Podstawy genetyki III. Biologia molekularna genu, replikacja, mutageneza

Transkrypt

1 Podstawy genetyki III Biologia molekularna genu, replikacja, mutageneza

2 2 Zarys biologii molekularnej genu

3 Pionierskie doświadczenia Griffiths Bakterie zawerają czynnik transformujący, zdolny do przekazania informacji z żywych bakterii do martwych Avery, McLeod, McCarthy Czynnikiem transformującym jest DNA 3

4 Materia genetyczny Materiałem genetycznym są kwasy nukleinowe Materiałem genetycznym organizmów komórkowych jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) 4

5 Budowa DNA DNA zbudowany jest z nukleotydów podwójna helisa DNA 5

6 Zasada komplementarności pozwala na replikację DNA 6 Na podstawie sekwencji jednej nici można jednoznacznie odtworzyć sekwencję nici komplementarnej 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5

7 Model semikonserwatywny replikacji 7

8 Centralna hipoteza ( dogmat ) DNA RNA BIAŁKO 8

9 Droga od DNA do bia ka Ekspresja genów jest najważniejszym dla funkcjonowania komórek i organizmów procesem Ekspresja genów składa się z wielu złożonych etapów, z których kazdy może podlegać regulacji 9

10 Ekspresja genów prokariotycznych i eukariotycznych Prokaryota dominuje regulacja na poziomie transkrypcji policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej operony mrna szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo równocześnie z transkrypcją 10

11 Ekspresja genów prokariotycznych i eukariotycznych Eukaryota Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) złożoność proteomu przekracza złożoność genomu 11

12 Transkrypcja U eukariontów występują 3 wyspecjalizowane polimerazy RNA. Za transkrypcję genów kodujących białka odpowiada polii 12

13 Losy mrna w komórce eukariotycznej Transkrypcja Dodanie czapeczki na końcu 5 Składanie (splicing) Poliadenylacja na końcu 3 Transport do cytoplazmy Translacja Degradacja 13

14 Etapy ekspresji/poziomy regulacji u Eukaryota struktura chromatyny transkrypcja obróbka i kontrola jakości RNA transport RNA degradacja RNA translacja modyfikacje post-translacyjne degradacja białka 14

15 Elementy systemów regulacji Elementy cis Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji Elementy cis w obrębie DNA np. promotory, operatory, enhancery Elementy cis w obrębie RNA sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp. 15

16 Elementy systemów regulacji Elementy trans Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne), aktywatory, represory itp. Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory translacji, splicingu itp.) RNA regulatorowe (sirna, mirna itp.) 16

17 Podstawy regulacji genu Regulacja pozytywna czynnik trans jest aktywatorem zwiększa ekspresję Regulacja negatywna czynnik trans jest represorem osłabia ekspresję 17

18 Podstawy regulacji genu Regulacja indukowalna Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję Regulacja reprymowalna Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności czynnika trans a indukowalna/reprymowalna odpowiedzi na sygnał 18

19 Przyk ad operon lac 19 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005

20 Kod genetyczny Trójkowy 20 aminokwasów kodony po 3 nukleotydy: 3 4 =64 możliwości (dwa: za mało) Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3 kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje) 20

21 Kod genetyczny Nienakładający się Dowody: załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i ACA (nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie centralnym, możliwe tylko 4 2 = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje trzyaminokwasowe (20 2 =400). Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie 21

22 Kod genetyczny Bezprzecinkowy Zdegenerowany 3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów 22

23 Kod genetyczny 23

24 Regularności w kodzie Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca (np. UCx Ser) Aminokwasy o podobnych właściwościach często z podobnymi kodonami Np. AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina UCx: seryna; ACx: treonina 24

25 Parowanie wobble W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/A (I inozyna) 25

26 Translacja 26

27 Nobel chemia 27

28 28 Animacja procesu translacji dostępna na stronie:

29 Sekwencja bia ka zawiera sygna y sortowania do przedzia ów komórki Kierowanie do ER i szlaku wydzielniczego zachodzi równocześnie z translacją Kierowanie do mitochondrium zachodzi po translacji 29

