Siedlce University of Natural Sciences and Humanities Polish Separation Science Society. Camera Separatoria. Volume 7, Number 1 / June 2015

Transkrypt

1 Siedlce University of Natural Sciences and Humanities Polish Separation Science Society Volume 7, Number 1 / June 2015 Siedlce 2015

2 Honorary Editor: Edward Soczewiński (Lublin) Editors-in-Chief: Bronisław K. Głód (Siedlce) Marian A. Kamiński (Gdańsk) Editors: Tadeusz Dzido (Lublin) Bronisław K. Głód (Siedlce) Marian Kamiński (Gdańsk) Piotr M. Słomkiewicz (Kielce) Piotr Stepnowski (Gdańsk) Andrzej Stołyhwo (Warszawa) Monika E. Waksmundzka-Hajnos (Lublin) Mieczysław Sajewicz (Katowice) Language Editor: John Podgórski (Manchester) Technical Editors: Paweł Piszcz Reviewers: Monika Asztemborska Bronisław K. Głód Marian Kamiński Iwona Kiersztyn Paweł Piszcz Mieczysław Sajewicz Piotr M. Słomkiewicz Monika E. Waksmundzka-Hajnos Editorial office s address: Department of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry Siedlce University of Natural Sciences and Humanities ul. 3 Maja 54, Siedlce tel. : (25) camera.separatoria@gmail.com URL:

3 SPIS TREŚCI (CONTENTS) Prace przeglądowe / Review papers Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ Techniki i metody wyodrębniania, rozdzielania i oznaczania frakcji asfaltenowej w rafineryjnych strumieniach procesowych.. 5 Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ Zastosowanie technik chromatograficznych do badań charakterystyki fizykochemicznej czystych substancji i mieszanin...17 Prace oryginalne / Original papers Marta GLINKA, Marina ANTOLAK, Rafał ŁUKAJTIS, Marian KAMIŃSKI Wpływ rodzaju kwasu jako dodatku do eluentu na parametry rozdzielania polifenoli techniką chromatografii cieczowej w odwróconych układach faz (RP-HPLC) Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Część I. Dobór warunków chromatograficznych Judyta KOSIŃSKA, Grażyna GAŁĘZOWSKA, Sebastian ZALEWSKI, Marian KAMIŃSKI Chromatografia cienkowarstwowa i technika TLC-FID w badaniach składu grupowego, szczególnie, tłuszczów i produktów ich konwersji Judyta KOSIŃSKA, Monika ŚMIEŁOWSKA, Marian KAMIŃSKI Badania nad rozdzielaniem grupowym technikami sorpcji i chromatografii. Część I Wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) dla doboru warunków rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji technikami kolumnowymi Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Część II. Właściwości antyoksydacyjne mięsa Instrukcje dla Autorów..94 Instructions for Authors and Editorial Policy.98

4 PRACE PRZEGLĄDOWE (Review papers)

5 CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ* Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej *Autor do korespondencji, grzegorz.boczkaj@gmail.com Techniki i metody wyodrębniania, rozdzielania i oznaczania frakcji asfaltenowej w rafineryjnych strumieniach procesowych Streszczenie: W pracy przedstawiono metodyki izolacji frakcji asfaltenowej z rafineryjnych strumieni procesowych w tym ropy naftowej, olei i asfaltów w skali analitycznej i preparatywnej. Uwzględniono podstawowe zależności pomiędzy właściwościami otrzymanej frakcji, a ciśnieniem, temperaturą, proporcją oraz rodzajem czynnika precypitującego, a także czasem i temperaturą kontaktu oraz techniką oczyszczania powstałego osadu. Dodatkowo opisano techniki pozwalające na dalsze rozdzielenie wydzielonej frakcji oraz przedstawiono sposoby badania zawa rtości asfaltenów w surowcu i produktach jego przeróbki. Słowa kluczowe: asfalteny, precypitacja, rozdzielanie grupowe, wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC, chromatografia cienkowarstwowa z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym TLC-FID Techniques and methods of isolation, separation and quantification of asphaltene fraction in refinery process streams Abstract: The paper presents methods of isolation of asphaltene fraction from refinery process streams especially from crude oil, oils and bitumen in analytical and preparative scale. The relationship between the properties of the obtained fraction, pressure, temperature, proportion and type of precipitating agent, time and contact temperature and the solid asphaltenes purification techniques are described in details. Additionally the techniques used for further separation of asphalthenes into subsequent fractions are discussed as well as methods used for quantitative analysis of asphaltenes content in the feedstock and products of its processing. Keywords: asphaltenes, precipitation, group-type separation, high performance liquid chromatography HPLC, thin layer chromatography with flame ionization detector TLC-FID. 1. Wstęp 1. Introduction Asfalteny są klasą związków chemicznych, stanowiących grupę składników surowej ropy naftowej, występującej w całości po przeróbce w pozostałości z destylacji próżniowej oraz produktów ekstrakcji lub jej konwersji. Charakteryzuje się je na podstawie rozpuszczalności składników tej grupy w określonych n-alkanach. W strukturze cząsteczek asfaltenów znajdują się przede wszystkim wielopierścieniowe skondensowane struktury poliaromatyczne, a także niewielkie ilości struktur alicyklicznych oraz raczej niewielka liczba prostych i rozgałęzionych łańcuchów węglowodorowych [1, 2]. Asfalteny wykazują rozpuszczalność w rozpuszczalnikach takich jak np.: toluen, tetrahydrofuran (THF), benzen i dichlorometan (DCM). Pod względem morfologicznym są policyklicznymi węglowodorami aromatycznymi z peryferyjnie przyłączonymi łańcuchami alifatycznymi zdolnymi do tworzenia ok. 6-członowych agregatów, a dalej ok. 8-członowych klastrów układających się w struktury pseudografitowe [3]. Asfalteny to czarno-brązowe, błyszczące substancje polarne zawierające w swej budowie heteroatomy siarki, azotu i tlenu oraz metale takie jak wanad, nikiel i żelazo. Większość składników frakcji asfaltenowej wykazuje rozkład termiczny poniżej temperatury wrzenia. Ich budowa i właściwości fizykochemiczne różnią się w zależności od metody, jaką je wyizolowano. Asfalteny to frakcja ropy naftowej lub produktów ropopochodnych, która nie rozpuszcza się w lekkich rozpuszczalnikach węglowodorowych, głównie n-pentanie, n-heksanie, n-heptanie i izo-oktanie. W literaturze bardzo często asfaltenami nazywana jest zarówno pozostałość nierozpuszczalną w parafinach jak i tę część otrzymanej frakcji, która rozpuszcza się w benzenie lub toluenie tj. nie zawierającą karbenó w (rozpuszczalnych w disiarczku węgla) i karboidów (nierozpuszczalnych w disiarczku węgla) [4, 5]. Asfalteny są głównymi składnikami asfaltów drogowych i mieszanek asfaltowych, nadającymi im spoistość i lepkość [6]. Można je stosować jako dodatek do gum mi neralnych poprawiający wytrzymałość na rozciąganie i nadający twardość [7].

6 6 Asfalteny to także prekursory tworzenia się koksu stanowiącego jeden z głównych problemów w procesach hydrorafinacji, hydroodsiarczania [8], oraz hydrokrakingu katalitycznego. Zdyspergowane, w niskim stężeniu obniżają temperaturę precypitacji wosków, działając jak inhibitory nukleacji, natomiast wpływ dużych agregatów przy wyższych stężeniach na proces żelacji jest dokładnie odwrotny [9]. Ze względu na wszystkie wyżej wymienione właściwości as faltenów, ważne jest, aby poznać ich charakterystykę fizykochemiczną i opisać ilościowo jej zależność od techniki izolacji, za pomocą której je uzyskano. Frakcja asfaltenowa o kontrolowanych właściwościach fizykochemicznych może znaleźć zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu. W niniejszej pracy porównano metody izolacji oraz rozdzielania i oznaczania frakcji asfaltenowej. Ponadto opisano również wpływ najważniejszych parametrów na ich właściwości. 2. Precypitacja standardowa 2. Standard precipitation Precypitacja standardowa, służąca pierwotnie do oznaczania zawartości asfaltenów w materiałach pochodzenia naftowego, jest najczęściej spotykaną i najlepiej opisaną techniką izolacji frakcji asfaltenowej. Istotą metody jest dodanie do surowca odpowiedniego czynnika precypitującego, czyli takiego, w którym rozpuszczają się wszystkie, albo większość, składników przetworów naftowych, a nie rozpuszcza się frakcja asfaltenowa. Istnieje wiele odmian tej operacji, które podzielić można ze względu na wykorzystany s urowiec, czynnik precypitujący, proporcje składników, sposób przemywania osadu oraz wykorzystaną aparaturę. Najczęściej miesza się surowiec i rozpuszczalniki, a następnie odfiltrowuje wytrącony osad. Do oddzielenia frakcji od przesączu alternatywnie wykorzystuje się również wirówki obrotowe, gdzie każdorazowo po dodaniu świeżej porcji czynnika precypitującego i odwirowaniu zlewa się ciecz znad osadu. Kolejnym krokiem, może być, ale nie musi, oczyszczanie asfaltenów z koprecypitatów i innych niechcianych składników zawartych w próbce. W zależności od zastosowanego surowca i czynnika precypitującego lub jego mieszanin oraz ich wzajemnej proporcji, a także temperatury prowadzenia procesu i czasu kontaktu składników możliwa jest nieskończenie duża liczba wariantów metodyki. Najczęściej stosowane są jednak te ujęte w normach, w szczególności serii ASTM oraz inne zestawione w tabeli 1. Tabela 1 Zestawienie wybranych norm opisujących techniki izolacji frakcji asfaltenowej [10-14]. Table 1 Selected standards describe the asphaltenes isolation techniques [10-14]. Norma Zakres zastosowania metodyki Precypitant Objętość precypitanta [ml/g próbki] Temperatura mieszania i czas kontaktu ASTM D oleje bazow e n-pentan 10 w irow anie 20min - ASTM D ASTM D ASTM D w ypełniacze gumow e, oleje naftow e oraz oleje, których temperatura destylacji rozpoczyna się pow yżej 260 C stałe i półstałe asfalty naftow e nie zaw ierające lub zaw ierające nieznaczne ilości materii mineralnej, oleje napędow e, ciężkie oleje opałow e, ropa naftow a asfalty naftow e, destylaty próżniow e, oleje napędow e i oleje smarow e n-pentan 10 n-heptan 100 n-heptan 100 delikatne ogrzewanie do rozpuszczenia się osadu, chłodzenie 30min ogrzew anie 15-30min, chłodzenie 60min, filtrow anie C ogrzew anie do rozpuszczenia się osadu (1godz.), chłodzenie przez noc Rodzaj filtra filtr papierow y w łókno szklane szybki/ średni ilościow y filtr papierow y Operacje dodatkowe 2-krotne odw irowywanie osadu ze św ieżą ok. 10mL porcją pentanu przemycie kolby i filtru porcjami po 60mL pentanu przemyw anie 3 porcjami n-heptanu po 10mL do osadu dodaje się 150mL n-heptanu, ogrzew a 30min i filtruje na gorąco przez św ieży filtr ASTM D ASTM D asfalty naftow e, destylaty próżniow e, oleje napędow e i oleje smarow e olej napędow y, resztkowy olej opałowy, olej smarow y, asfalt, ropa naftow a izooktan 100 n-heptan 30 ogrzew anie, chłodzenie i mieszanie po 2 godziny ogrzew anie 60±5min, chłodzenie min średni filtr szklany filtr Whatman 42 - ekstrakcja uzyskanego osadu w aparacie Soxhleta gorącym n-heptanem

7 7 Norma WRI (World Resources Institute) IFP 9313 absorbance versus maltenes at 750nm Zakres zastosowania metodyki Precypitant Objętość precypitanta [ml/g próbki] - n-heptan 40 - n-heptan Temperatura mieszania i czas kontaktu ogrzew anie 5min w 80 C, mieszanie 16godz. w temperaturze pokojow ej, odstaw ienie 30min ogrzew anie 5min w 80 C, filtrow anie w temp pokojow ej Rodzaj filtra średni filtr szklany filtr z estrów celulozy 0,45µm Operacje dodatkowe nie krócej niż 60min z następczym rozpuszczeniem w toluenie (30-60mL) - - W 1916 roku Marcusson stworzył pojęcie asfalteny, obejmujące frakcję nierozpuszczalną w mieszaninie n-pentanu, izopentanu i cyklopentanu (temperatura wrzenia 88 C). Scharakteryzował on oprócz asfaltenów jeszcze trzy inne frakcje: kwasy asfaltogenowe i ich bezwodniki, żywice asfaltenowe, a jako pozostałość- składniki olejowe [15]. Ancheyta powtórzył doświadczenie Marcussona stosując pentanowy strumień rafineryjny zawierający 40,9% n-pentanu, 30,5% izopentanu, 3,4% propan-butanu, 25,9% n-heksanu i n-heptanu. Próbkę ropy naftowej zmieszanej w stosunku 1:60 względem precypitanta podgrzewano do temperatury ok. 92 C przez 20 minut i pozostawiono na godzinę do ochłodzenia, następnie przefiltrowano, przemyto trzema porcjami heptanu i wysuszono w 107 C. W porównaniu z zastosowaniem czystego n-pentanu, uzyskano większą ilość frakcji asfaltenowej, jednak ze względu na złożoną mieszaninę rozpuszczalnika wyizolowane, z zastosowaniem jednakowej procedury, asfalteny charakteryzowały się odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi [16]. W 1941 roku do precypitacji wykorzystano n-pentan w temperaturze pokojowej (dodawany porcjami po 100, 75 i 50 ml) w proporcji 45:1 względem asfaltu, pozostawiając tak przygotowaną mieszaninę na noc. Po odsączeniu i przemyciu osadu dodano do niego pozostałości osadz one na ściankach kolby, wysuszono w 105 C i zważono [17]. W podobny sposób można wydzielić asfalteny z wykorzystaniem izopentanu, zmieszanego w proporcji 1:40 po 24 godzinnej ekspozycji [18], oraz n-pentanu w takiej samej proporcji po 2 godzinnej ekspozycji [19]. Izolacja frakcji asfaltenowej możliwa jest również z innych surowców niż ropa naftowa i jej przetwory. Asfalteny z rozdrobnionych mieszanek kauczukowych izolować można z wykorzystaniem zimnego eteru naftowego jako precypitanta w proporcji 1:49. Próbkę po wymieszaniu z rozpuszczalnikiem umieszcza się w chłodnym miejscu na 48 h, przesącza, a powstały osad przemywa eterem naftowym do czasu, gdy nie zauważa się pierścieni olejowych [7]. Asfalteny z węgla otrzymuje się w procedurze trzy-etapowej poprzez pierwotne rozpuszczenie w pirydynie, dodanie do frakcji rozpuszczalnej toluenu i właściwą precypitację n-heksanem. Badania węglową spektroskopią magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Carbon Nuclear Magnetic Resonance, CNMR) wykazały, że cząsteczki asfaltenów węglowych zawierają w swojej strukturze większą ilość węgli aromatycznych i krótsze alifatyczne łańcuchy boczne w stosunku do asfaltenów wydzielonych z ropy naftowej [20]. W 2004 roku E. Hong i P. Watkinson wykorzystali pozostałość próżniową (ang. Vacum Residue, VR) i pozostałość po destylacji atmosferycznej (ang. Atmospheric Tower Bottoms, ATB) jako surowiec do precypitacji. Rolę rozpuszczalników pełniły: czyste n-alkany, olej bazowy (ang. Lube Oil Base-Stock- Paraflex, PFX), ciężki próżniowy olej napędowy (ang. Heavy Vacuum Gas Oil, HVGO) i wzbogacona frakcja żywiczna (ang. Resin Enriched Fraction, REF) odzyskana z VR poprzez frakcjonowaną ekstrakcję płynem w stanie nadkrytycznym. Precypitacja przeprowadzana była w sposób standardowy poprzez 30 minutowe mieszanie surowca z czynnikiem precypitującym w temperaturze 60 C w przypadku n-alkanów i 85 C dla mieszanin wieloskładnikowych. Badania wykazały, że dla surowców poddanych precypitacji z zastosowaniem n-heptanu, n-dekanu i n-dodekanu, ilość uzyskanej frakcji asfaltenowej wzrastała wraz ze spadkiem liczby atomów węgla w łańcuchu węglowodorowym. W mniejszym stopniu tendencję tę stwierdza się dla cieczy precypitujących stanowiących mieszaniny bardziej polarnych frakcj i i surowców z dodatkiem alifatycznych rozpuszczalników, gdyż dodatek składnika bogatego w żywice hamuje wytrącanie się frakcji asfaltenowej, poprzez zwiększenie jej rozpuszczalności. Asfalteny rozpuszczają się w roztworze w zakresie temperatur od 100 do 140 C, ale mogą wytrącać się ponownie w temperaturze powyżej 200 C [21]. Dodatkowo stwierdzono, że ilość wydzielonych asfaltenów maleje monotonicznie wraz ze wzrostem temperatury, a efekt ten ma głównie znaczenie w temperaturach poniżej 160 C. Potwierdza t o wcześniejsze badania spadku procentowej zawartości wytrąconych asfaltenów wraz ze wzrostem temperatury dla czystego n-heptanu i jego mieszaniny z toluenem w granicach C [22]. E. Buenrostro-Gonzalez i inni poddali badaniom olej martwy (ang. Dead Oil), czyli olej o bardzo niskiej prężności par pozbawiony całkowicie frakcji lotnej, lub stosunkowo gęsty, tak że nie zawiera rozpuszczonego gazu (utracił swoje lotne składniki). Do 5g próbki po wstępnej filtracji dodawano czynnika precypitującego, którym był zamiennie n-pentan, n-heptan, n-nonan i n-dodekan w ilości 0,52; 1; 2; 3; 4; 7; 10; 30; 50 cm 3 /g.

