Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis imperfecta based on the chosen model of transgenic mice

Transkrypt

1 J Stoma 2013; 66, 1: Polish Dental Society O R I G I N A L A R T I C L E Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis imperfecta based on the chosen model of transgenic mice Badania mikrotwardości tkanek twardych zębów w przebiegu amelogenesis imperfecta na wybranym modelu myszy transgenicznych Jarosław Gibek 1, Elżbieta Pawłowska 2, Leszek Klimek 3,4, Joanna Szczepańska 1 1 Zakład Stomatologii Wieku Rozwojowego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Polska Department of Paediatric Dentistry, Medical University of Lodz, Poland Head: dr hab. J. Szczepańska; prof. nadzw. 2 Zakład Ortodoncji Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Polska Department of Orthodontics, Medical University of Lodz, Poland Head: dr hab. E. Pawłowska; 3 Zakład Badań Materiałów, Instytut Inżynierii Materiałowej Politechniki Łódzkiej, Polska Department of Materials Research of the Institute of Materials Science and Engineering, Technical University of Lodz, Poland Head: dr hab. inż. L. Klimek 4 Zakład Technik Dentystycznych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Polska Department of Dental Technique, Medical University of Lodz, Poland Head: dr hab. inż. L. Klimek Summary Introduction. Enamel formation is controlled by protein interactive network. Any protein insufficiency or overexpression may result in tissue developmental disorders i.e. amelogenesis imperfecta. Aim of the study. To compare the physical body features, molar teeth characteristics including microhardness of enamel and dentine in the transgenic mice overexpressing follistatin vs the standard mice. Material and methods. The study material was collected from twenty animals who received water with 10 mg/l of sodium fluoride, and twenty animals who received non-fluoridated water. The two groups involved 10 standard animals and 10 transgenics characterized by follistatin overexpression. Molars morphology was assessed in SEM and microhardness of enamel and dentine using Vickers method. Results. Macro- and microscopic differences were revealed between groups of animals. Enamel in standard mice was statistically significantly KEYWORDS: enamel microhardness, amelogenesis imperfecta, follistatin Streszczenie Wprowadzenie. Formowanie się szkliwa podlega kontroli ze strony licznych białek morfogenetycznych i cząsteczek sygnałowych. Zarówno obniżenie, jak i nadmierna ekspresja wielu z nich skutkuje zaburzeniami rozwojowymi tkanki, które mogą manifestować się jako amelogenesis imperfecta. Cel pracy. Porównanie fizycznych cech budowy ciała i uzębienia oraz mikrotwardości szkliwa i zębiny zębów trzonowych myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny i myszy standardowych. Materiał i metody. Materiał do badań został wypreparowany od 20 zwierząt pojonych wodą zawierającą 10 mg/l fluorku sodu i od 20 zwierząt pojonych wodą niefluorkowaną. W każdej grupie znajdowało się 10 zwierząt standardowych i 10 zwierząt transgenicznych z nadekspresją folistatyny. Badaniom poddano morfologię zębów trzonowych myszy w SEM oraz mikrotwardości szkliwa i zębiny metodą Vickersa. Wyniki. Badania wykazały różnice HASŁA INDEKSOWE: mikrotwardość szkliwa, amelogenesis imperfecta, folistatyna 10

2 Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis... J Stoma 2013; 66, 1 harder than the enamel of transgenic mice. Fluoride increased enamel hardness in transgenic mice. No differences were found in dentine between groups of animals. Conclusions. Follistatin overexpression causes a significant reduction in enamel hardness, while not affecting dentine hardness. Lower average hardness values of transgenic mice enamel confirm the essential role played by the follistatin in the process of mineralization of this tissue. No significant difference in the hardness of dentine in genetically modified animals vs standards suggests low impact of follistatin on the process of dentinogenesis. zarówno w budowie makro-, jak i mikroskopowej pomiędzy zwierzętami wchodzącymi w skład dwóch badanych grup. Wykazano istotne statystycznie różnice w twardości szkliwa u myszy dzikich pijących wodę z fluorem i myszy transgenicznych otrzymujących endogennie fluor. W przypadku myszy transgenicznych pijących wodę fluorkowaną uzyskano istotnie wyższe wartości niż u myszy modyfikowanych genetycznie nieotrzymujących fluoru. Istotną różnicę zaobserwowano także pomiędzy zwierzętami dzikimi nie otrzymującymi fluoru i podobnymi myszami transgenicznymi. Nie wykazano różnic w stopniu twardości zębiny. Wnioski. Nadekspresja folistatyny powoduje istotne zmniejszenie twardości szkliwa, jednocześnie nie wywierając wpływu na stopień twardości zębiny. Niższe średnie wartości twardości szkliwa myszy transgenicznych potwierdzają istotną rolę odgrywaną przez folistatynę w procesie mineralizacji tej tkanki. Brak istotnej różnicy w stopniu twardości zębiny pomiędzy zwierzętami modyfikowanymi genetycznie a standardowymi przypuszczalnie może świadczyć o niewielkim wpływie folistatyny na proces dentinogenezy. Introduction The buds of permanent teeth begin to form in humans in approximately the 5 th or 6 th month of fetal life. Correct development is affected by both genetic and environmental factors, including the health and nutrition of both the mother during pregnancy and the child in the early period of life. Important roles in enamel mineralization and maturation are played by a properly functioning endocrine system, as well as adequate levels of vitamins A, C, D, and such minerals as calcium, phosphate and fluoride. 1,2 The development of mouse tooth buds is subject to the same regulation as human odontogenesis. The dentition in a healthy mouse consists of one incisor and three molars in each quadrant. Between the incisor and the molars there is an edentulous gap a diastema. The material for the study of tooth formation in mice is usually the first tooth. For this tooth, germ morphogenesis occurs between days 12 and 20 of fetal life (called ED embryonic days), 3,4 the first signs of which are the formation of buds on ED12,5 in the form of the primary epithelial band. Around ED13,5 local neuromesenchymal cell proliferation occurs Wstęp Proces formowania się zawiązków zębów stałych u ludzi rozpoczyna się ok miesiąca życia płodowego. Na prawidłowy przebieg tego procesu mają wpływ zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, wśród nich stan zdrowia i właściwe odżywianie zarówno matki w trakcie ciąży, jak i dziecka w pierwszych okresach życia. Istotną rolę w mineralizacji i dojrzewaniu szkliwa odgrywa dostarczanie odpowiednich witamin A, C, D i minerałów (jonów wapniowych, fosforanowych, fluorkowych) oraz prawidłowe funkcjonowanie gospodarki hormonalnej organizmu. 1,2 Rozwój zawiązków zębów mysich podlega takim samym regulacjom jak odontogeneza u człowieka. Uzębienie zdrowej myszy składa się z jednego zęba siecznego i trzech zębów trzonowych w każdym kwadrancie uzębienia. Pomiędzy siekaczami i zębami trzonowymi znajduje się odcinek bezzębny diastema. Materiałem do badań nad powstawaniem zębów u myszy najczęściej jest pierwszy ząb trzonowy. Do morfogenezy zawiązka tego zęba dochodzi pomiędzy 12. a 20. dniem życia płodowego (ang. ED embryonic days). 3,4 Pierwsze objawy powstawania zawiązków zauwa- 11