30 Bia ka podlegają z ożonym modyfikacjom Fałdowanie wspomagane przez białka opiekuńcze Białka opiekuńcze odgrywają ważną rolę w patogenezie wielu chorób (nowotwory, choroba Huntingtona i inne choroby agregacyjne, choroba Parkinsona i Alzheimera, mukowiscydoza) Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja itp.) Ubikwitynacja i degradacja Zaburzenia w ubikwitynacji i degradacji białek stwierdzono w rodzinnej postaci choroby Parkinsona, zespole Angelmana, anemiach Fanconiego, zespole von Hippel-Landau i innych 30

31 31 Replikacja DNA

32 Model semikonserwatywny replikacji 32

33 Inne modele replikacji Rozproszony Semikonserwatywny Konserwatywny 33

34 Doświadczenie Meselsona i Stahla 34

35 Doświadczenie Meselsona i Stahla 35

36 Etapy replikacji Inicjacja Elongacja Terminacja 36

37 Inicjacja Rozplecenie (topnienie) podwójnej helisy DNA 37 Inicjacja replikacji u bakterii

38 Inicjacja u Eukaryota 38

39 Elongacja 39

40 Problem topologiczny Replikacja DNA postępując będzie generować naprężenia (superskręty) W DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne ze względu na upakowanie w komórce W DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne ze względu na brak wolnych końców 40

41 Problem topologiczny - topoizomerazy 41 Topoizomeraza typu I wprowadza nacięcie w jednej z nici, przesuwa drugą nić przez przerwę i łączy końce Topoizomerazy typu II nacinają obie nici

42 Synteza DNA - polimeraza Synteza DNA (i RNA też) zawsze zachodzi przez dołączanie nowych nukleotydów do grupy OH na końcu 3 syntetyzowanej cząsteczki Substratem są trójfosforany nukleotydów, enzymem polimeraza (zależna od DNA polimeraza DNA) Polimeraza DNA potrafi dobudowywać nukleotydy do istniejącego łańcucha, nie potrafi rozpocząć syntezy 42

43 Startery 43

44 Prymaza Prymaza (polimeraza RNA zależna od DNA) syntetyzuje starter (RNA) dla polimerazy DNA, która go wydłuża. 44

45 Aktywności polimeraz DNA Synteza DNA Egzonukleaza 3-5 korekcja błędów 45 Egzonukleaza 5-3 naprawa uszkodzeń, usuwanie starterów

46 Problem nici nieciąg ej Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać syntezę startera fragmenty Okazaki 46

47 Maszyneria replikacyjna 47

48 Maszyneria replikacyjna Topoizomeraza - usuwa naprężenia Helikaza (DnaB) - rozdziela nici SSB stabilizuje jednoniciowy DNA Prymaza syntetyzuje startery Polimeraza (-y) Ligaza skleja fragmenty 48

49 Wide ki replikacyjne - topologia 49

50 Polimerazy bakteryjne PolIII (PolC) główny enzym replikacyjny, ma aktywność Exo 3-5 (korekta błędów), synteza do 1000 nt/s PolIII nie ma aktywności Exo5-3 PolI (PolA) ma dodatkowo aktywność Exo 5-3, usuwa startery i dokańcza syntezę, do 20 nt/s Ligaza łączy zsyntetyzowane fragmenty (nie jest polimerazą) 50

51 Polimerazy bakteryjne c.d. PolII (PolB) naprawa uszkodzonego DNA w fazie stacjonarnej PolIV i polv synteza DNA w fazie stacjonarnej (poliv) i przy znacznych uszkodzeniach genomu (polv) 51

52 Mutacje w polimerazach E. coli PolI i polii mutacje nie są letalne, zwiększona wrażliwość na czynniki mutagenne (np. UV) PolIII (i niektóre poli) mutacje letalne, badana przez mutanty warunkowe (np. termowrażliwe) 52