8 8 Całość mieszano w wytrząsarce ultradźwiękowej 10 min i pozostawiano na noc. Wytrącone asfalteny filtrowano przez sączek teflonowy 0,45 µm i suszono w suszarce próżniowej pod ciśnieniem 0,1 bar w temperaturze 60 C przez 6 godzin. Dla dwóch badanych olei stwierdzono największy odsetek wyizolowanych asfaltenów w przypadku precypitacji z wykorzystaniem n-pentanu i proporcji surowiec rozpuszczalnik 1:50 [23]. Takie same wnioski wyciągnięto analizując ropę naft ową z zastosowaniem n - pentanu i n-heptanu przy 24godzinnej ekspozycji oraz z zastosowaniem procedury 2-etapowej, polegającej na pierwotnym zmieszaniu surowca z czynnikiem precypitującym w stosunku 1:3, przefiltrowaniu wytrąconej frakcji i dodaniu do przesączu kolejnej porcji rozpuszczalnika w proporcji 1:18 [24]. Zależność pomiędzy ilością i masą molową wytrąconych asfaltenów, a rodzajem i proporcją rozpuszczalnika badał wcześniej Rassamdana. Wykazał, że spośród badanych n-alkanów o 5, 6, 7, 8 i 10 atomów węgla w łańcuchu i dla proporcji od 1:1 do 1:10 g ropy/ml węglowodoru największą wydajność i najmniejszą liczbową i wagową masę cząsteczkową uzyskuje się dla 0,1 g/ml pentanu [25]. Dodatkowo udowodnił, że 72% asfaltenów rozpuszcza się ponownie w ropie po odparowaniu rozpuszczalnika wykorzystanego podczas precypitacji tak, aby zyskać zbliżony do początkowego skład surowca, a 62% gdy zamiast odparowania rozpuszczalnika dodana jest świeża porcja ropy [26]. Wydajność precypitacji zwiększyć można przez dodatkowe wydzielenie frakcji asfaltenowej z powstałego przesączu. Przesącz po asfaltenach wydzielonych z pozostałości próżniowej n -heptanem lub octanem etylu z zastosowaniem procedury całonocnej i proporcji 1:50 poddano ponownej precypitacji z wykorzystaniem n-pentanu. Badania wykazały znaczny wz rost ilości odzyskanej frakcji. W przypadku n-heptanu zaobserwowano wzrost, a dla octanu etylu spadek masy molowej [27]. Wykorzystanie do precypitacji mniejszej ilości czynnika precypitującego bądź użycie czynnika lotnego, takiego jak etan, czy propan może spowodować współstrącenie frakcji żywicznej. Większy odsetek wyizolowanej frakcji asfaltenowej wiąże się ze zmniejszeniem ilości atomów węgla w łańcuchu precypitanta i jego mniejszą masą molową [28, 29]. Wydajność precypitacji rośnie wraz ze wzrostem proporcji surowiecrozpuszczalnik do ok. 1:20 (% wagowego), aż osiągnie pleteu przy stosunku ok. 1:40, dalsze zwiększanie ilości rozpuszczalnika nie ma więc ekonomicznego uzasadnienia [30]. Szacuje się, że łańcuch alkilowy asfaltenów wyizolowanych za pomoc ą n-c7, n-c5 i ciekłym propanem będzie zawierał odpowiednio ok. 7, 8 i 9 atomów węgla. Najdłuższy łańcuch w przypadku asfaltenów izolowanych propanem, a tym samym większy udział grup alifatycznych w stosunku do aromatycznych, skutkuje najmniejszą polarnością wyizolowanej frakcji. Dobór czynnika precypitującego ma również wpływ na wygląd i masę molową. Im krótszy łańcuch czynnika alkilowego, tym mniejsza masa molowa i bardziej luźna budowa asfaltenów [31]. Już w 1985 roku wykazano, że na wartość średnią masy molowej asfaltenów wpływ może mieć również proporcja surowiec rozpuszczalnik. Dla zbadanych próbek asfaltenów z ropy naftowej masa wzrastała wraz ze zwiększeniem ilości n-heptanu w mieszaninie precypitującej od 8400 Da dla proporcji 1:20 do 9000 Da dla 1:60 [32]. Na właściwości fizyko-chemiczne asfaltenów wpływ ma również sposób przemywania powstałego osadu. Przeprowadzone badania wykazały, że masa molowa asfaltenów jest najniższa dla asfaltenów nieprzemywanych i wzrasta odpowiednio dla klasycznego przemywania, przemywania wspomaganego ultradźwiękami i ekstrakcji z zastosowaniem aparatu Soxhleta. W kolejności odwrotnej wzrasta natomiast stopień czystości osadu, określony na podstawie badań średniej masy molowej, gęstości i rozpuszczalności [33, 34]. Oczyszczanie asfaltenów poprzez ekstrakcję (w aparacie Soxhleta) czynnikiem precypitującym daje najlepsze wyniki pod względem czystości odzyskanej frakcji. Po 72 godzinach oczyszczania możliwe jest zwiększenie ich zawartości z ok. 20 do 40%. Dodatkowo wraz ze wzrostem czasu przemywania wzrasta masa molowa [35]. Popularną metodą oczyszczania z współstrąconych maltenów jest reprecypitacja. Wydzieloną frakcję rozpuszcza się w rozpuszczalniku wtórnym, najczęściej chlorku metylenu lub toluenie, do powstałej mieszaniny dodaje się nadmiar czynnika precypitującego, który powoduje ponowne wyt rącenie się asfaltenów z roztworu [36-39]. Osad poddać można filtracji otrzymując w ten sposób oczyszczoną frakcję. W 2012 roku przeprowadzono badania porównujące standardową precypitację asfaltenów z izolacją z wykorzystaniem rozpuszczalnika aromatycznego jakim był benzotrifluorek (ang. Benzotrifluoride, BTF). Do asfaltu dodano odczynnika (n-heptanu lub BTF) w proporcji 1:40 względem masy surowca, wymieszano wspomagając ultradźwiękami i pozostawiono w ciemności, w temperaturze pokojowej na 16 godzin. Wytrącone asfalteny odfiltrowano na filtrze o średnicy porów 1,2µm i przemywano czynnikiem precypitującym do odbarwienia się przesączu. Następnie osad rozpuszczono w niewielkiej ilości DCM/metanol (93:7 v/v) i odparowano rozpuszczalnik. Badania wyk azały, że wydajność precypitacji z zastosowaniem BTF jest mniejsza, niż dla n-heptanu. Dodatkowo dla n-heptanu przeprowadzono badania nad wpływem temperatury na wygląd uzyskanej frakcji. Dla temperatur 22, 30 i 45 C asfalteny były czarne, kruche, twarde i o ostrych krawędziach, w temperaturze 60 C kolor zmienia się na brązowy, a 90 C cząstki są mniejsze i bardziej błyszczące [40]. Poza tradycyjnymi metodami precypitacji można wyróżnić dwie rzadziej stosowane metodyki wydzielania frakcji asfaltenowej. Pierwsza, polega na zastosowaniu siły odśrodkowej i następczej filtracji, druga zaś, na wykorzystaniu rozpuszczalnika pierwotnego dla zapewnienia lepszego kontaktu pomiędzy surowcem, a czynnikiem precypitującym. W fiolce wirówkowej umieszczono próbkę dodając 40 ml/g pentanu i wymieszano do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Następnie umieszczono ją w kąpieli wodnej w

9 9 temperaturze 15,6 C i mieszano 10 min (2500 obr/min). Po tym czasie próbka została odstawiona na 12 godz. w zaciemnione miejsce, a następnie ponownie termostatowana i mieszana. Przed dekantacją n-pentanu asfalteny odwirowywano. Do pozostałego osadu dodano 25 ml świeżego czynnika precypitującego na każdy ml pozostałości, mieszano 10min w temperaturze 15,6 C i odwirowano. Przemywanie powtarzano 4-krotnie, a otrzymane asfalteny rozpuszczono w benzenie z niewielkim dodatkiem metanolu (zapobiega sorpcji asfaltenów na sączku) i przefiltrowano do uprzednio wytarowanej kolby. Rozpuszczalnik wtórny odparowano w strumieniu gazu obojętnego, a osad wysuszono w sus zarce próżniowej w temperaturze 105 C [41]. W 1972 roku zbadano odsetek wytrąconej frakcji asfaltenowej w zależności od zastosowanego czynnika precypitującego, przy zachowaniu stałej proporcji w stosunku do surowca wynoszącej 1:40 i benzenu jako rozpuszczalnika pierwotnego. Wyniki badań, zestawione w tabeli nr 2, wykazały, że największą wydajność precypitacji można uzyskać stosując jako czynnik precypitujący związki z grupy izo - alkanów, nieco mniejszą, gdy użyjemy n-alkanów, a najmniejszą w przypadku węglowodorów cyklicznych bez i z podstawnikami. Dodatkowo, w przypadku rozpuszczalników cyklicznych, zwiększenie ilości atomów węgla występujących w ich strukturze ma najmniejszy wpływ na wydajność precypitacji [42]. Tabela 2 Odsetek nierozpuszczonej frakcji w zależności od użytego czynnika precypitującego. Table 2 The percentage of insoluble fraction, depending on the used precipitating agent. % % % % Czynnik Czynnik Czynnik Czynnik nierozpuszczo nierozpuszczo nierozpuszczo nierozpuszczo precypitujący precypitujący precypitujący precypitujący nej frakcji nej frakcji nej frakcji nej frakcji n-pentan 16,9 izopentan 17,6 n-penten 16,2 cyklopentan 1,0 n-heksan 13,5 izoheksan 15,3 n-heksen 13,0 metylocyklopentan 1,4 n-heptan 11,4 izoheptan 12,8 n-hepten 10,9 etylocyklopentan 1,9 n-oktan 9,8 izooktan 11,5 n-okten 9,0 cykloheksan 0,7 n-nonan 9,4 izononan 10,0 n-nonen 8,6 metylocykloheksan 1,0 n-dekan 9,0 izodekan 9,8 n-deken 8,5 etylocykloheksan 1,4 Innymi alternatywnymi, dość często stosowanymi w różnych proporcjach rozpuszczalnikami pierwotnymi są toluen i dichlorometan [43-45]. Badania nad zależnością ilości wytrąconych asfaltenów w układach zawierających 10, 17, 25 i 35% wagowych oleju ciężkiego w toluenie wykazały że ilość, wydzielonych z zastosowaniem n-heptanu, asfaltenów zależy od stężenia materiału wejściowego (stężenia oleju w toluenie) [46]. 3. Frakcjonowanie asfaltenów 3. Asphaltenes fractionation Frakcjonowanie wydzielonych wcześniej asfaltenów przeprowadzić można na kilka sposobów, najczęściej pod względem rozpuszczalności oraz polarności. Jedna z metod obejmuje wykorzystanie w tym celu aparatu Soxhleta i ekstrakcję mieszaniną czynnika precypitującego i wybranego rozpuszczalnika polarnego w różnych proporcjach. Procedura ekstrakcyjna przebiega według schematu przedstawionego na rysunku 1. Najczęściej surowiec stanowią pozostałości z poprzedniej ekstrakcji. Badania wykazały że ostatnia frakcja, rozpuszczalna w mieszaninie 1:2 (v/v) toluen:n-heptan ma najbardziej złożoną strukturę przy jednoczesnej najmniejszej ilości pierścieni aromatycznych i aromatycznych atomów węgla [47]. Rys 1 Schemat frakcjonowania asfaltenów [47]. Fig 1 Asphaltenes fractionation scheme [47].

10 10 Tą samą technikę wykorzystano do frakcjonowania asfaltenów z zastosowaniem czystego tetrahydrofuranu i mieszaniny rozpuszczalników THF:aceton w proporcjach 1:60, 2:50, 3:40, 5:20 i 6:10. Każdą z próbek poddawano 24 godzinnej ekstrakcji. Stwierdzono, że wraz ze wzrostem stężenia THF masa molowa asfaltenów rośnie [35]. Asfalteny frakcjonować można również na podstawie zmiennej rozpuszczalności wchodzących w ich skład komponentów. W tym celu wykorzystuje się mieszaninę, w której znajduje się substancja polarnarozpuszczalnik (np. chlorek metylenu, toluen, tetrahydrofuran) i rozpuszczalnik dyspergujący (np. n-heptan, n-pentan). Wyizolowane wcześniej asfalteny rozpuszcza się w polarnym rozpuszczalniku w określonym stosunku, a następnie dodaje rozpuszczalnika dyspergującego. Całość miesza się i odwirowuje wydzielając pierwszą frakcję asfaltenową. Kolejne, otrzymuje się poprzez dodanie do poprzedniego supernatantu nowej porcji substancji polarnej w określonej proporcji [48]. Stwierdzono, że asfalteny stanowiące mniej polarną frakcję łatwiej ulegają dyspersji w rozpuszczalniku [49]. Jako rozpuszczalnik dyspergujący bardzo często wykorzystuje się aceton i n-heptan, gdyż obie te substancje można stosunkowo łatwo usunąć z wydzielonej frakcji. Ponadto czynniki te charakteryzują się właściwościami niepolarnymi i słabo polarnymi [50]. Stosowaną mieszaninę n-heptanu z toluenem nazywa się heptolem i wykorzystuje się do rozdzielenia asfaltenów na frakcje: lekką (rozpuszczalną w hepto lu) i ciężką [51]. Na podstawie badań rozpuszczalności asfaltenów w heptolu stwierdzono, że mechanizm precypitacji jest kontrolowany przez oddziaływania dyspersyjne między asfaltenami i rozpuszczalnikiem. Tendencja mniej rozpuszczalnych frakcji do strącania się w toluenie sugeruje, że frakcja rozpuszczalna zakłóca oddziaływania polarne i wiązań wodorowych, które są siłą napędową precypitacji [52]. Zastosowanymi w trój stopniowej metodzie, frakcjonowania asfaltenów z ropy naftowej, zaproponowanej przez M. Tojima rozpuszczalnikami były mieszaniny toluen/n -heptan w proporcjach: 35/65 (F1), 25/75 (F2) i 18/82 (F3). Średnia molowa masa cząsteczkowa najmniej rozpuszczalnej frakcji F1 wynosiła ok Da i malała odpowiednio do i dla F2 i F3. Odwrotną tendencję wykryto dla wartości proporcji liczby atomów wodoru do atomów węgla [53]. Ciężką ropę naftową i pozostałość po destylacji atmosferycznej rozpuszczono w THF w stosunku 1:10 m/m, dodano odpowiednią ilość n-heksanu, mieszano 40 min i pozostawiono do stabilizacji na godzinę, następnie odwirowywano 40 min i wysuszono w próżni. Czynność tą powtarzano wykorzystując różne ilości czynnika dyspergującego tak aby otrzymać 4 frakcje różniące się polarnością. Dla pozostałości próżniowej zastosowano proporcję n-heksan:thf wynoszącą 1,3:1, 1,6:1 i 2,3:1, natomiast dla ciężkiej ropy naftowej 1,8:1, 2,6:1 i 3,6:1. Otrzymane frakcje charakteryzowały się większą polarnością i wartością momentu dipolowego niż wyjściowe asfalteny, z których wyizolowano frakcje [54]. Popularną metodą frakcjonowania asfaltenów jest frakcjonowanie w kolumnie. Wyizolowaną uprzednio frakcję (ok. 80 mg) umieszcza się w celce ekstrakcyjnej, do której podaje się czynnik precypitujący (ditlenek węgla) w ilości 60 g/h, przy zachowaniu stałej wartości ciśnienia i temperatury. Następnie mieszanina przechodzi do dwóch ustawionych szeregowo pułapek, gdzie w wyniku barbotażu dochodzi do wymiany masy pomiędzy wprowadzanym surowcem, a pełniącym rolę czynnika ekstrahującego etanolem. Po zakończeniu operacji alkohol odparowuje się, a wysuszony ekstrakt waży. Badania dowiodły, że każdy kolejny ekstrakt zawiera większą ilość związków aromatycznych, oraz mniejszą ilość n-alkanów w stosunku do poprzedniego. Metodą tą możliwe jest wyekstrahowanie do 12% asfaltenów. Dodatkowo stwierdzono, że temperatura nie ma większego wpływu na proces ekstrakcji w przeciwieństwie do ciśnienia i obecności rozpuszczalnika. Zwiększenie ciśnienia (od 130 do 300 bar) prowadzi do ekstrakcji cięższych n-alkanów i związków aromatycznych oraz bardziej rozgałęzionych i cyklicznych alkanów. Porównanie procesu, dla tych samych warunków ciśnienia i temperatury, bez i z dodatkowym rozpuszczalnikiem (toluen, dichlorometan) pokazuje, że cięższe i bardziej rozgałęzione n-alkany i związki cykliczne ekstrahuje się, gdy stosuje się modyfikatory [55]. Zarówno w przypadku ropy naftowej jak i produktów ropopochodnych możliwe jest frakcjonowanie poprzez elucję rozpuszczalnikową. Wyizolowane wcześniej asfalteny rozpuszcza się i immobilizuje na wypełnieniu kolumny, przez którą przepuszcza się szereg rozpuszczalników. Zastosowane eluenty oraz charakterystykę eluowanych związków porównano w tabeli poniżej [56, 57].

11 11 Tabela 3 Charakterystyka wyizolowanych z zastosowaniem wybranych eluentów frakcji asfaltenowych. Table 3 Characteristics of selected asphaltenes fractions and their eluent. Eluent Charakterystyka frakcji Eluent Charakterystyka frakcji n-heksan zw iązki nasycone n-heksan zw iązki nasycone 15% toluen, 64% n-heksan, zw iązki aromatyczne 85% n-heksan 36% benzen zw iązki aromatyczne chloroform polarne zw iązki aromatyczne, nie zasadow e zw iązki heterocykliczne zaw ierające atomy chloroform zw iązki zaw ierające heteroatomy N, O, S 10% eter dietylow y, 90% monofenole 95% chloroform, zasadow e, azotow e fenole chloroform 3% etanol, 97% eter dietylow y metanol 3% etanol, 97% chloroform 3% etanol, 97% tetrahydrofuran 3% etanol, 97% pirydyna pirydyna zasadow e zw iązki heterocykliczne zaw ierające azot cząsteczki wysoce-funkcjonalne zawierające 10% heteroatomów polifenole grupy funkcyjne o w zrastającej zawartości N i O grupy funkcyjne o w zrastającej azotozasadow ości cząsteczki w ysoce funkcjonalne 5% eter dietylow y 93% chloroform, 7% etanol pirydyna zasadow e, azotow e amidy zw iązki w ysoce polarne Oprócz standardowej fazy stacjonarnej, jaką jest żel krzemionkowy możliwe jest wykorzystanie inertnego wypełnienia np. Politereftalanuetylu (PTFE). Metodę tą zastosowano w 2015 roku do porównania profilu rozpuszczalności asfaltenów pozyskanych z ropy naftowej i pochodzących z niej depozytów. Próbkę po rozpuszczeniu w chlorku metylenu naniesiono na PTFE, przeniesiono do kolumienki i odparowano rozpuszczalnik w strumieniu azotu. Całość w celu wyizolowania maltenów ekstrahowano n -heptanem w temperaturze pokojowej przez 60 min. Poszczególne frakcje asfaltenów wymyto mieszaninami DCM:n-heptan w proporcji: (F1) 15:85, (F2) 30:70, frakcję (F3) otrzymano z zastosowaniem czystego dichlorometanu, a (F4) z zastosowaniem mieszaniny 90:10 (DCM:metanol). Pierwsze cztery frakcje eluowano w warunkach temperatury pokojowej przez 60 min, ostatnią piąta frakcję (F5) wyeluowano trzema porcjami rozpuszczalnika (DCM: metanol 90:10) w 120 C przez 15min [58]. Poza frakcjonowaniem wcześniej wytrąconych asfaltenów możliwe jest wydzielenie podfrakcji asfaltenowych bezpośrednio z surowca np. smoły węglowej poprzez rozpuszczenie jej w chloroformie i naniesienie na żel krzemionkowy. Całość pakuje się do kolumny z zachowaniem kolejności: 5 mm piasku, 60 mm żelu krzemionkowego i ponownie 5 mm piasku. Pierwszym wprowadzanym eluentem jest n-heksan (F1), następnie toluen (F2) i pirydyna (F3). Frakcję 4 otrzymano poprzez ekstrakcję dimetyloformamidem pozostałości zaadsorbowanych na żelu krzemionkowym [59].Znana jest również metoda oparta na procedurze składającej się z siedmiu kroków. Procedura zakłada następującą kolejność wykorzystywania eluentów i otrzymywanych w wyniku ekstrakcji frakcji: n-heksan (F1), 64/36 n-heksan/benzen (F2), chloroform (F3), 95/5 chloroform/eter dietylowy (F4), 93/7 chloroform/etanol (F5), pirydyna (F6). Ostatnią frakcją nazwano pozostałość zaadsorbowaną na wypełnieniu kolumny, ekstrahowaną pirydyną z wykorzystaniem aparatu Soxhleta [44]. Opracowana w 2008 roku technika zakłada precypitację asfaltenów z zastosowaniem kolumny chromatograficznej. Próbkę, pozostałości po destylacji atmosferycznej rozpuszczoną w mieszaninie 1:1 dichlorometan:toluen, dozuje się do stalowej kolumny wypełnionej politetrafluoroetylenem (ang. Politetrafluoroetylene, PTFE). Rozdzielanie składników próbki następuje dzięki elucji skokowej z zastosowaniem 4 lub 3 mieszanin. W pierwszym przypadku (procedura 4 stopniowa) uzyskanymi frakcjami są malteny (elucja n-heptanem) oraz cztery frakcje asfaltenów eluowane kolejno: cykloheksanem, toluenem i chlorkiem metylenu (każdy z eluentów przepływał przez kolumnę 15minut). Do rozdzielenia z zastosowaniem trzech mieszanin wykorzystano elucję n-heptanem, następnie w minucie: 2-giej cykloheksan, 15-tej mieszaninę toluen:metanol (98:2), a w 40-tej ponownie n-heptan. Na skutek takiej sekwencji elucji otrzymano 3 frakcje: malteny, oraz asfalteny rozpuszczalne i nierozpuszczalne w cykloheksanie. Jako detektor do badań wykorzystano: detektor UV-vis i odparowalnościowy detektor laserowy rozpraszania światła (ang. Evaporative Light Scattering Detector, ELSD) [23, 60].

