Biologia medyczna II, materiały dla studentów kierunku lekarskiego

Transkrypt

1 Markery molekularne i ich wykorzystanie 1. Markery genetyczne Definicja Typy markerów 2. Markery morfologiczne 3. Markery enzymatyczne Definicja izoenzymów Przebieg analizy Genetyka izoenzymów 4. Markery DNA Definicja Enzymy restrykcyjne Markery oparte o reakcję PCR SNPs Prof. dr hab. Roman Zielinski 1

2 1. Markery genetyczne: definicja Marker genetyczny jest to cecha, która może być wykorzystana do identyfikacji osobników lub gatunków. Cechy markerów genetycznych Monogeniczny: warunkowany przez jeden gen Polimorficzny: występują 2 łatwo rozróżnialne formy Stabilny: nie podlega wpływowi środowiska Markery genetyczne dały podstawę pod rozwój genomiki (analiza genomów), współczesnej hodowli roślin i zwierząt oraz wspomagają diagnostykę chorób u człowieka. Brak plejotropii: wpływa tylko na jedną cechę 1. Markery genetyczne: typy markerów Rozwój technologii molekularnych umożliwił postęp w mapowaniu i analizie genetycznej gatunków użytkowych. Typy markerów genetycznych Morfologiczne: pierwsze mapy genetyczne tworzono na podstawie markerów morfologicznych, Enzymatyczne: np. D. melanogaster, umożliwiły rozwój genetyki jęczmień. populacyjnej dostarczając informacji o zmienności organizmów. Molekularne DNA: umożliwiły badanie organizacji genomów i ich ewolucji. Smart breeding to wykorzystanie markerów molekularnych w hodowli roślin i zwierząt czyli hodowla wspomagana markerami: MAS: ang. marker assisted selection. Prof. dr hab. Roman Zielinski 2

3 Markery molekularne i ich wykorzystanie 1. Markery genetyczne Definicja Typy markerów 2. Markery morfologiczne 3. Markery enzymatyczne Definicja izoenzymów Przebieg analizy Genetyka izoenzymów 4. Markery DNA Definicja Enzymy restrykcyjne Markery oparte o reakcję PCR SNPs 2. Markery morfologiczne Efektywne wykorzystanie markerów morfologicznych możliwe jest tylko, gdy istnieją kolekcje mutantów dotyczące różnych genów. Pisum sativum: barwa i rozmieszczenie kwiatów. Hordeum vulgare: kłos normalny oraz z mutacjami recesywnymi: sześciorzędowy (v), krótkie ości (lk), pomarańczowa osadka kłosowa (o), biała plewa (al). Pisum sativum: różne formy listków liścia Formy z wieloma mutacjami pierzastozłożonego: normalny, wąsy czepne, listki. recesywnymi to wielogenowe homozygoty recesywne. Prof. dr hab. Roman Zielinski 3

4 2. Markery morfologiczne U niektórych gatunków (modelowe, uprawne) stworzono mapy genetyczne na podstawie licznych markerów morfologicznych. Mapy genetyczne gatunków Drosophila. Mapa genetyczna chromosomu 7 jęczmienia. U większości gatunków liczba markerów morfologicznych jest zbyt mała, aby stworzyć mapę o rozdzielczości wystarczającej do izolowania genów oraz wykorzystania ich na potrzeby hodowli. Markery molekularne i ich wykorzystanie 1. Markery genetyczne Definicja Typy markerów 2. Markery morfologiczne 3. Markery enzymatyczne Definicja izoenzymów Przebieg analizy Genetyka izoenzymów 4. Markery DNA Definicja Enzymy restrykcyjne Markery oparte o reakcję PCR SNPs Prof. dr hab. Roman Zielinski 4

