6]. Wnioskuje się zatem, że miejscowe procesy hemostatyczne i lokalna fibrynoliza, poprzez stymulowanie proteolizy macierzy pozakomórkowej, mogą być jednym z czynników prowadzących do pęknięcia tętniaka. Tętniakom aorty brzusznej towarzyszą na ogół zaburzenia układu hemostazy. Aktywacja płytek krwi i czynników krzepnięcia krwi u chorych z AAA może być ograniczona do miejsca tętniakowego poszerzenia aorty, a może mieć również charakter uogólniony i obejmować krew obwodową. Istnieją doniesienia, że aktywacja krzepnięcia/fibrynolizy w osoczu może się również przekładać na wyższą aktywność prozakrzepową i profibrynolityczną w worku tętniaka [7, 8]. Wnętrze AAA zawiera najczęściej zakrzep przyścienny (intraluminal thrombus, ILT). Powstaje on w wyniku naturalnej reakcji hemostatycznej na uszkodzenie ściany aorty i jest miejscem pierwotnych i wtórnych procesów zapalnych i enzymatycznych, które to procesy mogą aktywować układ krzepnięcia/fibrynolizy, jak również nasilać procesy proteolityczne [9]. Nie ulega wątpliwości, że ITL ma bezpośredni wpływ na ścianę tętniaka. Jednak rola zakrzepu przyściennego w patogenezie AAA nie jest do końca jasna. Sugeruje się, że ILT może być jednym z czynników biomechanicznej protekcji przed pęknięciem ściany tętniaka, ponieważ obecność zakrzepu istotnie zmniejsza i dystrybuuje naprężenia w ścianie aorty. Z drugiej strony ILT może odgrywać rolę destrukcyjną, poprzez wywoływanie miejscowego niedotlenienia ściany tętniaka pod zakrzepem i stymulowanie proteolizy strukturalnych elementów ściany. Ściana tętniaka z przylegającym ILT jest cieńsza, zawiera więcej komórek zapalnych, mniej komórek mięśni gładkich i wykazuje nasiloną degradację macierzy pozakomórkowej w porównaniu ze ścianą AAA bez przylegającego zakrzepu. Zaobserwowano, że w większości przypadków do pęknięcia AAA dochodzi właśnie pod zakrzepem, co może wskazywać na ILT jako na czynnik odgrywający istotną rolę w tym procesie [10]. Ponadto, wyniki badań z ostatnich kilku lat sugerują, że ryzyko pęknięcia tętniaka może zależeć od morfologii wypełniającego go zakrzepu przyściennego. Zakrzep przyścienny ma heterogenną strukturę: można wyróżnić kilka typów/warstw ILT, które różnią się strukturalnie i w trakcie narastania zakrzepu mogą przechodzić z jednego typu w drugi. Od strony światła naczynia zakrzep ma bogatą w krew warstwę, która wykazuje biologiczną aktywność dzięki, m.in., rekrutacji granulocytów obojętnochłonnych, gromadzeniu się płytek - 5 -

6 krwi, tworzeniu fibryny i kumulowaniu plazminogenu i t-pa. Wraz z upływem czasu warstwa luminalna ILT przekształca się w warstwę pośrednią, a ostatecznie po lizie erytrocytów, apoptozie leukocytów i różnych stopniach fibrynolizy, przechodzi w martwy obszar abluminalny od strony ściany AAA. W najstarszych abluminalnych warstwach aktywność enzymatyczna jest zwykle bardzo niska [11, 12]. Zakrzep przyścienny w świetle AAA może mieć różną grubość, od kilku milimetrów do kilku centymetrów, nie tylko pomiędzy pacjentami, ale także w obrębie każdego pojedynczego tętniaka. W worku jednego AAA można obserwować obecność cienkiego ILT ( 10 mm), który pozostaje w bezpośrednim kontakcie ze światłem naczynia i ścianą tętniaka, i gruby ILT ( 25 mm), który może stanowić kombinację odrębnych warstw [13]. Obecność w zakrzepie dużej liczby komórek, takich jak limfocyty T, neutrofile, monocyty/makrofagi, płytki krwi i erytrocyty, które mogą być źródłem proteinaz, przyczynia się do nasilenia procesu zapalnego oraz stymulacji proteolizy elementów strukturalnych ściany naczynia. Sugeruje się, że nasilenie tych procesów jest prawdopodobnie proporcjonalne do grubości ITL, a cienki ILT umożliwia penetrację komórek zapalnych do jednego centymetra w głąb ILT [11]. Co więcej, w cienkim ILT czynniki wytwarzane w zakrzepie lub wychwytywane z krwi znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie ściany, dlatego sugeruje się, że mogą mieć na nią większy wpływ. W związku z tym próba wyjaśnienia wpływu ILT na progresję AAA wymaga uwzględnienia specyficznej dla grubości zakrzepu zmienności. Do tej pory nie wyjaśniono, jaki czynnik może być odpowiedzialny za wzmożoną aktywność prozakrzepową i fibrynolityczną w warstwie zakrzepu przyściennego. Ostatnio szczególną uwagę zwraca się na udział w patogenezie AAA czynników o udowodnionych właściwościach antyheparynowych, w tym również na homocysteinę (Hcy) [14]. Wykazano, że podwyższone stężenie Hcy w osoczu ma związek z chorobami sercowo-naczyniowymi; sugeruje się również, że wielokierunkowo wpływa na formowanie się i rozwój AAA [15]. Badania wskazują, że podwyższony poziom Hcy występuje u około 50% chorych z AAA, a tętniaki u pacjentów z hiperhomocysteinemią charakteryzują się większą średnicą w porównaniu z pacjentami z prawidłowym stężeniem homocysteiny w osoczu [16-18]. Homocysteina należy do czynników prozakrzepowych, wywołuje zmiany w ścianach naczyń i generuje zaburzenia przepływu krwi. Ponadto Hcy może stymulować rozwój ITL w tętniaku, wywierając niekorzystny wpływ na śródbłonek poprzez interakcje Hcy ze składnikami hemostazy. Może również potencjalnie wpływać na zaburzenie równowagi pomiędzy krzepnięciem krwi a układem fibrynolitycznym. Z kolei proces krzepnięcia i miejscowa - 6 -