12 12 4. Oznaczanie zawartości asfaltenów 4. Determination of asphaltenes contents Dzięki zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (ang. High Performance Liqid Chromatography, HPLC) w układzie faz normalnych (ang. Normal Phase, NP) możliwe jest określenie składu grupowego produktów naftowych z podziałem na: węglowodory nasycone i aromatyczne, żywice oraz asfalteny (ang. Saturates, Aromatics, Resins, Asphaltenes, SARA). Możliwe jest również dalsze podzielenie występujących w próbce związków aromatycznych i niearomatycznych z uwzględnieniem jedno -, dwu-, tróji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych [61]. W przypadku materiałów zawierających asfalteny bezpośrednia analiza chromatograficzna pozwala na określenie składu w zakresie SAR (ang. Saturates, Aromatics, Resins) [62, 63]. Technika HPLC posiada bowiem istotne ograniczenie - nie może być zastosowana w przypadku produktów zawierających asfalteny. Składniki frakcji asfaltenowej ze względu na swoją wysoką polarność trwale adsorbują się na powierzchni sorpcyjnej fazy stacjonarnej w postaci żelu krzemionkowego, a także innych faz do NP, tj. żel krzemionkowy modyfikowany grupami amino propylowymi (NH 2 ), której późniejsza regeneracja jest bardzo trudna, a często wręcz niemoż liwa. Powszechnie stosowanym detektorem w tej metodyce jest różnicowy detektor refraktometryczny (ang. Refractive Index Detector, RID). Dodatkowo w układzie szeregowym można zastosować detektor spektrofotometryczny w zakresie ultrafioletu i światła widzialnego UV-VIS (ang. Ultraviolet, Visible, UV-VIS) z matrycą fotodiodową (ang. Diode Array Detector, DAD). Umożliwia on identyfikację poszczególnych indywiduów na podstawie widma UV-VIS, a także zwiększenie czułości detekcji w przypadku niskiej zawartości niektórych frakcji. W tym przypadku przed analizą próbki techniką HPLC wykonuje się klasyczne wydzielenie asfaltenów poprzez precypitację z n-heptanu i dokonuje ich oznaczenia metodą grawimetryczną. Alternatywą dla tej metody jest technika cienkowarstwowej chromatografii cieczowej sprzężonej z detektorem płomieniowo jonizacyjnego (ang. Thin Layer Chromatography- Flame Ionization Detector, TLC-FID). Rozdzielanie ma miejsce na cienkiej warstwie żelu krzemionkowego osadzonego na pręcikach kwarcowych umieszczonych po 6-10 stuk w specjalnej ramce. Po naniesieniu próbki mikrostrzykawką ma miejsce elucja skokowa z zastosowaniem kolejno kilku mieszanin eluentów. Standardowo stosowanymi eluentami są n-heksan, toluen i mieszanina DCM:metanol (95:5 v/v) [64-66]. Po rozwinięciu w danym eluencie, do określonej wysokości czoła eluentu, suszy się pręciki i umieszcza w kolejnej komorze z innym eluentem. Po zakończeniu całej sekwencji wysuszone pręciki umieszczane są w przystawce do detektora FID. Ruchoma głowica przesuwa się wzdłuż wybranego pręcika, a spalane w utleniającym płomieniu grupy związków chemicznych są wykrywane w układzie elektrod detektora jako karbojony. Sygnał detektora FID jest praktycznie proporcjonalny do zawartości poszczególnych grup węglowodorów. Udział każdej z frakcji jest wyznaczany na podstawie oczekiwanego zakresu elucji dla danej grupy metodą prostej normalizacji na podstawie pola powierzchni piku danej grupy w stosunku do sumy pól powierzchni. Zwiększenie dokładności oznaczeń jest możliwe poprzez zastosowanie współczynników korekcyjnych wyznaczonych na podstawie substancji wzorcowych dla poszczególnych grup (SARA). Technika TLC-FID jest najczęściej stosowana do określenia składu grupowego asfaltów i ciężkich destylatów naftowych [67]. W stosunku do innych metod (frakcjonowanie kolumnowe SARA wg normy ASTM D4124) TLC -FID zużywa zdecydowanie mniej rozpuszczalników organicznych i wymaga mniejszego nakładu czasu i pracy. Możliwe jest zarówno określenie składu grupowego wg SARA jak i zbadanie stopnia oczyszczenia już wyizolowanej frakcji asfaltenowej. Jednocześnie, analiza tych drugich powodować może wiele problemów przez wzgląd na obecność dużej ilości związków polarnych, które zatrzymywane są w miejscu nakładania próbki. Dodatkowo, frakcje polarne przez wzgląd na zmienną ilość heteroatomów, a tym samym zmienny współczynnik odpowiedzi detektora FID, komplikują analizę ilościową. W 2008 roku podjęto próbę opracowania metodyki przydatnej dla rozdzielania wysokopolarnych frakcji w oparciu o porównanie wielkości nakładanych kropli oraz charakterystykę wykorzystywanych pręcików (żel krzemionkowy, żel krzemionkowy domieszkowany miedzią (II)) i 3 stopniowy program elucji: heksan (90% długości pręcików), heksan:toluen (1:1 v/v, 60%) i DCM:metanol (93:7 v/v, 30%). Stwierdzono, że nanosząc 1 µl roztworu (15 mg/ml DCM) w postaci dużej kropli (3,5-4 mm) można uzyskać lepszą rozdzielczość pomiędzy asfaltenami i żywicami niż dla 1-1,5 mm promienia kropli [68]. Autorzy niniejszej pracy, korzystając z doświadczeń prof. M. Kamińskiego, z którego zespołu się wywodzą mają na to zjawisko inny pogląd. Problem rozdzielania mieszanin zawierających asfalteny techniką TLC-FID polega na zjawisku częściowego ograniczenia dostępu niepolarnego rozpuszczalnika jakim jest n-heptan do kropli naniesionej mieszaniny z powodu występowania frakcji asfaltenowej, która nie podlega rozpuszczaniu ani elucji tym rozpuszczalnikiem. Obserwowane zjawisko opisane w pracy [68] jest więc związane ze zwiększeniem dostępu na skutek zwiększenia powierzchni kropli. Jest to podejście w zasadniczym stopniu niezgodne ze sztuką chromatograficzną. Rozwiązaniem problemu opracowanym na Politechnice Gdańskiej w zespole prof. Kamińskiego jest zastosowanie sekwencji elucji, w której eluent rozpuszczający asfalteny (mieszanina DCM:metanol 95:5 v/v) jest stosowany jako pierwszy. Elucja ma miejsce na wysokość 2,5 cm. Następnie stosowany jest n-heksan i mieszanina heksan:toluen (90:10 v/v) pozwalająca na rozdzielenie SAR. Frakcja asfaltenowa pozostaje do końca sekwencji na wysokości 2,5 cm.

13 13 5. Wnioski końcowe 5. Conclusions Wydzielenie asfaltenów z surowca nastąpić może po kilku do nawet kilkunastu godzinach kontaktu z czynnikiem precypitującym. Najczęściej gdy precypitacja odbywa się na zimno, to znaczy w temperaturze pokojowej, czas kontaktu surowca z rozpuszczalnikiem wynosi od 12 do 72 godzin, natomiast gdy odbywa się w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika od 0,5 do 3 godzin. Poza temperaturą, w której dochodzi do ustalenia się równowagi pomiędzy składnikami ważna, ze względu na rozpuszczalność frakcji asfaltenowej, jest temperatura samej filtracji. Ilość wydzielonych asfaltenów maleje monotonicznie wraz ze wzrostem temperatury, a efekt ten ma głównie znaczenie w temperaturach poniżej 160 C. Ze zmianą temperatury zmienia się także wygląd asfaltenów. Kolejnym parametrem determinującym właściwości fizykochemiczne wydzielonej frakcji jest proporcja surowca i dodawanego czynnika precypitującego. Wydajność precypitacji rośnie wraz ze wzrostem proporcji surowiec-rozpuszczalnik do ok. 1:20 (% wagowego), aż osiągnie pleteu przy stosunku ok. 1:40. Wykorzystanie do precypitacji mniejszej ilości czynnika precypitującego bądź użycie czynnika lotnego może spowodować współstrącenie frakcji żywicznej, dlatego bardzo ważna jest procedura przemywania/oczyszczania powstałego osadu. W tym celu wykorzystuje się między innymi reprecypitację, ekstrakcję ciecz-ciało stałe i wielokrotne przemywanie osadu świeżymi porcjami precypitanta. Dodatkowo dla zapewnienia lepszej wymiany masy pomiędzy składnikami można wspomóc proces precypitacji działaniem promieniowania ultradźwiękowego lub zastosować rozpuszczalnik pierwotny próbki. Stosując odpowiednią procedurę możliwe jest więc otrzymanie asfaltenów o z góry zaplanowanych właściwościach fizykochemicznych. Ponadto w razie potrzeby lub dla wyizolowania węższej frakcji możliwe jest zastosowanie frakcjonowania, a kontrola czystości frakcji odbywać się może z zastosowaniem jednej z opisanych metodyk analizy ilościowej Podziękowania Acknowledgements Praca finansowana w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (Program LIDER, edycja V, nr projektu: LIDER/036/573/L -5/13/NCBR/2014) pt. Badania nad otrzymywaniem i właściwościami sorbentów wytwarzanych z asfaltów. 6. Literatura References [1] J. G. Speight, "Chemical composition," in The chemistry and technology of petroleum, 3rd edition, Nowy Jork, Marcel Dekker, 1999, pp [2] K. H. Altgelt and M. M. Boduszynski, "Structural group characterization of heavy petroleum fractions," in Composition and analysis of heavy petroleum fractions, Nowy Jork, Marcel Dekker, 1994, pp [3] O. C. Mullins, "The modified Yen model," Energy & Fuels, vol. 24, pp , [4] J. G. Speight, "Petroleum asphaltenes part 1: Asphaltenes, resins and the structure of petroleum," Oil Gas Science Technology, vol. 59, pp , [5] J. G. Speight, "The chemical and physical structure of petroleum: effects on recovery operations," Journal of Petroleum Science and Engineering, vol. 22, pp. 3-15, [6] M. L. Greenfield and D. D. Li, "Chemical compositions of improved model asphalt systems for molecular simulations," Fuel, vol. 115, pp , [7] F. S. Rostler and H. W. Sternberg, "Compounding rubber with petroleum products, correlation of chemical characteristics with compounding properties and analysis of petroleum products used as compounding ingredients in rubber," Industrial and Engineering Chemistry, vol. 41, pp , [8] F. Kumata and H. Seki, "Deactivation of hydrodesulfurization catalysts for resids: Effect of hydrodemetallization operation conditions," Studies in Surface Science and Catalysis, vol. 126, pp , [9] H. D. Dettman, J. P. Jahnke, R. K. Prud'home and J. F. Tinsley, "Waxy gels with asphaltenes 1: characterization of precipitation, gelation, yield stress, and morphology," Energy & Fuels, vol. 23, pp , [10] J. F. Rovani, M. M. Sanderson and J. F. Schabron, "Pavement performance and prediztion symposium," in Optimized asphaltene determinator and waxphaltene determinator separations for rapid characterization of asphalt binders, Laramie, 2010.

14 14 [11] ASTM D 2007 Standard test method for characteristic groups in rubber extender and processing oils and other petroleum-derived oils by the clay-gel absorption chromatographic method, [12] ASTM D 4124 Standerd test methods for separation of asphalt into four fractions, [13] ASTM D 6560 Standard test method for determination of asphaltenes (heptane insolubles) in crude petroleum and petroleum products, [14] ASTM D 893 Standard test method for insolubles in used lubricating oils, [15] J. Marcusson, "Zur unterscheidung von natur und kunst asphalt," Zeitschrift für Angewandte Chemie, vol. 29, pp , [16] J. Ancheyta, G. Centeno, J. A. Garcia, G. Morroquin, E. Tenorio, A. Torres and F. Trejo, "Extraction and characterization of asphaltenes from different crude oils and solvents," Energy & Fuels, vol. 16, pp , [17] O. G. Strieter, "Method for determining the components of asphalts and crude oils," Journal of Research of the National Bureau of Standards, vol. 26, pp , [18] G. O'Donnell, "Separating asphalt into its chemical constituents," Analytical Chemistry, vol. 23, pp , [19] L. R. Kleinschmidt, "Chromatographic method for the fractionation of asphalt into distinctive groups of components," Journal of Research of the National Bureau of Standards, vol. 54, pp , [20] E. Buenrestro-Gonzalez, H. Groenzin, C. Lira-Galeana and O. C. Mullins, "The overriding chemical principles that define asphaltenes," Energy & Fuels, vol. 15, pp , [21] E. Hong and P. Watkinson, "A study of asphaltene solubility and precipitation," Fuel, vol. 83, pp , [22] S. I. Andersen, A. Keul and E. Stenby, "Variation in composition of subfractions of petroleum asphaltenes," Petroleum Science and Technology, vol. 15, pp , [23] E. Buenrostro-Gonzalez, A. Gil-Villegas, C. Lira-Galena and J. Wu, "Asphaltene precipitation in crude oils: Theory and ex periments," American Institute of Chemical Engineers Jou rnal, vol. 50, pp , [24] M. Fossen, H. Kallevik, K. D. Knudsen and J. Sjoblom, "Asphaltenes precipitated by two -step precipitation procedure. 1. Interfacial tension and solvent properties," Energy & Fuels, vol. 21, pp , [25] B. Dabir, M. Nematy, A. R. Mehrabi, H. Rassamdana and M. Sahimi, "Asphalt flocculation and deposition III. The molecular weight distribution," Fuel, vol. 75, pp , [26] B. Dabir, M. Farhani, N. Nematy, H. Rassamdana and M. Sahimi, "As phalt flocculation and deposition I. The onset of precipitation," American Institute of Chemical Engineers Journal, vol. 42, pp , [27] S. D. Bhagot, S. Z. Erhan, C. D. Sharma and B. K. Sharma, "Maltenes and asphaltenes of petroleum vacum residues: physico-chemical characterization," Petroleum Science and Technology, vol. 25, pp , [28] G. A. Mansoori, M. Shariaty-Niassa and D. Vazquez, "Polidispersity of heavy organics in crude oils and their role in oil well fouling," Journal of Petroleum Science ang Engineering, vol. 58, pp , [29] G. A. Mansoori and D. Vazquez, "Identification and measurement of petroleum precipitates," Journal of Petroleum Science and Engineering, vol. 26, pp , [30] G. Gonzalez, E. F. Lucas and M. A. Sousa, "Asphaltenes precipitation from crude oil and hydrocarbon media," Energy & Fuels, vol. 20, pp , [31] Y. Gu, P. Luo and X. Wang, "Characterization of asphaltenes precipitated with three light alkanes under different experimental conditions," Fluid Phase Equilibria, vol. 291, pp , [32] S. Acevedo, I. Layrisse, B. Mendez, H. Rivas and A. Rojas, "Asphaltenes and resins from the Orinoco basin," Fuel, vol. 64, pp , [33] K. Akbarzadeh, H. Alboudwarej, J. Beck, W. Y. Svrcek and H. W. Yarranton, "Regular solution model for asphaltene precipitation from bitumens and solvents," American Institute of Chemical Engineers Journal, vol. 49, pp , [34] K. Akbarzadeh, H. Alboudwarej, J. Beck, W. Y. Svrcek and H. W. Yarranton, "Sensitivity of asphaltene properties to separation techniques," Energ Fuel, vol. 16, pp , [35] S. Acevedo, A. Amorin, G. Escobar, J. Pinnate and M. A. Ranaudo, "Observations about the structure and dispersion of petroleum asphaltenes aggregates obtained from dialysis fractionation and characterization," Energy & Fuels, vol. 11, pp , [36] R. B. Fisher, J. E. Hunt, J. T. Miller, P. Thiyagarajan and R. E. Winans, "Subfractionation and characterization of Mayan asphaltene," Energy & Fuels, vol. 12, pp , [37] R. Alvarez, J. N. Bolanos, J. Douda and M. E. Llanos, "Structure of maya asphaltene-resin complexes through the analysis of soxhlet extracted fractions," Energy & Fuels, vol. 18, pp , [38] L. A. Alcazar-Vara, E. Buenrostro-Gonzalez and J. A. Garcia-Martinez, "Effect of asphaltenes on equilibrium and rheological properties of waxy model systems," Fuel, vol. 93, pp , 2012.

15 15 [39] M. Barcenas, E. Buenrostro-Gonzalez, Y. Duda, P. Orea and L. S. Zamudio-Rivera, "Study of medium effect on asphaltene agglomeration inhibitor efficiency," Energy & Fuels, vol. 22, pp , [40] P. Fotland, E. Gilje, H. Hoiland and O. Bjoroy, "Asphaltene precipitation from athabasca bitumen using an aromatic diluent: A composition to standard n-alkane liquid precipitants at different temperatures," Energy & Fuels, vol. 26, pp , [41] R. L. Hubbard and K. E. Stanfield, "Determination of asphaltebes, oils, and resins in asphalt," Analytical Chemistry, vol. 20, pp , [42] D. L. Mitchell and J. G. Speight, "The solubility of asphaltenes in hydrocarbon solvents," Fuel, vol. 52, pp , [43] R. Altoe, L. C. M. Cirilo, G. Gonzalez, H. E. Lopes, E. F. Lucas, M. C. K. de Oliveira and C. Teixeira, "Solution behavior of asphaltic residues and deasphalted oil prepared by extraction of heavy oil," Colloid Surface A, vol. 445, pp , [44] J. Bermejo, M. Granda, R. Menendez and J. M. D. Tascon, "Comparative analysis of pitches by extrography and thermal analysis techniques," Carbon, vol. 32, pp , [45] J. Czarnecki, T. Dabros, J. Sjoblom, P. Tchoukov, Z. Xu and F. Yang, "Role of asphaltenes in stabilizing thin liquid emulsion films," Langmuir, vol. 30, pp , [46] C. W. Anglea, H. Hamza, Y. Long and L. Lue, "Precipitation of asphaltenes f rom solvent-diluted heavy oil and thermodynamic properties of solvent-diluted heavy oil solutions," Fuel, vol. 85, pp , [47] J. Ancheyta, G. Centeno and F. Trejo, "Precipitation, fractionation and characterization of asphaltenes from heavy and light crude oils," Fuel, vol. 83, pp , [48] S. Fogler, V. Nalwaya, P. Piumsomboon and V. Tantayakom, "Studies on asphaltenes through analysis of polar fractions," Industrial & Engineering Chemistry Research, vol. 38, pp , [49] G. Que, H. Shan, C. Yang and L. Zhang, "Dipole moment variation af a petroleum residue during catalytic and thermal upgrading," Energy & Fuels, vol. 23, pp , [50] S. I. Andersen, E. Buenrostro-Gonzalez, J. A. Garcia-Martinez and C. Lira-Galeana, "Solubility/molecular structure relationship of asphaltenes in polar and nonpolar media," Energy & Fuels, vol. 16, pp , [51] D. M. Barrera, D. P. Ortiz and H. W. Yarranton, "Molecular weight and density distributions of asphaltenes from crude oils," Energy & Fuels, vol. 27, pp , [52] K. L. Gawrys, P. K. Kilpatrick and P. Matthew Spiecker, "Aggregation and solubility behavior of asphaltenes and their subfractions," Journal of Colloid and Interface Science, vol. 267, pp , [53] A. Furuta, M. Imamura, S. Suhara and M. Tojima, "Effect of heavy asphaltene on stability of residual oil," Catalysis Today, vol. 43, pp , [54] L. Li, Y. Li, J. Wang, C. Yang, G. Yang and L. Zhang, "Study on the polarity, solubility, and stacking characteristics of asphaltenes," Fuel, vol. 128, pp , [55] A. Boukir, P. Doumenq, M. Guiliano and G. Mille, "Supercritical fluid extraction of bal 150 crude oil asphaltenes," Energy & Fuels, vol. 14, pp , [56] J. Bermejo, M. Granda, R. Menendez and S. R. Moinelo, "Application of extrography for characterization of coal tar and petroleum pitches," Fuel, vol. 69, pp , [57] R. H. Filby and F. S. Jacobs, "Liquid chromatographic fractionation of oil-sand and crude oil asphaltenes," Fuel, vol. 62, pp , [58] T. Miao, E. Rogel, M. Roye and J. Vien, "Comparing asphaltenes: Deposit versus crude oil," Fuel, vol. 147, pp , [59] G. P. Blumer, H. W. Kleffner, W. Lucke and M. Zander, "Fractionation of coal-tar pitch by extrography," Fuel, vol. 59, pp , [60] J. F. Rovani Jr, M. M. Sanderson and J. F. Schabron, "Asphaltene determination method for automated on-column precipitation and redissolution of pericondensed aromatic asphaltene components," Energy & Fuels, vol. 24, pp , [61] E. Gilgenast, M. Kaminski and R. Kartanowicz, "Group -type analysis of middle distillates by test metod IP-391/ EN-12916/ ASTM D 6379 in terms of resolution and selectivity of chromatographic columns," Chemia Analityczna, vol. 52, pp , [62] N. Aske, H. Kallevik and J. Sjoblom, "Determination of saturate, aromatic, resin, and, asphaltenic (SARA) components in crude oils by means of infrared and near-infrared spectroscopy," Energy & Fuels, vol. 15, pp , [63] E. Buenrostro-Gonzalez, C. A. Islas -Flores and C. Lira-Galeana, "Comparisons between open column chromat ography and HPLC SARA fractionations in petroleum," Energy & Fuels, vol. 19, pp , [64] T. Górecki, J. Gudebska, M. Kamiński and R. Kartanowicz, "Optimized conditions for hydrocarbon group type analysis of base oils by thin-layer chrimatography-flame ionization detection," Journal of Chromatography A, vol. 991, pp , [65] A. F. Nikolaides, Bituminous miztures and pavemants VI, Londyn: Taylor & Francis, 2015.