5 3. Markery enzymatyczne: definicja Izoenzymy (izozymy): formy enzymu o tej samej funkcji ale różniące się właściwościami w polu elektrycznym. Dehydrogenaza mleczanowa człowieka, LDH zbudowana jest z 4 podjednostek kodowanych przez 2 geny, LDHA i LDHB. LDHA M LDHB H Geny dehydrogenazy mleczanowej Polipeptydy, podjednostki LDH Podjednostki M i H tworzą 5 różnych tetramerów. M M M M M H M H H H M M M H M H H H H H LDH5: wątroba, mięśnie szkieletowe LDH4: nerki, trzustka LDH3: płuca LDH2: fagocyty LDH1: serce, krew, mózg Większość enzymów występuje w postaci wielu form (izoenzymów). Występowanie enzymu w jednej formie jest wyjątkiem. 3. Markery enzymatyczne: przebieg analizy Izoenzymy uwidacznia się w procesie elektroforezy w odpowiednim nośniku (np. skrobia) oraz barwnej reakcji histochemicznej. -OOC Koniec C: C-terminus Aminokwasy budujące białko posiadają różne ładunki w zależności od łańcuchów bocznych (kwasowe, zasadowe) NH 3 Koniec N: N-terminus Sumaryczny ładunek białka zależy od liczby aminokwasów zasadowych i kwasowych = -2 Ładunek białka zależy także od ph środowiska. Białko może mieć ładunek dodatni w wysokim ph i ujemny w niskim lub odwrotnie. Prof. dr hab. Roman Zielinski 5

6 3. Markery enzymatyczne: przebieg analizy Elektroforeza to ruch cząsteczki obdarzonej ładunkiem w polu elektrycznym. Ruchliwość zależy od ładunku i wielkości cząsteczki. Anoda (+) Białka o ładunku ujemnym migrują w kierunku elektrody dodatniej (anody) Miejsce nałożenia prób Katoda (-) +2 Białka o ładunku dodatnim migrują w kierunku elektrody ujemnej (katody) 3. Markery enzymatyczne: przebieg analizy Elektroforezę prowadzi się w nośnikach żelach, które działają jak sito molekularne. Duże pory: cząsteczki poruszają się szybko. Małe pory: cząsteczki poruszają się wolno. Duże białka mogą nie migrować. Im większe pory tym szybciej poruszają się białka. Małe białka poruszają się szybciej, natomiast duże zatrzymują się blisko miejsca nałożenia. Prof. dr hab. Roman Zielinski 6

7 3. Markery enzymatyczne: przebieg analizy Funkcję nośnika (żelu) może pełnić skrobia, agaroza, celuloza i poliakrylamid. Nośnik Charakterystyka Wykorzystanie Agaroza Duże pory Białka, kwasy nukleinowe Octan celulozy Skrobia Poliakrylamid Białka migrują po powierzchni Duże pory, migruje większość białek Małe pory, im większe stężenie tym mniejsze pory, może zahamować migrację Białka Białka Białka, kwasy nukleinowe Poliakrylamid to polimer akrylamidu. Akrylamid jest rakotwórczy. Najczęściej wykorzystuje się skrobię ze względu na łatwość, szybkość i niskie koszty oraz poliakrylamid ze względu na wysoką rozdzielczość. 3. Markery enzymatyczne: przebieg analizy Miejsce na żelu, w którym enzym jest unieruchomiony ujawnia się wykorzystując reakcję katalizowaną przez enzym. Substrat, np.: β-galaktozyd 4- metyloumbeliferolu Enzym, np.: esteraza Produkt 1, np.: β-galaktozyd + Produkt 2, np.: 4-metyloumbeliferol Rozdział esteraz fluorescencyjnych Lolium perenne x L. multiflorum na żelu skrobiowym. Esterazy są widoczne jako świecące prążki. 4 MU fluoryzuje w świetle UV Izoenzymy różniące się ruchliwością Prof. dr hab. Roman Zielinski 7

8 3. Markery enzymatyczne: przebieg analizy 3. Markery enzymatyczna: genetyka Izoenzymy mogą być uwarunkowane różnymi genami lub są produktami alleli jednego genu. Podział izoenzymów Uwarunkowane genetycznie Uwarunkowane epigenetycznie, np. w wyniku modyfikacji potranslacyjnych Allozymy: produkty ekspresji alleli jednego genu (locus) Izoenzymy: uwarunkowane przez odrębne geny (loci) Związane z różnymi organellami Powstałe w wyniku duplikacji i poliploidyzacji Prof. dr hab. Roman Zielinski 8