7 fibrynoliza, w przyściennej warstwie zakrzepu, mogą być częścią łańcucha reakcji prowadzących do zniszczenia ściany tętniaka i w rezultacie do jego pęknięcia. Obserwowano, zależne od stężenia Hcy, indukowanie ekspresji TF oraz zmniejszenie dostępności trombomoduliny na komórkach śródbłonka, a także upośledzenie aktywacji białka C, upośledzenie wiązania t-pa z komórkami śródbłonka, aktywację V czynnika krzepnięcia, nasilenie generacji trombiny oraz zmniejszenie aktywności antytrombiny. Sugeruje się, że homocysteina jest odpowiedzialna za degradację elastyny w błonie wewnętrznej, indukuje syntezę elastazy serynowej w komórkach mięśniówki gładkiej ściany tętnicy, w wyniku czego dochodzi do aktywacji metaloproteinaz, co w konsekwencji prowadzi do degradacji macierzy [19, 20]. Naukowcy nie mają jednoznacznego zdania, co do wpływu Hcy na rozwój tętniaka, a wyniki przeprowadzonych do tej pory badań są rozbieżne. Nasuwa się pytanie, czy podwyższony poziom Hcy w osoczu odgrywa rolę w patogenezie AAA, czy też jest tylko prostym markerem uszkodzenia naczyń. Sugeruje się, że Hcy może być czynnikiem dodatkowym, nakładającym się na inne. Dzięki postępowi w technice chirurgicznej oraz w nadzorze okołooperacyjnym poprawiły się wyniki leczenia niepękniętych AAA. Jednak śmiertelność w operacjach pękniętych AAA nadal utrzymuje się na poziomie 40-70%. Od lat za najważniejsze czynniki rokownicze dotyczące ryzyka pęknięcia AAA uważa się średnicę tętniaka oraz tempo jego wzrostu [10, 13]. Dużo wysiłku poświęca się również badaniom, mającym na celu poszukiwanie czynników wskazujących na zwiększone ryzyko pęknięcia, które pozwoliłyby na prognozowanie zachowania się tętniaka oraz dodatkowo umożliwiłyby optymalnie zindywidualizować kryteria kwalifikacyjne do operacji. Sugeruje się, że grubość ITL ma związek z ryzykiem pęknięcia AAA i może stanowić jeden z czynników prognostycznych. Istnieje szereg publikacji, w których pod różnym kątem badano rolę zakrzepu przyściennego w AAA. Jednak w większości z nich brano pod uwagę tylko obecność zakrzepu bądź jego brak, lub porównywano fragmenty ściany tętniaka pokryte zakrzepem z fragmentami ściany kontaktującymi się bezpośrednio z przepływającą krwią. Natomiast niewiele jest opublikowanych doniesień dotyczących zakrzepu przyściennego z uwzględnieniem różnic wynikających z jego grubości w worku tego samego tętniaka. Cel naukowy cyklu prac Wiodącym celem naukowym prezentowanego cyklu publikacji była ocena aktywności procesów krzepnięcia/fibrynolizy oraz procesów proteolitycznych w tkankach tętniaka aorty brzusznej (zakrzep przyścienny i przylegająca ściana naczynia), uwzględniając różnice w - 7 -

8 grubości zakrzepu przyściennego (ILT). Ponadto weryfikowano założenie, że homocysteina może wpływać na układ hemostazy i procesy proteolityczne w warstwie ITL oraz w ścianie tętniaka pod zakrzepem, w sposób zależny od grubości zakrzepu przyściennego. Badania były realizowane w ramach projektu badawczego finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (MNiSW), nr N N Oprócz aspektów poznawczych, wyniki przedstawionych badań mogą mieć również zastosowanie praktyczne, ponieważ wciąż brakuje wiarygodnych markerów umożliwiających prognozowanie pęknięcia AAA. Poznanie czynników mających wpływ na nasilenie procesów krzepnięcia i wtórną aktywację fibrynolizy w obszarze zakrzepu AAA, co w konsekwencji może prowadzić do pęknięcia tętniaka, mogłoby potencjalnie przyśpieszyć wprowadzenie nowych terapii zapobiegających lub opóźniających ten proces. Dodatkowo pozwoliłoby na opracowanie skuteczniejszych metod prognozowania ryzyka pęknięcia, tak aby pomogły one w przyszłości optymalnie zindywidualizować kryteria kwalifikacyjne do operacji. Hiperhomocysteinemia jest czynnikiem ryzyka, którego modyfikację umożliwia właściwa dieta, podaż witamin z grupy B oraz kwasu foliowego. Wprowadzenie takiej diety może być elementem postępowania zachowawczego, które stanowić będzie potencjalną ochronę przed pęknięciem AAA. W prezentowanych pracach dokonano: a. oceny stanu prozakrzepowego we krwi obwodowej w grupie pacjentów ze stwierdzonym tętniakiem aorty brzusznej, zakwalifikowanych do operacji planowej i grupie kontrolnej, którą stanowili pacjenci, u których w badaniu USG lub tomografii komputerowej (CT) nie stwierdzono obecności AAA, b. porównania stężenia/aktywności wybranych czynników krzepnięcia/fibrynolizy oraz czynników proteolitycznych w pobranych od pacjentów fragmentach tkanek zakrzepów przyściennych, z najgrubszej i najcieńszej części zakrzepu tego samego tętniaka oraz fragmentów tkanek przylegającej do zakrzepów ściany tętniaka od strony zakrzepu cienkiego i grubego, c. oceny wpływu różnych stężeń homocysteiny na stężenie/aktywności wybranych czynników proteolitycznych oraz czynników krzepnięcia/fibrynolizy we fragmentach tkanek zakrzepu cienkiego i grubego tętniaka aorty brzusznej oraz ściany tętniaka od strony zakrzepu cienkiego i grubego. Omówienie wyników prac oraz ich ewentualnego wykorzystania - 8 -