16 16 [66] M. K. Sharma and T. F. Yen, Asphaltene particles in fossil fuel exploration, recovery, refining, and production processes, Nowy Jork: Plenum Press, [67] PN-EN 12916, Przetwory naftowe- Oznaczanie grup węglowodorów aromatycznych w średnich destylatach- Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem współczynnika załamania światła, [68] C. Jiang, S. R. Larter, K. J. Noke and L. R. Snowdon, "TLC-FID (latroscan) analysis of heavy oil tar sand samples," Organic Geochemistry, vol. 39, pp , 2008.

17 CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp Dorota CHRUSZCZYK, Grzegorz BOCZKAJ* Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej *Autor do korespondencji, grzegorz.boczkaj@gmail.com Zastosowanie technik chromatograficznych do badań charakterystyki fizykochemicznej czystych substancji i mieszanin Streszczenie: W pracy przedstawiono metody wyznaczania charakterystyki fizykochemicznej substancji czystych i ich mieszanin z zastosowaniem technik chromatograficznych. Opisano metodę destylacji symulowanej oraz techniki odwróconej chromatografii cieczowej i gazowej. Przedstawiono metody wyznaczania parametrów rozpuszczalności, entalpii adsorpcji, współczynnika podziału, porowatości, właściwości kwasowo-zasadowych. Słowa kluczowe: destylacja symulowana, chromatografia odwrócona, charakterystyka fizykochemiczna Study of physicochemical characteristic of pure substances and mixtures by means of chromatographic techniques Abstract: The paper presents methods of determination of the physicochemical properties of pure substances and their mixtures by the use of chromatographic techniques. Simulated distillation, reversed gas and liquid chromatography have been described. Basic equation and relationship allowing to calculate solubility parameters, adsorption enthalpy and isotherm, partition coefficient, porosity and acid/based characteristic are also given. Key words: simulated distillation, inverse chromatography, physicochemical characterization 1. Wstęp 1. Introduction Właściwości fizykochemiczne czystych substancji i ich mieszanin wyznaczać można z zastosowaniem wielu technik w zależności od badanego materiału i parametru. Nie rzadko kompleksowe badania wiążą się z koniecznością zastosowania dużej liczby różnej aparatury badawczej, co znacznie wydłuża czas przeprowadzanych badań i zwiększa koszty. Alternatywą dla metod klasycznych jest zastosowanie w tym celu technik chromatograficznych. Pozwalają one na szybkie i stosunkowo proste (oparte na podstawowych parametrach retencji i równaniach matematycznych) wyznaczenie podstawowych właściwości fizykochemicznych podczas jednej analizy. Do najczęściej spotykanych technik chromatograficznych pozwalających na określenie charakterystyki badanej substancji należą chromatografia gazowa i cieczowa. Do najlepiej opanowanych metodyk opierających się na chromatografii gazowej najeżą destylacja symulowana (ang. Simulated Distillation, SIMDIS) i odwrócona chromatografia gazowa (ang. Inverse Gas Chromatography, IGC). Pierwsza pozwala na zbadanie rozkładu temperatury destylacji mieszaniny w czasie ok. 1 godziny wykorzystując do tego mniej niż 1mL substancji badanej. Zaletą IC jest natomiast możliwość jej zastosowania do badania powierzchni ciał stałych w postaci filmów, włókien, proszków, a także struktur krystalicznych i amorficznych. Zasada metody polega na uzyskiwaniu informacji na temat substancji stanowiącej fazę stacjonarną na podstawie analizy związków testowych o znanych właściwościach. Aktualnie technikę IC podz ielić można na trzy grupy, z których jako pierwsza, we wczesnych latach 60, pojawiła się, za sprawą profesora Kiselev a, odwrócona chromatografia gazowa [1], następnie zaczęto stosować odwróconą chromatografię cieczową, w której największą wartość aplikacyjną posiada odwrócona chromatografia wykluczania. W praktyce odwróconą chromatografię wykonywać można w dwóch wariantach, z których najczęściej stosowany opiera się na wykorzystaniu takiej wartości stężenia próbki, aby mogło być one przybliżone nieskończonym rozcieńczeniem- stężenie substancji rozpuszczonej jest mniejsze od 0,01P/P0. Cząsteczki nie oddziałują między sobą, a parametry retencji można powiązać z prawem Henry ego. Gdy przedmiotem badania stają się izotermy adsorpcji oraz współczynniki dyfuzji i porowatość konieczne jest zastosowanie bardziej skomplikowanego badania przy tzw. stężeniu skończonym [2]. W pracy opisano podstawy metod wyznaczania parametrów fizykochemicznych z zastosowaniem technik chromatograficznych z uwzględnieniem najczęściej stosowanych zależności matematycznych.

18 18 2. Destylacja symulowana 2. Simulated Distillation Destylacja symulowana (ang. Simulated Distillation, SIMDIS), której początki sięgają roku 1960 [3, 4] polega na wyznaczaniu rozkładu temperatury destylacji mieszaniny na podstawie zarejestrowanego chromatogramu. Technika ta opisana w normach serii PN-EN-ISO, PN-EN oraz ASTM jest najczęściej stosowana w kontekście wyznaczania temperatury destylacji produktów naftowych. Rozdzielanie wykonuje się techniką chromatografii gazowej, jako detektor stosując najczęściej detektor płomieniowo jonizacyjny (ang. Flame Ionization Detector, FID) rzadziej detektor cieplno przewodnościowy (ang. Thermal Conductivity Detector, TCD). Zastosowanie niepolarnej fazy stacjonarnej skutkują elucją składników mieszaniny, zgodnie z ich temperaturą wrzenia. Wyniki korelowane są następnie z temperaturą wrzenia na podstawie przeprowadzonej kalibracji czasu retencji od temperatury wrzenia substancji wzorcowych - n-alkanów. Wartość temperatury wrzenia badanej próbki oblicza się z zależności [5] (1): (1) R i - czas retencji uzyskania kolejnego procent odzysku [min] R 1 - czas retencji wzorca eluowanego bezpośrednio przed R i [min] R 2 - czas retencji wzorca eluowanego bezpośrednio po R i [min] B 1 - temperatura wrzenia substancji o czasie retencji R 1 [ C] B 2 - temperatura wrzenia substancji o czasie retencji R 2 [ C] Destylacja symulowana pozwala ponadto na uzyskanie dodatkowych informacji (poza temperaturą wrzenia) na temat badanych próbek poprzez zastosowanie podczas analizy detektorów selektywnych takich jak detektor chemiluminescencji siarki (ang. Sulfur Chemiluminescence Detector, SCD) [6], pulsacyjny detektor płomieniowo-fotometryczny (ang. Pulsed Flame Photometric Detector, PFPD), detektor emisji atomowej (ang. Atomic Emission Detector, AED), detektor chemiluminescencji azotu (ang. Chemiluminescence Nitrogen Detector, CND), detektor emisji atomowej ze wzbudzeniem od plazmy mikrofalowej (ang. Microwave Plasma Emission Detector, MED) [7] oraz spektrometr mas (ang. Mass Spectrometer, MS) [8]. Zastosowanie detektorów selektywnych pozwoliło między innymi na ocenę stopnia konwersji polietylenu podczas pirolizy prowadzącej do otrzymania olejów smarowych i wosków [9]. Na podstawie informacji zebranych w wyniku badania metodą destylacji symulowanej można ponadto określić zakres masy cząsteczkowej frakcji ropy naftowej zawierającej w swoim składzie od 5 do 120 atomów węgla. Obejmuje to zakres masy cząsteczkowej pomiędzy 72 a 1700 g/mol. Ustalono, że temperatura 50% wagowych frakcji odpowiada normalnej temperaturze wrzenia czystego składnika, co w oparciu o znaną gęstość umożliwia dokonanie odpowiednich obliczeń i uzyskanie wyniku różniącego się o ok. 2% od wartości rzeczywistej [10]. Jedną z nowatorskich metod określaną jako EC-GC (ang. Empty Column Gas Chromatography) jest zastosowanie pustej kolumny o dezaktywowanej powierzchni (ang. Fused Silica Tubing, FST) do badania rozkładu temperatury destylacji produktów naftowych [11]. Różnice pomiędzy wartościami wyznaczonych temperatur dla trzech frakcji wahają się w granicach 0,37-2 C w przypadku początku temperatury destylacji, oraz 0,9-2 C dla końca temperatury destylacji w stosunku do klasycznej metody SIMDIS. Opracowana metoda pozwala obniżyć temperaturę, elucji składników produktów naftowych przez ograniczenie oddziaływań między substancjami analizowanymi a fazą stacjonarną. Jej wadą jest jednak możliwość zastosowania dla związków wrzących powyżej temperatury 128 C w przypadku początkowej temperatury pieca chromatograficznego wynoszącej 40 C. Dalsze badania wykazały większą zgodność wyznaczanej temperatury wrzenia w warunkach EC-GC dla czystych substancji chemicznych [12]. Koncept fazy stacjonarnej o dezaktywowanej powierzchni został zastosowany do metodyki SIMDIS z kolumnami pakowanymi, w których fazę stacjonarną stanowi silanizowany żel krzemionkowy [13]. Opracowano również metodykę SEC-RID umożliwiającą badanie rozkładu temperatury destylacji wysokowrzących frakcji naftowych w warunkach chromatografii wykluczania [14]. Bardziej szczegółowy przegląd prac dotyczących metodyki SIMDIS przedstawiono w [15]. 3. Odwrócona chromatografia gazowa 3. Inverse gas chromatography Odwrócona chromatografia gazowa (ang. Inverse Gas Chromatography, IGC), jest obok destylacji symulowanej drugą najczęściej stosowaną techniką wyznaczania właściwości fizykochemicznych badanych substancji z zastosowaniem technik chromatograficznych. Ta technika zakłada wyznaczenie parametrów fizykochemicznych substancji stanowiących fazę stacjonarną najczęściej naniesioną na inertny nośnik przy

19 19 wykorzystaniu parametrów chromatograficznych i wyników uzyskanych podczas analizy grup związków testowych. Odwrócona chromatografia gazowa pozwala w przypadku porowatych substancji stałych na wyznaczenie izotermy adsorpcji, energii powierzchniowej, ciepła adsorpcji, heterogeniczności złoża i współczynnika dyfuzji oraz przepuszczalności [16], najczęściej w warunkach nieskończonego rozcieńczenia. Izotermę adsorpcji wyznaczyć można na podstawie wielkości powierzchni i wysokości piku chromatograficznego oraz całkowitej powierzchni adsorpcyjnej [17]. Heterogeniczność oblicza się natomiast w oparciu o pierwszą pochodną zależności zaadsorbowanej substancji i potencjału adsorpcji. IGC um ożliwia ponadto określenie wypływu i wkładu oddziaływań dyspersyjnych i kwasowo zasadowych (wg Levisa) na napięcie powierzchniowe poprzez analizę energii adsorpcji grup związków o różnych właściwościach [18]. W tym celu najczęściej stosuje się równanie Dorris i Gray a do określania wkładu dyspersyjnych sił Londona na wartość napięcia powierzchniowego [19] [20]. Badania z zastosowaniem tej metody pozwoliły na określenie właściwości powierzchniowych serii smektytów o różnym składzie chemicznym. Scharakteryzowano oddziaływania pomiędzy powierzchnią materiału, a alkenami, oraz stwierdzono, że wysokie wartości określanego parametru oddziaływań są spowodowane istnieniem silnych centrów kwasowych związanych z między-warstwowymi kationami i strukturą chemiczną związku [21]. Technika IGC jest najczęściej stosowana do wyznaczania parametru Flory -Huggins a (2) charakteryzującego oddziaływania pomiędzy substancją rozpuszczoną, a fazą stacjonarną i parametru rozpuszczalności Hildebranda. (2) 1- indeks odpowiadający substancji rozpuszczonej (wzorcowi) [-] 2- indeks odpowiadający badanemu materiałowi (fazie stacjonarnej) [-] M 1 - masa molowa substancji rozpuszczonej [kg/mol] - prężność pary nasyconej substancji rozpuszczonej [Pa] B 11 - drugi współczynnik wirialny substancji rozpuszczonej [-] - objętość molowa [m 3 /mol] ρ i - gęstość [kg/m 3 ] R- uniwersalna stała gazowa [J/(mol K)] T- temperatura kolumny [K] V g - objętość retencji [m 3 /kg] Występujący w równaniu drugi współczynnik wirialny wyznaczyć można z zastosowaniem odwróconej chromatografii gazowej [22], lub wykorzystując zależności matematyczne opierające się na korelacji Tsonopoulos a [23] i Pitzer a Curl a [24]. Posiadając zbiór wartości i dla rozpuszczonych substancji testowych wyznaczyć można nachylenie liniowej zależności lewej strony poniższego równania do, które jest proporcjonalne do parametru rozpuszczalności w badanym materiale (3). (3) Z zastosowaniem tej metody określono zmiany zachodzące w ciągu procesów utleniania mieszaniny oleju mineralnego i poli-α-olefiny. Zmiany wartości odzwierciedlają zmieniające się powinowactwo do różnych rodzajów mieszanin (oddziaływania międzycząsteczkowe) oraz potencjał mieszalności i rozpuszczalność [25]. Na przykład wraz ze wzrostem wartości parametru Flory-Huggins a wskazuje na spadek mieszalności substancji testowej i składników wypełnienia kolumny. Dodatkowo wprowadzając do równania parametr binarny I 1,2 zależny od masy cząsteczkowej i natury chemicznej możliwe jest określenie występujących oddziaływań, polarnych i wiązań wodorowych [26]. W 2005 roku opracowano procedurę pozwalającą na wyznaczenie szeregu parametrów fizykochemicznych na podstawie parametrów retencyjnych (nie używając bezpośrednio wartości czasu, czy indeksu retencji) z zastosowaniem kapilarnej kolumny wypełnionej ciekłą w warunkach pokojowych cieczą jonową (ang. Room Temperature Ionic Liquid, RTIL) [27]. Fazę stacjonarną stanowiły: 1-butylo-3- metyloimidazo heksafluorofosforan, chlorek 1-metylo-3-oktaimidzaolu oraz imidek di(trifluorometylosulfoniowy)-1-butylo-3-etyloimidazoliowy, a badaniu poddano 31 związków organicznych tj. alkany, alkeny, alkiny, cykloalkany, związki aromatyczne i alkohole. Podstawą obliczeń była znajomość parametrów opisujących między innymi liczbę moli składników fazy stacjonarnej w kolumnie, prędkość przepływu gazu nośnego, temperaturę kolumny, prężność par, oddziaływania pomiędzy substancją badaną a fazą stacjonarną, objętość molową i lotność. Ich wartości pozwoliły na wyprowadzenie równań, dzięki którym możliwe stało się wyznaczenie współczynnika aktywności przy nieskończonym rozcieńczeniu, parametru rozpuszczalności Hildebranda oraz Hansena, cząstkową molową entalpię i rozpuszczalność dwutlenku węgla w wybranej RTIL.

20 20 IGC wykorzystać można również do wyznaczenia udziału wagowego współczynnika aktywnoś ci rozpuszczalnika w nieskończonym rozcieńczeniu Ω 2 (4), wartości energii swobodnej Gibbsa (5) oraz cząstkowego molowego ciepła mieszania (6) [28]. Fazę stacjonarną stanowił izotaktyczny, krystaliczny Poli(1-buten) o niskiej masie cząsteczkowej, immobilizowany poprzez sporządzenie roztworu w cykloheksanie (stężenie 10%) i odparowaniu próżniowemu rozpuszczalnika, na Chromosorbie. Na podstawie wartości objętości retencji możliwe stało się obliczenie wyżej wymienionych parametrów termodynamicznych według zależności: (4) (5) R- stała gazowa [kj/ (mol K)] V g - objętość retencji [cm 3 /mol] P 2 -ciśnienie par rozpuszczalnika w temperaturze T [bar] M 2 - masa molowa rozpuszczalnika [g/mol] B 22 - współczynnik wirialny rozpuszczalnika [-] V 2 - objętość molowa rozpuszczalnika [cm 3 /mol] T- temperatura dokonywania pomiarów [K] Zaprojektowanie wąsko-kanałowej prostokątnej kolumny i wykorzystanie zmodyfikowanej techniki IGC (ang. Rectangular Thin-Channel Column Inverse Gas Chromatography, RTCCIGC) pozwoliło na określenie współczynnika podziału (K) i dyfuzji (D p ) niskocząsteczkowego rozpuszczalnika w membranie polimerowej. Badania przeprowadzono dla etanolu i membran z dioctanu celulozy (ang. Cellulose DiAcetate, CDA) oraz sulfonowanego poli(etero etero) ketonu (ang. Sulfonated Poly(Ether Ether Ketone), SPEEK). Opracowano model matematyczny do opisu profilu prędkości przepływu gazu nośnego i stężenia rozpuszczalnika w kolumnie niezbędny do predykcji współczynnika dyfuzji. Równanie charakteryzujące ten parametr opiera się na zależnościach między innymi pomiędzy współczynnikiem podziału, wartościami opisującymi wymiary kolumny i uśrednioną prędkością gazu nośnego w kolumnie [29]. (6) (7) (8) -bezwymiarowa wartość czasu retencji [-] - bezwymiarowa wariancja piku (wartość eksperymentalna) [-] - bezwymiarowa wariancja piku związana z czynnikami zewnętrznymi (dodatkowa długość przewodu łączącego, objętości martwe) - grubość membrany [cm] - obszar średniej prędkości gazu nośnego wewnątrz kolumny [cm/s] - połowa wysokości kanału [cm] - długość kanału [cm] Widegren i Bruno wykazali, że za pomocą odwróconej chromatografii gazowej można z powodzeniem przewidzieć entalpię adsorpcji węglowodorów [30]. Swoje badania przeprowadzali z użyciem detektora TCD oraz pakowanej kolumny miedzianej, którą wypełniono około 25g frakcji µm cementu portlandzkiego. W zakresie temperatur C badany był przepływ gazu nośnego, temperatura przepływomierza, ciśnienie pary wodnej oraz czas retencji. Dzięki trzem pierwszym wartościom możliwe było wyliczenie skorygowanego natężenia przepływu gazu nośnego (9) pozwalającego na obliczenie objętości retencji węglowodorów, a w rezultacie entalpii adsorpcji ΔH a według zależności (10): (9) (10) F c - skorygowany przepływ gazu nośnego [ml/min] j- współczynnik ściśliwości Martin a- James a [-] t R - zredukowany czas retencji (t R -t 0 ) [min]