9 3. Markery enzymatyczne: genetyka Zaletą izoenzymów jest kodominacja czyli ujawnianie się obu alleli u heterozygoty. Dzięki temu można jednoznacznie określić genotyp. A 1 A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 1 A 2 A 1 A 2 A 1 A 2 A 1 A 1 A 2 A 2 A 1 A 2 Wzór peroksydazy u Lolium Na żelu można rozróżnić oba typy homozygot oraz heterozygoty. Peroksydazy rozkładają nadtlenek wodoru. Uczestniczą w reakcjach oksydo-redukcyjnych w procesach metabolicznych oraz w odpowiedzi na stres. Wykorzystane są do oczyszczania wody poprzemysłowej z fenoli. 3. Markery enzymatyczne: genetyka Na jednym żelu obserwuje się allozymy będące produktami alleli jednego genu oraz izoenzymy kodowane przez różne geny. Homozygoty Heterozygoty SS FF FF FS FF FS SSFS FF FS FF AAT: transaminaza asparaginianowa AAT1 AAT2 AAT3 Homozygoty EST: esterazy Heterozygoty SS FF SS FF SS FS SS FS FF FS SS EST1 EST2 EST3 EST4 AAT1, AAT2, AAT3 to produkty 3 genów (loci): Aat1, Aat2 i Aat2. Obserwowane prążki to izoenzymy. W genie (locus) Aat2 występują 2 typy wzorów jednoprążkowych SS i FF. Są to allozymy będące produktami różnych alleli w locus Aat2. Homozygoty są jednoprążkowe a heterozygoty dwuprążkowe. EST1, EST2, EST3, EST4 to produkty 4 genów (loci): Est1, Est2, Est3, Est4. W genie (locus) Est1 występują 2 allele, które widoczne są na żelu jako formy jednoprążkowe (homozygoty). Heterozygoty mają 2 prążki. Prof. dr hab. Roman Zielinski 9

10 3. Markery enzymatyczne: genetyka Kwaśne fosfatazy rozkładają reszty kwasu ortofosforowego. Izoenzymy uwarunkowane są genetycznie i epigenetycznie. Nazwa Kwaśne fosfatazy u człowieka LAP Lizosomy 11 PAP Prostata, mózg, wątroba EAP Erytrocyty 2 MAP Makrofagi 19 Lokalizacja Chromosom 3 Diagnostyka Choroby metaboliczne Rak prostaty, sprawy o gwałt Anemia, testy ciążowe Zaburzenia rozwoju mięśni OcAP Osteoklasty 19 Choroby kości Jęczmień Przesunięcie grupy prążków Lolium Izoenzymy kwaśnej fosfatazy u roślin często są efektem obróbki potranslacyjnej. Zmiana genetyczna obserwowana jest jako przesunięcie całej grupy prążków. Kwaśne fosfatazy człowieka są markerami wielu chorób i powszechnie wykorzystywane są w diagnostyce klinicznej. Markery molekularne i ich wykorzystanie 1. Markery genetyczne Definicja Typy markerów 2. Markery morfologiczne 3. Markery enzymatyczne Definicja izoenzymów Przebieg analizy Genetyka izoenzymów 4. Markery DNA Definicja Enzymy restrykcyjne Markery oparte o reakcję PCR SNPs Prof. dr hab. Roman Zielinski 10

11 4. Markery DNA: definicja Marker DNA to jakakolwiek sekwencja DNA, która może być wykorzystana do identyfikacji osobników, gatunków. Typy markerów DNA Markery wykorzystujące enzymy restrykcyjne. Markery wykorzystujące reakcję PCR: sekwencje unikalne, sekwencje powtarzalne, losowe sekwencje genomu. Markery łączące enzymy restrykcyjne i reakcję PCR. Markery DNA są powszechnie wykorzystywane w badaniach genetycznych i ewolucyjnych, a także w hodowli roślin, zwierząt i diagnostyce. 4. Markery DNA: enzymy restrykcyjne Enzymy restrykcyjne są to endonukleazy, które mają zdolność przecinania łańcucha DNA w ściśle określonych miejscach. Nazwy enzymów pochodzą od szczepów bakterii, z których je wyizolowano: EcoRV: Escherichia coli, szczep R, enzym klasy V; HindII: Haemophilus influenze, szczep d, enzym klasy II ReBASE: baza informacji o enzymach restrykcyjnych. Zidentyfikowano ~3000 enzymów restrykcyjnych, z czego ~600 jest dostępnych komercyjnie. Są one powszechnie wykorzystywane w genomice i inżynierii genetycznej. Cząsteczka EcoRV. Strzałki pokazują miejsca cięcia. Enzymy restrykcyjne pochodzą od bakterii i Archaea, u których służą do degradacji DNA bakteriofagów (wirusów atakujących bakterie) i tym samym chronią je przed atakiem wirusów. Prof. dr hab. Roman Zielinski 11