9 Wymienia się przynajmniej kilkanaście czynników (m.in. czynniki krzepnięcia i fibrynolizy, enzymy proteolityczne, cytokiny zapalne, przeciwciała i aktywatory), których stężenie/aktywność wzrasta podczas procesu formowania się i wzrostu średnicy tętniaka aorty brzusznej i które mogą wywierać wpływ na różne etapy rozwoju AAA [2, 4]. U pacjentów z AAA obserwuje się stan aktywacji zarówno procesów krzepnięcia, jak i fibrynolizy. Z kolei formowanie i wzrost zakrzepu przyściennego wydaje się być aktywnym, dynamicznym procesem, w którym mają swój udział różne czynniki hemodynamiczne i biochemiczne. Ciągła przebudowa ILT może prowadzić do podwyższonego stężenia fibrynogenu, kompleksów trombina-antytrombina, fragmentów protrombiny 1+2 (F 1+2) oraz D-dimerów we krwi pacjentów z AAA [21]. Celem pierwszej pracy (Siennicka i wsp., 2013) było porównanie stężenia wybranych krążących markerów fibrynolizy, tj. t-pa, inhibitora aktywatora plazminogenu (PAI-1), fibrynogenu (Fb) i D-dimerów oraz markerów krzepnięcia, tj. F1 + 2 oraz tromboksanu B2 (TXB2), pomiędzy grupą pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej i grupą pacjentów kontrolnych. Dodatkowo przeprowadzono analizę korelacji między oznaczonymi parametrami i maksymalną średnicą tętniaka oraz grubością zakrzepu wewnątrz światła AAA. Stężenie wybranych parametrów zmierzono we krwi 36 pacjentów z AAA, u których w badaniu USG lub tomografii komputerowej (CT), wykonywanym przed operacją, wykazano obecność zakrzepu przyściennego, który w najszerszym miejscu miał minimum 25 mm i nie więcej niż 10 mm w najwęższym miejscu oraz we krwi 30 pacjentów z grupy kontrolnej, u których w badaniu USG lub CT nie stwierdzono obecności AAA. Wykazano, że wśród ocenianych czynników hemostazy stężenie t-pa (5.2±2.5 vs 4.2±1.1, p=0,039) oraz D-dimerów (2673±1824 vs 1125±895, p=0,002) było istotnie wyższe u pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej, w porównaniu z osobami z grupy kontrolnej. Co ciekawe, już wcześniej obserwowano wyższe stężenia D-dimerów w grupie pacjentów z AAA (niepęknięte tętniaki), w porównaniu z grupą pacjentów bez AAA, jednak nie obserwowano różnic w stężeniu t-pa [21, 22]. Uzyskane wyniki wskazują, że wtórna aktywacja fibrynolizy może odgrywać ważną rolę w patogenezie tętniaka aorty brzusznej. Wyższe stężenie D- dimerów, kluczowego markera wtórnej aktywacji fibrynolizy oraz wyższe stężenie t-pa, wskazują przede wszystkim na proces nasilonej degradacji fibryny u pacjentów z AAA i potwierdzają założenie, że układ fibrynolityczny odgrywa istotną rolę w patogenezie AAA. W prezentowanej pracy uzyskano również silną dodatnią korelację pomiędzy grubością zakrzepu wewnątrz światła tętniaka a maksymalną średnicą tętniaka (r=0.69, p<0.0001), która może - 9 -

10 wskazywać na ważną rolę ILT w progresji tętniaka. Dodatkowo obserwowano ujemną korelację między stężeniem t-pa, który przekształca plazminogen w plazminę i grubością ILT (r=-0.53, p=0,001), a także średnicą tętniaka (r=-0.38, p=0,023). Obserwacja ujemnego związku między stężeniem t-pa w osoczu a grubością ILT może oznaczać niewydolność aktywności fibrynolitycznej w zewnętrznej warstwie ILT, prowadzącą do zaburzenia równowagi krzepnięcia/fibrynolizy i przyspieszonego tworzenia się zakrzepu wewnątrz światła naczynia, a w konsekwencji również progresji AAA. Jest to pierwsza praca, w której wykazano taką korelację. Należy oczywiście wziąć pod uwagę potencjalnie przeciwstawne działanie t-pa i plazminy. Po pierwsze, t-pa, główny aktywator plazminogenu, stanowi ważną składową układu zaangażowanego w niszczenie macierzy pozakomórkowej. Z drugiej strony, zarówno t-pa jak i plazmina pojawiają się w kontekście aktywności fibrynolitycznej. Biorąc udział w procesie wtórnej aktywacji fibrynolizy i przebudowy ILT głównie w obrębie warstwy od strony światła tętniaka, t-pa i plazmina są zdolne do spowolnienia wzrostu zakrzepu przyściennego, który jest ogólnie postrzegany jako wskaźnik progresji tętniaka [5]. Wpływ tej złożonej i kontrastującej aktywności t-pa może być trudny do określenia. Ponadto może być dodatkowo modulowany przez szereg specyficznych dla pacjenta biochemicznych i biomechanicznych czynników, w tym przez różnice w aktywności fibrynolitycznej i proteolitycznej, zarówno w zakrzepie przyściennym jak i w przylegającej ścianie tętniaka. Jak wspomniano wyżej, zaburzony proces krzepnięcia i fibrynolizy jest częstym zjawiskiem u pacjentów z AAA [21, 22]. Jednak obecność czy wysokie stężenie/aktywność wielu czynników hemostatycznych czy proteolitycznych obserwuje się nie tylko w osoczu czy surowicy pacjentów z AAA, ale również w zakrzepie oraz w ścianie tętniaka. Od lat próbuje się określić związek przyczynowy między obecnym w świetle worka tętniaka zakrzepem przyściennym, a degradacją ściany AAA pod zakrzepem. Nie ulega wątpliwości, że ITL ma bezpośredni wpływ na ścianę tętniaka i jako źródło i rezerwuar dla proteaz, które mogą być uwalniane lub aktywowane podczas procesów krzepnięcia/fibrynolizy oraz procesów proteolitycznych, może przyczyniać się do jej osłabienia i w konsekwencji pęknięcia. Wysunęliśmy hipotezę, że składowe krzepnięcia i fibrynolizy akumulują się lub są aktywowane w tkankach AAA w sposób zależny od grubości ILT, a nasilenia tych zjawisk można się spodziewać najczęściej na pograniczu cienkiej ITL i ściany tętniaka, co wynika z możliwości penetracji, od światła naczynia w głąb zakrzepu aż do ściany, elementów komórkowych krwi jak i czynników aktywujących enzymy proteolityczne. Celem kolejnych dwóch prac (Siennicka i wsp., 2016; Siennicka i wsp., 2018a) było porównanie