21 21 w s - masa adsorbentu [g] R- stała gazowa [kj/(mol K)] T- temperatura kolumny [K] C- stała charakteryzująca entropię [ml/g] Z przeprowadzonych badań wynika, że wartość energii sorpcji wzrasta ze wzrostem liczby atomów węgla w cząsteczce oraz nieznacznie maleje w stosunku do węglowodorów rozgałęzionych oraz cyklicznych względem ich liniowych odpowiedników o takiej samej liczbie atomów w cząsteczce. Tą samą metodą badano również entalpię adsorpcji organicznych tioli i sulfidów, charakteryzujących się nieprzyjemnym zapachem, wykorzystywanych jako dodatek do mieszanek gazowych w celu łatwiejszej identyfikacji wycieków [31]. W tym celu zastosowano kolumny typu WCOT z fazą stacjonarną w postaci syntetycznej gliny Laponite-RD o wzorze sumarycznym Na + 0,7[(Si 8 Mg 5,5 Li 0,3 )O 20 (OH) 4 ] -0,7 czystej oraz zimmobilizowaną warstwą oktadekanu nazywaną dalej organo-glinową. Pomiarów objętości retencji dokonywano w 4 do 7 temperaturach w zakresach C dla kolumny organo-glinowej i C dla kolumny glinowej. Wyniki badań wskazują na większą wartość entalpii adsorpcji sulfidów w porównaniu z tiolami dla obu rodzajów wypełnień. Oznacza to, iż te drugie w mniejszym stopniu zdolne są adsorbować się na powierzchni gleby. Zasugerowano, że może mieć to związek z zawartością wilgoci w próbkach gliny. IGC stosowana może być również do badania oddziaływań pomiędzy stosowanym wypełnieniem kolumny, a substancjami rozdzielanymi co pozwana na określenie aplikacyjności nowo wprowadzanych faz do zastosowań przy rozdzielaniu charakterystycznych grup substancji chemicznych. W tym celu zbadano różne rodzaje asfaltów i frakcji asfaltenowych [32] [33]. Immobilizowano 10% wagowych fazy stacjonarnej na nośniku, którego rolę pełnił Fluoropak 80, a następnie zbadano charakterystykę retencyjną grupy związków wzorcowych w tym alkoholi, kwasów, amin, estrów, olefin, związków aromatycznych, cyklicznych i zawierających siarkę. Dla każdej z substancji obliczono współczynnik oddziaływań (ang. Interraction Coefficient, I P ) jako 100-krotność różnicy pomiędzy logarytmem objętości retencji (V R ) badanego związku, a objętością retencji wzorcowego n-alkanu o takiej samej masie cząsteczkowej (wartość wyznaczona na podstawie wykresu zależności logarytmu V R od masy molekularnej n-parafin). W związku z tym, że n-alkany słabo oddziałują z polarną fazą stacjonarną (oddziaływania dyspersyjne), można przyjąć, że współczynnik oddziaływań jest jedynie miarą powinowactwa funkcyjnych grup substancji wzorcowych do osadzonych asfaltów/ asfaltenów. Dzięki temu możliwe stało się podjęcie prób skorelowania wartości I P ze składem grupowym badanego asfaltu. Wykazano, że im wyższy jest skorygowany w oparciu o l iczbę kwasową i zawartość związków azotu w próbce współczynnik oddziaływań formamidu tym większa procentowa zawartość sumy asfaltenów i żywic asfaltenowych. Za pomocą techniki IGLC możliwe jest również analizowanie asfaltów w kontekście ich trwałości podczas utleniania bezpośrednio w kolumnie [34]. Zaletą tej metody jest łatwe i precyzyjne sterowanie szybkością narostu temperatury i przepływu powietrza oraz uzyskanie powtarzalnych warunków utleniania. Zastosowanie odwróconej chromatografii gazowej eliminuj e ponadto dodatkowy etap występujący gdy utlenienie przeprowadza się na zewnątrz kolumny a tym samym możliwość zanieczyszczenia próbki. 4. Odwrócona chromatografia cieczowa 4. Inversed Liquid chromatography Obok najczęściej stosowanej odwróconej chromatografii gazowej wyróżnić można odwróconą chromatografię wykluczania (ang. Inversed Size Exclusion Chromatography, ISEC) dzięki której możliwe jest uzyskanie danych na temat wewnątrz-ziarnowej ε i (11) i między-ziarnowej ε e porowatości kolumny oraz rozkładzie wielkości porów adsorbentu ø (12). W badaniach wykorzystuje się dane dotyczące retencji próbki polistyrenu o znanym wąskim rozkładzie masy cząsteczkowej [35]. (11) (12) - porowatość całkowita [-] V T - objętość elucji niezatrzymywanego trasera (objętość martwa) [ml] V e - objętość elucji substancji wykluczanej [ml] V g - objętość geometryczna kolumny [ml] Metodę tą wykorzystano do wyznaczenia porowatości oraz stosunku faz dla serii kationo -wymiennych adsorbentów powszechnie stosowanych do oczyszczania białek. W badaniach zastosowano wzorce dekstranu, polimeru glukozy rozpuszczalnego w wodzie. Stwierdzono, że procedura przygotowania adsorbentu gdzie polimery wytworzone in situ lub wszczepiane w materiał bazowy ma znaczący wpływ na wymiary porów i stosunek faz charakteryzowany jako dostępna powierzchnia adsorbentu przypadająca na jednostkę objętości fazy ruchomej [36].

22 22 W 2015 roku grupa naukowców z Polski wykorzystała zależności pozwalające na obliczenie stałych równowagi adsorpcji dla IGC i dostosowała ją na potrzeby chromatografii cieczowej. Wyznaczono izotermy i entalpię adsorpcji aniliny i 4-chloroaniliny na haloizycie metodą podziału szczytu piku [37]. 5. Wnioski końcowe 5. Conclusions Wyznaczanie parametrów fizykochemicznych badanych substancji zarówno w przypadku chromatografii standardowej jak i odwróconej jest stosunkowo szybkie, wydajne i łatwe. Rozwój metodyk jak i poszukiwanie zależności matematycznych pozwalających korelować posz czególne parametry spowodowały możliwość uzyskania dużej ilości informacji na temat próbki podczas jednej analizy. Obecnie destylacja symulowana praktycznie całkowicie wyparła technikę klasyczną i jest powszechnie stosowana zwłaszcza w kontekście analizy rozkładu temperatury destylacji produktów naftowych. Chromatografia odwrócona jest natomiast doskonałym narzędziem badań nad nowymi substancjami stosowanymi głównie w przemyśle farmaceutycznym, polimerami oraz innowacyjnymi fazami stacjonarnymi. Podziękowania Acknowledgements Praca finansowana w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (Program LIDER, edycja V, nr projektu: LIDER/036/573/L -5/13/NCBR/2014) pt. Badania nad otrzymywaniem i właściwościami sorbentów wytwarzanych z asfaltów. 6. Literatura (References) 1. K. Shcherbakova, Y. I. Yashin, V. Andrej, Kiselev's contributions to the science of adsorption, molecular interaction and chromatography, Pure and Applied Chemistry 61 (1989) D. Butler i D. R. Williams, Particulate characterization: inverse gas chromatography w Encyclopedia of Separation Science, Londyn, Elsevier Science Ltd, 2000, pp F. T. Eggertsen, S. Groennings, J. J. Holst, Analytical distillation by gas chromatography programmed temperature operation, Analytical Chemistry 32 (1960) L. E. Green, L. J. Schmauch, J. C. Worman, Simulated distillation by gas chromatography, Analytical Chemistry 36 (1964) PN-EN , Oznaczanie rozkładu temperatur wrzenia metodą chromatografii gazowej - ropa naftowa. 6. L. M. Meyer i R. L. Shearer, Simultaneous measurement of hydrocarbons and sulfur compounds using flame ionization and sulfur chemiluminescence detection for sulfur simulated distillation, Journal of High Resolution Chromatography 22 (1999) J. L. Buteyn i J. J. Kosman, Multielement simulated distillation by capillary GC-AED, Journal Chromatography Science, 28 (1990) W. P. Fitzgerald i S. G. Roussis, Gas chromatographic simulated distillation-mass spectrometry for the determination of the boiling point distributions of crude oils, Analytical Chemistry 72 (2000) E. M. Canto, M. B. De Souza, A. D. M. Lima i M. L. M. Valle, Using simulated distillation or density to maximize lubricants production from low density pole ethylene LDPE pyrolysis, Chemical Engineering Transactions 26 (2012) A. G. Goossens, Prediction of molecular weight of petroleum fractions, Industrial & Engineering Chemistry Research 35 (1996) G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, A new procedure for the determination of distillation temperature distribution of high-boiling petroleum products and fractions, Analytical and Bioanalytical Chemistry 399 (2011) G. Boczkaj, M. Kamiński, Research on the separation properties of empty-column gas chromatography (EC-GC) and conditions for simulated distillation (SIMDIS), Analytical and Bioanalytical Chemistry 405 (2013) G. Boczkaj, M. Momotko, A. Przyjazny, M. Kamiński, Studies of separation performance of silanized silica gel for simulated distillation, Journal of Separation Science, DOI: /jssc G. Boczkaj, A. Przyjazny, M. Kamiński, Size-exclusion chromatography for the determination of the boiling point distribution of high-boiling petroleum fractions, Journal of Separation Science 38 (2015) 741.

23 M. Momotko, G. Boczkaj, Use of simulated distillation for analysis of petroleum -derived products (Zastosowanie destylacji symulowanej do analizy produktów naftowych), Przemysł Chemiczny 4 (2015) F. Thielmann, Introduction into the characterization of porous materials by inverse gas chromatography, Joural of Chromatography A 1037 (2004) K. Czech, P. M. Słomkiewicz, Zastosowanie pakietów oprogramowania komputerowego do wyznaczania izoterm adsorpcji metodą inwersyjnej chromatografii gazowej, 3 (2011) M. M. Chehimi, M. L. Abel, C. Perruchot, M. Delamar, S. F. Lascelles, S. P. Armes, The determination of the surface energy of conducting polymers by inverse gas chromatography at infinite dilution, Synthetic Metals, 104 (1999) G. M. Dorris, D. G. Gray, Adsorption, spreading pressure, and London force interactions of hydrocarbons on cellulose and wood fiber surfaces, Journal of Colloid Interface Science 71 (1979) G. M. Dorris, D. G. Gray, Adsorption of n-alkanes at zero coverage on cellulose paper and wood fibers, Journal of Colloid Interface Science 77 (1980) T. J. Bandosz, J. Jagiełło, B. Andersen, J. A. Schwarz, Inverse gas chromatography study of modified smectite surface, Clays Clay Minerals 40 (1992) A. Voelkel i J. Fall, Influence of prediction method of the second virial coefficient on inverse gas chromatographic parameters, Journal of Chromatography A 721 (1995) C. Tsonopoulos, An empirical correlation of second virial coefficients, American Institute of Chemical Engineers 20 (1974) K. S. Pitzer, R. F. Curl, The volumetric and thermodynamic properties of fluids. 3. Empirical equation for the 2nd virial coefficient, Journal of the American Chemical Society 79 (1957) A. Voelkel, J. Fall, Application of inverse gas chromatography to the examination of annealing processes of semi-synthetic base oils, Journal of Chromatography A 982 (2002) A. Voelkel, J. Janas, J. A. Garcia-Dominguez, Inverse gas chromatography in characterization of surfactants. Determination of binary parameter, Journal of Chromatography A 654 (1993) F. Mutelet, V. Butet, J. Jean-Noel, Application of Inverse Gas Chromatography and Regular Solution Theory for Characterization of Ionic Liquids, Industrial & Engineering Chemistry Research 44 (2005) M. K. Kozłowska, U. Domańska, M. Lempert, M. Rogalski, Determination of thermodynamic properties of isotactic poly(1-butene) at infinite dilution using density and inverse gas chromatography, Journal of Chromatography A 1068 (2005) R. Y. M. Huang, P. Shao, G. Nawawi, X. Feng, C. M. Burns, Measurements of partition, diffusion coefficients of solvents in polymer membranes using rectangular thin-channel column inverse gas chromatography (RTCCIGC), Journal of Membrane Science. 188 (2001) J. A. Widegren, T. J. Bruno, Enthalpy of adsorption for hydrocarbons on concrete by inverse gas chromatography, Journal of Chromatography A 1218 (2011) K. E. Miller, T. J. Bruno, Enthalpy of fuel gas odorants on surrogate soil surface by gas chromatography, Journal of Chromatography A 975 (2002) T. C. Davis, J. Petersen, Inverse gas-liquid chromatographic studies of asphalt. Comparison with analyses by fractionation, Analytical Chemistry 39 (1967) T. C. Davis, J. C. Petersen, W. E. Haines, Inverse gas-liquid chromatography a new approach for studying petroleum asphalts, Analytical Chemistry 38 (1966) T. C. Davis, J. C. Petersen, An adaptation of inverse gas-liquid chromatography to asphalt oxidation studies, Analytical Chemistry 38 (1966) M. Al-Bokari, D. Cherrak, G. Guiochon, Determination of the porosities of monolithic columns by inverse size-exclusion chromatography, Journal of Chromatography A 975 (2002) P. DePhillips, A. M. Lenhoff, Pore size distributions of cation-exchange adsorbents determined b y inverse size-exclusion chromatography, Journal of Chromatography A 883 (2000) P. M. Słomkiewicz, B. Szczepanik, M. Garnuszek, Determination of adsorption isotherms of aniline and 4-chloroaniline on halloysite adsorbent by inverse liquid chromatography, Applied Clay Science 114 (2015) 221.

24 24 PRACE ORYGINALNE (Original papers)

25 CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp Marta GLINKA, Marina ANTOLAK, Rafał ŁUKAJTIS, Marian KAMIŃSKI* Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Gdansk University of Technology, Chemical Faculty, Chemical and Process Engineering Department ul. Gabriela Narutowicza 11/ Gdańsk, Poland *Autor do korespondencji, markamin@pg.gda.pl Wpływ rodzaju kwasu jako dodatku do eluentu na parametry rozdzielania polifenoli techniką chromatografii cieczowej w odwróconych układach faz (RP-HPLC) Streszczenie: Chromatografia cieczowa jest jedną z technik najczęściej wykorzystywanych w badaniach składu mieszanin, a także do wydzielania czystych składników z mieszanin w postaci frakcji eluatu. Z punktu widzenia współczesnej chemii, farmakologii, a także medycyny, czy biotechnologii, chromatografia pełni ważną rolę, w zakresie analityki jakościowej i ilościowej. Dzięki możliwości otrzymywania naturalnych składników biologicznie czynnych w czystej postaci z ekstraktów pochodzenia naturalnego, jak i składników mieszanin po syntezie organicznej, ma też ważne znaczenie w skali preparatywnej, i coraz większe, w skali procesowej. W celu zapewnienia efektywności procesu konieczne jest dobranie optymalnych warunków realizacji operacji rozdzielania, detekcji oraz kolekcji frakcji, w zależności od właściwości fizykochemicznych składników rozdzielanej mieszaniny. Niniejsza praca dotyczy badań nad optymalizacją warunków stosowanych przy rozdzielaniu składników jednej z grup związków chemicznych stanowiących metabolity roślinne polifenole. W pracy zbadano wpływ na retencję, selektywność i sprawność rozdzielania, w tym także na s ymetrię pików, poprzez zastosowanie dodatków do eluentu w postaci kwasów (HCl, H3PO4, H2SO4, CH3COOH, TFA), do rozdzielania wybranych, naturalnie występujących materiale roślinnym polifenoli w warunkach RP HPLC. W rozdzielaniu peptydów w układach RP, w tym, w proteomice, najczęściej używanym modyfikatorem fazy ruchomej, jest k was trifluorooctowy (TFA). Spełnia on wówczas dwie funkcje: - ogranicza kwaśną dysocjację peptydu (na tzw. C-końcu ), co zwiększa poziom hydrofobowości molekuł; - solwatuje sprotonowane lub spolaryzowane, dodatnio naładowane fragmenty cząsteczki peptydu lub białka ujemnymi jonami zdysocjowanego kwasu, powodując wyraźne dodatkowe podwyższenie hydrofobowości rozdzielanych cząsteczek. W przypadku polifenoli i warunków RP, obecny w eluencie kwas, powoduje jedynie cofnięcie dysocjacji elektrolitycznej rozdzielanych mniej lub bardziej kwaśnych związków chemicznych. Wpływa to na wyraźny wzrost hydrofobowości cząsteczek. Zwiększenie hydrofobowości skutkuje wzrostem współczynnika retencji, poprawą symetrii pików i lepszym rozdzieleniem składników mieszaniny w stosunków do warunków rozdzielania bez dodatku kwasu do eluentu. Badania tej pracy potwierdzają konieczność dodania k wasu do eluentu, w przypadku stosowania warunków faz odwróconych ( RP). Pokazują, że każdy z badanych k wasów powoduje korzystne efekty, jednak, najbardziej korzystne - zwłaszcza dla celów analityki - okazuje się stosowanie niewielkiego dodatku kwasu siarkowego (VI). Słow a kluczow e: RP-HPLC, Polifenole, Optymalizacja rozdzielania, Kwasowy modyfikator eluentu Effects of the acid additive to the eluent on the chromatographic parameters of separation of polyphenols using reversed phase liquid chromatography (RP-HPLC) Abstract: Liquid chromatography is the one of commonly used technique in research of mixture composition, and also for separation of pure components form of eluate fractions. From the standpoint of modern chemistry, pharmacology, medicine or biotechnology, chromatography plays an significant role in the field of qualitative and quantitative analysis. Additionally, through the possibility of isolation from natural origin extracts the biologically active components in its pure form, as well as the components of the mixture after organic synthesis, chromatography is important technique, which can be used in preparati ve and also in process scale. In order to provide the effectiveness of the process, it is necessary to select the optimum condit ions of the separation, detection and collection of fractions, which dep end on the physiochemical properties of separated components constituting the mixture. This paper, include the research related to optimization of chromatographic conditions, applied for the separation of the one group of chemical compounds, namely plant metabolites polyphenols. In this research, effects of retention, separation selectivity and efficiency, including the symmetry of peaks, by applying the additive to the eluent in the form of acids (HCl, H3PO4, H2SO4, CH3COOH, TFA) for separation naturally occurring in plant polyphenols under RP- HPLC conditions was investigated. In the separation of peptides under RP conditions, including proteomics, the most commonly used acidic modifier is trifluoroacetic acid (TFA). It meets two functions: - reduces the acid dissociation of the peptide (on the so-called C-end ), which results in an increase hydrophobicity of the molecules; - causes the sal vation of the protonated or positively polarized fragments of the peptide or protein molecule by negative ions dissociated acid, resulting in a noticeable increase hyrophobicity of separated molecules. In the case of polyphenols and RP conditions, the presence of acid in the eluent, cause only the withdrawal of electrolytic dissociation of separated acidic compounds. This can affect the significant increase in the hydrophobicity of the molecules. In addition, increasing hydrophobicity resulting in increase the retention rate, improvement of peak symmetry and better separat ion of mixture components, regarding to separation without the addition of acid to the eluent. Research, carried out in this study, confirm that it is necessary to use acid additive to the eluent, in the case of reversed phase (RP) conditions. Indicate that each of tested acids results in beneficial effects, however, the most preferred - especially for the purpose of analysis turns out a small addition of sulfuric acid (VI). Key w ords: RP-HPLC, Polyphenols, Optimization of separation, Acidic eluent modifier

