Badania nad amelogenesis imperfecta w oparciu o model myszy transgenicznych z nadekspresją. folistatyny

Transkrypt

1 Czas. Stomatol., 2010, 63, 4, Polish Dental Society Badania nad amelogenesis imperfecta w oparciu o model myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny* Amelogenesis imperfecta studies based on a model of transgenic mice overexpressing follistatin Jarosław Gibek 1, Elżbieta Pawłowska 1, Bogumiła Polaszczyk 2, Joanna Szczepańska 1 Z Zakładu Stomatologii Wieku Rozwojowego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 1 Kierownik: prof. dr hab. n. med. M. Wochna-Sobańska Ze Zwierzętarnii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 2 Kierownik: inż. zootechnik J. Komos Summary Introduction: The function of various proteins and signaling molecules during amelogenesis is not fully recognized. Disorders occurring at various stages of enamel formation can manifest symptoms of amelogenesis imperfecta (AI). Aim of the study: To compare phenotypes of structure and chemical composition of hard dental tissues in transgenic mice overexpressing follistatin vs. standard mice. Material and method: The study involved ten transgenic mice and ten standard ones. After they had been sacrificed, alveolar processes containing mandibular and maxillary molars were prepared. Subsequently, the teeth images were analysed following X-ray examination and SEM scanning. Results: The examination of the collected material revealed major dental morphological differences between transgenic mice and standard mice. Conclusion: Animal models of disorders of human dentition are a useful means of examining pathologies of dental tissues. Streszczenie Wstęp: rola poszczególnych protein i cząsteczek sygnałowych w procesie amelogenezy nie jest do końca poznana. Zaburzenia powstałe na różnych etapach formowania się szkliwa manifestować się mogą objawami amelogenesis imperfecta (AI). Cel pracy: porównanie fenotypów budowy oraz składu chemicznego tkanek zmineralizowanych zębów myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny w porównaniu z myszami standardowymi. Materiał i metody: materiał do badań stanowiło 10 myszy transgenicznych oraz 10 myszy standardowych. Po uśmierceniu zwierząt wypreparowywano bloczki kostne zawierające zęby trzonowe szczęki oraz żuchwy, które następnie poddano badaniu mikroanalizatorem rentgenowskim oraz analizie na podstawie zdjęć wykonanych w skaningowym mikroskopie elektronowym. Wyniki: badania materiału pobranego od zwierząt wykazały znaczne różnice w budowie morfologicznej zębów myszy transgenicznych w porównaniu z myszami standardowym. Podsumowanie: modele zwierzęce zaburzeń uzębienia występujących u ludzi są użytecznym narzędziem badania tkanek zęba dotkniętych zmianami patologicznymi. KEYWORDS: amelogenesis imperfect, animal model, follistatin overexpression HASŁA INDEKSOWE: amelogenesis imperfecta, model zwierzęcy, nadekspresja folistatyny *Praca zrealizowana w ramach pracy własnej UM nr

2 J. Gibek i in. Czas. Stomatol., Wstęp Szkliwo jest najtwardszą i jedyną zmineralizowaną tkanką ludzkiego organizmu pochodzenia nabłonkowego. Nie ma zdolności do gojenia się ani do regeneracji, co jest związane z faktem utraty komórek szkliwotwórczych, do której dochodzi wkrótce po wyrznięciu się zęba [5, 8]. Proces formowania się tej tkanki podlega kontroli ze strony licznych białek morfogenetycznych oraz cząsteczek sygnałowych. Najistotniejszymi proteinami odpowiedzialnymi za amelogenezę jest amelogenina i ameloblastyna, stanowiące ponad 90% wszystkich białek szkliwa. Pozostałe istotne proteiny to między innymi enamelina, folistatyna i tuftelina [9, 20, 21]. Zaburzenia pojawiające się na którymkolwiek z etapów amelogenezy, kontrolowanych przez powyższe proteiny, mogą skutkować wystąpieniem wrodzonych uszkodzeń szkliwa (amelogenesis imperfecta AI). Pojęcie amelogenesis imperfecta obejmuje wiele genetycznie uwarunkowanych defektów szkliwa, mogących dotyczyć zarówno uzębienia mlecznego jak i stałego oraz jednocześnie obejmować inne tkanki pochodzenia ektodermalnego włosy, skórę czy paznokcie. Częstość występowania AI w populacji jest szacowana od 1:14000 w Ameryce Północnej do 1:700 w Szwecji [3, 7]. We współczesnych klasyfikacjach wyróżnia się odmiany amelogenesis imperfecta związane z hipoplazją, hipomineralizacją, hipomaturacją szkliwa oraz postacie połączone z taurodontyzmem. Pod względem genetycznym wyróżnia się typy dziedziczone w sposób autosomalny dominujący, autosomalny recesywny oraz sprzężone z chromosomem X [2, 7]. Amelogenesis imperfecta w łagodnej postaci objawiać się może jedynie przebarwieniami zębów, jednak w większości przypadków dochodzi do zdecydowanie poważniejszych zaburzeń w obrębie narządu żucia. Powierzchnia zębów pokryta jest nieregularnymi dołkami i zagłębieniami, warstwa szkliwa jest cienka a ono samo jest chropowate i słabo zmineralizowane. Znaczna podatność na ścieranie może prowadzić do zmian kształtu lub wręcz do ścierania całych koron klinicznych, co przyczyniać się może do powstawania licznych powikłań [10, 26]. Rola folistatyny, jako cząsteczki sygnałowej biorącej udział w regulacji morfogenezy zęba, jest najmniej poznanym czynnikiem wpływającym na proces tworzenia zęba. Odgrywa bardzo ważną rolę w embriogenezie, rozwoju i życiu człowieka. Folistatyna jest zewnątrzkomórkową glikoproteiną, która jest wykrywana w pewnych okresach rozwoju w licznych tkankach: łożysku, jajniku, jądrach, szpiku, chrząstkach, trzustce, wątrobie, płucach, czy też w zębach. Nadekspresja folistatyny powoduje silne hamowanie sygnałowania min. nadrodziny TGFβ (ang. transforming growth factor), co ma wpływ na zaburzenia procesu morfogenezy na różnych etapach rozwoju zęba [19, 23]. Pozyskiwanie od ludzi materiału do analizy struktur twardych tkanek zębów dotkniętych zaburzeniami jest utrudnione, co spowodowało konieczność znalezienia odpowiedniego modelu zwierzęcego. Generowanie u myszy nadekspresji lub delecji określonych genów związanych z ekspresją białek morfogenetycznych szkliwa manifestuje się różnymi typami zaburzeń amelogenezy określanych jako AI [9, 24]. Przykładem modeli zwierzęcych, u których wygenerowano różne typy amelogenesis imperfecta są: autosomalnie recesywna mutacja wywołana u szczura w chromosomie 14 [15] lub u myszy w chromosomie 5 (odpowiadającym ludzkiemu 4q21) [20], myszy transgeniczne z nadekspresją ameloblastyny 218