53 Mutanty warunkowe polimeraz Mutanty natychmiastowego zatrzymania (quick stop) po przeniesieniu do temperatury restrykcyjnej replikacja natychmiast się zatrzymuje (poliii, prymaza, helikaza, topoizomeraza, SSB) Mutanty powolnego zatrzymania (slow stop) dokańczają rundę replikacji, lecz nie są w stanie rozpocząć następnej (poli, ligaza, białka inicjacji replikacji DnaA, DnaC) 53

54 Polimerazy Eukaryota Pol α prymaza, wydłuża startery Pol β naprawa DNA Pol δ główny enzym replikacyjny Pol ε replikacja, kontrola cyklu kom., naprawa DNA Pol γ replikacja DNA w mitochondriach Polimerazy eukariotyczne nie mają aktywności Exo 5-3, startery RNA usuwają nukleazy FEN1, RnazaH i inne białka 54

55 Mutacje polimeraz eukariotycznych U drożdży (przykłady) POL1 (pol α) letalny, ts POL2 (pol ε) letalny, ts CDC2 (pol δ) letalny POL4 (pol β) zwiększona częstość rekombinacji i wrażliwość na mutageny MIP1 (pol γ) utrata funkcji mitochondrialnej, utrata mtdna U człowieka POLG (pol γ) mutacje powodują dziedziczoną autosomalnie chorobę mitochondrialną PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) związana z uszkodzeniami mtdna opadanie powiek, niezdolność do poruszania gałkami oczu, ogólne osłabienie mięśni, zaburzenia neurologiczne, 55

56 Replikacja genomu kolistego pętla D 56

57 Replikacja genomu kolistego rolling circle 57

58 Problem zakończenia replikacji DNA liniowego Na końcu cząsteczki nie ma skąd zacząc nowego fragmentu Okazaki na nici opóźnionej Cząsteczka potomna będzie skrócona 58

59 Telomery i telomeraza Końce chromosomów posiadają serię powtórzonych fragmentów telomerów Telomeraza może wydłużać telomery wykorzystując fragment RNA Skracanie telomerów ogranicza liczbę podziałów niektórych komórek Aktywacja telomerazy związana jest z unieśmiertelnianiem komórek nowotworowych 59

60 60

61 61 Mutageneza i naprawa DNA

62 Zmiany genomu Wielkoskalowe Zmiany liczby i formy chromosomów, duplikacje całych genomów Rearanżacje chromosomowe Dotyczą dużej liczby genów, fenotyp plejotropowy Mutacje Dotyczą jednego, bądź niewielkiej liczby genów 62

63 Mutacja Trwała, przekazywana przy replikacji zmiana sekwencji nukleotydowej w materiale genetycznym Nie każde uszkodzenie DNA jest mutacją staje się nią dopiero po utrwaleniu i przekazaniu do cząsteczki (lub cząsteczek) potomnych 63

64 Mutacja i naprawa 64

65 Replikacja utrwala zmianę 65

66 Przyczyny mutacji Mutacje spontaniczne Nieuniknione błędy podczas replikacji Mutacje indukowane Błędy w wyniku działania czynników uszkadzających DNA lub zaburzających replikację mutagenów Podział nie jest ścisły mechanizmy nieraz są podobne, wiele mutagenów zwiększa częstość błędów o mechanizmie takim, jak przy mutacjach spontanicznych 66

67 Dok adność replikacji Specyficzność parowania nukleotydów nie jest zbyt wysoka (~5%) Mechanizm selekcji nukleotydów polimerazy: na 3 etapach: wiązanie nukleotydu z polimerazą przenoszenie do centrum aktywnego dołączanie do 3 końca syntetyzowanego łańcucha Mechanizm korekcji błędów: Aktywność egzonukleazy 3-5 Usuwanie niewłaściwie wstawionego nukleotydu Zasada konkurencji między aktywnością polimerazy a egzonukleazy 67

68 Dok adność replikacji Ostatecznie polimeraza jest bardzo dokładnym enzymem U E. coli częstość błędów 1:10 7 wstawianych nukleotydów Częstość błędów na nici opóźnionej 20x wyższa niż na wiodącej PolI mniej dokładna niż PolIII 68