3 J Stoma 2013; 66, 1 Gibek J., Pawłowska E., Klimek L., Szczepańska J. in this area. The consequence of this process is local epithelial proliferation, which delves into the shape of a bud mesenchyme. After another day (ED14,5) the tooth germ passes from the bud stage to the cap stage, which lasts until about the 17 th day of fetal life, after which starts the early part of the bell stage. Around ED18, predentin can be found on top of the forming nodules. During the first days after birth, the amelogenesis and dentinogenesis processes continue to build up the first layer of dentine and enamel. 4,5 The formation of highly organized tissues such as enamel is overseen by numerous morphogenetic proteins and signalling molecules. Disorders occurring at any stage of amelogenesis, controlled by these proteins, can lead to congenital disorders of enamel mineralization known as amelogenesis imperfecta (AI). This concept defines a number of developmental disorders of tissue, for both milk and permanent teeth. Moreover, the defect may involve other structures of ectodermal origin: skin, hair or nails. The current classification is divided into four main types of AI: related hypomineralization, enamel hypoplasia and hypomaturation, and disorders linked to taurodontism. 6-8 Amelogenesis imperfecta associated with enamel hypomineralization is characterized, as in the case of hypomaturation, by the occurrence of enamel of normal thickness but poorly mineralized with reduced hardness in comparison with tissue of normal construction. In cases of hypoplastic AI, however, the enamel is of thinner construction. The tooth surface is covered with characteristic holes and depressions, and sometimes localized tissue deficiencies can be observed. In the case of hypomaturation AI disorder, the tissue undergoes a maturation process. After eruption, the tooth enamel layer is of normal thickness, but as a result of reduction in hardness of the tissue, excessive abrasion and local dentine exposure may occur. Immature tissue is also more susceptible to staining than properly developed enamel One of the main problems of AI disorders is that they are associated with low resistance to abrasion of enamel. The reduced hardness of the tissue associated with inadequate or impaired mineralization occurring at the stage of tissue żane są w ED12,5 pod postacią pierwotnego prążka nabłonkowego. Około ED13,5 dochodzi do miejscowego zagęszczenia komórek neuromezenchymalnych. Następstwem tego procesu jest lokalna proliferacja nabłonka, który zagłębia się w mezenchymę na kształt pączka. Po upływie kolejnego dnia (ED14,5) powstający zawiązek zęba przechodzi z fazy pączka w fazę czapeczki, która trwa do około 17. dnia życia płodowego wtedy rozpoczyna się faza wczesnego dzwonu. Około ED18 na szczytach tworzących się guzków obecna jest prezębina. W trakcie pierwszych dni po narodzeniu wciąż przebiega proces dentinogenezy i amelogenezy, odkładają się pierwsze warstwy zębiny i szkliwa. 4,5 Powstawanie tak wysoce zorganizowanej tkanki jak szkliwo jest poddawane kontroli ze strony licznych białek morfogenetycznych i cząsteczek sygnałowych. Zaburzenia pojawiające się na którymkolwiek z etapów amelogenezy kontrolowanym przez wspomniane białka mogą skutkować wrodzonymi zaburzeniami mineralizacji szkliwa amelogenesis imperfecta (AI). Tym pojęciem określa się szereg zaburzeń rozwojowych tkanki, dotyczących zarówno uzębienia mlecznego, jak i stałego. Ponadto defekt może obejmować inne struktury pochodzenia ektodermalnego skórę, włosy czy paznokcie. W obecnie obowiązujących klasyfikacjach wyróżnia się cztery główne rodzaje AI związane z hipomineralizacją, hipoplazją i hipomaturacją szkliwa oraz zaburzenia połączone z taurodontyzmem. 6-8 Amelogenesis imperfecta związana z hipomineralizacją szkliwa charakteryzuje się, podobnie jak w przypadku hipomaturacji, występowaniem szkliwa o prawidłowej grubości, jednak niedostatecznie zmineralizowanego, o zredukowanej twardości w porównaniu z tkanką o prawidłowej budowie. W przypadkach hipoplastycznego typu AI stwierdza się szkliwo prawidłowej budowy jednak o mniejszej grubości. Powierzchnia zęba pokryta jest charakterystycznymi dołkami, zagłębieniami, niekiedy obserwuje się miejscowe braki tkanki. W hipomaturacyjnej postaci AI zaburzeniu ulega proces dojrzewania tkanki. Po wyrżnięciu się zęba warstwa szkliwa jest prawidłowej grubości, jednak w wyniku obniżenia twardości tkanki, może dochodzić do nadmiernego 12