3 2010, 63, 4 Myszy transgeniczne z nadekspresją folistatyny [17], myszy z niedoborem enamelizyny (metaloproteinazy-20) [5], myszy z mutacją genu MSX2-/ typu knock-in [1]. Jedną z takich protein biorących udział w procesie formowania szkliwa jest folistatyna, a myszy transgeniczne z nadekspresją folistatyny są właściwym modelem zwierzęcym do badania morfologii zębów dotkniętych tą patologią. Cel pracy Celem badań było porównanie fenotypów budowy oraz składu chemicznego tkanek twardych zębów myszy transgenicznych ze sztucznie zaplanowanym defektem genetycznym związanym z nadekspresją folistatyny w porównaniu z myszami standardowymi. Materiał i metody Do badań wykorzystano 10 myszy transgenicznych powstałych poprzez wprowadzenie do genomu zapłodnionej komórki jajowej odpowiedniego konstruktu genetycznego. Użyte w obecnym badaniu myszy transgeniczne uzyskuje się w wyniku skrzyżowania myszy C57BL/6J-Tg K14-Fst z hodowli, w której kojarzy się zwierzęta wsobnie lub wstecznie ze szczepem myszy standardowych C57BL/6J. Z pierwszego pokolenia chimer selekcjonuje się potomstwo zawierające transgen i wyprowadza hodowlę. W tym przypadku każda komórka myszy transgenicznej posiadała dodatkowy obcy konstrukt zawierający gen folistatyny. Ekspresja wprowadzonego genu występowała pod warunkiem uaktywnienia obecnego ludzkiego promotora keratyny 14 we wprowadzonym DNA, czyli w komórkach nabłonka. Skutkiem modyfikacji kodu genetycznego zwierząt była nadekspresja folistatyny (FOE follistatin overexpressing mice), w wyniku czego zaobserwowano m. in. cechy uzębienia charakterystyczne dla amelogenesis imperfecta hereditaria. Zwierzęta były namnażane poprzez krzyżówkę osobników męskich w wieku 3 miesięcy (szczep TgN(K14-Fst)C57Bl/6J) i żeńskich w wieku 3 miesięcy (standardowy szczep C57Bl). Stosunek ilościowy samców do samic był równy 1:1. Warunki rozmnażania 1 miot na klatkę (w tym samica i samiec). Następnie samice ciężarne były odstawione od samców i przez okres 3 tygodni wychowywały młode. Hodowlę zwierząt i doświadczenia wykonano w Zwierzętarni Wydziału Lekarskiego UM w Łodzi. Grupę porównawczą stanowiło 10 zwierząt standardowych (Wild Type WT). W celu identyfikacji myszy izolowano DNA z materiału pobranego podczas procedury znakowania. Po izolacji materiału genetycznego wykonywano reakcję PCR (ang. polymerase chain reaction), zaś jej wynik odczytywany był w procesie elektroforezy. Obydwie grupy zwierząt wykorzystane w badaniu były karmione dietą standardową. Po 21 dniach od narodzin myszy były odstawione od matek i uśmiercone poprzez przerwanie ciągłości rdzenia kręgowego. Następnie pobrano materiał do badań, który stanowiły bloczki kostne zawierające zęby trzonowe szczęki oraz żuchwy. Badania morfologiczne Wypreparowane bloczki kostne zawierające zęby trzonowe przechowywane były w 0,4% azydku sodu w temperaturze 4 o C. Oceny fenotypu dokonywano na podstawie zdjęć wykonywanych w skaningowym mikroskopie elektronowym Vega 5135 MM Tescan. Po oczyszczeniu zębów w myjce ultradźwiękowej wykonywano zdjęcia powierzchni zębów trzonowych (całe bloczki kostne) oraz zdjęcia przekrojów zębów. Po wykonaniu przekroju próbki na wysokości guzka bliższego pierwszego zęba trzonowego, powierzchnia przekroju była wytra- 219