12 4. Markery DNA: enzymy restrykcyjne Enzymy restrykcyjne rozpoznają sekwencje palindromowe. Są one identyczne gdy obie nici DNA czyta się od końca 5 do końca 3. EcoRI 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 MseI 5 TTAA 3 3 AATT 5 PstI 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 EcoRI i PstI rozpoznają 6-nukleotydową sekwencję. TaqI 5 TCGA 3 3 AGCT 5 MseI i TaqI rozpoznają 4-nukleotydową sekwencję. Enzymy restrykcyjne najczęściej rozpoznają sekwencje 4- i 6- nukleotydowe, rzadziej 5-, 7- i 8-nukleotydowe. 4. Markery DNA: enzymy restrykcyjne Enzymy restrykcyjne tną DNA dając tzw. lepkie końce lub tępe końce. Oba typy enzymów mają różne zastosowania. Lepkie końce EcoRI Miejsce cięcia 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Miejsce cięcia 5 G 3 3 CTTAA 5 5 AATTC 3 3 G 5 Tępe końce AluI Miejsce cięcia 5 AGCT 3 3 TCGA 5 Miejsce cięcia 5 AG 3 3 TC 5 5 CT 3 3 GA 5 Prof. dr hab. Roman Zielinski 12

13 4. Markery DNA: enzymy restrykcyjne Enzymy restrykcyjne można wykorzystać do analizy miejsc restrykcyjnych w pojedynczych genach. Mapa restrykcyjna regionu ITS u Lolium oraz przewidywane miejsca cięcia HaeIII. Wyniki analizy regionu ITS u Lolium za pomocą enzymów restrykcyjnych. Dla Hae zidentyfikowano 2 miejsca cięcia, co powinno dać 3 fragmenty na żelu agarozowym. Jeden z fragmentów ma ~90 bp i agaroza ma zbyt małą rozdzielczość by fragment ujawnić. Analiza restrykcyjna pojedynczych genów wymaga uprzedniej izolacji lub amplifikacji takiego genu przy pomocy np. reakcji PCR. 4. Markery DNA: enzymy restrykcyjne Geny posiadają wiele miejsc restrykcyjnych. Gen LDHA (dehydrogenaza mleczanowa) człowieka posiada >20 takich miejsc. Mapa restrykcyjna genu LDHA człowieka. Marker LDHA Potencjalne miejsca cięcia geny LDHA enzymem BbsI. Przewidywany wzór prążków uzyskany po cięciu LDHA enzymem BbsI. Mapy restrykcyjne genów przedstawiają potencjalne miejsca cięcia. Ułatwiają one wybór odpowiednich enzymów do analiz. Prof. dr hab. Roman Zielinski 13

14 4. Markery DNA: enzymy restrykcyjne Cięcie genomowego DNA enzymami restrykcyjnymi jest podstawą metody RFLP: polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Pokolenie F 2 : potomstwo dwóch heterozygot. P: homozygotyczne linie rodzicielskie, np. AA i aa. F 1 : potomstwo otrzymane ze skrzyżowania linii homozygotycznych P. Wszystkie osobniki są heterozygotami, np. Aa. F 2 : otrzymujemy w wyniku skrzyżowania heterozygot F 1, np. Aa x Aa. W F 2 osobniki mają różne genotypy: segregują. P1 P2 F 1 F 2 A1A 1 A 2 A 2 A1A 2 A1A 1 A1A 2 A1A 2 A2A 2 A1A 2 A1A 2 A1A 2 Segregacja markerów RFLP w pokoleniu F 2 otrzymanym ze skrzyżowania dwóch homozygotycznych linii jęczmienia. A1A 1 A1A 2 A2A 2 Markery RFLP są kodominujące co umożliwia identyfikację genotypów w segregujących populacjach. A1A 2 A2A 2 A1A 2 A2A 2 A2A 2 A1A 2 A1A 2 Markery RFLP były pierwszymi markerami DNA, które powszechnie wykorzystano do tworzenia map genetycznych u wyższych Eukariota. 4. Markery DNA: markery oparte o PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) to replikacja in vitro, która umożliwia uzyskanie milionów kopii fragmentów DNA. PCR (ang. polymerase chain reaction) Składniki niezbędne do PCR: DNA, które jest matrycą dla replikacji; startery: krótkie fragmenty DNA, które inicjują reakcję; nukleotydy: budulec dla nowo powstałego łańcucha DNA; enzym termostabilna polimeraza DNA prowadząca replikację. Termocykler umożliwia szybkie zmiany temperatur zgodne z zadanym schematem. Jeden z pierwszych modeli termocyklerów Model pozwalający na analizę w czasie rzeczywistym (real time). Współczesny model z gradientem temperaturowym i grzejną pokrywą. PCR polega na powtarzaniu cykli ogrzewania i oziębiania mieszaniny reakcyjnej w celu manipulowania temperaturo-zależnymi procesami: denaturacją DNA i replikacją prowadzoną przez enzym. Prof. dr hab. Roman Zielinski 14