11 stężenia/aktywności wybranych parametrów krzepnięcia, fibrynolizy i proteolizy zdolnych do niszczenia macierzy pozakomórkowej bezpośrednio lub poprzez aktywację metaloproteinaz, w uzyskanych od pacjentów, fragmentach zakrzepów przyściennych, z najgrubszej (A1, 25 mm) i najcieńszej (B1, 10 mm) części zakrzepu tego samego tętniaka oraz fragmentach przylegającej do zakrzepu ściany tętniaka od strony zakrzepu grubego (A) i cienkiego (B). Założono, że w analizowanych próbach cienkie skrawki ILT zawierały głównie regiony luminalne (bioaktywne), podczas gdy grubsze, wielowarstwowe fragmenty ILT mogły stanowić kombinację odrębnych warstw. Oceniano aktywność plazminy i TF oraz stężenie plazminogenu, PAI-1, t-pa i α2-antyplazminy (α2ap) oraz stężenie MMP-2 i MMP-9 oraz ich inhibitorów: tkankowego inhibitora metaloproteinaz-1 (TIMP-1) i -2 (TIMP-2) w grubych i cienkich obszarach ILT, a także w sąsiadujących ścianach. Potwierdzono znaną już wcześniej obserwację, że wszystkie czynniki są obecne w zakrzepach i przylegających ścianach, co wskazuje, że ILT jest strukturą, w mniejszym czy większym stopniu, biologicznie aktywną. Z badanych parametrów na szczególną uwagę zasługuje TF kluczowy czynnik w indukcji i aktywacji procesu krzepnięcia. W trzeciej pracy (Siennicka i wsp., 2018a) wykazano, że aktywność krzepnięcia, mierzona aktywnością TF, jest znacznie bardziej nasilona w obszarze cienkiego zakrzepu (B1) i ścianie AAA pod cienkim zakrzepem (B), w porównaniu do zakrzepu grubego (A1) i ściany pod zakrzepem grubym (A) (B1 vs A1, 60.2±62.0 vs 15.2±10.3, p=0.003; B vs A i A1, 108.4±93.7 vs 46.8±48.2, p=0.001 i 108.4±93.7 vs 15.2±10.3, p=0.001). Obserwowana nasilona aktywność TF w cienkich częściach ILT i przylegających ścianach, co z kolei sprzyja aktywacji protrombiny i aktywnemu tworzeniu się trombiny, sugeruje obecność stanu nadkrzepliwości w tym właśnie obszarze AAA. Najbardziej prawdopodobnym źródłem TF w tkance AAA są komórki również te migrujące tj., komórki endotelialne i subendotelialne, komórki mięśni gładkich naczyń czy fibroblasty i monocyty/makrofagi. Napływowi w obszar AAA dużej liczby komórek sprzyja obecność stanu zapalnego [23, 24]. Nasilenie wspomnianych procesów jest prawdopodobnie proporcjonalne do grubości ITL, a wśród oznaczanych segmentów tętniaka to właśnie cienki ILT charakteryzuje się obecnością dużej liczby migrujących komórek. Z kolei część zewnętrzna ITL (od ściany tętniaka) jest znacznie uboższa w komórki i wykazuje znacznie mniejszą aktywność zapalną i proteolityczną. Ponadto, narastanie zakrzepu powoduje oddalenie się ściany tętniaka od aktywnej warstwy luminalnej, co mogłoby sugerować ochronną rolę grubego ILT, a brak lub niewielka liczba komórek w głębszych

12 warstwach ILT (gruby ILT) uniemożliwia syntezę nowych proteaz w tych regionach. Dlatego wydaje się, że obszary ściany AAA o najbardziej nasilonej degradacji, to regiony z cienkim ILT. Czynnik tkankowy może również odgrywać rolę w aktywacji fibrynolizy przez t-pa w cieńszej części ILT i przyległej ścianie. Plazmina wytworzona w wyniku tych procesów, w zależności od poziomu α2ap, może następnie aktywować MMP, które są odpowiedzialne za degradację proteolityczną ściany aorty. Rzeczywiście, jak wykazano w drugiej pracy (Siennicka i wsp., 2016), procesy proteolityczne są bardziej intensywne w obszarze tętniaka z cienkim ILT. Zaobserwowano istotnie wyższe stężenie MMP-9 i wyższy stosunek MMP- 9/TIMP-1 (wskaźnik aktywności MMP-9) w cienkim zakrzepie (B1), w porównaniu z grubym zakrzepem (A1) (odpowiednio: 113.4±118.0 vs 63.0±61.2, p=0.004; 18.9±27.8 vs 9.1±10.6, p=0.017) i sąsiadującą ścianą tętniaka (A) (odpowiednio: 113.4±118.0 vs 31.7±30.0, p<0.001; (18.9±27.8 vs 2.5±2.2, p<0.001). W przypadku MMP-2 i TIMP-1, znamiennie wyższe stężenie tych parametrów obserwowano w ścianach w porównaniu z zakrzepami, brak było jednak istotnych różnic pomiędzy cienkimi i grubymi fragmentami zakrzepów i przylegających ścian AAA. Gromadzenie się MMP-9 w obszarze AAA z cienkim ILT jest z jednej strony prawdopodobnie związane z jej źródłem pochodzenia, którym są neutrofile i makrofagi, a z drugiej strony cienki zakrzep umożliwia przemieszczanie się MMP-9 oraz elementów morfotycznych krwi i czynników osoczowych od światła tętniaka przez warstwę zakrzepu do przylegającej do zakrzepu ściany. Aktywność metaloproteinaz w ścianie naczynia zależy przede wszystkim od równowagi między ich aktywatorami i inhibitorami (TIMP-1 i TIMP-2). Nieprawidłowy stosunek MMP do TIMP może skutkować niekontrolowanymi zmianami w macierzy zewnątrzkomórkowej, co prowadzi do rozszerzenia tętniakowatego naczynia, a w przyszłości może doprowadzić do pęknięcia tętniaka aorty brzusznej. Wyniki wielu badań wskazują na obniżony poziom tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w ścianach AAA. W prezentowanej pracy istotną korelację pomiędzy MMP-9 i TIMP-1 (r=0.35, p=0.039) obserwowano jedynie w grubym zakrzepie, co sugeruje zachwianie równowagi pomiędzy stężeniem MMP-9 i TIMP-1 w obszarach AAA z cienkim ILT. Prawdopodobnie MMP-9 i TIMP-1 mogą przemieszczać się swobodnie z cienkiego zakrzepu do ściany, ale ilość inhibitora nie wystarcza do zahamowania aktywności MMP-9, którego stężenie jest największe w cienkim ILT. Nasilony stan prozakrzepowy w obszarze cienkiego ILT i sąsiedniej ściany powinien być w pewnym stopniu zrównoważony wyższą aktywnością plazminy/plazminogenu, znaczną aktywnością aktywatorów plazminogenu i brakiem αap. Co ciekawe, w badaniach