4 J. Gibek i in. Czas. Stomatol., wiana przez 30 sekund 36% kwasem ortofosforowym a następnie oczyszczana z pozostałych substancji organicznych poprzez umieszczenie na 24 godziny w acetonie. Pomiary długości i szerokości koron klinicznych zębów trzonowych wykonywane były na zdjęciach z mikroskopu skaningowego z użyciem programu graficznego ImageJ. Program ten oparty na technologii JAVA umożliwia m.in. wyświetlanie, edytowanie i analizowanie plików graficznych zapisanych w różnych formatach. Umożliwia także obliczanie powierzchni, czy mierzenie długości odcinków i kątów zawartych pomiędzy nimi. Wymiar przednio-tylny zębów trzonowych myszy transgenicznej określano mierząc maksymalną odległości pomiędzy punktem stycznym a najdalej mezjalnie wysuniętym punktem bruzdy pomiędzy guzkami bliższymi pierwszego zęba trzonowego, bądź najdalej dystalnie wysuniętym punktem powierzchni żującej drugiego zęba trzonowego. Długość drugich zębów trzonowych myszy dzikich była mierzona pomiędzy punktami stycznymi. Wymiar poprzeczny określano prowadząc linię pomiędzy szczytami guzków drugiego rzędu (protoconid i metaconid). Mierzono odległość pomiędzy punktami znajdującymi się na przecięciu tak poprowadzonej linii z brzegiem zęba (ryc. 1). Oznaczenie wymiarów zębów trzonowych myszy transgenicznych w związku ze znacznym zniszczeniem powierzchni żujących niekiedy powodowało trudności. Szczególnie utrudnione były pomiary drugich zębów trzonowych w szczęce. W przypadku dużej destrukcji tkanek powierzchnia zęba była dzielona linią poprowadzoną pomiędzy guzkami na część policzkową i językową. Następnie przeprowadzano prostopadłą do niej linię. Mierzono odległość pomiędzy punktami przecięcia się linii z krawędzią zęba. Analiza dokonana za pomocą programu Ryc. 1. Zęby trzonowe myszy standardowej żółtymi strzałkami zaznaczone wymiary przednio tylny i poprzeczny pierwszego i drugiego zęba trzonowego, czerwonymi strzałkami zaznaczone miejsca dokonania analizy składu chemicznego powierzchni zębów trzonowych (pow. 100x). ImageJ dostarczała wyniki podane w pikselach. Po zmierzeniu w podobny sposób belki pomiarowej o znanej długości (1 mm) obliczono wymiary zębów w milimetrach. Stopień starcia tkanek twardych na powierzchni żującej oceniano na podstawie trzy stopniowej skali, opracowanej przez autorów na potrzeby badań, według następujących kryteriów: I o starcie szczytów guzków; II o starcie guzków z odsłonięciem zębiny; III o znaczne starcie zębiny lub widoczne obnażenie miazgi. Dla identyfikacji i opisu poszczególnych guzków przyjęto nazewnictwo zaproponowane przez Cope`a i Osborna (ryc. 2) [4, 22]. Badania mikroanalityczne Skład chemiczny powierzchni zębów trzonowych był analizowany z użyciem mikroanalizatora rentgenowskiego EDX Link 300 ISIS (Oxford Instruments). Analizowane były dane pozyskane z bruzdy dalszej zarówno pierwszego jak i drugiego zęba trzonowego. 220

5 2010, 63, 4 Myszy transgeniczne z nadekspresją folistatyny Ryc. 2. Nazewnictwo guzków wg Cope`a i Osborna na przykładzie pierwszego zęba trzonowego żuchwy myszy standardowej (pow. 100x). Badania z użyciem SEM i mikroanalizatora rtg wykonano w Katedrze Fizyki Ciała Stałego Uniwersytetu Łódzkiego. Wyniki badań poddano analizie statystycznej testem t Studenta, przy poziomie istotności p< 0,05. Wybór testu był podyktowany rozkładem normalnym cechy w porównywanych grupach. Charakter rozkładu badanych cech w analizowanych grupach sprawdzono przy pomocy testu Shapiro-Wilka. Na badania uzyskano zezwolenie Lokalnej Komisji Etyki ds. Badań na Zwierzętach w Łodzi (uchwała nr 10/ŁB 450/2009) i Ministerstwa Ochrony Środowiska. zębów trzonowych o prawidłowej budowie powierzchni żującej (ryc. 1). W przypadku pierwszego zęba trzonowego wyróżnić można 3 pary guzków układających się w poprzeczne rzędy, zaś cała powierzchnia żująca pokryta jest warstwą szkliwa. Guzki są ostro zakończone i nie obserwuje się na ich powierzchni patologicznego starcia. Widoczne na powierzchni zębów pęknięcia spowodowane zostały próżnią konieczną do wykonania zdjęć w mikroskopie skaningowym. Uzębienie myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny (ryc. 3) charakteryzuje się brakiem trzeciego zęba trzonowego oraz pewnymi cechami typowymi dla amelogenesis imperfecta. We wszystkich przypadkach obserwowano nadmierne ścieranie się szkliwa, miejscami jego całkowity brak, co jest dobrze widoczne na szczytach guzków pierwszego zęba trzonowego. Zauważalne są także zaburzenia w budowie morfologicznej koron zębów trzonowych brak polaryzacji, czyli rozdzielenia na guzki policzkowe i podniebienne (bądź ję- Wyniki Badania morfologiczne W uzębieniu myszy standardowej zarówno w szczęce, jak i w żuchwie występuje 6 Ryc. 3. Zęby trzonowe myszy transgenicznej zaburzenia budowy powierzchni żującej (pow. 100x). 221