4 Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis... J Stoma 2013; 66, 1 Materiał i metody W badaniach wykorzystano myszy transgeniczne i standardowe, których hodowla była promaturation may result in the clinical crowns taking a different shape or even, in extreme cases, their destruction. The hardness of enamel, the hardest tissue of the human body, is rated as 5 on the Mohs scale, according to which dentine is rated 3. Over time, a need emerged for a method that allows the degree of hardness of materials to be quantified. One of the most common of these is the Vickers hardness test. 8,9 As it is difficult to perform experimental studies on amelogenesis imperfecta using material derived from humans, another method of analysis of hard tissue structures affected by these pathologies must be found. One way to study the clinical effects of genetic disorders of the substrate is to use an animal model with a planned defect within the gene encoding one of the proteins that control the process of amelogenesis. Such a transgenic mouse model is characterized by overexpression of follistatin (FST) a member of the TGFβ superfamily of proteins. FST plays an important role in the early stages of amelogenesis and is detected in secondary enamel knots, which have a strong influence on the emerging shape of the tooth crown and the number and distribution of nodules. 12,13 Aim of the study The aim of this study was to compare the characteristics, dental morphology and microhardness of enamel and dentine of molars from transgenic mice overexpressing follistatin with those of standard mice. Material and methods The study used transgenic mice and the standard mice obtained from the Department of Animal Medicine, Medical University of Lodz. The effect of modifying the genetic code of animals was the overexpression of follistatin (Follistatin Overexpressing mice, or FOE), resulting in among other things the observed dental traits characteristic of amelogenesis imperfecta. The non-transgenic mice are also referred to as wild or wild type, in accordance with the nomenclature used in the English-language literature. To maintain the culture, transgenic animals ścierania i miejscowych obnażeń zębiny. Niedojrzała tkanka jest ponadto bardziej podatna na przebarwienia niż prawidłowo rozwinięte szkliwo Jednym z głównych problemów w przebiegu AI są zaburzenia związane z niską odpornością szkliwa na ścieranie. Obniżona twardość tkanki na skutek niedostatecznej mineralizacji bądź zaburzeń pojawiających się na etapie jej dojrzewania, może powodować zmianę kształtu koron klinicznych lub w skrajnych przypadkach nawet całkowite ich zniszczenie. Twardość szkliwa, będącego najtwardszą tkanką ludzkiego organizmu, wynosi według skali wprowadzonej w 1812 roku przez Mohsa 5, natomiast zębiny 3. Z czasem pojawiła się potrzeba znalezienia metody umożliwiającej liczbowe określenie stopnia twardości materiałów. Jednym z najczęściej stosowanych w tym celu sposobów jest ustalanie twardości metodą Vickersa. 8,9 Przeprowadzenie badań doświadczalnych nad amelogenesis imperfecta na materiale pochodzącym od ludzi jest utrudnione, co spowodowało konieczność znalezienia innej metody analizy struktur tkanek twardych dotkniętych tymi patologiami. Jednym ze sposobów badań skutków klinicznych zaburzeń o podłożu genetycznych jest wykorzystanie modelu zwierzęcego z zaplanowanym defektem w obrębie genu kodującego jedną z protein kontrolujących proces amelogenezy. Takim modelem jest mysz transgeniczna charakteryzująca się nadmierną ekspresją folistatyny (FST) proteiny będącej członkiem nadrodziny TGFβ. FST odgrywa istotną rolę we wczesnych etapach amelogenezy i jest wykrywana między innymi we wtórnych węzłach szkliwnych, które warunkującą kształt powstającej korony zęba, a także liczbę i rozmieszczenie guzków. 12,13 Cel pracy Celem pracy było porównanie fizycznych cech budowy ciała i uzębienia oraz mikrotwardości szkliwa i zębiny zębów trzonowych myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny i myszy standardowych. 13

5 J Stoma 2013; 66, 1 Gibek J., Pawłowska E., Klimek L., Szczepańska J. overexpressing follistatin were inbred or bred back. Animals used for testing were propagated by crossing males at the age of 3 months (TGN transgenic strain (K14-Fst) C57BL/6J) with females at the age of 3 months (standard strain C57BL). Terms of reproduction 1 litter per cage (including female and male). In order to identify animals during the process of combining them in pairs and then confirming their transgenic nature, genotyping was performed. Determination of the genotype were performed using primers 5 -GGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3 and 5 -CAGCACAATAACCAGCACGTTGCC-3, which amplify in the PCR reaction (a fragment of the rabbit ß-globin intron included in transgene construct. The primers 5 -TTACGTCCATCGTGGACAGA-3 and 5 TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA-3, multiplying 250 base pairs of miogenin, were also introduced as a positive control reaction. 14 The material for the determination of the genotype was obtained by numbering specimens by cutting pieces of the external ear using a rubber dam punch or scissors. The DNA template was prepared using the Genomic Mini Catalog No DNA isolation kit, A & A Biotechnology (Gdynia, Poland), according to the instructions supplied with the kit. After the PCR reaction, the product was subjected to DNA molecule chapter gel electrophoresis, stained with ethidium bromide and then compared with model masses from GeneRuler 50 bp DNA Ladder cat. no. SM1133 (Fermentas, Vilnius, Lituania). The presence of 250 bp bands confirmed that the PCR reaction had been successful. The presence of bands about 700 bp long indicated that the mice were transgenic, while their absence indicated they were wild type. 14 After birth, the females were separated from the males, and the newborns were reared for 3 weeks. The study population consisted of 20 animals whose mothers were given ad libitum access to water containing sodium fluoride 10 mg / L (10 ppm) during gestation. Newborn mice also drank fluoridated water and milk from their mothers. wadzona w Zwierzętarni Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Skutkiem modyfikacji kodu genetycznego zwierząt była nadekspresja folistatyny (FOE ang. follistatin overexpressing mice), w wyniku czego zaobserwowano m. in. cechy uzębienia charakterystyczne dla amelogenesis imperfecta. Myszy standardowe są określane także, zgodnie z nazewnictwem stosowanym w piśmiennictwie anglojęzycznym, dzikimi (ang. wild type WT). Aby utrzymać hodowlę, zwierzęta transgeniczne z nadekspresją folistatyny kojarzono wsobnie lub wstecznie. Zwierzęta wykorzystane do przeprowadzenia badań namnażane były poprzez krzyżowanie osobników męskich w wieku 3 miesięcy (szczep transgeniczny TgN(K14-Fst)C57Bl/6J) i żeńskich w wieku 3 miesięcy (szczep standardowy C57Bl). Warunki rozmnażania 1 miot na klatkę (w tym samica i samiec). W celu identyfikacji zwierząt podczas procesu łączenia ich w pary, a następnie potwierdzenia transgeniczności wykonano badanie genotypowania. Oznaczanie genotypu przeprowadzono z użyciem następującej pary starterów: 5 -GGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3 i 5 -CAGCACAATAACCAGCACGTTGCC-3, które powielają w reakcji PCR (ang. Polymerase Chain Reaction reakcja łańcuchowa polimerazy) fragment intronu króliczej ß-globiny włączony w konstrukt transgenu. Równocześnie do mieszaniny reakcyjnej wprowadzano primery namnażające fragment genu miogeniny 250 par zasad 5 -TTACGTCCATCGTGGACAGA-3 i 5 TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA-3, jako kontrolę pozytywną reakcji. 14 Materiał do oznaczania genotypu uzyskiwano w wyniku numerowania osobników poprzez wycinanie fragmentów małżowiny usznej przy użyciu dziurkacza do koferdamu lub nożyczek. Matrycę DNA otrzymywano przy użyciu zestawu do izolacji DNA Genomic Mini nr katalogowy firmy A&A Biotechnology (Gdynia, Polska), według instrukcji dołączonej do zestawu. Po przeprowadzeniu reakcji PCR, produkt poddawano rozdziałowi cząsteczek DNA elektroforezą żelową, następnie wybarwiano bromkiem etydyny i porównywano otrzymane produkty ze wzorcem mas 14