15 4. Markery DNA: markery oparte o PCR Reakcja PCR obejmuje denaturację DNA, przyłączanie starterów (annealing) i syntezę nowych nici DNA (elongacja). 1. Denaturacja: rozplecenie nici DNA, temp. 94 o C Powielany fragment matryca DNA 2. Annealing: przyłączenie starterów, temp o C. 3. Elongacja (amplifikacja): wydłużanie łańcucha DNA, temp. 72 o C Startery to jednoniciowe oligonukleotydy (10-25 bp), komplementarne do danego fragmentu DNA, umożliwiają przyłączenie polimerazy DNA Polimeraza DNA syntetyzuje nowy łańcuch komplementarny do matrycy wykorzystując nukleotydy zawarte w mieszaninie reakcyjnej. Specyfika reakcji zależy od temperatury przyłączania starterów, zbyt niska starter przyłącza się do sekwencji niekomplementarnych, zbyt wysoka starter się nie przyłączy. 4. Markery DNA: markery oparte o PCR W wyniku pojedynczego cyklu PCR z każdej cząsteczki DNA powstają dwie nowe cząsteczki DNA. Rutynowo przeprowadza się cykli. Liczba kopii danej sekwencji DNA w reakcji PCR rośnie wykładniczo według wzoru 2 n (n: liczba cykli). Cykl Liczba kopii Powstałe cząsteczki DNA są matrycami w następnym cyklu W reakcji PCR wykorzystuje się odporną na wysoką temperaturę polimerazę z Thermus aquaticus (Taq) lub z T. flavus (Tfl). Prof. dr hab. Roman Zielinski 15

16 Etapy reakcji PCR: czas i temperatura Czas prowadzenia poszczególnych etapów waha się od 30 s do 150 s. Najdłuższy jest czas elongacji. Wstępna denaturacja: wstępne rozplecenie nici DNA: 94 o C przez 3-5 min. Jednorazowo, nie powtarza się w kolejnych cyklach cykli obejmujących: denaturację 94 o C przez s w zależności od metody; annealing czyli przyłączanie starterów o C w zależności od temperatury topnienia starterów przez s w zależności od metody; elongacja czyli wydłużanie łańcucha 72 o C przez s w zależności od metody. Końcowe procesy po zakończeniu wszystkich cykli: końcowe wydłużanie pozwala dosyntetyzować końcowe fragmenty DNA, 72 o C przez 5-10 min. w zależności od długości amplifikowanych sekwencji. 4 o C ustawia się po zakończeniu wszystkich reakcji, pozwala na pozostawienie prób w termocyklerze po zakończeniu reakcji. Warunki reakcji PCR: temperatura topnienia Temperatura topnienia DNA to temperatura, w której połowa cząsteczek jest zdenaturowana. Temperatura przyłączania starterów (annealing) zależy od temperatury topnienia. Dlatego projektując warunki reakcji PCR należy zacząć do określenia temperatury topnienia starterów. 5 AGCTAAGGCCTAGCGTAGCCT 3 Liczba nukleotydów: 21 Liczba nukleotydów z G+C: 12 Procent G+C: 57% Testowanie warunków przyłączania starterów na ogół zaczyna się od Tm +/- 5oC. Projektując startery należy je tak dobrać, aby ich temperatury topnienia nie różniły się znacząco. T m = (logna + ) + 41 G+C/długość 600/długość T m = (log0.05) + 41 x 12/21 600/21 T m = (-1.3) T m = o C Prof. dr hab. Roman Zielinski 16