6 J. Gibek i in. Czas. Stomatol., do zniszczenia sklepienia komory na znacznej powierzchni. Ocenie poddano także wymiary zębów, stwierdzając statystycznie istotne różnice między długością I i II zęba trzonowego w szczęce i żuchwie zarówno myszy standardowych jak i transgenicznych (ryc. 5, 6; tab. 1, 2). U myszy Ryc. 4. Ząb trzonowy myszy transgenicznej III stopień starcia tkanek twardych (pow. 100x). zykowe), ich odwrotne podstawy oraz charakterystyczne obręcze szkliwne, szczególnie wyraźnie widoczne na przykładzie drugiego zęba trzonowego (ryc. 3). Guzki są niższe i mniej wyraźnie zaznaczone niż u myszy dzikich. Utrudnione jest także odróżnienie poszczególnych guzków. Na przykładzie pierwszego zęba trzonowego (ryc. 3) można zauważyć dość dobrze zarysowane guzki drugiego rzędu protoconid oraz metaconid. Podobnie zaznaczony jest guzek dalszy wewnętrzny (entoconid), podczas gdy guzek dalszy zewnętrzny (hypoconid) nie jest widoczny. Guzki pierwszego rzędu (ang. vestibular et lingual anteroconid) są płaskie i postrzępione. U 8 myszy transgenicznych starcie powierzchni żującej zębów było nieznaczne bądź średnio zaawansowane pierwszego albo drugiego stopnia. W dwóch przypadkach zaobserwowano bardzo silne zniszczenie struktury zębów. Na rycinie 4 widoczny jest zachowany pierwszy ząb trzonowy myszy, w wyniku starcia tkanek twardych doszło Ryc. 5. Szerokość (sz.) i długość (dł.) pierwszego (I) i drugiego (II) zęba trzonowego szczęki u myszy dzikich (D) i transgenicznych (T) z odchyleniami standardowymi (pow. 5000x). Ryc. 6. Szerokość (sz.) i długość (dł.) pierwszego (I) i drugiego (II) zęba trzonowego żuchwy u myszy dzikich (D) i transgenicznych (T) z odchyleniami standardowymi (pow. 5000x). standardowych długość pierwszego zęba trzonowego wynosiła średnio 1,29 mm, zaś drugiego 0,89 mm. W przypadku zwierząt transge- 222

7 2010, 63, 4 Myszy transgeniczne z nadekspresją folistatyny T a b e l a 1. Porównanie wymiarów (długość dł i szerokość sz) (mm) pierwszych i drugich zębów trzonowych szczęki u myszy dzikich (D) i transgenicznych (T) śr sd n xdśr poziom istotności D I-sz.sz. 0,758 0, , D II sz.sz. 0,71 0, , t= 1,60267 p= 0,1 D I-sz.dł. 1,266 0, , D II sz.dł. 0,948 0, , t=23,37982 p = 0,001 T I-sz.sz. 0,568 0, , T II sz.sz. 0,588 0, , t=-0,86251 p= 0,4 T I-sz.dł. 1,026 0, , T II sz.dł. 0,904 0, , t=3,64545 p= 0,01 D I-sz.sz. 0,758 0, , T I-sz.sz. 0,568 0, , t=6,64257 p = 0,001 D II sz.sz. 0,71 0, , T II sz.sz. 0,588 0, , t=4,91337 p = 0,001 D I-sz.dł. 1,266 0, , T I-sz.dł. 1,026 0, , t=7,70777 p = 0,001 D II sz.dł. 0,948 0, , T II sz.dł. 0,904 0, , t=2,40232 p= 0,04 nicznych odpowiednio: 1,22 mm i 0,75 mm. Średnia szerokość pierwszego zęba trzonowego myszy standardowej wynosiła 0,68 mm, podczas gdy drugiego zęba 0,62 mm. U myszy transgenicznych średnia szerokość pierwszego zęba trzonowego wyniosła 0,56 mm, natomiast drugiego 0,53 mm (różnice statystycznie nieistotne). Długości i szerokości odpowiednich zębów trzonowych myszy transgenicznych były znamiennie statystycznie mniejsze w porównaniu do zębów zwierząt dzikich. W mikroskopie skaningowym analizowano zdjęcia przekrojów przez pierwszy ząb trzonowy. W przypadku myszy standardowych zauważono prawidłową budowę szkliwa (ryc. 7). W środkowej części widoczne były gęsto upakowane pryzmaty oraz między nimi przestrzenie międzypryzmatyczne. Przy dużym powiększeniu powierzchni zębiny zęba trzonowego myszy dzikiej widać kanalikową strukturę tkanki (ryc. 8). Porównanie przekroju zęba trzonowego myszy standardowej (ryc. 9) i myszy FOE (ryc. 10) ukazuje zatarcie regularnych struktur szkliwa i zębiny u myszy z nadekspresją folistatyny. W przypadku myszy dzikiej widoczny jest nieprostolinijny przebieg kana- 223