6 Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis... J Stoma 2013; 66, 1 The fluorine content in water was determined on the basis of available literature to be a therapeutic dose in mice The second group consisted of 20 animals whose mothers were watered with non-fluoridated water during gestation. Also, the young mice in this control group, like their mothers during pregnancy and after birth, were provided water without fluoride in addition to their breast milk intake. Both groups of animals used in the study were fed a standard diet. Each of the groups used in this study was formed from 10 animals: 10 in the transgenic group and 10 in the standard group. 18 Morphological studies The next stage was to compare the characteristics of the tooth construction of transgenic mice with those of the wild type mice and to weight the animals. Twenty-one days after birth, the mice were weaned from their mothers and euthanised, and material was collected for the study: blocks containing bone molars dissected from the maxilla and mandible. After preparation, the material was stored in 0.4% sodium azide at 4 C. The phenotypes of the molar crowns were ranked based on photos taken in a scanning electron microscope. Tests were conducted at the Materials Research Laboratory, Department of Solid State Physics, University of Lodz. 18 Microhardness analysis Measurement of tissue hardness was performed using Vickers method according to EN ISO :1999, under load 1N. The resulting diagonal footprint was read in Vickers-HV units and converted to the SI derived unit Pascal (Pa). 19,20 Prior to testing, the samples were placed inside polyvinyl chloride cylinders and embedded in Epidian 5 epoxy resin. After 24 hours, when the resin had set, the samples were subjected to pretreatment consisting of smoothing the surface of the discs using increasingly finer abrasives. The study area was the first molar of the mouse: the enamel around the summits of the nodules, enamel in the cervical area, as well as the dentine in the area of the dentine-enamel junction. The study area and the places where the analysis was O GeneRuler 50 bp DNA Ladder numer kat. SM1133 (Fermentas, Vilnius, Lituania). Obecność prążka na wysokości 250 par zasad (bp ang. base pair) świadczyło o poprawności przebiegu reakcji PCR. Ujawnienie produktu o długości ok. 700 bp identyfikowało osobnika jako mysz transgeniczną, brak tego prążka oznaczało mysz standardową. 14 Po narodzinach potomstwa samice były odstawione od samców i przez okres 3 tygodni wychowywały młode. Grupę badaną tworzyło 20 zwierząt, których matki od momentu skojarzenia z samcami spożywały ad libitum wodę fluorkowaną o zawartości fluorku sodu 10 mg/l (10 ppm). Także nowo narodzone myszy piły wodę fluorkowaną oraz ssały mleko matek. Zawartość fluoru w wodzie została ustalona na podstawie dostępnego piśmiennictwa i stanowi dla myszy dawkę terapeutyczną Drugą grupę tworzyło 20 zwierząt, których matki od momentu skojarzenia z samcami były pojone wodą niefluorkowaną. Również młode myszy, tak jak ich matki w okresie ciąży i po urodzeniu potomstwa, pojone były, oprócz ssania mleka matek, wodą bez fluoru (grupa porównawcza). Obydwie grupy zwierząt wykorzystane w badaniu karmione były dietą standardową. W każdej z grup badanej i porównawczej było 10 zwierząt transgenicznych i 10 zwierząt standardowych. 18 Badania morfologiczne zwierząt W celu porównania charakterystycznych cech budowy fizycznej myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny i standardowych dokonano pomiarów masy ciała zwierząt. Po 21 dniach od narodzin myszy były odstawione od matek, uśmiercane i pobierano materiał do badań stanowiły go bloczki kostne zawierające zęby trzonowe wypreparowane ze szczęki i żuchwy. Po preparacji materiał był przechowywany w 0,4% azydku sodu w temperaturze 4 C. Ocena fenotypów koron zębów trzonowych dokonywana była na podstawie zdjęć wykonanych w elektronowym mikroskopie skaningowym. Badania były przeprowadzane w Pracowni Badań Materiałowych Katedry Fizyki Ciała Stałego Uniwersytetu Łódzkiego. 18 Analiza mikrotwardości Pomiar twardości tkanek wykonano metodą 15