26 26 1. Wstęp (Introduction) 1.1. Polifenole właściwości fizykochemiczne i wykorzystanie (Polyphenols physiochemical properties and their applications) Polifenole są naturalnie występującymi związkami chemicznymi, charakteryzującymi się obecnością pierścieni aromatycznych podstawionych przynajmniej dwiema grupami hydroksylowymi ( OH). Głównymi źródłami polifenoli są: owoce, warzywa, przyprawy, zioła oraz napoje tj. czerwone wino, czy zielona herbata. Ze względu na swoje właściwości farmakologiczne, w tym przeciwutleniające, polifenole wykorzystywane są jako składniki kosmetyków oraz farmaceutyków. Dieta bogata w związki z grupy polifenoli, ze względu na ich sile działanie antyoksydacyjne, może znacznie zmniejszyć ryzyko wielu schorzeń cywilizacyjnych, m.in. chorób nowotworowych oraz układu krążenia [1, 2]. Ponadto, związki te wykazują działanie przeciwalergiczne, a także przeciwzapalne [3]. Dodatkowo stwierdzono, że polifenole pochodzenia naturalnego są łatwiej przyswajalne przez organizmy żywe w porównaniu do syntetycznych przeciwutleniaczy, tj. BHA (butylohydroksyanizolu) czy BHT (butylohydroksytoluenu). Dlatego korzystne jest pozyskiwanie naturalnych polifenoli z materiału roślinnego. To z kolei wpływa na rozwój technik rozdzielania i wydzielenia tych substancji w postaci czystej w skali preparatywnej oraz procesowej. Ze względu na budowę strukturalną, polifenole można podzielić na kilka następujących podgrup: kwasy fenolowe, flawonoidy, kwasy hydroksycynamonowe [4]. Najlepiej poznaną dotychczas grupą są flawonoidy (rys. 1), ich struktura chemiczna oparta jest na układzie flawonu. Zawierają one 15 atomów węgla, które tworzą, dwa pierścienie fenylowe, połączone ze sobą po przez strukturę piranu (flawanole, antocyjany) bądź pironu (flawony, flawanony, flawanole, izoflawony). a) b) Rys.1. Struktury molekularne dwóch flawonoidów: a) kwercetyna, b) mirycetyna. Fig. 1. Molecular structures of two flavonoids: a) quercetin, b) myricetin. Naturalnie występujące flawonoidy, będące przedmiotem niniejszych badań, posiadają w swojej strukturze grupy hydroksylowe znajdujące się w konkretnych położeniach. Grupy OH, znajdujące się blisko struktury ketonu lub umiejscowi one kilka obok siebie, mają kwasowy charakter, dlatego w obecności wody dochodzi do odszczepiania protonów. Flawonoidy zwykle występują jako glikozydy flawonoidowe (rys. 2), zawierające w swojej strukturze część cukrową, rozpuszczalną w wodzie (glikozydy) oraz nie cukrową, znacznie gorzej rozpuszczalną (aglikony), jednakże oba rodzaje charakteryzują się dobrą rozpuszczalnością w alkoholach. Są to głównie O glikozydy, bądź C glikozydy [5]. a) b) Rys. 2. Struktury molekularne flawonoidów w postaci: a) O glikozydu (Apiin), b) C glikozydu (Vitexin). Fig. 2. Molecular structure of flavonoids in the form of: a) O glycoside (Apiin), b) C glycoside (Vitexin).

27 Modyfikatory eluentów wykorzystywanych w technice wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych RP-HPLC rodzaje i funkcje stosowanych dodatków (Modifiers of eluents used in the reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) classification and function of additives) Wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych (RP -HPLC) jest główną techniką wykorzystywaną obecnie do rozdzielania polifenoli pochodzących z materiałów roślinnych [5-6]. Powierzchnia sorpcyjna w tego typu układach składa się z niepolarnych, hydrofobowych łańcuchów alkilowych (np. nc18, nc8), propylonitrylowych bądź arylowych lub diarylowych, a także innych (np. C32, izo- lub fluoro-alkanów, o określonych strukturach molekuł), związanych wiązaniami kowalencyjnymi z powierzchnią nośnika (np. na drodze reakcji grup OH na powierzchni żelu krzemionkowego z utworzeniem wiązań siloksanowych z C18, albo z innymi grupami funkcyjnymi o charakterze hydrofobowym). Fazę ruchomą zwykle stanowi mieszanina wody i składnika organicznego (najczęściej acetonitrylu (ACN) bądź metanolu (MeOH)). W celu optymalizacji warunków rozdzielania mieszanin o złożonym składzie (np. próbki ekstraktów roślinnych) wykorzystuje się różnego typu modyfikacje układów ch romatograficznych. Ma to na celu zwiększenie efektywności procesu rozdzielania, a w konsekwencji uzyskanie składników mieszaniny o jak najwyższej czystości. W układzie faz odwróconych najłatwiejszą do wykonania, a zarazem dającą znaczące rezultaty, jest modyfikacja fazy ruchomej polegająca na wprowadzeniu dodatków w ilości nie większej niż kilka procent objętościowych. Jednocześnie, nie powodującej szkodliwego działania na fazę stacjonarną. W tabeli nr 1 zestawiono najczęściej wykorzystywane przykłady modyfikatorów oraz opisano ich rolę. Tabela 1. Zestawienie dodatków do eluentów, wykorzystywanych w chromatografii cieczowej w układach faz odwróconych (RP). Table 1. Summary of additives to the eluents, used in reversed phase (RP) liquid chromatography. Lp. Rodzaj dodatku do eluentu Przykłady Funkcje Lit. (Type of eluent additive) 1. Kw asy/zasady organiczne lub nieorganiczne (Organic or inorganic acids/bases) (Examples) CH 3COOH, TFA, DMA, TMA, MEA, H 2SO 4, RSO 2 - H + (Functions) - stosowane w celu cofnięcia dysocjacji elektrolitycznej (odpow iednio kwasowej, zasadowej) substancji rozdzielanych (applied to withdraw electrolytic (acid/base) dissociation of separated substances) (Ref.) [7, 8] 2. Kompleksony (Complexing agents) 3. Środki pow ierzchniowoczynne (Surfactants) EDTA SDS, SLS - solw atacja sprotonowanych grup funkcyjnych (przez aniony posiadające hydrofobowe fragmenty cząsteczek) dla zw iększenia oddziaływań hydrofobowych z powierzchnią sorpcyjną (solvation of protonated functional groups (via anions with hydrophobic moieties) to increase the hydrophobic interaction with sorption surface) - stosowane w celu kompleksow ania jonów metali ciężkich, a także zmniejszenia heterogeniczności powierzchni sorpcyjnej (used for the complexation of heavy metals ions and to reduce the heterogeneity of the sorption surface) - micellizacja (tw orzenie micelli normalnych bądź odw róconych ) (micellisation the formation of normal or reversed micelles) [9] [10] 4. Sole (Salts) RSO 3 - Me +, RSO 3 - H +, R R 3N + OH -, R 3N + X - - tw orzenie par jonowych z jonami próbki, w celu utw orzenie neutralnych par jonow ych (the formation of Ion pairs with ions contained in the sample, in order to create a neutral ion pairs) * TFA kwas trifluorooctowy (ang. Trifluoroacetic acid); DMA dimetyloamina (ang. Dimethyloamine); TMA trimetyloamina (ang. Trimethyloamine); MEA monoetanoloamina (ang. Monoethanolamine); R symbol niepolarnej, hydrofobowej grupy funkcyjnej (ang. symbol of the non-polar, hydrophobic functional group); EDTA kwas wersenowy (ang. Ethylenediaminetetraacetic acid); SDS siarczan dodecylu sodu (ang. Sodium dodecyl sulfate); SLS siarczan laurylu sodu (ang. Sodium laureth sulfate); Me + kation metalu (ang. metal cation); X - anion niemetalu (ang. non-metal anion). [11]

28 28 Do rozdzielania substancji o charakterze kwaśnym, jak ma to miejsce, np. w przypadku polifenoli, korzystne jest stosowanie kwasów, jako dodatku do fazy ruchomej, w celu obniżenia ph eluentu, tak by spełniony był następujący warunek ph < (pk a 0,5 1), jednakże przy zachowaniu wartości bezpiecznej dla fazy stacjonarnej tzn. niepowodującej hydrolizy wiązań siloksanowych. W praktyce, za optymalną wartość uznaje się ph 2. Obniżenie wartości ph eluentu stosowanego do rozdzielania lub analizy związków chemicznych będących słabymi kwasami powoduje cofnięcie dysocjacji elektrolitycznej a w konsekwencji wzrost hydrofobowości i siły oddziaływań z fazą stacjonarną. W poniższej tabeli przedstawiono opisane w literaturze naukowej, przykładowe warunki chromatograficzne, stosowane do rozdzielania flawonoidów obecnych w ekstraktach roślinnych techniką RP -HPLC z wykorzystaniem różnych rodzajów kwasów jako modyfikator fazy ruchomej. Tabela 2. Zestawienie przykładowych warunków rozdzielania flawonoidów techniką RP-HPLC. Table 2. Summary of examples of chromatographic conditions for flavanoids separation using RP -HPLC. Ekstrahowany materiał Przygotowanie próbki/warunki Warunki chromatograficzne Przykład oznaczanych polifenoli Lit. ekstrakcji (Extracted material) Cynara cardunculus Oliwa z oliwek (Olive oil) Ilex paraguariens Zielona herbata (Green tea) (Sample preparation/extraction conditions) Ekstrakcja liści w 70% EtOH z dodatkiem kw asu mrów kowego (ph = 3,2) (Extraction of leaves with 70% EtOH and addition of formic acid, ph = 3,2) Ekstrakcja SPE, C 8, rozpuszczalniki (w kolejności użycia): n-heksan (elucja składników niepolarnych), acetonitryl, metanol oraz mieszanina metanol-w oda (1:1 v/v) (wymywanie kolejnych frakcji składników polarnych) (Extraction SPE, C 8; solvents, respectively, in the order: n-hexane (in order to remove the non-polar fraction) acetonitrile, methanol, methanolwater 1:1 v/v) (in order to gradually remove polar fractions) Ekstrakcja z w ykorzystaniem gorącej w ody (Extraction by the using a hot water) Ekstrakcja z w ykorzystaniem gorącej w ody (Extraction by the using a hot water) (Chromatographic conditions) Eluent A: H 2O (z dodatkiem HCOOH do ph = 3,2) Eluent B: CH 3CN Elucja gradientow a: 30 min: gradient liniow y od 0 do 100% B Kolumna: C 18 Temperatura: 27 C V = 0,6 ml/min Detekcja: DAD Eluent A: H 2O/CH 3COOH (98:2 v/v)/ Eluent B: CH 3OH/ CH 3CN (1:1 v/v) Elucja gradientow a: 25 min: 95 70% A 10 min: 70 60% A 5 min: 60 52% A 10 min: 52 30% A 5 min: 30 0% A 10 min: 0 95% A 5 min: 95% A Kolumna: C 18 Temperatura: 25 C V = 0,5 ml/min Detekcja: DAD Eluent A: H 2O/CH 3COOH (98:2 v/v) Eluent B: CH 3OH/CH 3COOH (98:2 v/v) Elucja gradientow a: 30 min: 15 40% B 10 min: 40 75% B 5 min: 75 85% B Kolumna: IB-SIL RP C 18 Temperatura: (nie podano) V = 1,2 ml/min Detekcja: DAD Eluent: H 2O/CH 3OH (70:30 v/v) + 0,1% CH 3COOH Kolumna: SB-C 18 Temperatura: (nie podano) V = 1 ml/min Detekcja: DAD (Example of analyzed polyphenols) Luteolina O-lukozyd; Luteolina 7-O-malonylglukozyd; Apigenina 7-O-rutynozyd; Kw as 3,4-dihydroksyfenylooctowy; Tyrosol; Oleuropeina; Rutyna; Pochodne kaw oilo; Procyjanidy; Epikatechina; Katechina; (Ref.) [12] [13] [14] [15]

29 29 Ekstrahowany materiał Przygotowanie próbki/warunki ekstrakcji Warunki chromatograficzne Przykład oznaczanych polifenoli Lit. (Extracted material) Suplementy diety zawierające polifenole (Dietary supplements containing polyphenols) Suplementy diety zawierające polifenole (Dietary supplements containing polyphenols) (Sample preparation/extraction conditions) Ekstrakcja z w ykorzystaniem metanolu (Extraction by the using a methanol) Ekstrakcja z w ykorzystaniem metanolu (Extraction by the using a methanol) (Chromatographic conditions) Eluent A: H 2O/CF 3COOH (99,95:0,05 v/v) Eluent B: CH 3CN Elucja gradientow a: 0,5 min: 95 80% A 1,5 min: 80 60% A 1,5 min: 60 10% A Kolumna: C 18 Temperatura: 25 C V = 1 ml/min (t = 0 min); 0,5 ml/min (t = 0,5 min); 0,4 ml/min ( t= 2 min); 0,9 ml/min (t=3,5 min) Detekcja: DAD Eluent A: CH 3CN Eluent B: H 2O/CF 3COOH (99,95:0,05 v/v) Elucja gradientow a: 0,5 min: 8 13% A 0,5 min: 13 % A 1 min: 13 25% A 0,5 min: 25 35% A 0,5 min: 35% A 1 min: 35 70% A 1,5 min: 70 80% A 0,5 min: 80 8% A Kolumna: RP-18e Temperatura: 20 C V = 1,3 ml/min (t = 0-1 min); 1,2 ml/min (t = 1-3 min); 1,3 ml/min (3-4,5 min); 1,2 ml/min (4,5-5 min) Detekcja: DAD (Example of analyzed polyphenols) Rutyna; Kw ercetyna; Hesperydyna; Rutyna; Kw ercetyna; Hesperydyna; Neohesperydyna; Katechiny; (Ref.) [16] [17] Na podstawie zestawionych w tabeli nr 2 przykładów przytoczonych z literatury naukowej, można zauważyć, że istnieje wiele możliwości optymalizacji warunków rozdzielania chromatograficznego, tak aby wyizolować związki chemiczne z grupy polifenoli z materiał u roślinnego. Dotychczasowe rezultaty badań dotyczących rozdzielania mieszanin polifenoli [12-17] sugerują, że korzystniejsze jest użycie acetonitrylu który charakteryzuje się większą siłą elucji niż metanol co ma wpływ szczególnie na współczynnik retencji [16]. Zaobserwowano m.in. znaczące skrócenie czasu retencji składników mieszanin. Rezultaty innych badań dowodzą, że użycie dodatku do fazy ruchomej w postaci buforów może powodować rozkład izoflawonów o charakterze estrowym, dlatego tak istotne jest, by w tego typu rozdzieleniach zapewnić kwaśne środowisko fazy ruchomej [18]. Magiera i współpracownicy udowodnili również że wzrost ph od ok. 3 do 6 powodował zwiększenie stopnia rozmycia pików chromatograficznych, natomiast dla ph = 2,5 3 uzyskali oczekiwany poziom rozdzielenia składników [16,17]. W większości przypadków zastosowań techniki RP, znacznie bardziej korzystne jest stosowanie elucji gradientowej, pozwalającej na uzyskanie wymaganego stopnia rozdzielenia oraz wyższej czułości. Tego typu rozdzielani a są zazwyczaj preferowane, gdy obecne w mieszaninie substancje charakteryzują się istotnymi różnicami w hydrofobowości. Jednakże do zastosowań na większą skalę (semi-preparatywną, preparatywną), realizacja rozdzielania w programie elucji gradientowej jest niekorzystna i może to powodować utrudnienia związane z realizacją procesu, głównie poprzez konieczność ścisłej kontroli składu eluentu oraz stosowanie dodatkowej aparatury. Należy nadmienić także, że w przypadku elucji gradientowej, proces recyrkulacji eluentu, a także regeneracji złoża kolumny jest znacznie bardziej utrudniony, niż w przypadku elucji izokratycznej, co także wywiera istotny wpływ na możliwość wykorzystania na skalę procesową. Ze względu na powyższe, w pracy badawczej przeprowadzono rozdzielania jedynie w warunkach izokratycznych z zastosowaniem ACN, jako organicznego składnika eluentu. Rozwiązanie to umożliwiło także na dokonanie jednoznacznej oceny wpływu dodatku kwasu na retencję składników (przy niezmiennej sile elucyjnej fazy ruchomej).

30 30 2. Część doświadczalna (Experimental) 2.1. Aparatura i odczynniki (Apparatus and reagents) W celu zbadania wpływu rodzaju kwasu na retencję polifenoli, wykorzystano chromatograf cieczowy LaChrom (Merck Hitachi, Niemcy) z czterokanałowym systemem elucji gradientowej z zaworami proporcjonującymi; pompę L-7100 oraz zawór dozujący Rheodyne Rh-7725i z pętlą dozującą o objętości 20 μl; detektor: UV-VIS DAD L-300 z rejestracja w zakresie długości fali promieniowania: nm oraz kolumny chromatograficzne: LiChrospher RP18 5 µm, 250x4 mm (Merck, Niemcy), LiChrospher RP18e 5 µm, 250x4 mm (Merck, Niemcy). Próbki wzorców rozpuszczano w acetonitrylu oraz filt rowano z wykorzystaniem filtrów strzykawkowych (0,45 µm, Millipore). Próbki dozowano strzykawką o objętości całkowitej 100 µl (Hamilton, USA). Substancje wzorcowe: kwercetyna (Sigma Aldrich), mirycetyna (Sigma Aldrich). Pozostałe odczynniki: acetonitryl o czystości gradient grade (Merck, Niemcy), woda dejonizowana (otrzymana za pomocą aparatu Mili Q, Milipore, USA), kwas solny cz.d.a. (POCH, Polska), kwas trifluorooctowy o czystości gradient grade (Merck, Niemcy), kwas siarkowy cz.d.a. (P.P.H. Standard, P olska), kwas octowy cz.d.a. (POCH, Polska) Metodyka badań (Research) Każdorazowo pobierano ok. 50 µl roztworu kwercetyny (stężenie ok. 1,8 mg/ml w acetonitrylu (ACN) lub mirycetyny (ok.2 mg/ml w AcCN). Wprowadzono do pętli zaworu dozującego o objętości: 20 μl. Objętość dozowania wynosiła więc wówczas 20 µl. Objętość dozowania Vi, w przypadku wysokosprawnej chromatografii cieczowej w skali analitycznej, powinna być jak najmniejsza. Zawsze powinna być mniejsza od wartości wyrażenia: ((Vc/N)1/2), gdzie: Vc - objętość wypełnienia kolumny, a N - liczba półek teoretycznych kolumny. Dla kolumny o długości wypełnienia, Lc=250 mm i jego średnicy dc = 4 mm, gdy liczna półek teoretycznych kolumny N, to ok. 5000, wynosi ok. 43 μl. W praktyce objętość dozowania powinna, więc, mieścić się w granicach od 5 do 40 μl. W przypadku niniejszych badań, wynosiła 20 μl, co jest zgodne z podaną wyżej zasadą. Rejestrację widm prowadzono w zakresie promieniowania o długościach fali: od 200 do 560 nm, z zastosowaniem detektora UV -DAD L-300. Chromatogramy uwzględnione w tej pracy wykonano dla takich długości fali, by zapewnić liniowy zakres odpowiedzi detektora. Dokładne dane w Tabeli 3. Tabela 3. Zestawienie warunków rozdzielania chromatograficznego. Table 3. Summary of chromatographic separation conditions. 1 Substancje wzorcowe a) b) Kwercetyna (ang. Quercetin), C = 1,8 mg/ml Mirycetyna (ang. Myricetin), C = 2 mg/ml (Reference substances) 2 Skład eluentów (Composition of eluents) 3 Kolumna Chromatograficzna (Column) 4 Natężenie przepływu eluentu (Eluent flow rate) 5 Detekcja Mieszanina ACN/H2O 3:7 (v/v) zakwaszana do ph = 3: Mixture of ACN//H2O 3:7 (v/v), ph adjusted to 3, with: a) CH3COOH (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), b) H3PO4 (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), c) TFA (0,5 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), d) HCl (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), e) H2SO4 (1 cm 3 na 1 dm 3 mieszaniny ACN/H2O), a) LiChrospher RP18e 5 µm, 250x4 mm, t0 = 1,98 min, b) LiChrospher RP18 µm, 250x4 mm, t0 = 1,98 min. 1 ml/min UV VIS DAD (Detection)