17 Warunki reakcji PCR: składniki Do przeprowadzenia reakcji PCR niezbędna jest matryca DNA oraz elementy niezbędne do przeprowadzenia reakcji. Matryca DNA Matrycą jest DNA, który wyizolowany został z organizmu. Do reakcji dodaje się ng w zależności od metody. Startery Startery są niezbędne do zainicjowania reakcji replikacji in vitro. Są to krótkie, jednoniciowe odcinki DNA (10-25 bp). Startery projektuje się na podstawie sekwencji, która będzie amplifikowana. Startery powinny zawierać >50% zasad z GC. Stężenie starterów wynosi µm dntp (nukleotydy) Nukleotydy: ATP, GTP, CTP, TTP niezbędne do tworzenia DNA. Stężenie każdego wynosi 200 µm. Polimeraza DNA: U polimerazy TAQ (Thermus aquaticus) lub Tfl (T. flavus). Bufory Bufor dla polimerazy: 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4 i 50 mm Tris-HCl, dostarczany z polimerazą jako roztwór 10x lub 20x stężony. MgCl 2 : mm, kofaktor polimerazy, podnosi specyfikę reakcji. Objętość µl, uzupełnia się wodą do ostatecznej objętości. 4. Markery DNA: markery oparte o PCR 1. Próby przygotowane do reakcji PCR. 2. Umieszczenie prób w termocyklerze. 3. Programowanie warunków reakcji. 4. Reakcja PCR. 5. Rozdział prób na żelu agarozowym. 6. Obserwacja w świetle UV, dokumentacja. Prof. dr hab. Roman Zielinski 17

18 4. Markery DNA: PCR sekwencje unikalne Reakcja PCR pozwala powielić określony, unikalny fragment genomu pod warunkiem znajomości jego sekwencji. W reakcji PCR niezbędne są startery. Aby je zaprojektować konieczna jest znajomość sekwencji amplifikowanej. Reakcja PCR pozwala wykryć polimorfizm sekwencji unikalnych (genów) wynikający z mutacji w miejscach przyłączenia starterów. Jeżeli starter się przyłączy to zachodzi amplifikacja a na żelu obserwujemy prążek. Jeżeli zaszła mutacja to starter się nie przyłącza i nie zachodzi amplifikacja. Nie obserwujemy prążka na żelu. Obecność prążka jest cechą dominującą. Heterozygoty mają prążek. Reakcja specyficzna Reakcja niespecyficzna LolP1 LolP1-3 LolP1B Lhab Produkty reakcji PCR alergenów pyłkowych i białka fotosystemu I (Lhab) u Lolium. PCR umożliwia wykrycie polimorfizmu sekwencji unikalnych co znajduje zastosowanie w diagnostyce i badaniach genetyczno-ewolucyjnych. 4. Markery DNA: PCR sekwencje unikalne Reakcja PCR genu KatG u M. tuberculosis wykorzystywana jest do identyfikowania szczepów lekoopornych. Para starterów 8 Reakcja niespecyficzna, może świadczyć o mutacji i lekooporności szczepu. Produkty PCR otrzymane przy pomocy pary starterów KatG8. Gen KatG podzielono na 12 ~300-nukleotydowych fragmentów na podstawie występowania mutacji warunkujących oporność na izoniazyd. Startery dobrano tak aby były komplementarne do miejsc mutacji. Jeżeli mutacja występuje u danego szczepu to starter się nie przyłącza (brak komplementacji) i nie zachodzi amplifikacja. Prof. dr hab. Roman Zielinski 18

19 4. Markery DNA: PCR - sekwencje powtarzalne Mikrosatelity (SSR): 1-6 nukleotydowe sekwencje, które występują w tandenomych powtórzeniach (5-50 kopii) w wielu miejscach genomu. Powtórzenia sekwencji CTG. Allele różnią się liczbą powtórzeń CTG. Allel A 1 : 9 powtórzeń 5 CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG 3 3 GACGACGACGACGACGACGACGACGAC 5 Allel A 2 : 7 powtórzeń 5 CTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG 3 3 GACGACGACGACGACGACGAC 5 Elektroforeza A 1 A 1 A 2 A 2 A 1 A 2 Polimorfizm wynika z różnej liczby kopii sekwencji w tandemie. Allele różnią się długością, a więc także ruchliwością na żelu. U heterozygot widoczne są oba allele kodominacja. 4. Markery DNA: PCR - sekwencje powtarzalne Mikrosatelity (SSR) charakteryzują się wysoką częstością mutacji, co pozwala rozróżniać osobniki. Segregacja SSR (H06) w pokoleniu F 2 (L. perenne x L. multiflorum) L. loliaceum, 2. L. remotum, 3. L. persicum, 4. L. temulentum, 5. L. canariense, 6. L. edwardii, 7, 8. L. multiflorum, 9, 10, 11. L. perenne, 12. L. rigidum. Wzory SSR u limby. Mikrosatelity wykorzystywane są do oceny zróżnicowania genetycznego, śledzenia pokrewieństwa i dróg migracji. Prof. dr hab. Roman Zielinski 19