7 J Stoma 2013; 66, 1 Gibek J., Pawłowska E., Klimek L., Szczepańska J. Fig. 1. Bone block containing the transgenic mouse molars embedded in epoxy resin Epidian yellow arrow marked the first tooth. Bloczek kostny zawierający zęby trzonowe myszy transgenicznej zatopiony w żywicy epoksydowej epidian żółtą strzałką zaznaczony analizowany pierwszy ząb trzonowy. Fig. 2. First standard mouse tooth yellow arrows shows a point of the analysis of enamel, red arrows point of analysis of dentine. Pierwszy ząb trzonowy myszy standardowej żółtymi strzałkami zaznaczone miejsca analizy szkliwa, czerwonymi strzałkami zaznaczone miejsca analizy zębiny. Vickersa wg EN ISO :1999) przy obciążeniu 1N. Po zakończeniu badania mierzono przekątne odcisku i z odpowiednich tabel odczytywany był wynik w jednostkach skali Vickersa HV. Następnie wynik był przeliczany na jednostki pochodne układu SI paskale (Pa). 19,20 Badane próbki przed badaniem zostały umieszczone w wykonanych z polichlorku winylu walcach i zatopione w żywicy epoksydowej Epidian 5. Po 24 godzinach dochodziło do pełnego związania materiału i próbki poddawane były wstępnej obróbce polegającej na wygładzaniu badanej powierzchni krążkami ściernymi o coraz drobniejszym nasypie. Badaniu poddana została powierzchnia pierwszego zęba trzonowego myszy analizowano szkliwo w okolicy szczytów guzków i w okolicy przyszyjkowej oraz zębinę w okolicy połączenia szkliwno zębinowego na wysokości punktów stycznych. Badana powierzchnia oraz miejsca, w których wykonano analizę pokazane zostały na Fig. 1 i 2. Po przygotowaniu powierzchni badana próbka była umieszczana na twardościomierzu i po stabilnym umocowaniu zwalniany był zgłębnik. W niniejszym badaniu zastosowano obciążenie 100 g w czasie 10 sekund. Dla cech ilościowych obliczono następujące parametry: średnią arytmetyczną (x) i medianę (Me) jako miary przeciętne, wartość minimalną i maksymalną, a także zróżniperformed are shown in Fig. 1 and 2. After preparing the surface, the test sample was placed on a hardness tester on a stable stand. In the present study, a 100 g load was applied for 10 seconds. The following parameters were calculated: the arithmetic mean (x) and median (Me) as a measure of average, minimum and maximum value and variation: standard deviation (SD), quartile deviation (Qx) and the coefficient of variation. The Wilcoxon test was used to compare the results between the two groups with a significance of p <0.05. This test provides the strongest alternative to Student s t test for related variables (95% by Student s T test). The study was conducted using a Sopelem microhardness tester at the Department of Materials Research of the Institute of Materials Science, Technical University of Lodz. The study was performed in accordance with the recommendations of the Helsinki Convention and approved by the Local Bioethics Committee of the Medical University of Lodz on animal testing Resolution No. 450/ /ŁB. Results Phenotype assessment of construction animals and their teeth Excessive secretion of follistatin results in a degree of developmental disabilities for many 16

8 Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis... J Stoma 2013; 66, 1 Fig. 3. Standard mouse. Mysz standardowa. Fig. 4. Transgenic follistatin overexpressing mice. Mysz transgeniczna charakteryzująca się nadekspresją folistatyny. tissues of ectodermal origin. Transgenic animals are noticeably smaller than a standard mouse and FOE mouse fur is thin and receding. In places, naked, shiny, tight skin can be seen. Animals have smaller standard ears and a shorter tail. Phenotypic differences between standard and transgenic mice are shown in Figures 3 and 4. Significant differences in body weight have been reported between wild and transgenic mice consuming water treated with fluorine and fluorides and those not receiving fluorine compounds (p <0.05). Transgenic mice had significantly lower mass. Also analyzed was the relationship between body weight and gender, but no statistically significant differences were found. Standard mouse dentition consists of one incisor and three molars in each quadrant. Between the incisors and the molar, there is a toothless space called the diastema. Properly constructed molars are completely covered with enamel. On the occlusal surface, pairs of cusps are arranged in rows of three. Transgenic animals sometimes lack a third molar. In addtion, on the occlusal surface the local enamel is noticeably missing, the dentine is visibly exposed and the arrangement and shape of the nodules is disorganised. Another point concerns the visible polarization found in wild mice, that is the distinction between the lingual and buccal cusps (Fig. 5). In the case of animals which over-express follistatin, this polarization is markedly impaired. The enamel rim is also visible, especially in the first molar tooth (Fig. 6) cowanie: odchylenie standardowe (SD), odchylenie ćwiartkowe (Qx) i współczynnik zmienności. Porównując uzyskane wyniki wykonano test kolejności par Wilcoxona przy poziomie istotności p<0,05. Test ten stanowi najmocniejszą alternatywę testu t-studenta dla zmiennych powiązanych (95% mocy testu t-studenta). Badania zostały przeprowadzone w Zakładzie Badań Materiałów Instytutu Inżynierii Materiałowej Politechniki Łódzkiej mikrotwardościomierzem Sopelem. Badania zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Konwencji Helsińskiej, na badania uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Etyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 9 ds. badań na zwierzętach uchwała nr 10/ŁB 450/2009. Wyniki Ocena fenotypu budowy zwierząt i ich uzębienia Nadmierny stopień wydzielania folistatyny skutkuje licznymi zaburzeniami rozwojowymi dotyczącymi tkanek pochodzenia ektodermalnego. Zwierzęta transgeniczne są zauważalnie mniejsze od myszy standardowych. Futro myszy FOE jest przerzedzone i płoche. Miejscami jest widoczna naga, lśniąca, napięta skóra. Zwierzęta standardowe mają mniejsze uszy i krótszy ogon. Różnice fenotypowe pomiędzy myszami standardowymi i transgenicznymi zostały pokazane na Fig. 3 i 4. Zanotowano istotne różnice w masie ciała pomiędzy myszami dzikimi poddanymi działaniu 17