13 (Siennicka i wsp., 2016) obserwowano najwyższą aktywność/stężenie TF i α2ap w cienkim ILT, natomiast nie wykazano podwyższonego stężenia/aktywności t-pa, plazminy i plazminogenu w tym obszarze AAA. Istotnie wyższe stężenie t-pa wykazano w ścianie leżącej pod grubym zakrzepem (A), w porównaniu do ściany leżącej pod cienkim zakrzepem (B) oraz, w porównaniu do zakrzepu grubego (A1) i zakrzepu cienkiego (B1) (odpowiednio: 0.72±0.54 vs 0.51±0.32, p=0.015; 0.72±0.54 vs 0.11±0,19, p=0.001; 0.72±0.54 vs 0.12±0.20, p=0.001). Stężenie plazminogenu było wyższe w zakrzepie niż w ścianie AAA, niezależnie od grubości ILT. Natomiast stężenie α2ap w ścianie przylegającej do cienkiego zakrzepu (B) było wyższe w porównaniu ze ścianą leżącą pod grubym zakrzepem (A) (39.3±19.6 vs 22.9±26.2, p=0.021) i grubym ILT (A1) (39.3±19.6 vs 10.5±11.6, p<0.001). Dodatkowo wykazano istotne korelacje (między oznaczanymi czynnikami) głównie w obszarze grubego ILT; jedyną istotną statystycznie korelacją w obszarze cienkiego ILT była korelacja pomiędzy plazminą i TF (r=0.55, p=0.004). Brak jakiejkolwiek istotnej korelacji w obszarze AAA z przylegającym cienkim ILT, w przeciwieństwie do znaczących dodatnich korelacji w obszarze z grubym ILT, może sugerować zachwianie równowagi między stężeniem/aktywnością badanych czynników w cienkich warstwach AAA. Z kolei istotna dodatnia korelacja między TF i plazminą przypuszczalnie wskazuje na jednoczesną aktywację krzepnięcia i fibrynolizy w regionach z cienkim ILT. Prawdopodobnie aktywność krzepnięcia i fibrynolizy może się różnić w zależności od lokalnej dostępności aktywatorów lub inhibitorów i może być regulowana na różne sposoby w poszczególnych obszarach AAA. Zatem wysoka aktywność TF i istotnie niższe stężenie t-pa, stwierdzone w niniejszym badaniu, mogą z jednej strony wskazywać na znaczną aktywność prozakrzepową w częściach AAA z cienkim ILT, z drugiej zaś może to być wynikiem zużycia t-pa w wyniku nasilonej wtórnej aktywacji fibrynolizy. Już wcześnie obserwowano, że D-dimery uwalniane są głównie z luminalnej części ILT, co może skutkować wtórną aktywacją fibrynolizy w tym obszarze, poprzedzoną generacją procesów trombinogenezy (10). Podsumowując, nasilone krzepnięcie i prawdopodobnie miejscowa fibrynoliza wraz z nasiloną proteolizą w segmentach AAA z cienkim ILT mogą być częścią łańcucha reakcji prowadzących do zniszczenia ściany tętniaka i w konsekwencji jego pęknięcia. Procesy te przypuszczalnie indukowane są przez czynniki pochodzące z surowicy, ściany worka tętniaka lub zakrzepu przyściennego i są ograniczone grubością ILT, a warstwa cienkiego ILT jest prawdopodobnie bardziej przepuszczalna od warstwy grubej [11]. Sugeruje się, że grubość zakrzepu przyściennego jest istotnym parametrem rzutującym na procesy związane

14 bezpośrednio ze wzrostem i wcześniejszym pęknięciem ściany, dlatego ocena aktywności proteolitycznej wewnątrz ściany AAA mogłaby być dobrym wskaźnikiem, świadczącym o podatności ściany na pęknięcie, a obecność cienkiego zakrzepu w worku AAA, który cechuje się większą aktywnością proteolityczną, mogłaby być wykorzystywana jako wskaźnik potencjalnego miejsca pęknięcia tętniaka. Biorąc pod uwagę znaczną zdolność układu krzepnięcia/fibrynolizy do formowania ILT, jak również do regulacji proteolizy macierzy pozakomórkowej ściany AAA, różnice w rozmieszczeniu składowych tych układów i zrozumienie specyficznej zmienności ILT i jego wpływu na ścianę tętniaka może nie tylko pomóc w wyjaśnieniu kontrowersji, wynikających z wcześniejszego badania ILT jako struktury homogenicznej lub obojętnej, ale może być również użyteczne w przyszłych badaniach eksperymentalnych mających na celu zrozumienie roli ILT w tej istotnej patologii naczyniowej. Ponadto, jak wykazały wyniki niniejszej pracy, obszar tętniaka z którego pobierane są fragmenty tkanek do badań jest niezwykle istotny, ponieważ w zależności od grubości zakrzepu, w tkankach tętniaka występują znamienne różnice w stężeniach/aktywności składowych układu krzepnięcia/fibrynolizy i proteolizy. Opierając się na doniesieniach, jakie pojawiły się do tej pory, wysunięto hipotezę, że homocysteina może wpływać na patogenezę tętniaka aorty brzusznej poprzez zaburzenie równowagi w układzie hemostazy i nasilanie procesu proteolizy. Celem czwartej pracy (Siennicka i wsp., 2018b) było określenie wpływu Hcy na aktywność krzepnięcia i fibrynolizy oraz aktywność proteolityczną w ITL oraz w ścianie tętniaka do której przylega zakrzep, przy uwzględnieniu różnic w grubości zakrzepu przyściennego. Aby określić wpływ Hcy wykonano eksperyment in vitro, z wykorzystaniem uzyskanych od pacjentów fragmentów zakrzepów przyściennych, z najgrubszej (A1, 25 mm) i najcieńszej (B1, 10 mm) części zakrzepu tego samego tętniaka oraz fragmentów przylegającej do zakrzepu ściany tętniaka od strony zakrzepu grubego (A) i cienkiego (B). Po inkubacji fragmentów tkanek z DL-homocysteiną, w różnym zakresie stężeń, oceniano stężenie/aktywność parametrów krzepnięcia/fibrynolizy i proteolizy (aktywność MMP-9, MMP-2 i TF oraz stężenie t-pa, plazminogenu i PAI-1) w przygotowanych homogenatach tkankowych. Wykazano, że inkubacja fragmentów cienkich i grubych zakrzepów oraz przylegających ścian tętniaka z Hcy może wpływać na aktywność/stężenie MMP i parametrów hemostatycznych w sposób zależny od stężenia Hcy oraz grubości zakrzepu przyściennego. Ponadto zaobserwowano, że stężenie/aktywność większości parametrów hemostatycznych i proteolitycznych w próbkach kontrolnych (skrawki inkubowane z samym