31 31 Zastosowano elucję izokratyczną z fazą ruchomą, w postaci mieszaniny dwuskładnikowej (3:7 v/v): acetonitrylu oraz wody z dodatkiem kwasu: octowego, ortofosforowego, trifluorooctowego (TFA), solnego bądź siarkowego. Objętość dodatku kwasu wyznaczono doświadczalnie z wykorzystaniem ph-metru, tak by ph czystego roztworu wodnego wynosiło 3. W tym celu do 1 dm 3 wody dodawano porcjami znaną objętość kwasu, kontrolując by ph nie przekraczało wymaganej wartości. Następnie sporządzono roztwory eluentów ACN/H2O (3:7 v/v) z dodatkiem analogicznej do wyznaczonej ilości dodatku danego kwasu na 1 dm 3 mieszaniny (tabela 3). Rozdzielanie wykonano w temperaturze pokojowej (20 C). Natężenie przepływu eluentu ustawiono na 1 ml/min 3. Wyniki i dyskusja (Results and discussion) Analiza wpływu dodatku różnych kwasów do fazy ruchomej na parametry rozdzielania chromatograficznego, została przeprowadzona z użyciem dwóch naturalnie występujących w materiale roślinnym polifenoli z grupy flawonoidów: kwercytyny oraz miry cetyny. Związki te posiadają właściwości słabych kwasów (pka 6,5) [19], szczególnie ze względu na obecność hydroksylowych grup funkcyjnych obecnych w ich strukturze. W przypadku tego typu związków chemicznych dodatek kwasu do eluentu ma wpływ na cofnięcie ich dysocjacji elektrolitycznej, a tym samym na wzrost ich hydrofobowość [20]. Równanie 1, przedstawia schematyczną reakcję dysocjacji kwasu w środowisku wodnym: (1) gdzie: H x A kwas, H 3 O + jon hydroniowy, A x- anion reszty kwasowej. W przypadku słabych kwasów, dysocjacja zachodzi jedynie w pewnym, ograniczonym stopniu. W tego typu roztworach ustala się równowaga między częścią zdysocjowaną a niezdysocjowaną, co oznacza, że liczba zdysocjowanych cząsteczek jest identyczna jak liczba cząsteczek powstałych w wyniku połączenia się jonów. Stosunek stężeń powyższych indywiduów chemicznych pozwala na wyznaczenie stałej dysocjacji (K a ), wyrażonej równaniem nr 2: (2) gdzie: [ ] stężenie poszczególnych indywiduów chemicznych (cząsteczki/jony), [mol/dm 3 ] Alternatywnie do wartości K a, można posługiwać się parametrem pk a, określającym w sposób ilościowy moc kwasu. Zależność stałą dysocjacji, a mocą kwasu przedstawia równanie (3):, (3) natomiast ph wyrażane jest jako zależność: Jeśli do roztworu słabego kwasu, znajdującego się w równowadze określonej wzorem (2) zostaną wprowadzone w jony hydroniowe (obniżenie ph roztworu mocnym kwasem), wówczas pierwotnie ustalona równowaga zostanie zakłócona, i w konsekwencji nastąpi cofnięcie dysocjacji wzrost stężenia niezdysocjowanego kwasu oraz spadek stężenia jonów. Wynika to z nadmiaru jonów [H 3 O + ] w roztworze w stosunku do jonów [A x- ] i ponownego łączenia się wyżej wspomnianych jonów w cząsteczki. Efekt ten ma znaczenie zwłaszcza podczas realizacji rozdzielania w odwróconym układzie faz, gdzie mamy do czynienia z oddziaływaniami sorpcyjnymi rozdzielanych substancji z hydrofobowymi fragmentami f azy stacjonarnej [21, 22]. Rozdzielanie w układzie RP substancji, które w zastosowanych warunkach chromatograficznych ulegają dysocjacji, powoduje że są one eluowane z objętością martwą kolumny. Analogiczne zjawisko wykorzystywane jest w niniejszych badaniach. Obniżenie ph eluentu. Wybrane do badań kwasy różnią się pod względem siły oraz hydrofobowości. Największą hydrofobowością spośród zastosowanych kwasów charakteryzują się kwasy: TFA oraz octowy. Natomiast pod względem kwasowości, szereg ten przedstawia się następująco: kwas solny (najsilniejszy kwas, pka = -8,0) > kwas siarkowy (pka = -3,0) > TFA (pka = 0,52) > kwas ortofosforowy (pka = 2,12) > kwas octowy (pka = 4,76). Wszystkie z wybranych kwasów spełniają wymagany warunek, mianowicie pk a kwasu, (4)

32 32 stanowiącego dodatek do eluentu musi posiadać niższą wartość, niż rozdzielane składniki w powyższych badaniach wybrane flawonoidy. Powoduje to gwarancję cofnięcia dysocjacji elektrolitycznej analitów. Chromatogramy z przeprowadzonych badań przedstawione są na rysunkach 3 i 4. Celem jednoznacznego oraz dokładnego ukazania wpływu rodzaju kwasu, jako dodatku do eluentów na poszczególne związki z grupy flawonoidów, analizie chromatograficznej poddano pojedyncze wzorce. Umożliwiło to także określenie kolejności elucji powyższych (analiza jakościowa) oraz wyznaczenie wartości głównych parametrów chromatograficznych. Wszystkie analizy roztworu wzorców flawonoidów, wykonano przynajmniej dwukrotnie, dla każdego z eluentów, a przedstawione wyniki są wartościami ś rednimi co najmniej dwóch rezultatów, dla których wartości błędu względnego nie przekraczają pięciu procent. a) b) 0,16 0,14 0,12 0, ,06 0,04 0,02 0,00 c) 0,18 0,16 0,14 0,12 0, ,06 0,04 0,02 0,00

33 33 d) e) Rys. 3. Chromatogramy, otrzymane z zastosowaniem detektora UV-VIS DAD, roztworu wzorca kwercetyny w acetonitrylu, o stężeniu 1,8 mg / ml ACN. Dozowano 20 µl roztworu wzorca. Kolumna: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 µm; Eluent: acetonitryl : woda (3:7 v/v) z dodatkiem kwasu: a) CH 3COOH, b) TFA, c) HCl, d) H3PO4, e) H2SO4; ph =3; przepływ 1 ml/min, długość fali 365 nm. Fig. 3 Chromatograms (DAD, λ = 365 nm) obtained for the standard solution of quercetin in acetonitrile (C = 1,8 mg/ml ACN). Sample injection volume: 20 μl. Column: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 μm. Eluent: acetonitrile:water (3:7 v/v) with addition of: a) CH3COOH, b) TFA, c) HCl, d) H3PO4, e) H2SO4; ph = 3; flow rate: 1 ml/min. a)

34 34 b) 0,12 0,10 0,08 0, ,02 0,00 c) 0,10 0,08 0, ,02 0,00 d) e) Rys. 4. Chromatogramy, otrzymane z zastosowaniem detektora UV-VIS DAD, roztworu wzorca mirycetyny w acetonitrylu, o stężeniu 2 mg / ml ACN. Dozowano 20 µl roztworu wzorca. Kolumna: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 µm; Eluent: acetonitryl : woda (3:7 v/v) z dodatkiem kwasu: a) CH 3COOH, b) TFA, c) HCl, d) H 3PO 4, e) H 2SO 4, ph w roztworze wodnym = 3, przepływ 1 ml/min, długość fali 370 nm. Fig. 4 Chromatograms (DAD, λ = 370 nm) obtained for the standard solution of myricetin in acetonitrile (C = 2 mg/ml ACN). Sample injection volume: 20 μl. Column: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 μm. Eluent: acetonitrile:water (3:7 v/v) with addition of: a) CH3COOH, b) TFA, c) HCl, d) H3PO4, e) H2SO4; ph = 3; flow rate: 1 ml/min.

35 35 Na podstawie uzyskanych w trakcie badań chromatogramów dla kwercetyny i mirycetyny wyliczone zostały parametry chromatograficzne właściwe dla poszczególnych składników mieszaniny wzorców [23]. Wyznaczenie m.in. współczynnika retencji (k), czy liczby pólek teoretycznych (N) dla różnych eluentów, przy zastosowaniu tej samej kolumny stanowi materiał odniesienia i pozwala na określenie najlepszych z pośród przeanalizowanych warunków rozdzielania. Liczbę pólek teoretycznych wyznaczono na podstawie szerokości połówkowej pików (4), ze względu na bardziej dokładne wyznaczanie jej wartości., (4) gdzie: t r czas retencji (czas mierzony od momentu zadozowania próbki do maksimum piku na chromatogramie), [min] w 0,5 szerokość połówkowa piku, [min]. Jest to konsekwencją asymetryczności otrzymanych doświadczalnie pików pik symetryczny, charakteryzuje się współczynnikiem symetryczności wynoszącym 0,95 1. Liczba półek teoretycznych wyznaczana przy pomocy szerokości piku u jego podstawy daje najbardziej dokładne wartości, w przypadku pików o kształcie gaussowskim. Jako czas retencji substancji niezatrzymywanej (tzw. czas martwy kolumny), do obliczeń przyjęto wartość wyznaczoną doświadczanie (na podstawie chromatogramu wykonanego z użyciem trasera azotanu sodu), równą: t 0 = 1,98 min. Wartość ta dla każdego z dodatków eluentu jest taka sama. Wynika to z mechanizmów sorpcji w układzie faz odwróconych substancje nie wykazujące oddziały wań z fazą stacjonarną, tj. sole nieorganiczne nie są zatrzymywane, ze względu na brak jakichkolwiek oddziaływań z fazą stacjonarną (jedynie wnikają we wszystkie pory wypełnienia kolumny). W tabeli 4 i 5 zestawiono otrzymane wyniki. Tabela 4. Zestawienie wyznaczonych parametrów chromatograficznych, uzyskanych w wyniku analizy chromatograficznej (RP HPLC) próbki kwercetyny, z zastosowaniem różnych kwasów, jako dodatków do eluentu. Table 4. Summary of the derived chromatographic parameters, obtained by the analysis of samples of quercetin, using different acids as additives to the eluent. Lp. Rodzaj kwasu Liczba półek teoretycznych, N [-] Współczynnik asymetrii, As0,5 [-] Współczynnik asymetrii, As0,1 [-] Czas retencji, tr [min] Współczynnik retencji, k [-]* (Type of acid) (Number of theoretical plates, N [-]) (Asymmetry factor, As0,5 [-]) (Asymmetry factor, As0,1 [-]) (Retention time, tr [min]) 1 H 3PO ,00 2,00 9,09 3,59 9, ,00 1,57 8,98 3,53 2 HCl ,20 1,86 9,31 3,70 9, ,80 1,86 9,26 3,68 3 H2SO ,00 1,60 9,15 3,62 9, ,00 1,43 9,15 3,62 4 CH3COOH ,50 2,00 10,30 4,20 10, ,50 1,75 10,29 4,19 5 TFA ,50 2,20 9,18 3,64 9, ,50 1,86 9,23 3,66 * wartość czasu retencji substancji niezatrzymywanej: t0 = 1,98 min (Retention factor, k [-]) 3,56 3,69 3,62 4,20 3,65

36 36 Tabela 5. Zestawienie wyznaczonych parametrów chromatograficznych, uzyskanych w wyniku analizy chromatograficznej (RP HPLC) próbki kwercetyny, z zastosowaniem różnych kwasów, jako dodatków do eluentu Table 5. Summary of the derived chromatographic parameters, obtained by the analysis of samples of myricetin, using different acids as additives to the eluent. Lp. Rodzaj kwasu Liczba półek teoretycznych, N [-] Współczynnik asymetrii As 0,5 [-] Współczynnik asymetrii, As 0,1 [-] Czas retencji, tr [min] Współczynnik retencji, k [-]* (Type of acid) (Number of theoretical plates, N [-]) (Asymmetry factor, As0,5 [-]) (Asymmetry factor, As0,1 [-]) (Retention time, tr [min]) 1 H3PO ,50 2,00 5,04 1,55 5, ,50 2,16 5,02 1,53 2 HCl ,33 2,20 5,25 1,65 5, ,90 1,66 5,16 1,60 3 H 2SO ,00 1,60 5,08 1,57 5, ,99 1,50 5,08 1,57 4 CH3COOH ,50 1,85 5,65 1,85 5, ,50 2,00 5,63 1,84 5 TFA ,00 2,50 5,18 1,61 5, ,00 2,20 5,21 1,63 * wartość czasu retencji substancji niezatrzymywanej: t0 = 1,98 min (Retention factor, k [-]) Z otrzymanych wyników badań dotyczących określenia wpływu zastosowania różnych rodzajów kwaśnego modyfikatora na parametry chromatograficzne (tabele 4 i 5) można zauważyć, że najkorzystniejszy wpływ na sprawność rozdzielania ma obecność tlenowych kwasów nieorganicznych w fazie ruchomej. Dla kwasu siarkowego oraz ortofosforowego otrzymano następujące wartości: (kwercetyna: N H2SO4 = 13495; N H3PO4 = oraz mirycetyna: N H2SO4 = 11620; N H3PO4 = 7740). W przypadku pozostałych kwasów, na chromatogramach widoczne jest niewielkie przesunięcie w wartościach czasów retencji analitów oraz różnice w szerokościach połówkowych, co wpływa na rozbieżności wyznaczonych liczb półek teoretycznych (rys. 3 i 4). Identyczna zależność obserwowana jest także ze względu na wartość współczynnika asymetrii pików. Najlepszą symetrię pików pochodzących od analizowanych związków uzyskano dla kwasów nieorganicznych zwłaszcza dla kwasu siarkowego i solnego, np. dla kwasu siarkowego, współczynnik As 0,5 piku właściwego dla kwercetyny oraz mirycetyny wynosi 1. Obecność w eluencie kwasów organicznych skutkuje wzrostem czasu retencji w porównaniu do kwasów nieorganicznych. Te rezultaty są efektem zastosowania powszechnie używanego, zwłaszcza w chromatografii białek i peptydów, kwasu trifluorooctowego [24]. Wynika to z tworzenia, tzw. par jonowych dzięki dodatkowi TFA, a w konsekwencji minimalizowania ładunku zdysocjowanych grup funkcyjnych peptydu i zwiększenia jego hydrofobowości [24-26]. W przypadku rozdzielenia i analizy polifenoli charakteryzuje się jednak znacznie mniejszą sprawnością i gorszą symetrią pików zwłaszcza w porównaniu do kwasu siarkowego i ortofosforowego (tabele 4 i 5). Jedynie zastosowanie kwasu solnego daje podobny efekt jak dla TFA w postaci liczby półek teoretycznych, jednakże w przypadku HCl uzyskiwane są piki o większej symetrii. W celu sprawdzenia zasadności użycia kwasu jako dodatku do eluentu przy rozdzielaniu związków będących słabymi kwasami wykonano analizę chromatograficzną mieszanin dwóch polifenoli w identycznych warunkach, z tą tylko różnicą, że dla pierwszego przypadku eluent nie zawierał dodatku, a drugim obecny był kwas siarkowy (jako dodatek z użyciem którego uzyskano najlepsze wartości parametrów chromatograficznych). Dodatkowo, zastosowano inny rodzaj kolumny chromatograficznej, mianowicie kolumnę C-18 zamiast C-18e, wykorzystywanej we wcześniejszym etapie badań. Zabieg ten miał na celu porównanie wartości współczynników retencji oraz asymetrii pików, w zależności od zastosowanej kolumny chromatograficznej (tabele 4-6). Rezultaty w postaci chromatogramów przedstawiono na rys. 5. 1,54 1,63 1,57 1,85 1,62

37 37 Rys. 5. Chromatogramy, otrzymane z zastosowaniem detektora UV, roztworu wzorca mirycetyny oraz kwercetyny w acetonitrylu. Dozowano 20 µl kwercetyny oraz 10 µl mirycetyny. Kolumna: LiChrospher RP18, 250 x 4 mm, 5 µm; Eluent: acetonitryl : woda (3:7 v/v); Chromatogram: a) bez dodatku kwasu do eluentu; b) z dodatkiem kwasu H 2SO4 (ph w roztworze wodnym = 3), przepływ 1 ml/min, długość fali 254 nm. Fig. 5 Chromatogram (DAD, λ = 254 nm) obtained for standards mixture of myricetin and quercetin in acetonitrile. Sample injection volume: 20 μl (quercetin) and 10 μl (myricetin). Column: LiChrospher RP18e, 250 x 4 mm, 5 μm. Eluent: acetonitrile:water (3:7 v/v) with addition of: a) without acid, b)with H 2SO4 (0,05 %; ph = 3); flow rate: 1 ml/min. Porównując chromatogramy przedstawione na rysunku nr 5 można zauważyć niewątpliwy wpływ obecności kwasu w fazie ruchomej (w tym przypadku, kwasu siarkowego) na kształt pików a w konsekwencji na jakość rozdzielania, w stosunku do warunków w których nie zastosowano żadnego modyfikatora eluentu. Obniżenie ph eluentu skutkuje bardzo wyraźną poprawą jakości rozdzielania polifenoli. Świadczą o tym również wartości podstawowych parametrów chromatograficznych przedstawione w tabeli 6. Tabela 6. Zestawienie parametrów chromatograficznych, uzyskanych w wyniku rozdzielania chromatograficznego w warunkach RP HPLC próbki kwercetyny oraz mirycetyny, bez oraz z zastosowaniem kwasu siarkowego, jako dodatku do eluentu Table 6. Summary of the derived chromatographic parameters, obtained b y the analysis of mixture samples (myricetin and quercetin), with and without acid as additive to the eluent. Dodatek kwasu (Acid additive) Brak (Without) Kwas siarkowy (Sulphuric acid) Wzorzec (Standard) Kwercetyna (Quercetin) Mirycetyna (Myricetin) Kwercetyna (Quercetin) Mirycetyna (Myricetin) Liczba półek teoretycznych, N [-] (Number of theoretical plates, N [-]) Współczynnik asymetrii As0,1[-] (Asymmetry factor, As 0,1[-]) Współczynnik asymetrii As0,5[-] (Asymmetry factor, As 0,5[-]) Czas retencji, tr [min] (Retention time, t r [min]) Współczynnik retencji, k [-] (Retention factor, k [-]) ,70 2, ,63 3, ,61 1,01 5,91 1, ,48 1,20 10,05 3,03

38 38 Ze względu na znaczne rozmycie pików na chromatogramie uzyskanym z rozdzielania bez dodatku modyfikatora do eluentu, nie było możliwe precyzyjne obliczenie parametrów chromatograficznych (rys.5). Obecność kwasu siarkowego ma wpływ na poprawę symetrii pików i istotny wzrost liczby półek teoretycznych. Skrócenie czasu retencji w obecności kwasu w eluencie jest trudne do wyjaśnienia. Wyznaczone współczynniki asymetrii (As 0,1 ) dla składników mieszaniny zawierającej kwercetynę oraz mirycetynę (tabela 6) różnią się od wartości uzyskanych dla pojedynczych składników (tabela 4 i 5). Wynika to z zastosowania innego rodzaju kolumny, mianowicie kolumny typu RP18 bez endcappingu i konsekwencji możliwości występowania oddziaływań grup polarnych analiów z powierzchnią wypełnienia. Efektem jest ogonowanie pików i zwiększenie ich asymetryczności [27]. Dodatkowo, wpływ ma również większa objętość próbki wprowadzanej do zaworu dozującego (30 μl). Podobne różnice można także zauważyć w przypadku wartości czasu retencji badanych polifenoli, jednak porównując wartości współczynników retencji nie widać znaczących zmian. Uzyskane wartości współczynników retencji przy zastosowaniu różnych kwasów, jako modyfikatorów, pozwoliły również w sposób pośredni (na podstawie zestawienia par odpowiednich chromatogramów pojedynczych wzorców, rys. 3 i 4) wyznaczyć wartoś ci współczynników selektywności oraz rozdzielczości dla użytych w badaniach polifenoli. Rodzaj zastosowanego kwasu nie ma znaczącego wpływu na wartość tego parametru (tabela nr 7)., (5) gdzie: k 1 współczynnik rwetencji substancji eluującej wcześniej, [-] k 2 współczynnik retencji substancji eluującej później, [-], (6) gdzie: t r1 czas retencji substancji eluującej wcześniej, [min] t r2 czas retencji substancji eluującej później, [min] w b1 szerokość piku nr 1, mierzona u jego podstawy, [min] w b2 szerokość piku nr 2, mierzona u jego podstawy, [min] Tabela 7. Zestawienie wyznaczonych wartości współczynników selektywności rozdzielania chromatograficznego kwercetyny oraz mirycetyny, w zależności od zastosowanego modyfikatora eluentu. Tabele 7. Values of selectivity coefficients, obtained by the analysis of myricetin and quercetin mixture, with and without acid as additive to the eluent. Lp. Rodzaj kwasu (Type of acid) Współczynnik selektywności, α [-] (Selectivity coefficient, α [-]) Rozdzielczość pików, R [-] (Resolution of peaks, R [-]) 1 H3PO4 2,31 2,02 2 HCl 2,26 3,58 3 H2SO4 2,31 3,67 4 CH 3COOH 2,27 3,35 5 TFA 2,25 3,08 W tabeli 7 zestawiono także wyliczone parametry rozdzielczości pików, w zależności od rodzaju dodatku do eluentów. W każdym z przypadków osiągnięto wymagany stopień rozdzielenia pików: R > 1 [23]. Najniższą wartość parametru określającego rozdzielczość pików uzyskano w przypadku zastosowania kwasu fosforowego (R = 2,02) jako modyfikatora fazy ruchomej, natomiast najlepszy w przypadku kwasu siarkowego (R = 3,67). Dodatek w postaci kwasu solnego gwarantuje zbliżoną wartość parametru rozdzielczości do kwasu siarkowego. Jednak, należy ponadto zauważyć, że użycie HCl powoduje zmniejszenie liczby półek teoretycznych, N, (tabela 4 i 5).