69 Mutacje spontaniczne tautomeria zasad Zasady azotowe występują w fomach tautomerycznych keto i enol (T, G, U) oraz amino i imino (A, C) Dominuje forma ketonowa (lub aminowa) i ona daje właściwe parowanie Rzadszy tautomer enolowy/iminowy może dać niewłaściwe parowanie 69

70 Poślizg replikacji Częsty na sekwencjach powtórzonych, powoduje insercje i delecje Zmienne sekwencje mikrosatelitarne Wykorzystywane jako markery w badaniach populacyjnych, kryminalistycznych itp. Niestabilność mikrosatelitów jest jednym z fenotypów komórek nowotworowych Ekspansje powtórzeń trójnukleotydowych mutacje dynamiczne 70

71 Poślizg replikacji Przesunięcie nici matrycowej i potomnej o jedną (lub więcej) jednostkę (zachowane parowanie) 71

72 Ekspansje trójkowe Wydłużanie serii powtórzeń trójnukleotydowych Mechanizm złożony: możliwe zaburzenia syntezy nici opóźnionej, efekt struktury DNA Trójki bogate w pary G-C Drożdżowy mutant genu RAD27 kodującego endonukleazę FEN1 Przyczyna szeregu chorób genetycznych Niekiedy efekt antycypacji: liczba powtórzeń rośnie z pokolenia na pokolenie, aż osiągnie wartość krytyczną fenotyp w każdym kolejnym pokoleniu coraz cięższy 72

73 Przyk ady chorób Zespół kruchego chromosomu X norma (CAG) 6-35, chorzy (CAG) >60 w sekwencji liderowej genu Choroba Huntingtona norma (CAG) 6-35, chorzy (CAG) w sekwencji kodującej, trakt poliglutaminowy cecha dominująca, agregacja białka Ataksja Friedreicha norma (CTG) 5-37, chorzy (CTG) w intronie, zaburza splicing, obniżony poziom białka 73

74 Mutageny Chemiczne analogi zasad błędnie wykorzystywane jako substraty reagujące bezpośrednio z DNA np. czynniki alkilujące, deaminujące, interkalujące tworzące addukty działające pośrednio np. zwiększające produkcję reaktywnych form tlenu (nadtlenki, rodniki) w komórce działające na polimerazę np. jony Mn 2+ (zamiast Mg 2+ )jako kofaktory polimerazy γ powodują wzrost częstości błędów Fizyczne Np. UV, promieniowanie jonizujące, temperatura Biologiczne Wirusy i ruchome elementy genetyczne integrujące się do genomu 74

75 Mutagen chemiczny - przyk ad 5-bromouracyl analog tyminy, ale równowaga przesunięta w stronę formy enolowej, tworzącej pary z G 75

76 Mutageny chemiczne EMS (metanosulfonian etylu) alkiluje zasady azotowe Czynniki deaminujące (kwas azotawy, dwusiarczyn sodowy) Deaminacja adeniny daje hipoksantynę: paruje z C zamiast T 76

77 Czynniki interkalujące Płaskie cząsteczki, wciskają się między pary zasad, zmieniają skok helisy najczęściej insercje np. bromek etydyny, akryflawiny 77

78 Dzia anie temperatury Hydroliza wiązania β-n-glikozydowego, powstaje miejsce AP (apurynowe/apirymidynowe) i luka Zwykle wydajnie naprawiane, ale w sytuacjach przeciążenia systemów naprawczych może być mutagenne W ludzkich komórkach powstaje miejsc AP dziennie 78

79 Dzia anie UV Powstają fotoprodukty np. dimery cyklobutylowe sąsiadujących zasad (najczęściej T-T), uszkodzenia

80 Naprawa DNA U E. coli częstość błędów polimerazy 1:10 7 wstawianych nukleotydów Ogólna częstość błędów przy replikacji: 1: :10 11 wstawianych nukleotydów genom ~4, bp, czyli błąd raz na ~ podziałów Za zmniejszenie częstości błędów replikacji o 3-4 rzędy wielkości odpowiadają systemy naprawy DNA 80