8 J. Gibek i in. Czas. Stomatol., T a b e l a 2. Porównanie wymiarów (długość dł i szerokość sz) (mm) pierwszych i drugich zębów trzonowych żuchwy u myszy dzikich (D) i transgenicznych (T) śr sd N Xdśr poziom istotności D I-ż.sz. 0,62 0, , D II ż.sz. 0,56 0, , t=1,83625 p= 0,9 D I-ż.dł. 1,35 0, , D II ż.dł. 0,88 0, , t=27,05210 p = 0,001 T I-ż.sz. 0,52 0, , T II ż.sz. 0,48 0, , t=1,68939 p= 0,1 T I-ż.dł. 1,15 0, , T II ż.dł. 0,71 0, , t=31,11358 p = 0,001 D I-ż.sz. 0,62 0,08 9 0, T I-ż.sz. 0,52 0, , t=3,31399 p = 0,01 D II ż.sz. 0,56 0,06 9 0, T II ż.sz. 0,48 0, , t=3,01313 p = 0,02 D I-ż.dł. 1,31 0,04 9 0, T I-ż.dł. 1,15 0, , t=11,72107 p = 0,001 D II ż.dł. 0,88 0,04 9 0, T II ż.dł. 0,71 0, , t=11,49254 p = 0,001 lików w zębinie oraz regularnie ułożone kryształy formujące szkliwo. Obraz szkliwa zębów myszy FOE jest zatarty, nie są widoczne poszczególne elementy strukturalne wchodzące w skład prawidłowego szkliwa. Podobnie w zębinie nie jest widoczna prawidłowa struktura tej tkanki. Badania mikroanalityczne Za pomocą mikroanalizatora rentgenowskiego dokonano analizy składu chemicznego powierzchni zębów trzonowych myszy zarówno standardowych (WT) jak i transgenicznych z nadekspresją folistatyny (ryc. 11). Badaniu poddane zostały pierwsze i drugie zęby trzonowe. W przypadku myszy transgenicznych zawartość zarówno wapnia jak i fosforu była niższa niż u myszy standardowych. U myszy standardowych zawartość fosforu w pierwszym zębie trzonowego wynosiła jednakowo 13,34% w szczęce i żuchwie, w porównaniu z 12,85% w szczęce i 11,85% w żuchwie u myszy transgenicznych. Zawartość wapnia w szczęce wynosiła odpowiednio: 22,29% dla myszy transgenicznej oraz 23,38% dla myszy standardowej. Wszystkie różnice badanych 224

9 2010, 63, 4 Myszy transgeniczne z nadekspresją folistatyny Ryc. 7. Szkliwo myszy standardowej (WT) przekrój czołowy wykonany na wysokości guzków bliższych pierwszego zęba trzonowego (pow. 5000x). Ryc. 8 Szkliwo myszy standardowej (WT) przekrój czołowy wykonany na wysokości guzków bliższych pierwszego zęba trzonowego (pow. 1000x). Ryc. 9. Zębina myszy standardowej (WT) przekrój czołowy wykonany na wysokości pierwszego zęba trzonowego (pow. 5000x). Ryc. 10. Szkliwo myszy transgenicznej (FOE) przekrój czołowy wykonany na wysokości pierwszego zęba trzonowego (pow. 2000x). 225