9 J Stoma 2013; 66, 1 Gibek J., Pawłowska E., Klimek L., Szczepańska J. Fig. 5. Standard mouse molars. Zęby trzonowe myszy standardowej. fluoru i myszami transgenicznymi spożywającymi wodę fluorkowaną oraz pomiędzy standardowymi i transgenicznymi nie otrzymującymi związków fluoru (p<0,05). Myszy transgeniczne miały istotnie mniejszą masę. Analizowano także związek pomiędzy masą ciała a płcią, jednak nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie. U wszystkich zwierząt standardowych zaobserwowano prawidłowe uzębienie jeden ząb sieczny i trzy zęby trzonowe w każdym kwadrancie. Pomiędzy zębami siecznymi i trzonowymi znajduje się diastema odcinek bezzębny. Prawidłowej budowy zęby trzonowe całkowicie pokryte są szkliwem. Na powierzchni żującej znajdują się ułożone w rzędach trzy pary guzków. W przypadku zwierząt transgenicznych odnotowano brak trzeciego zęba trzonowego. Na powierzchni żującej zauważalne jest patologiczne starcie szkliwa i miejscowo widoczne obnażenia zębiny. Zaburzeniu ulega także układ i kształt guzków. U myszy dzikich widoczna jest polaryzacja podział na guzki policzkowe i językowe (Fig. 5). W przypadku zwierząt charakteryzujących się nadmierną ekspresją folistatyny polaryzacja ulega wyraźnemu zaburzeniu. Widoczna jest ponadto, szczególnie wyraźnie zaznaczona w pierwszym zębie trzonowym, obręcz szkliwna (Fig. 6). Fig. 6. Follistatin overexpressing mice molars. Zęby trzonowe myszy transgenicznej z nadekspresją folistatyny. Analysis of microhardness An analysis of the hardness of hard tissues, the enamel and dentine of molars prepared from animals included in the four treatment groups, was carried out in the course of the study. The subjects were divided into groups of wild-type and transgenic mice, and these were subdivided into mice which drank fluoridated and those which drank unfluoridated water. The average microhardness of the first molar enamel was 2.26 GPa for the wild mice, and 2.03 GPa for the transgenic mice. The highest molar enamel microhardness value was recorded Analiza mikrotwardości W toku badań przeprowadzona została analiza stopnia twardości tkanek twardych szkliwa i zębiny zębów trzonowych wypreparowanych od zwierząt wchodzących w skład czterech badanych grup ( dzikich pijących i niepijących wody fluorowanej oraz transgenicznych pijących i niepijących wody fluorowanej). Średnia wartość mikrotwardości szkliwa pierwszego zęba trzonowego myszy standardowej wynosiła 2,26 GPa, a myszy transgenicznej z nadekspresją folistatyny 2,03 GPa. Najwyższą wartość mikrotwardości zanotowano dla szkliwa zębów trzonowych myszy standardowych poddanych endogennej suplementacji związkami fluoru (2,29 GPa), zaś najniższą w przypadku zwierząt transgenicznych niepijących wody z zawartością fluorków (2,03 GPa). Twardość szkliwa u połowy 18

10 Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis... J Stoma 2013; 66, 1 Table 1. Enamel and dentine microhardness of the first molar of the transgenic and standard animals average values (GPa) and measurements variation Animal groups Microhardness of enamel (GPa) and the calculated statistical parameters Min Max X Me SD Qx V (%) Wild with fluoride (E) Wild without fluoride (E) Transgenic with fluoride (E) Transgenic without fluoride (E) Wild with fluoride (D) Wild without fluoride (D) Transgenic with fluoride (D) Transgenic without fluoride (D) Table 2. Comparison of the enamel microhardness in the test groups Compare group The value of the test z Significance p Wild: with fluoride without fluoride p>0.05 Transgenic: with fluoride without fluoride p<0.05 Wild with fluoride transgenic with fluoride p<0.001 Wild without fluoride transgenic without fluoride p<0.001 zwierząt standardowych była wyższa niż 2,31 GPa (Tab. 1). Porównanie czterech badanych grup wykazało istotne statystycznie różnice w twardości szkliwa u myszy dzikich pijących wodę z fluorem i myszy transgenicznych otrzymujących endogennie fluor (p<0,001). W przypadku myszy transgenicznych pijących wodę fluorkowaną uzyskano istotnie wyższe wartości niż u myszy modyfikowanych genetycznie, nieotrzymujących fluoru (p<0,05). Istotną różnicę zaobserwowano także pomiędzy zwierzętami dzikimi nieotrzymującymi fluoru i podobnymi myszami transgenicznymi (p<0,001) (Tab. 2). Analiza zębiny pochodzącej z zębów zwierząt wchodzących w skład dwóch badanych grup nie wykazała istotnych różnic. Twardość zębiny pochodzącej z pierwszych zębów trzonowych myfor mice treated with standard supplementation of endogenous fluorine compounds (2.29 GPa), and lowest in the case of transgenic animals which were not treated with fluoridated water (2.03 GPa). The hardness of the enamel in half the standard animals was higher than 2.31 GPa (Tab. 1). The comparison of the four treatment groups showed statistically significant differences in the hardness of the enamel in wild-type mice treated with fluoridated water and the corresponding transgenic mice (p<0.001). Significantly higher values were obtained in transgenic mice treated with fluoridated water than in those not receiving fluoride (p<0.05). A significant difference was also observed between the wild-type mice not receiving fluoride and the corresponding transgenic mice (p<0.001) (Tab. 2). However, no significant 19