20 4. Markery DNA: PCR sekwencje powtarzalne U człowieka mikrosatelity są równomiernie rozmieszczone na wszystkich chromosomach. Stanowią one 3% genomu. Rozmieszczenie mikrosatelitów na chromosomach człowieka liczone jako stosunek par zasad (bp) w mikrosatelitach do milionów par zasad w chromosomie (Mbp). Rozmieszczenie mikrosatelitów w egzonach (niebieskie), intronach (czerwone) i regionach międzygenowych (żółte). W egzonach człowieka występują głownie powtórzenia 3- i 6-nukleotydowe. Ekspansja mikrosatelitów może być przyczyną chorób neurodegeneracyjnych. Subramanian et al Markery DNA: PCR sekwencje powtarzalne Większość mikrosatelitów (85%) człowieka występuje u blisko spokrewnionych gatunków. Procent sekwencji podobnych do sekwencji człowieka (czerwone) oraz procent mikrosatelitów w uliniowanych sekwencjach. Występowanie mikrosatelitów człowieka u kręgowców poza naczelnymi. Liczby wskazują u ilu gatunków dany procent sekwencji występuje. Konserwacja mikrosatelitów u kręgowców może wskazywać, że nie zawsze są one neutralnymi markerami nie mającymi wartości adaptacyjnej. Buschiazzo and Gemme 2010 Prof. dr hab. Roman Zielinski 20

21 4. Markery DNA: SNPs Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP, ang. single nucleotide polymorphism) to zmiana jednego nukleotydu w danej pozycji. SNP dotyczy tranzycji i transwersji: tranzycja - zmiana w obrębie jednej grupy, np. A na G; transwersja - zmiana między grupami np. A na T. SNP może występować w sekwencjach kodujących i niekodujących. Podstawienie może mieć charakter: synonimiczny nie zmienia się aminokwas w białku; niesynonimiczny zmienia się aminokwas. Zamiana A na T (transwersja) w transgenie Pgip wprowadzonym do grochu. SNPs wykrywa się podczas sekwencjonowania genomów. SNP to polimorfizm co oznacza, ze częstość wariantu w populacji jest >1%. 4. Markery DNA: SNPs SNPs w egzonach mogą być przyczyną chorób jednogenowych (np. hemofilia), w intronach mogą zwiększać ryzyko np. nowotworów. Baza NCBI Baza Uniwersytetu Utah Baza OMIM: katalog genów i chorób u człowieka SNPs w populacji ludzkiej zdeponowano w bazach danych, które pozwalają na analizę zmienności oraz powiązanie z genami i cechami. Prof. dr hab. Roman Zielinski 21

22 Zagadnienia Markery genetyczne Co to jest marker genetyczny? Jakimi cechami powinien charakteryzować się marker genetyczny? Jakie wyróżniamy typy markerów genetycznych i gdzie poszczególne typy znalazły zastosowanie? 2. Markery morfologiczne Jakie warunki muszą być spełnione aby efektywnie wykorzystać markery morfologiczne? Dlaczego markery morfologiczne nie znalazły zastosowania w hodowli oraz tworzeniu map genetycznych? 3. Markery enzymatyczne: definicja Podaj definicję izoenzymu. Wyjaśnij w jaki sposób powstaje 5 różnych izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej (LDH) u człowieka? 4. Markery enzymatyczne: analiza Zagadnienia 4-5 W jaki sposób uwidaczniamy izoenzymy? Ile wynosi sumaryczny ładunek polipeptydu, który składa się z 5 aminokwasów o ładunku ujemnym (każdy -1) oraz 3 aminokwasów o ładunku dodatnim (każdy +1)? Co to jest elektroforeza? Od czego zależy ruchliwość cząsteczki w polu elektrycznym? Wymień nośniki, w których prowadzi się elektroforezę? Które nośniki stosuje się tylko do białek, a które znajdują zastosowanie do białek i kwasów nukleinowych? 5. Markery enzymatyczne: genetyka Jak dzielimy izoenzymy ze względu na uwarunkowania genetyczne? Co to są allozymy? Z czego wynika obecność izoenzymów uwarunkowanych przez odrębne geny (loci)? Na czym polega epigenetyczne uwarunkowanie izoenzymu i jak je rozpoznać? Co jest główną zaletą izoenzymów w analizach genetycznych? Czy na jednym żelu można zaobserwować wszystkie typy izoenzymów? Podaj przykłady. Jaką funkcję pełnią peroksydazy? Gdzie są wykorzystane peroksydazy? Jaką funkcję pełnią kwaśne fosfatazy u człowieka? Prof. dr hab. Roman Zielinski 22