10 J. Gibek i in. Czas. Stomatol., Ryc. 11. Zawartość pierwiastków (wagowo-procentowa) w powierzchownej warstwie szkliwa zębów trzonowych myszy standardowych i transgenicznych. pierwiastków między myszami standardowymi i transgenicznymi okazały się nieistotne statystycznie. Stosunek ilościowy wapnia do fosforu u myszy FOE wyniósł 1,77, zaś u myszy dzikich 1,85. Omówienie wyników i dyskusja Odpowiedzialne za syntezę folistatyny mrna jest wykrywane w łożysku myszy już w 5 dniu życia płodowego [14]. W późniejszych okresach pojawia się w różnych tkankach w tyłomózgowiu, jajnikach, jądrach czy w zębach. U myszy transgenicznych z sztucznie zaplanowanym defektem genetycznym manifestującym się nadekspresją folistatyny pierwszą zauważalną cechą fenotypową jest rzadkie, nieregularne futro. Miejscami widoczna jest odsłonięta, napięta i nieco lśniąca skóra. Badania histologiczne skóry nie wykazały przyczyn występowania tego typu zaburzeń [11]. Zwierzęta transgeniczne są ponadto mniejsze i lżejsze niż myszy dzikie. Dorosłe osobniki FOE charakteryzują się także większymi uszami oraz nieznacznie dłuższym ogonem od myszy dzikich [25]. Guo i wsp. [11] wykonali badania na zwierzętach transgenicznych z nadekspresją folistatyny, w których oceniali różnice fenotypowe i morfologiczne, porównując je ze zwierzętami dzikimi. W toku badań wykazali, że zarówno samce jak i samice wykazujące najsilniejszą nadekspresję folistatyny są bezpłodne. Jądra samców transgenicznych były mniejsze niż w przypadku zwierząt dzikich. W badaniach histologicznych stwierdzono hiperplazję komórek Leydiga. U samic zauważono podobne zaburzenia wielkości jajników oraz macicy [11]. Oprócz wymienionych cech ogólnoustrojowych, zwierzęta urodzone z defektem genetycznym, powodującym nadekspresję folistatyny mają uzębienie charakterystyczne dla wrodzonych wad formowania się szkliwa. W niniejszych badaniach, wykonanych na materiale pochodzącym od takich zwierząt, stwierdzono różnice, zarówno w budowie morfologicznej, jak i w składzie chemicznym powierzchni zębów trzonowych w porównaniu ze zwierzętami standardowymi. Viriot i wsp. [22] poddali badaniu mysie embriony będące na różnym etapie rozwoju. Oceniali stopień uformowania się pierwszego zęba trzonowego. Wykazali, że powierzchnia żująca zęba trzonowego myszy zbudowana jest z trzech par guzków. Na podstawie materiału pochodzącego od coraz starszych embrionów ustalili, że w 14 dniu życia płodowego, jako pierwsze rozwijają się guzki drugiego rzędu (protoconid oraz metaconid). Następnie, około 15 dnia życia płodowego pojawiają się guzki pierwszego rzędu (vestibular anteroconid et lingua anteroconid) zaś jako ostatnie guzki trzeciego rzędu (hypoconid et entoconid). We wszystkich badanych przypadkach uzębienie myszy standardowych było podobne do opisywanego przez innych autorów [3, 19]. 226

11 2010, 63, 4 Myszy transgeniczne z nadekspresją folistatyny U myszy FOE układ guzków jest zaburzony, nie występuje ich polaryzacja, podstawy są odwrócone a także widoczne są charakterystyczne obręcze szkliwne. Wang i wsp. [24] wykonali badania, w których porównali fenotypy zębów siecznych myszy z nadekspresją folistatyny, myszy z zablokowaną ekspresją folistatyny oraz myszy dzikich. W badaniach wykorzystane zostały miesięczne zwierzęta. Na przekrojach zębów siecznych myszy dzikich zauważono, że powierzchnia wargowa, w przeciwieństwie do językowej, jest pokryta szkliwem, podczas gdy u myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny szkliwo na powierzchni zębów siecznych nie występuje. Analiza zębów siecznych zwierząt z zablokowaną ekspresją folistatyny pozwoliła uwidocznić na powierzchni językowej komórki, morfologicznie odpowiadające ameloblastom, jednak ich układ był zdecydowanie mniej regularny niż na powierzchni wargowej. Sugeruje to zdaniem autorów, że funkcja folistatyny została częściowo zrównoważona przez inne molekuły. W celu potwierdzenia tej tezy autorzy zbadali ekspresję innych cząsteczek odpowiedzialnych za amelogenezę, m.in. amelogeniny, ameloblastyny i metaloproteinazy-20. U zwierząt z nadekspresją folistatyny ekspresja wszystkich molekuł była na powierzchni wargowej hamowana, zaś u myszy z zablokowaną ekspresją folistatyny zarówno na powierzchni wargowej jak i językowej wydzielanie wspomnianych molekuł było zachowane na wysokim poziomie. Wyniki uzyskane przez ww. autorów pozwoliły im stwierdzić, że nadmierna ekspresja folistatyny hamuje różnicowanie ameloblastów i jest odpowiedzialna za występowanie ubytków szkliwa. W innych badaniach Wang i wsp. [23] ocenili wpływ folistatyny na formowanie się zębów trzonowych u myszy. Podczas powstawania zawiązka zęba, w stadium czapeczki i dzwona, na szczytach przyszłych guzków z nabłonka szkliwotwórczego formują się węzły szkliwne (enamel knots), które odpowiadać będą za kształt zęba. Następnie z komórek nabłonka szkliwotwórczego i z komórek mezenchymalnych różnicują się amelo i odontoblasty. Cały ten proces podlega ścisłej kontroli ze strony czynników wzrostu w tym nadrodziny TGFβ. Zaburzenia pojawiające się w funkcji wspomnianych molekuł mogą skutkować poważnymi zaburzeniami ogólnoustrojowymi, prowadząc nawet do rozwoju choroby nowotworowej. Sztucznie spowodowana u myszy nadekspresja folistatyny manifestowała się m.in. zaburzeniami w budowie zębów trzonowych. Autorzy w swoich badaniach zauważyli, iż nieprawidłowości w budowie powierzchni żujących w znacznie większym stopniu dotykają zębów szczęki oraz są wyraźniej zaznaczone w przypadku drugich zębów trzonowych. U kilku badanych w niniejszej pracy myszy niemożliwe było rozróżnienie poszczególnych guzków, zaś w pozostałych przypadkach guzki były niskie i zaburzona była ich polaryzacja. Może być to spowodowane różnym stopniem ekspresji folistatyny bądź też różną wrażliwością poszczególnych zębów na sygnałowanie ze strony nadrodziny TGFβ. Kolejną istotną cechą odnotowaną u myszy FOE była absencja trzecich zębów trzonowych zarówno w szczęce jak i w żuchwie. Prawdopodobnie jest to związane z różnymi terminami powstawania zawiązków poszczególnych zębów trzonowych. Podczas gdy pierwszy i drugi ząb przed 16 dniem życia wewnątrzmacicznego znajdują się już w stadium czapeczki, trzeci ząb trzonowy osiąga ten etap rozwoju w okresie okołoporodowym. Nadekspresja folistatyny może skutkować niedoborem tkanki, w wyniku czego najpóźniej rozwijający się ząb nie powstaje. Ten mechanizm może tłumaczyć fakt, że u ludzi najczęściej występuje agenezja 227