15 medium bez dodatku Hcy) silnie korelowało z poziomem tych parametrów po inkubacji z różnymi stężeniami Hcy. Ten sam schemat powtórzył się dla większości mierzonych parametrów. Może to wskazywać, że wpływ Hcy zależy w dużym stopniu od początkowej aktywności/stężenia wspomnianych czynników zarówno w ILT, jak i przyległych ścianach, a wysoka aktywność/stężenie czynników proteolitycznych i hemostatycznych w osoczu pacjentów w połączeniu z podwyższonym stężeniem Hcy może potencjalnie prowadzić do nasilenia procesów degradacji ścian tętniaka, a w konsekwencji do zwiększonego ryzyka pęknięcia AAA. W prezentowanej pracy, po inkubacji tkanek z DL-Hcy obserwowano, zależny od stężenia Hcy, wzrost aktywności MMP-2 (B; 9.54±5.88 vs 7.44±4.48, p=0.011), a także wzrost stężenia plazminogenu (B1; 11.64±5.05 vs 10.34±5.52, p=0.018) i t-pa (B1; 1.39±1.65 vs 0.84±0.74, p=0.024) w cienkich segmentach ILT i przylegającej ścianie AAA (B i B1) w porównaniu do prób kontrolnych. Maksymalną aktywność/stężenie osiągnięto przy stężeniu Hcy równym 500 μmol/l. Z kolei, inkubacja grubych skrawków ILT i przylegającej ściany AAA (A i A1) z Hcy prowadziła do, zależnego od stężenia Hcy, spadku aktywności MMP-2 (A; 5.89±3.39 vs 7.26±5.49, p=0.046) i TF (A; 67.13±72.59 vs ±106.29, p=0.007) oraz stężenia plazminogenu (A1; 9.25±4.59 vs 12.63±9.56, p=0.017) i t-pa (A1; 0.67±0.57 vs 0.96±0.91, p=0.021), w porównaniu do prób kontrolnych. Wyniki te mogą odzwierciedlać różnice w sposobie, w jaki Hcy może wpływać na procesy hemostatyczne i proteolityczne w segmentach tętniaka z różną grubością ILT. Prawdopodobnie homocysteina może uczestniczyć w patofizjologii AAA, poprzez aktywowanie czynników hemostatycznych i proteolitycznych głównie w biologicznie aktywnej, bogatokomórkowej warstwie luminalnej ILT. Ponieważ procesy te mogą być indukowane przez czynniki pochodzące z krwi, w tym Hcy, wydaje się, że obszary AAA z cienkim ILT są najbardziej podatne na oddziaływanie Hcy. Z uwagi na wpływ czynników środowiskowych i genetycznych związek pomiędzy występowanie AAA i hiperhomocysteinemią wydaje się być bardzo złożony. Nie wiadomo, czy Hcy bierze udział w inicjacji patogenezy AAA, czy też intensyfikuje zmiany w ścianach naczyń spowodowane innymi czynnikami. Sugeruje się, że Hcy może być dodatkowym czynnikiem, którego efekty nakładają się na szkodliwe działanie innych czynników. Jeśli zostanie potwierdzone zaangażowanie Hcy w patogenezę AAA, możliwe będzie wprowadzenie odpowiedniego leczenia zachowawczego u pacjentów z czynnikami ryzyka AAA. Podsumowując, prezentowane badanie in vitro wykazało możliwy związek między

16 podwyższonym stężeniem Hcy i aktywacją MMP-2 i czynników hemostatycznych w obszarach tętniaka z cienkim ILT. Biorąc pod uwagę znaczną zdolność układu krzepnięcia/fibrynolizy do regulowania proteolizy macierzy pozakomórkowej ściany tętniaka, wiedza na temat zróżnicowanego wpływu Hcy na te czynniki, w zależności od grubości ILT wewnątrz worka tętniaka, może pomóc w planowaniu nadzoru nad pacjentami z AAA oraz ocenie potencjalnego ryzyka pęknięcia tętniaka. Celowe jest prowadzenie dalszych badań, które pozwolą spojrzeć w głąb procesów przyczyniających się do pękania AAA i pozwolą na poszukiwanie nowych sposobów terapii. Poznanie biochemicznych, komórkowych, hemodynamicznych i proteolitycznych procesów przyczyniających i prowadzących do pękania tętniaka mogą zaowocować rozwojem farmakologicznych czynników, które nie tylko umożliwią zahamowanie wzrostu średnicy tętniaka, ale co ważniejsze - pozwolą na wstrzymanie procesu pękania tętniaka. Otrzymane wyniki, poprzez wzbogacenie naszej wiedzy w zakresie zróżnicowanego nasilenia procesów krzepnięcia/fibrynolizy oraz procesów proteolitycznych w obszarach AAA z grubym i cienkim zakrzepem przyściennym oraz wiedzy dotyczącej wpływu czynników o właściwościach antyheparynowych na składowe krzepnięcia/fibrynolizy i proteolizy w zakrzepie i ścianie tętniaka, mogą przyczynić się do znalezienia czynnika bezpośrednio zwiększającego ryzyko pęknięcia. Wiedza ta może posłużyć również do opracowania skuteczniejszych metod prognozowania ryzyka pęknięcia, tak aby pomogły one w przyszłości optymalnie zindywidualizować kryteria kwalifikacyjne do operacji. Wnioski 1. Istotnie wyższe stężenie t-pa i D-dimerów we krwi pacjentów z tętniakiem aorty brzusznej potwierdza hipotezę o roli wtórnej aktywacja układu fibrynolitycznego w progresji tętniaka aorty brzusznej. 2. Segment tętniaka z cienkim zakrzepem przyściennym charakteryzuje się nasiloną aktywnością prozakrzepową oraz wyższym stężeniem MMP-9 i wyższym stosunkiem MMP- 9/TIMP-1, w porównaniu z warstwą AAA z grubym zakrzepem. Prawdopodobnie w tej części tętniaka dochodzi do wzmożonej degradacji proteolitycznej oraz wtórnej aktywacji układu fibrynolitycznego. Procesy te mogą być indukowane przez czynniki pochodzące z surowicy, ściany worka tętniaka lub zakrzepu przyściennego i są ograniczone grubością zakrzepu. 3. W badaniu in vitro wykazano możliwy związek między podwyższonym stężeniem homocysteiny i aktywacją MMP-2 i czynników hemostatycznych w obszarach tętniaka

17 jedynie z cienkim zakrzepem przyściennym. Biorąc pod uwagę znaczną zdolność układu krzepnięcia/fibrynolizy do regulowania proteolizy macierzy pozakomórkowej ściany tętniaka, wiedza w zakresie zróżnicowanego wpływu homocysteiny na te czynniki, w zależności od grubości zakrzepu, może pomóc w planowaniu nadzoru nad pacjentami z AAA oraz w ocenie potencjalnego ryzyka pęknięcia. 4. Określenie obszaru tętniaka, z którego pobierane są fragmenty tkanek do badań, jest niezwykle istotne, a dane z badań z wykorzystaniem tkanek tętniaka aorty brzysznej należy uważnie interpretować, ponieważ w zależności od grubości zakrzepu przyściennego występują znamienne różnice w stężeniu/aktywności składowych układu krzepnięcia/fibrynolizy i proteolizy w worku jednego tętniaka. 5. Celowe jest prowadzenie dalszych badań, które pozwolą spojrzeć w głąb procesów przyczyniających się do pękania AAA i umożliwią poszukiwanie nowych sposobów terapii. Dokładniejsze poznanie procesów patologicznych na poziomie komórkowym i tkankowym w ścianie tętniaka może stać się podstawą do przygotowania potencjalnie bardziej skutecznego postępowania zachowawczego. Bibliografia 1. Davies MJ. Aortic aneurysm formation: lessons from human studies and experimental models. Circulation 1998; 98(3): Fontaine V, Jacob MP, Houard X, et al. Involvement of the mural thrombus as a site of protease release and activation in human aortic aneurysms. Am J Pathol 2002; 161(5): Petersen E, Wågberg F, Angquist KA. Proteolysis of the abdominal aortic aneurysm wall and the association with rupture. Eur J Vasc Endovasc Surg 2002; 23(2): Khan JA, Abdul Rahman MN, Mazari, FA, et al. Intraluminal Thrombus has a Selective Influence on Matrix Metalloproteinases and Their Inhibitors (Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinases) in the Wall of Abdominal Aortic Aneurysms. Ann Vasc Surg 2012; 26: Jean-Claude J, Newman KM, Li H, et al. Possible key role for plasmin in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Surgery 1994; 116: Kotschy M, Witkiewicz W, Grendziak R, Dubis J, Zapotoczny N, Kotschy D. Selected clotting factors in blood of patients with abdominal aortic aneurysms. Kardiol Pol 2012; 70: Kazi M, Zhu C, Roy J, et al. Difference in matrix-degrading protease expression and activity between thrombus-free and thrombus-covered wall of abdominal aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25:

18 8. Houard X, Rouzet F, Touat Z, Philippe M, Dominguez M, Fontaine V, et al. Topology of the fibrinolytic system within the mural thrombus of human abdominal aortic aneurysms. J Pathol 2007; 212: Swedenborg J, Kazi M, Eriksson P, et al. Influence of the intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysms. Acta Chir Belg 2004; 104: Kazi M, Thyberg J, Religa P, et al. Influence of intraluminal thrombus on structural and cellular composition of abdominal aortic aneurysm wall. J Vasc Surg 2003; 38: Adolph R, Vorp DA, Steed DL. Cellular content and permeability of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm. J Vasc Surg 1997; 25(5): Folkesson M, Silveira A, Eriksson P, et al. Protease Activity in the Multi-Layered Intra-Luminal Thrombus of Abdominal Aortic Aneurysms. Atherosclerosis 2011; 218: Wiernicki I, Stachowska E, Safranow K, et al. Enhanced matrix-degrading proteolytic activity within the thin thrombus-covered wall of human abdominal aortic aneurysms. Atherosclerosis 2010; 212: Sofi F., Marcucci R., Giusti B. et al.: High levels of homocysteine, lipoprotein (a) and plasminogen activator inhibitor-1 are present in patients with abdominal aortic aneurysm. Thromb Haemost 2005;94: Moroz P., Le M.T., Norman P.E.: Homocysteine and abdominal aortic aneurysms. ANZ J Surg 2007; 77: Halazun KJ, Bofkin KA, Asthana S, et al. Hyperhomocysteinaemia is associated with the rate of abdominal aortic aneurysm expansion. Eur J Vasc Endovasc Surg 2007; 33: Wong YY, Golledge J, Flicker L, et al. Plasma total homocysteine is associated with abdominal aortic aneurysm and aortic diameter in older men. J Vasc Surg 2013; 58: Cao H, Hu X, Zhang Q, et al. Homocysteine Level and Risk of Abdominal Aortic Aneurysm: A Meta- Analysis. PLoS One 2014; 9(1): e Bescond A, Augier T, Chareyre C, et al. Influence of homocysteine on matrix metalloproteinase-2: activation and activity. Biochem Biophys Res Commun 1999; 263: Khajuria A, Houston DS. Induction of monocyte tissue factor expression by homocysteine: a possible mechanism for thrombosis. Blood 2000; 96: Yamazumi K, Ojiro M, Okumura H, et al. An activated state of blood coagulation and fibrinolysis in patients with abdominal aortic aneurysm. Am J Surg 1998; 175: Wallinder J, Bergqvist D, Henriksson AE. Haemostatic markers in patients with abdominal aortic aneurysm and the impact of aneurysm size. Thromb Res 2009; 124: Cimmino G, D'Amico C, Vaccaro V, et al. The missing link between atherosclerosis, inflammation and thrombosis: is it tissue factor? Expert Rev Cardiovasc Ther 2011; 9: Michel JB, Martin-Ventura JL, Egido J, et al. Novel Aspects of the Pathogenesis of Aneurysms of the Abdominal Aorta in Humans. Cardiovasc Res 2011; 90:

19 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo badawczych. W mojej dotychczasowej działalności naukowej można wyróżnić, poza kierunkiem dotyczącym szczególnego osiągnięcia naukowego, 5 głównych kierunków badań. W odniesieniu do każdego z nich podano najważniejsze informacje oraz przywołano odpowiednie publikacje. 5.1 Badania dotyczące wczesnych etapów aterogenezy prowadzone z wykorzystaniem hodowli komórek śródbłonka, monocytów oraz linii komórkowej H9c2 Efektem początkowych zainteresowań naukowych dotyczących wczesnych etapów aterogenezy są 3 prace oryginalne opublikowane w czasopismach znajdujących się w bazie Journal of Citation Reports (JCR), 2 prace oryginalne oraz 2 prace poglądowe opublikowane w czasopismach krajowych. Uczestnicząc w tych projektach miałam okazję zdobyć doświadczenie w pracy badawczej z hodowlami komórkowymi oraz zapoznać się z różnymi metodami izolacji komórek z krwi i tkanek. a. Siennicka A, Zapolska-Downar D. Modyfikacja lipoprotein niskiej gęstości i ich wpływ na rozwój blaszki miażdżycowej (Effect of low density lipoprotein modification on the atherosclerotic plaque development). Czyn. Ryz. 2002;4/2003:30-39, MNiSW: b. Zapolska-Downar D, Zapolski-Downar A, Naruszewicz M, Siennicka A, Krasnodębska B, Kołodziej B. Protective properties of artichoke (Cynara scolymus) against oxidative stress induced in cultured endothelial cells and monocytes. Life Sci. 2002;71: , IF: 1.824, MNiSW: c. Siennicka A, Zapolska-Downar D. Rola zmodyfikowanych oksydacyjnie lipoprotein małej gęstości w patogenezie miażdżycy (The role of oxidatively modified low density lipoprotein in the pathogenesis of atherosclerosis). Post. Hig. 2003;57; , MNiSW: d. Zapolska-Downar D, Siennicka A, Kaczmarczyk M, Kołodziej B, Naruszewicz M. Simvastatin modulates TNF alpha-induced adhesion molecules expression in human endothelial cells. Life Sci : vol. 75, nr 11, s , IF: 2.158, MNiSW: e. Zapolska-Downar D, Siennicka A, Kaczmarczyk M, Kołodziej B, Naruszewicz M. Butyrate inhibits cytokine-induced VCAM-1 and ICAM-1 expression in cultured endothelial cells : the role of NF-kappaB and PPARalpha. J. Nutr. Biochem : vol. 15, nr 4, s , IF: 2.591, MNiSW: f. Siennicka A. Wpływ krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na stymulowaną zmodyfikowanymi oksydacyjnie LDL ekspresję śródbłonkowych cząstek adhezyjnych (The effect of short-chain fatty acids on expression of endothelial adhesion molecules stimulated by oxidatively modified LDL). Ann. Acad. Med. Stetin. 2005;51: MNiSW: g. Borecki K, Żuchowski M, Siennicka A, Adler G, Jastrzębska M. Polyphenol-rich extract of Aronia melanocarpa inhibits TNF-alpha induced apoptosis in H9c2 cells. J. Med. Sci. 2016: vol. 85, nr 3, s , MNiSW:

20 Miażdżyca jest przewlekłym procesem zapalnym, obejmującym błonę wewnętrzną tętnic. Cechą charakterystyczną wczesnych etapów miażdżycy jest adhezja, transendotelialna migracja a następnie akumulacja monocytów i limfocytów w błonie wewnętrznej ściany naczynia. Komórki śródbłonka odgrywają istotną rolę w definiowaniu typu komórek przechodzących przez ich barierę poprzez ekspresję specyficznych cząstek adhezyjnych, takich jak: naczyniowa cząsteczka adhezyjna 1 (VCAM-1) i międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1 (ICAM -1). Monocyty dzięki cząstkom adhezyjnym przedostają się do warstwy podśródbłonkowej i podlegają aktywacji, przemianie w makrofagi, a następnie w komórki piankowate. Jednym ze stymulatorów ekspresji cząstek VCAM-1 i ICAM-1 jest utleniona forma lipoprotein niskiej gęstości (ox-ldl). Dwie prace poglądowe (a. Siennicka i wsp., 2002; c. Siennicka i wsp., 2003), opisują aktualny stan wiedzy na temat wpływu ox-ldl na rozwój blaszki miażdżycowej i związane są z tematem mojej pracy doktorskiej. Udział w pisaniu tej pracy był dobrą nauką przed rozpoczęciem pracy doświadczalnej. Moje zaangażowanie w kolejnych pracach badawczych polegało na wykonaniu izolacji komórek śródbłonka lub monocytów, wykonaniu większości eksperymentów i oznaczeń z wykorzystaniem hodowli komórkowych oraz uczestniczeniu w przygotowaniu manuskryptów. W jednej z pierwszy prac oryginalnych (b. Zapolska-Downar i wsp., 2002) badano wpływ wodnych i etanolowych ekstraktów z karczochów (Cynara scolymus) na stymulowany przez mediatory zapalne: czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), lipopolisacharyd (LPS) oraz ox-ldl, wewnątrzkomórkowy stres oksydacyjny w komórkach śródbłonka i monocytach. Ekstrakt z karczocha wykazuje właściwości hipolipemiczne i zawiera liczne substancje czynne o właściwościach antyoksydacyjnych in vitro. Uzyskane wyniki wskazują na ochronny wpływ ekstraktu z liści karczocha na indukowany przez mediatory zapalne i ox- LDL stres oksydacyjny. Zaobserwowano, że wyciąg z karczocha hamuje podstawową i stymulowaną produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach śródbłonka i monocytach, w sposób zależny od dawki. Jak wspomniano wyżej, aktywacja komórek śródbłonka i rekrutacja komórek zapalnych limfocytów i monocytów jest nieodzownym elementem tworzenia się blaszki miażdżycowej. Celem kolejnych trzech publikacji była ocena potencjału adhezyjnego śródbłonka, wyrażona ekspresją VCAM-1 i ICAM-1 oraz badanie wpływu simwastatyny i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na indukowaną cytokinami ekspresję tych adhezyn

21 W jednej z prac (d. Zapolska-Downar i wsp., 2004) poszukiwano molekularnych mechanizmów antymiażdżycowego działania simwastatyny inhibitora reduktazy 3- hydroksy-3-metylglutarylo-coa. Z doniesień w piśmiennictwie wynika, że korzystne działanie statyn nie jest jedynie wynikiem ich hamującego wpływu na biosyntezę cholesterolu. Jednym z mechanizmów może być również wpływ na ekspresję receptorów aktywujących proliferację peroksysomów (PPARα i PPARγ). Sugeruje się, że przeciwzapalne działanie aktywatorów PPARα jest efektem hamującego wpływu na aktywność czynnika transkrypcyjnego NF-κB, który jest odpowiedzialny za ekspresję wielu genów związanych z odpowiedzią zapalną. Antymiażdżycowe działanie statyn może być następstwem ich bezpośredniego wpływu na komórki śródbłonka, mięśnie gładkie czy monocyty/makrofagi. We wspomnianej pracy badano wpływ simwastatyny na poziomu cholesterolu LDL w osoczu oraz ekspresję cząsteczek adhezyjnych VCAM-1 i ICAM-1 przez ludzkie komórki śródbłonka izolowane z żyły pępowinowej (HUVEC), stymulowane TNF-α. Wykazano, że ekspresja ICAM-1 i/lub VCAM-1 jest znacznie hamowana przez stosowany lek, w sposób zależny od czasu i stężenia. Efekt ten był powiązany ze zmniejszeniem aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-κB przy jednoczesnym zwiększeniu ekspresji genu kodującego PPARα. Działania te były również związane ze zmniejszeniem przylegania monocytów i limfocytów do warstwy komórek śródbłonka. Uzyskane wyniki sugerują, że antymiażdżycowe i przeciwzapalne działanie simwastatyny może być po części wynikiem jej hamującego wpływu na ekspresję śródbłonkowych cząstek adhezyjnych oraz może przyczynić się do zmniejszenia ryzyka progresji miażdżycy nie tylko poprzez obniżenie stężenia LDL, ale także poprzez bezpośrednie działanie na śródbłonek naczyniowy. Kolejne dwie prace (e. Zapolska-Downar i wsp., 2004; f. Siennicka i wsp., 2005) były wynikiem weryfikacji hipotezy, że występujące naturalnie krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, którym przypisuje się działanie przeciwmiażdżycowe, głównie poprzez wpływ na metabolizm lipidów, mogą mieć również bezpośredni wpływ na funkcje komórek śródbłonka. Podjęto badania in vitro zmierzające do wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których kwas propionowy i masłowy mogłyby wpływać na istotny dla rozwoju miażdżycy etap jakim jest dysfunkcja komórek śródbłonka i związana z tym zwiększona adhezywność dla monocytów i limfocytów. W pierwszej pracy wykazano, że maślan hamuje stymulowaną przez interleukinę 1 (IL-1) ekspresję VCAM-1 i ICAM-1 oraz obniża indukowaną TNFα ekspresję mrna dla VCAM-1 i ICAM-1, co związane jest również ze zmniejszeniem przylegania monocytów i limfocytów do stymulowanej przez cytokiny warstwy komórek śródbłonka. Maślan hamował