11 J Stoma 2013; 66, 1 Gibek J., Pawłowska E., Klimek L., Szczepańska J. Omówienie wyników i dyskusja Jedną z właściwości fizycznych opisujących ciała stałe jest, obok łupliwości czy gęstości, jego twardość. Jest to pojęcie określające odporność danego materiału na działanie punktowych sił, w wyniku czego może dojść do odkształcenia powierzchni, jej zgniecenia lub zarysowania. Fenotyp zębów trzonowych myszy transgenicznych z nadekspresją folistatyny może sugerować zmiany właściwości fizycznych szkliwa. Pola obnażonej zębiny, widoczne starcie patologiczne, szczególnie na szczytach guzków wskazywać mogą na obniżenie twardości tkanki. Zostało to potwierdzone w przeprowadzonych badaniach mikrotwardościomierzem. Zaburzenia w rozwoju szkliwa u zwierząt modyfikowanych genetycznie, manifestujące się nadmiernym wydzielaniem jednej z protein odpowiadającej za amelogenezę, spowodowały statystycznie istotne zmniejszenie stopnia twardości szkliwa w porównaniu do myszy standardowych (odpowiednio: 2,03 i 2,26 GPa). Nie zauważono natomiast zmian w twardości zębiny, co może sugerować, że nadmierne wydzielanie folistatyny nie ma istotnego wpływu na proces formowania tej tkanki. Podobne wyniki dotyczące mikrotwardości tkanek twardych zębów myszy uzyskali White i wsp., 20 którzy zajmowali się badaniem zaburzeń pojawiających się w wyniku nadmiernego wydzielania sialofosfoproteiny zębinowej (Dspp). Jest to białko, które po wydzieleniu dzieli się na dwie aktywne formy Dsp i Dpp. Autorzy poddawali analizie zęby pozyskane od 28-dniowych zwierząt z zaplanowanym defektem manifestującym się nadekspresją obydwóch protein. Analiza twardości wykazała twardość szkliwa w grupie porównawczej: zwierząt standardowych 2,1 GPa, podczas gdy u myszy z nadmierną ekspresją Dsp 2,5 GPa. Wysokie poziomy wydzielanego białka Dpp skutkowały istotnym obniżeniem twardości do jedynie 1,8 GPa. Twardość zębiny pozyskanej od zwierząt, wchodzących w skład trzech badanych grup, mieściła się w granicach 0,41-0,44 GPa. Zmiany właścidifferences regarding the dentine were found between the two treatment groups. The hardness of dentine derived from first molars of both groups of mice was 0.73 GPa. Results and discussion In addition to cleavage and density, one of the physical properties of solids is their hardness. It is a concept defining the resistance of the material to point forces, with the result that can lead to surface deformation, crushing or being scratched. The phenotype of FOE mice, areas of bare dentine and visible pathological abrasions, especially on the tops of nodules, may suggest a softening of molar enamel. This reduction in the hardness of molar enamel was confirmed in our studies. Disturbances in the enamel development of genetically modified animals, manifested by excessive secretion of one of the proteins responsible for amelogenesis, were found to cause a significant reduction in enamel hardness in comparison with a standard mouse (respectively 2.03 and 2.26 GPa). However, no change was noticed with regard to the hardness of dentine, which may suggest that excessive secretion of follistatin has no significant effect on the process of formation of this tissue. Similar microhardness values were found for the hard tissue of mouse teeth in a study by White et al. 19 who investigated the problems arising as a result of excessive secretion of dentine sialophosphoprotein (DSPP), a protein which can separate into two active forms: Dsp and the DPP. Teeth obtained from transgenic 28-day-old animals which overexpress both proteins were found to be harder than those from controls: wild type controls 2.1 GPa, mice overexpressing Dsp 2.5 GPa. Mice with high levels of secreted DPP protein resulted in a significant reduction of hardness to only 1.8 GPa. The hardness of dentine gained from animals included in the three groups studied ranged from 0.41 to 0.44 GPa. According to White, 20 changes in the physical properties of the enamel caused by increased secretion of Dsp and DPP are related not only to decreased tissue mineralization, but also changes in the microstructure of the enamel. Microscopic szy zarówno grupy badanej, jak i porównawczej wynosiła 0,73 GPa. 20

12 Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis... J Stoma 2013; 66, 1 analysis revealed abnormalities in the structure and packing of the prisms. The degree of hardness of the tooth tissues was also evaluated by Snead et al. 21 using animals producing only one amelogenin isoform amelogenin M-180. No macroscopic or microscopic differences were found between the incisors of 6-week-old transgenic animals and their corresponding wild type. SEM images of the enamel revealed the tissue to be of good conformation: the prisms were densely packed and arranged in an orderly and regular way. The evaluation of the microhardness of enamel showed significant differences between the enamel of animals included in the two treatment groups. In the case of enamel, the microhardness values were 2.6 GPa for transgenic mice and 2.3 GPa for standard animals. Amelogenin is one of the major proteins that play an important role in the process of amelogenesis. Under normal conditions, different forms of amelogenin encoded by different mrnas can be found. Elimination of active isoforms, but leaving only one of them, may result in an increase in enamel microhardness. An organized system of prisms, their dense packing, a small amount of interprismatic substance and a high degree of mineralization of enamel are the most important characteristics affecting the degree of microhardness. Follistatin, as one of the signalling molecules involved in controlling the early stages of enamel formation, plays an important role in the formation of tissue with the appropriate physical and chemical properties. Changes in the expression of FST, both its excess and deficiency, result in the abnormal formation of enamel with regard to its histological structure and it being poorly mineralized. Summary 1. Overexpression of follistatin causes a significant reduction in enamel hardness, while not affecting the degree of hardness of dentine. 2. Lower average hardness values of enamel in transgenic mice confirm the essential role played by the follistatin in the process of mineralization of this tissue. wości fizycznych szkliwa wywołane zwiększonym wydzielaniem Dsp i Dpp według White`a 20 są związane nie tylko ze zmniejszeniem mineralizacji tkanki, ale także zmianami w mikrostrukturze szkliwa. Analiza mikroskopowa wykazała zaburzenia w układzie i upakowaniu pryzmatów. Stopień twardości tkanek zębów oceniali także Snead i wsp. 21 Zajmowali się badaniem zwierząt, które w wyniku modyfikacji genetycznej wydzielały jedynie jedną z izoform amelogeniny amelogeninę M-180. Analizie poddane zostały zęby sieczne pozyskane od 6-tygodniowych zwierząt. Zarówno makro-, jak i mikroskopowo nie wykazano różnic pomiędzy zębami zwierząt transgenicznych i standardowych. Obserwacja szkliwa w mikroskopie skaningowym ujawniła tkankę o prawidłowej budowie pryzmaty były ułożone w sposób zorganizowany i regularny, były gęsto upakowane. Ocena stopnia mikrotwardości szkliwa wykazała istotne statystycznie różnice pomiędzy szkliwem zwierząt wchodzących w skład dwóch badanych grup. W przypadku szkliwa wartość mikrotwardości wynosi odpowiednio: 2,6 GPa dla myszy transgenicznych i 2,3 GPa dla zwierząt standardowych. Badania ww. autorów wykazały, że amelogenina jest jednym z głównych białek odgrywającym niezwykle istotną rolę w procesie amelogenezy. W warunkach prawidłowych wykrywane są różne formy amelogeniny kodowane przez różne rodzaje mrna. Wyeliminowanie części izoform i pozostawienie aktywnej jedynie jednej z nich, może skutkować zwiększeniem mikrotwardości szkliwa. Budowa szkliwa zorganizowany układ pryzmatów, ich gęste upakowanie, mała ilość substancji międzypryzmatycznej oraz wysoki stopień mineralizacji tkanki stanowią najważniejsze cechy wpływające na stopień mikrotwardości. Folistatyna, jako jedna z cząsteczek sygnałowych biorących udział w kontrolowaniu wczesnych faz formowania szkliwa odgrywa ważną rolę w powstawaniu tkanki o odpowiednich właściwościach fizycznych i chemicznych. Zmiany w ekspresji FST, zarówno jej nadmiar, jak i niedobór, skutkują powstawaniem szkliwa o nieprawidłowej budowie histologicznej i niedostatecznie zmineralizowanego. 21