12 J. Gibek i in. Czas. Stomatol., zęba, który z danej grupy zębów rozwija się jako ostatni [6, 16, 23]. Z badań Pawłowskiej i wsp. [18] wynika, że w przypadku ludzkich zębów zauważalna jest zależność między wymiarami drugiego a trzeciego zęba trzonowego. W żuchwie istotnie dłuższa była ósemka, w przeciwieństwie do szczęki, gdzie większy wymiar mezjalno-dystalny miał drugi ząb trzonowy. Według autorek świadczyć to może o braku tendencji do zanikania zawiązków trzecich zębów trzonowych w żuchwie. Jedna z przytaczanych przez autorki teorii głosi, że w przypadku hipodoncji dochodzi do kompensacyjnego zwiększenia wymiarów innych zębów. Przykładowo w sytuacji, gdy występuje wrodzony brak bocznych zębów siecznych dochodzi do zwiększenia wymiarów siekaczy przyśrodkowych. Zupełnie inaczej przedstawiają się doniesienia Kiesera i wsp. [12] którzy zauważyli, że większe wymiary jednego zęba z danej grupy powodują zwiększone wymiary pozostałych zębów, analogicznie mniejsze wymiary jednego zęba indukują zmniejszenie kolejnych. Są to wyniki zgodne z uzyskanymi w naszych badaniach na modelu zwierzęcym. Agenezja trzecich zębów trzonowych myszy transgenicznych wiąże się ze zmniejszeniem zarówno wymiaru przednio-tylnego (wynik statystycznie znamienny), jak i poprzecznego pierwszego i drugiego zęba trzonowego w porównaniu do odpowiednich zębów myszy standardowych. Lyaruu i wsp. [13] poddali badaniom myszy transgeniczne z deficytem Ae-2 (anion Exchanger-2). Porównywali zwierzęta transgeniczne w wieku od 6. do 12. tygodni ze zwierzętami zdrowymi w podobnym wieku. Analizie dotyczyła zarówno morfologii zębów trzonowych, jak i składu chemiczny szkliwa. Dokonano analizy przekrojów zębów trzonowych w mikroskopie elektronowym, stwierdzając brak struktury pryzmatycznej szkliwa nawet po uprzednim wytrawieniu. Analizując skład chemiczny powierzchni szkliwa autorzy stwierdzili istotne różnice w zawartości zarówno wapnia jak i fosforu na niekorzyść myszy transgenicznych. Badaniu poddane zostały zęby trzonowe oraz sieczne. Różnice w składzie chemicznym szkliwa zdecydowanie wyraźniej zaznaczone były w zębach siecznych. Podobne wyniki, potwierdzające nasze obserwacje, uzyskali Gibson i wsp. [9], którzy badali myszy transgeniczne charakteryzujące się deficytem amelogeniny. W badaniach wykorzystywane były 16 tygodniowe zwierzęta, zaś analizowano budowę morfologiczną zębów trzonowych i siecznych, stwierdzając znaczne zaburzenia formowania się szkliwa w porównaniu z osobnikami dzikimi. Zęby trzonowe pokryte były szkliwem o zredukowanej grubości, miejscami zauważalne były jego braki. Wykonane w mikroskopie elektronowym zdjęcia przekrojów zębów uwidoczniły brak pryzmatycznej struktury szkliwa. Podsumowanie Modele zwierzęce zaburzeń uzębienia występujących u ludzi są użytecznym narzędziem badania tkanek zęba dotkniętych zmianami patologicznymi i mogą służyć udoskonaleniu diagnostyki w celu lepszego prognozowania i planowania skutecznych metod terapeutycznych. Piśmiennictwo 1. Aïoub M, Lézot F, Molla M, Castaneda B, Robert B, Goubin G, Néfussi J R, Berdal A: Msx2 -/ transgenic mice develop compound amelogenesis imperfecta, dentinogenesis imperfecta and periodental osteopetrosis. Bone 2007, 41:

13 2010, 63, 4 Myszy transgeniczne z nadekspresją folistatyny 2. Aldred M J, Savarirayan R, Crawford P J M: Amelogenesis imperfecta: a classification and catalogue for the 21st century. Oral Dis 2003, 9: Bäckman B, Holm A K: Amelogenesis imperfecta: prevalence and incidence in a northern Swedish country. Community Dent Oral Epidemiol 1986, 14: Biggerstaff R H: On the Cope-Osborn Nomenclature for Molar Cusps. J Dent Res 1968, 47: Caterina J J, Skobe Z, Shi J, Ding Y, Simmer J P, Birkedal-Hansen H, Bartlett J D: Enamelysin (Matrix Metalloproteinase 20) deficient mice display an amelogenesis imperfecta phenotype. J Biol Chem 2002, 277, 51: Chang H, Brown C W, Matzuk M M: Genetic analysis of the mammalian transforming growth factor-beta superfamily. Endocr Rev 2002, 23: Crawford P J M, Aldred M, Bloch-Zupan A: Amelogenesis imperfecta. Orphanet J Rare Dis 2007, 2: Fincham A G, Moradian-Oldak J, Simmer J P: The structural biology of the developing dental enamel matrix. J Struct Biol 1999, 30, 126, 3: Gibson C W, Yuan Z A, Hall B, Longenecker G, Chen E, Thyagarajan T, Sreenath T, Wright J T, Decker S, Piddington R, Harrison G, Kulkarni A B: Amelogenin-deficient mice display an amelogenesis imperfecta phenotype. J Biol Chem 2001, 276, 34: Grzybowska A, Gordon A, Zadurska M, Wacińska-Drabińska M, Gajdzik-Plutecka D, Wal A, Sobczak M, Sosnowska-Boroszko A, Remiszewski A: Amelogenesis imperfecta problem wielospecjalistyczny. Dent Med Probl 2003, 40, 2: Guo Q, Kumar T R, Woodruff T, Hadsell L A, DeMayo F J, Matzuk M M: Overexpression of Mouse Follistatin Causes Reproductive Defects in Transgenic Mice. Mol Endocrinol 1998, 12: Kieser J A, Groeneveld H T, Preston C B: On the non-existence of compensatory tooth size interaction in a contemporary human population. J Dent Res 1986, 65, 8: Lyaruu D M, Bronckers A L J J, Mulder L, Mardones P, Medina J F, Kellokumpu S, Oude Elferink R P J, Everts V: The anion exchanger Ae2 is required for enamel maturation in mouse teeth. Matrix Biol 2008, 27, 2: Matzuk M M, Kumar T R, Vassalli A, Bickenbach J R, Roop D R, Jaenisch R, Bradley A: Functional analysis of activins during mammalian development. Nature 1995, 374: Masuyama T, Miyajima K, Ohshima H, Osawa M, Yokoi N, Oikawa T, Taniguchi K: A novel autosomal-recessive mutation, whitish chalk-like teeth, resembling amelogenesis imperfecta, maps to rat chromosome 14 corresponding to human 4q21. Eur J Oral Sci 2005, 113: Nieminen P, Arte S, Tanner D, Paulin L, Alaluusua S, Thesleff I, Pirinen S: Identification of a nonsense mutation in the PAX9 gene in molar oligodontia. Eur J Hum Genet 2001, 9: Paine M L, Wang H J, Luo W, Krebsbach P H, Snead M L: A transgenic animal model resembling amelogenesis imperfecta related to ameloblastin overexpression. J Biol Chem 2003, 278: Pawłowska E, Szczepańska J: Cechy różnicowe górnych i dolnych drugich oraz trzecich zębów trzonowych. Czas Stomatol 2008, 61, 9: Ruspita I, Miyoshi K, Muto T, Abe K, Horiguchi T, Noma T: Sp6 downregulation of follistatin gene expression in ameloblasts. J Med Invest 2008, 55: Seedorf H, Springer IN, Grundner-Culemann E, Albers H K, Reis A, Fuchs H, Hrabe de Angelis M, Açil Y: Amelogenesis Imperfecta in a New animal model a mutation in chromosome 5 (human 4q21). J Dent Res 2004, 83, 8: Smith C: Cellular and Chemical Events 229

14 J. Gibek i in. Czas. Stomatol., During Enamel Maturation. Crit Rev Oral Biol Med 1998, 9: Viriot L, Lesot H, Peterka M, Peterkova R: Cusp development in the mouse first lower molar. Eur Cell Mat 2007, 14, 2: Wang X P, Suomalainem M, Jorgez C J, Matzuk M M, Wankell M, Werner S, Thesleff I: Modulation of activin/bone morphogenetic protein signaling by follistatin is required for the morphogenesis of mouse molar teeth. Dev Dyn 2004, 231: Wang X P, Suomalainen M, Jorgez C J, Matzuk M M, Werner S, Thesleff I: Follistatin Regulates Enamel Patterning in Mouse Incisors by Asymmetrically Inhibiting BMP Signaling and Ameloblast Differentiation. Dev Cell 2004, 7: Wankell M, Munz B, Hubner G, Hans W, Wolf E, Goppelt A, Werner S: Impaired wound healing in transgenic mice overexpressing the activin antagonist follistatin in the epidermis. EMBO J 2001, 20, 19: Zadurska M, Siemińska-Piekarczyk B, Maciejak D, Remiszewski A, Grzybowska A, Gordon A, Wacińska-Drabińska M, Piekarczyk J, Jagielak M, Mierzwińska-Nastalska E, Szczyrek P: Zespołowe leczenie pacjentów z amelogenesis imperfecta doświadczenia własne. Czas Stomatol 2007, 12: Adres autorów: Łódź, ul. Pomorska 251 Tel.: joanna.szczepanska@umed.lodz.pl Paper recived 27 Jannuary 2010 Accepted 7 May