23 Zagadnienia Markery DNA: definicja jak definiujemy marker DNA? Jakie wyróżniamy typy markerów DNA? 7. Markery DNA: enzymy restrykcyjne Co to są enzymy restrykcyjne, u jakich organizmów występują i jaką pełnią u nich funkcję? Gdzie enzymy restrykcyjne znalazły wykorzystanie? Co to jest sekwencja palindromowa? Przedstaw na schemacie? Jakie sekwencje rozpoznają enzymy restrykcyjne? Czym różnią się lepkie końce od tępych końców? Przedstaw na schemacie. Co jest warunkiem analizy miejsc restrykcyjnych w pojedynczych genach? Czy wszystkie potencjalne fragmenty DNA jakie mogą powstać po cięciu enzymem restrykcyjnym są zawsze widoczne na żelu? uzasadnij odpowiedź. Ile miejsc restrykcyjnych może posiadać gen? Co to jest mapa restrykcyjna? Co oznacza skrót RFLP? Co jest podstawą tej metody? Przedstaw na schemacie co oznacza stwierdzenie, że markery RFLP są kodominujące? Zagadnienie Markery DNA: markery oparte o PCR Co oznacza skrót PCR? Co jest istotą reakcji PCR? Jakie składniki są niezbędne do przeprowadzenia reakcji PCR? Jaką funkcję pełni każdy z tych składników? Podaj etapy reakcji PCR? Jakie procesy zachodzą podczas każdego etapu? Narysuj schemat reakcji PCR. od czego zależy specyfika reakcji PCR? Ile cząsteczek DNA powstaje w jednym cyklu jeżeli w mieszaninie była: i) jedna cząsteczka DNA; ii) dwie cząsteczki DNA? Ile kopii cząsteczek DNA powstaje z jednej cząsteczki wyjściowej po 5 cyklach? Co to jest termocykler? 9. Markery DNA: PCR sekwencje unikalne Jaka wiedza jest niezbędna aby powielić dany fragment DNA przy pomocy PCR? W jakich fragmentach genów można wykryć polimorfizm za pomocą PCR? Z czego wynika obecność lub brak prążka na żelu w przypadku analizy PCR sekwencji unikalnych? Wyjaśnij dlaczego markery PCR są dominujące? Jakie zastosowanie ma reakcja PCR geny KatG u Mycobactrerium tuberculosis? Prof. dr hab. Roman Zielinski 23

24 Zagadnienia Markery DNA: PCR sekwencje powtarzalne Co oznacza skrót SSR? Co to są mikrosatelity? Z czego wynika kodominacja markerów mikrosatelitarnych? Jaka cecha mikrosatelitów pozwala rozróżniać osobniki? Czy mikrosatelity człowieka występują we wszystkich chromosomach? uzasadnij odpowiedź. Czy mikrosatelity człowieka są dla niego unikalne? uzasadnij odpowiedź. O czym może świadczyć konserwacja mikrosatelitów u kręgowców? 11. Markery DNA: SNPs Wyjaśnij znaczenie skrótu SNP. Jaki typ zmian leży u podłoża SNP? Czy polimorfizm na poziomie nukleotydów zawsze prowadzi do polimorfizmu na poziomie białka? Uzasadnij odpowiedź. Jakie znaczenie może mieć SNP w genomie człowieka? Gdzie można znaleźć informacje o SNP w genomie człowieka? Centre for Evolution, Genomics and Biomathematics, e-gene prof.romanzielinski@gmail.com Prof. dr hab. Roman Zielinski 24