13 J Stoma 2013; 66, 1 Gibek J., Pawłowska E., Klimek L., Szczepańska J. 3. No significant difference in the degree of hardness of dentine between animals and genetically modified standard supposedly can indicate a low impact of follistatin on the process of dentinogenesis. Podsumowanie 1. Nadekspresja folistatyny powoduje istotne zmniejszenie twardości szkliwa, jednocześnie nie wywierając wpływu na stopień twardości zębiny. 2. Niższe średnie wartości twardości szkliwa myszy transgenicznych, potwierdzają istotną rolę odgrywaną przez folistatynę w procesie mineralizacji tej tkanki. 3. Brak istotnej różnicy w stopniu twardości zębiny pomiędzy zwierzętami modyfikowanymi genetycznie a standardowymi przypuszczalnie może świadczyć o niewielkim wpływie folistatyny na proces dentinogenezy. References 1. Jernvall J, Thesleff I: Reiterative signaling and patterning during mammalian tooth morphogenesis. Mech Dev 2000; 92: Thesleff I, Tummers M: Tooth organogenesis and regeneration; Harvard Stem Cell Institute Cobourne MT: The genetic control of early odontogenesis. Br J Orthod 1999; 26: Gaete M, Lobos N, Torres-Quintana MA: Mouse tooth development time sequence determination for the ICR/Jcl strain. J Oral Sci 2004; 46: Viriot L, Lesot H, Peterka M, Peterkova R: Cusp development in the mouse first lower molar. Eur Cell Mater 2007; 14 Supp 2: Crawford PJ, Aldred M, Bloch-Zupan A: Amelogenesis imperfect. Orphanet J Rare Dis 2007; 4: Aldred MJ, Savarirayan R, Crawford PJ: Amelogenesis imperfecta: a classification and catalogue for the 21st century. Oral Dis 2003; 9: Gibek J, Szczepańska J: Amelogenesis imperfecta diagnostyka kliniczna i genetyczna na podstawie piśmiennictwa. Nowa Stomatol 2009; 1-2: Pawłowska E, Piastowska A, Błasiak J, Szczepańska J: Amelogenesis imperfecta w niesyndromicznym zespole zaburzeń uzębienia. Czas Stomatol 2009; 62: Kida M, Ariga T, Shirakawa T, Oguchi H, Sakiyama Y: Autosomal-dominant hypoplastic form of amelogenesis imperfecta caused by an enamelin gene mutation at the exon-intron boundary. J Dent Res 2002; 81: Mårdh CK, Bäckman B, Holmgren G, Hu JC, Simmer JP, Forsman-Semb K: A nonsense mutation in the enamelin gene causes local hypoplastic autosomal dominant amelogenesis imperfecta (AIH2). Hum Mol Genet 2002; 11: Nakatani M, Takehara Y, Sugino H, Matsumoto M, Hashimoto O, Hasegawa Y, et al: Transgenic expression of a myostatin inhibitor derived from follistatin increases skeletal muscle mass and ameliorates dystrophic pathology in mdx mice. FASEB J 2008; 22: Thompson TB, Lerch TF, Cook RW, Woodruff TK, Jardetzky TS: The structure of the follistatin: activin complex reveals antagonism of both type I and type II receptor binding. Dev Cell 2005; 9: Pawłowska E: Rola folistatyny w transformacji systemu korzeniowego zęba. Rozprawa habilitacyjna. Łódź: UM; p Lyaruu DM, de Jong M, Bronckers AL, Wöltgens JH: Ultrastructure of in vitro recovery of mineral- 22

14 Studies of microhardness of hard dental tissues in the course of amelogenesis... J Stoma 2013; 66, 1 ization capacity of fluorotic enamel matrix in hamster tooth germs pre-exposed to fluoride in organ culture during the secretory phase of amelogenesis. Arch Oral Biol 1987; 32: Levenson GE: The effect of fluoride on ameloblasts of mouse molar tooth germs in vitro. J Biol Buccale 1980; 8: Maciejewska I, Spodnik JH, Domaradzka-Pytel B, Sidor-Kaczmarek J, Bereznowski Z: Fluoride alters type I collagen expression in the early stages of odontogenesis. Folia Morphol (Warsz) 2006; 65: Gibek J: Badania nad mineralizacją tkanek twardych zębów w oparciu o wybrany model myszy transgenicznych. Praca doktorska. Łódź: UM; 2011, p.58-64, Chuenarrom C, Benjakul P, Daosodsai P: Effect of indentation load and time on knoop and vickers microhardness tests for enamel and dentin. Mater Res 2009; 12: White SN, Paine ML, Ngan AY, Miklus VG, Luo W, Wang H, et al: Ectopic expression of dentin sialoprotein during amelogenesis hardens bulk enamel. J Biol Chem 2007; 282: Snead ML, Zhu DH, Lei Y, Luo W, Bringas Jr. PO, Sucov HM, et al: A simplified genetic design for mammalian enamel. Biomaterials 2011; 32: Address: Łódź, ul. Pomorska 251 Tel.: joanna.szczepańska@umed.lodz.pl Received: 16 th September 2012 Accepted: 2 nd November