81 Systemy naprawy DNA Naprawa bezpośrednia (DR) Naprawa przez wycinanie (ER) Naprawa przez wycinanie zasad (BER) Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) Naprawa pęknięć dwuniciowych (DSBR) system łączenia końców niehomologicznych (NHEJ) 81

82 Systemy naprawy DNA 82

83 Naprawa bezpośrednia Naprawa pęknięć jednoniciowych przez ligazę Odwrócenie reakcji alkilacji np. MGMT (metylotransferaza O 6 -metyloguanino DNA) usuwa grupy alkilowe z atomu 6 guaniny Fotoreaktywacja dimerów cyklobutylowych fotoliaza DNA Występuje u mikroorganizmów i wielu zwierząt, ale brak u ssaków łożyskowych, w tym u człowieka (jej rolę przejmuje system NER tzw. naprawa ciemna) 83

84 Naprawa przez wycinanie zasad (BER) Usunięcie uszkodzonej zasady azotowej przez specyficzną glikozydazę DNA Powstaje miejsce AP Endonukleaza AP oraz fosfodiesteraza usuwają resztkę nukleotydu Luka wypełniana jest przez polimerazę 84

85 Glikozydazy przyk ady (ssaki) 85

86 Naprawa przez wycinanie nukleotydów U bakterii dwa systemy krótkich łat (wycinane ~12 nt) długich łat (wycinane ~ 2 kb) U Eukaryota wycinane ~25-30 nt naprawa sprzężona z transkrypcją 86

87 Xeroderma pigmentosum Pol. skóra pergaminowata i barwnikowa Choroba genetyczna związana z mutacjami genów kodujących białka systemu NER (7 grup komplementacji) U człowieka to NER odpowiada za naprawę fotoproduktów Działanie światła słonecznego wywołuje liczne przebarwienia i nowotwory skóry Nie ma lekarstwa pacjenci muszą całkowicie unikać światła słonecznego 87

88 Naprawa b ędnie sparowanych nukleotydów (MMR) W odróżnieniu od DR, BER i NER nie dotyczy uszkodzeń w DNA, tylko błędów replikacji wstawionych niewłaściwych nukleotydów (np. błędy wynikające z tautomerii zasad) Rozpoznawane zaburzenie podwójnej helisy, błędny nukleotyd wraz z otoczeniem (nawet do 1 kb) usuwany, po czym polimeraza uzupełnia lukę Problem: jak rozpoznać, która nić jest rodzicielska (i ma właściwy nukleotyd), a która potomna (z błędem) 88

89 Naprawa b ędnie sparowanych nukleotydów (MMR) U bakterii nić rodzicielska jest metylowana U Eukaryota metylacja też ma znaczenie (u ssaków, u drożdży już nie), ale są też inne mechanizmy (sprzężenie z replikacją, białka naznaczające nić rodzicielską) 89

90 Naprawa b ędnie sparowanych nukleotydów (MMR) MMR u bakterii kilka systemów różniących się długością wycinanej łaty 90

91 Naprawa pęknięć DNA Pęknięcia w jednej nici są łatwe do naprawienia: polimeraza + ligaza. Białka PARP chronią jednoniciowe fragmenty przed dalszą degradacją Pęknięcia dwuniciowe są trudniejsze do naprawienia Powstają np. w wyniku działania promieniowania jonizującego Blokują replikację, nienaprawione mogą doprowadzić do utraty dużych fragmentów chromosomu podczas podziału 91

92 Naprawa pęknięć dwuniciowych Występuje u Eukaryota, uproszczony wariant może też u bakterii 92

93 System SOS u bakterii Przy rozegłych uszkodzeniach matrycy (miejsca AP, fotoprodukty, uszkodzone zasady) Białko RecA pokrywa matrycę Polimeraza V z RecA tworzy mutasom Replikacja zachodzi, ale generuje wiele błędów 93