39 39 4. Podsumowanie (Summary) Wyniki przeprowadzonych badań, wskazują, że zastosowanie modyfikatorów fazy ruchomej w postaci kwasów przy rozdzielaniu polifenoli z grupy flawonoidów, a także wielu innych organicznych związków chemicznych zdolnych do odszczepiania protonów w wodzie, jest konieczne w warunkach faz odwróconych (RP). Najlepsze wartości parametrów chromatograficznych, które mają wpływ na jakość rozdzielania substancji, uzyskano - w przypadku kwasów nieorganicznych - dla kwasu siarkowego (VI). Spośród kwasów organicznych kwas octowy (AcOH) okazał się bardziej korzystny od trifluorooctowego (TFA). Kwas octowy jest tylko nieco mniej korzystny pod względem wpływu na sprawność rozdzielania od kwasu siarkowego, natomiast, jego zaletą jest lotność oraz to, że nie jest to kwas mocny. Pomimo najbardziej korzystnych wyników otrzymanych przy zastosowaniu kwasu siarkowego (tj. pod względem symetrii pików oraz liczby półek teoretycznych), do wydzielania rozdzielanych polifenoli w skali preparatywnej, bardziej praktyczne może być użycie kwasu octowego. Jest on bardziej lotny, co umożliwia łatwiejsze usunięcie go z otrzymanych frakcji i jest nie jest mocnym kwasem, co zapewnia brak "destrukcyjnego" działania w warunkach podwyższonej zawartości w okresie wzbogacania frakcji eluatu. Results of this study indicate that the use of mobile phase modifiers, in the form of acids is necessary, when polyphenols (from the group of flavanoids) and many organic compounds capable to cleveage of protons in water under reversed phase (RP) conditions are separated. In the case of inorganic acids, the best values of chromatographic parameters (affecting the quality of the separation) were obtained with sulfuric acid (VI). Among the organic acids, the addition of acetic acid (AcOH) proved to be more advantageous than trifluoroacetic (TFA). Acetic acid, in comparison to the sulfuric acid, is less preferred in terms of its impact on the efficiency of separation. However, its advantage is volatility and the fact, that AcA is not a strong acid. Although the most favorable results obtained using sulfuric acid (i.e. symmetry of peaks, number of theoretical plates), separation and isolation in preparative scale of polyphenols, may be more practical with AcA. As mentioned above, acetic acid is more volatile, which makes it easier to remove from obtained fractions. Additionally, acetic acid is not a strong acid, which provides no destructive influence under its elevated content during enrichment of eluate fractions. Literatura (References) [1] B.A. Graf, P.E. Milbury, J.B. Blumberg, Flavonols, flavones, flavanones, and human health: Epidemiological evidence, Journal of Medicinal Food 8 (2005) 281 [2] D. Chen, S.B. Wan, H. Yang, J. Yuan, T.H. Chan, Q.P. Dou, Chapter 7 EGCG, green tea polyphenols and their synthetic analogs and prodrugs for human cancer prevention and treatment, Advances in Clinical Chemistry 53 (2011) 155 [3] I. Erlud, Review of the flavonoids quercetin, hesperetin, and narigenin. Dietary sources, bioactivities, bioavailability, and epidemiology, Nutrition Research 24 (2004) 851 [4] Y. Liu, P. Wang, F. Chen, Y. Yuan, Y. Zhu, H. Xan, X. Hu, Role of plant polyphenols in acrylamide formation and elimination, Food Chemistry 186 (2015) 46 [5] S. Gouveia, P.C. Castilho, Characterisation of phenolic acid derivatives and flavonoids from different morphological parts of Helichrysum obconicum by a RP -HPLC-DAD-(-)-ESI-MS n method, Food Chemistry 129 (2011) 333 [6] D. Romanova, D. Grancai, B. Jozova, P. Bozek, A. Vachalkova, Determination of apigenin in rat plasma by high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A 870 (2000) 463 [7] F.L. Vigni, C. Baschieri, A. Marchetti, M. Cocchi, RP-HPLC and chemometrics for wheat flour protein characterization in an industrial bread-making process monitoring context, Food Chemistry 139 (2013) 553 [8] F. Khuda, Z. Iqbal, Y. Shah, L. Ahmmad, F. Nasir, A.Z. Khan, Amanullah, N. Shahbaz, Method development and validation for simultaneous determination of lumefantrine and its major metabolite, desbutyl lumefantrine in human plasma using RP -HPLC/UV detection, Journal of Chromatography B 944 (2014) 114 [9] K.R. Naidu, U.N. Kale, M.S. Shingare, Stability indicating RP-HPLC method for simultaneous determination of amlodipine and benazepril hydrochloride from their combinationdrug product, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 39 (2005) 147

40 40 [10] R.I. El-Bagary, M.A. Fouad, M.A. El-Shal, E.H. Tolba, Forced degradation of mometasone furoate and development of two RP-HPLC methods for its determination with formoterol fumarate or salicylic acid, Arabian Journal of Chemistry (2015) doi: /j.arabjc [11] M. Gazdag, K. Mihalyfi, S. Gorog, Ion-pair RP-HPLC separation of thymopoietin fragments and related peptides, Analytica Chimica Acta 352 (1997) 231 [12] P. Pinelli, F. Agostini, C. Comino, S. Lanteri, E. Portis, A. Romani, Simultaneous quantification of caffeoyl esters and flavonoids in wild and cultivated cardoon leaves, Food Chemistry 105 (2007) 1695 [13] A. Bendini, M. Bonoli, L. Cerretani, B. Biguzzi, G. Lercker, T.G. Toschi, Liguid-liquid and solid-phase extractions of phenols from virgin olive oil and their separation by chromatographic and electrophoretic methods, Journal of Chromatography A 985 (2003) 425 [14] R. Filipa, P. Lopeza, G. Gibertib, J. Coussioa, G. Ferraroa, Phenolic compounds in seven South American Ilex species, Fitoterapia 72 (2001) 774 [15] M. Ding, H. Yang, S. Xiao, Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reve rsed-phase column liquid chromatography, Journal of Chromatography A 849 (1999) 637 [16] S. Magiera, Opracowanie metod oznaczania mieszanin wybranych związków polifenolowych, wybranych leków oraz ich metabolitów i ich aplikacje, rozprawa doktorska, Politechnika Rzeszowska, Gliwice 2012 [17] S. Magiera, I. Baranowska, A. Lautenszleger, UPLC-UV method for the determination of flavanoids in dietary supplements and for evaluation of their antioxidant activities, of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 102 (2015) 468 [18] E. Cienfuegos-Jovellanos, M. del Mar Quinones, B. Muguerza, L. Moulay, M.Miguel, A. Aleixandre, Antihypertensive effect of a polyphenol- rich cocoa powder industrially processed to preserve the original flavonoids of the cocoa beans, Journal of Agricultural Food Chemistry 57 (2009) 6156 [19] S. Zheng, Z. Ma, H. Han, J. Ye, R. Wang, S. Cai, H. Zhou, L. Yu, S. Zeng, H. Jiang, Post-column mobile phase adjustment: A strategy to eliminate the contradiction between liquid chromatography and mass spectrometry in the determination of flavonoids in rat plasma, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 95 (2014) 176 [20] A. Skrzypczak, M. Jaszczołt, A. Królicka, M. Kamiński, Techniki i metody chromatografii cieczowej w rozdzielaniu, oznaczaniu oraz izolowaniu nafto chinonów i flawonoidów z roślin, 3 (2011) 253 [21] M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, Opracowanie optymalnych warunków rozdzielania i identyfikacji metabolitów roślin z rodzaju droseraceae, z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej, 3 (2011) 283 [22] M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, Badania nad doborem najkorzystniejszego składu eluentu do rozdzielania metabolitów wtórnych z grupy naftochinonów i flawonoidów z zastosowaniem chromatografii planarnej w normalnym i odwróconym układzie faz, 3(2011) 14 [23] M. Kamiński, Chromatografia Cieczowa (praca zbiorowa), Centrum Doskonałości Analityki i Monitoringu Środowiskowego, Gdańsk 2004 [24] M. Shibue, C.T. Mant, R.S. Hodges, Effect of anionic ion-paring reagent concentration (1-60 mm) on reversed-phase liquid chromatography elution behavior of peptides, Journal of Chromatography A 1080 (2005) 58 [25] Y. Chen, A.R. Mehok, C.T. Mant, R.S. Hodges, Optimum concentration of trifluoroacetic acid for reversed-phase liquid chromatography of peptides revisited, Journal of Chromatography A, 1043 (2004) 9 [26] D.C. Guo, C.T. Mant, R.S. Hodges, Effects of ion-pairing reagents on the prediction of peptide retention in reversed-phase high-resolution liquid chromatography, Journal of Chromatography A 386 (1987) 205 [27] P. Novotna, V. Pacáková, Z. Bosáková, K. Štulìk, High-performance liquid chromatographic determination of some anthraquinone and naphthoquinone dyes occurring in historical textiles, Journal of Chromatography A, 863 (1999) 235

41 CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD* Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach ul. 3 Maja 54, Siedlce. *Autor do korespondencji, bkg@onet.eu O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Część I. Dobór warunków chromatograficznych. Streszczenie: Do oznaczania aktywności antyoksydacyjnej próbek spożywczych najczęściej stosowana jest metoda wykorzystująca rodnik 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowy (DPPH). Zmiany stężenia rodnika są w niej oznaczane fotometrycznie, przy 517 nm. Wadą tej metody jest interferencja zarówno przez zredukowaną postać rodnika jak i składniki badanej próbki absorbujące światło przy 517 nm. Dlatego, do oznaczania zmian stężenia rodnika DPPH zastosowano chromatografię cienkowarstwową. Celem pracy było rozdzielenie różnych form DPPH za pomocą TLC oraz zbadanie możliwości zastosowania tej techniki do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA). Słowa kluczowe: chromatografia cienkowarstwowa, TLC; 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl, DPPH; antyoksydanty; całkowity potencjał antyoksydacyjny, CPA. About the possibility of application of thin layer chromatography to the measurements of the total antioxidant potential. Part I. Chromatographic conditions. Abstract: The antioxidant activity of food samples usually is determined using the 1,1-diphenyl-2-pikrylohydrazyl radical (DPPH). Changes of the radical concentration are determined photometrically at 517 nm. The disadvantage of this method is the interference by the reduced form of radical as well as the sample components absorbing light at 517 nm. Therefore, changes in the DPPH concentration where measured using thin layer chromatography. The aim of the study was the separation of the different forms of DPPH using TLC and examine its applicability to the determination of the total antioxidant potential (TAP). Key words: thin layer chromatography, TLC; 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH; antioxidants; total antioxidant potential, TAP. 1. Wprowadzenie /Introduction/ Wolne rodniki są cząsteczkami, jonami, atomami lub grupami atomów posiadającymi na powłoce walencyjnej (lub na ostatnim orbitalu) jeden lub więcej niesparowanych elektronów, nadającym im właściwości paramagnetyczne. Niektóre z nich są wysoce reaktywne, niestabilne, dążą do przyłączania elektronów lub wodorów od otaczających ich cząsteczek, prowadząc do ich utleniania. Wiąże się to ze zmianą biochemicznych właściwości utlenionych cząsteczek. Wolne rodniki mają zdolność uszkadzania struktury błon komórkowych, lipidów, białek i kwasów nukleinowych w komórce. W konsekwencji może to doprowadzić do uszkodzenia funkcji życiowych komórek, tkanek organizmu i całego organizmu [1-3]. Rodniki odgrywają ważną rolę w wielu działach chemii, biologii, medycyny i są przedmiotem wielu badań związanych z problemami zdrowotnymi. Organizmy rozwinęły wiele mechanizmów obronnych, aby chronić się przed działaniami wolnych rodników. System obronny organizmów żywych przed wolnymi rodnikami można podzielić na trzy etapy: (i) zapobiegający ich wytwarzaniu (np. chelatory metali przejściowych - hemoglobina, laktoferyna), (ii) usuwający wolne rodniki (antyoksydanty lub zmiatacze wolnych rodników) oraz (iii) naprawiający uszkodzenia przez nie wywołane [4, 5]. Antyoksydanty są substancjami występującymi w stężeniach niskich w porównaniu ze składnikami utleniającymi i opóźniają bądź hamują utlenianie spowodowane przez wolne rodniki. Utrzymanie równowagi pomiędzy ilością wolnych rodników a antyoksydantami ma ogromne znaczenie dla zachowania zdrowia. Ekspozycja organizmu na działanie wolnych rodników określane jest mianem stresu oksydacyjnego. Intensywność stresu zależy od rodzaju i ilości wolnych rodników, sprawności organizmu i zasobu antyoksydantów istniejących w organizmie. Antyoksydanty tworzą barierę ochronną występują zarówno w części hydrofobowej jak i hydrofilowej (wodnej) znajduje się w cytoplazmie komórek i płynach pozakomórkowych [3, 6, 7].

42 42 Jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru sumarycznych właściwości antyoksydacyjnych, ze względu na prostotę, krótki czas analizy oraz stosunkowo wysoką dokładność i odtwarzalność wyników, jest metoda oparta o badanie stopnia przereagowania z próbką rodnika DPPH (1,1 -difenylo-2-pikrylohydrazylu). Wykorzystywana jest ona do pomiaru CPA (całkowitego potencjału antyoksydacyjnego) żywności, owoców, soków itp. Rodnik DPPH rozpuszcza się wyłącznie w rozpuszczalnikach organicznych, dlatego też metoda uniemożliwia oznaczenie antyoksydantów o charakterze hydrofilowym. Pomiar CPA polega na dodaniu do alkoholowego roztworu DPPH o barwie purpurowej, próbki zawierającej przeciwutleniacz, który redukuje rodnik do DPPH-H zabarwiony na żółto. Zmianę barwy roztworu mierzy się spektrofotometrycznie przy maksimum absorbancji nm. [8-10, 19]. W pracy przedyskutowano możliwość rozdzielania postaci utlenionej i zredukowanej rodnika DPPH za pomocą TLC. 2. Część Eksperymentalna /Experimental/ 2.1. Aparatura /Apparatus/ Pomiary chromatograficzne techniką TLC zostały wykonane przy użyciu komór chromatograficznych typu DS II D (Chromdes, Lublin) o wymiarach 10 x 5 cm i 20 x 20 cm oraz płytek szklanych pokrytych żelem krzemionkowym NP (Silicagel 60 i Silicagel 60 F 254S ) oraz płytek szklanych pokrytych żelem krzemionkowym modyfikowanymi grupami oktadecylowymi (RP-18WF 254S ) (Merck, Niemcy), 5 x 10 cm, grubość złoża 0,25 mm. Plamki zamieniono na chromatogramy za pomocą skanera HP Scanjet G210 oraz pakietu oprogramowania ScionImage oraz ImageJ [20] Odczynniki chemiczne /Chemicals/ Podczas badań wykorzystano następujące odczynniki: n-heksan cz.d.a., etanol cz.d.a 96,6 %,, 2- propanol cz.d.a., wodoroortofosforandisodu, diwodoroortofosforan sodu (Chempur, Piekary Śląskie, Polska), aceton cz.d.a (Stanlab, Lublin, Polska), metanol cz.d.a HPLC (Honeywell, Niemcy), dichlorometan HPLC, 33 % kwas solny cz.d.a., kwas galusowy (POCh, Gliwic e, Polska), acetonitryl Chromasolv, DPPH (Sigma - Aldrich, Niemcy). Wszystkie roztwory wodne wykorzystane w badaniach przygotowano stosując wodę trójkrotnie destylowaną z kwarcu. W pracy stosowano 1 mm metanolowy roztwór DPPH Możliwość zastosowania skanera biurowego w TLC /The ability to use office scanner in TLC/ W pracy zbadano możliwość zastosowania skanera biurowego do przekształcenia w formę cyfrową obrazu płytki chromatograficznej [20]. Płytki skanowane były z rozdzielczością 300 DPI w trybie milion a kolorów i zapisywane w formacie TIFF. Następnie wyniki były poddawane obróbce: konwersji do skali szarości, przycięciu skanowanej płytki i redukcji szumu za pomocą metody Savitzkyego-Golay a [11]. 3. Wyniki i dyskusja /Results and Discussion/ 3.1. Retencja rozpuszczalników /Retention of solvents/ Rozpuszczalniki możemy podzielić na polarne (np. woda, aceton) i niepolarne (np. heksan czy czterochlorek węgla). Niepolarne charakteryzują się niską stałą dialektryczną i momentem dipolowym. W chromatografii często stosowaną miarą polarności są współczynniki Hildebranda. Na R f wpływa polarność zarówno fazy ruchomej jak i próbki. W układzie faz prostych wzrost polarności rozpuszczalnika zwiększa R f [12, 13]. Składniki eluentów mogą być tak samo zatrzymywane na płytkach TLC jak inne (badane) związki. Zakłóca to pomiar chromatograficzny. Dlatego też we wstępnej fazie badań sprawdzono powinowactwa rozpuszczalników do fazy stacjonarnej. Na Rys. 1 i 2 oraz w Tabeli 1 pokazano odległości przebyte przez różne rozpuszczalniki w czasie 5 min oraz czasy potrzebne na przebycie całej płytki.

43 Rys. 1. Odległości przebyte przez różne rozpuszczalniki na płytce NP w czasie 5 min. Fig. 1. Distance completed by different solvents on the NP plate in 5 min. Rys. 2. Odległości przebyte przez różne rozpuszczalniki na płytce RP-18WF 254S w czasie 5 min. Fig. 2. Distance completed by different solvents on the RP-18WF 254S plate in 5 min. Tabela 1 Czasy, t [s], przebycia płytki przez rozpuszczalniki. Table 1 The migration times t [s], of plates by the solvents. Rozpuszczalniki Solvents NP t [s]/ time RP 2-propanol etanol heksan aceton dichlorometan metanol acetonitryl Okazało się, że zaobserwowano tę samą kolejność szybkości poruszania się rozpuszczalników wzdłuż obu płytek. Najpowolniejszy przepływ, około 22 min dla płytki NP i 33 min dla RP -18W, zaobserwowano dla 2-propanolu (Tabela 1). Acetonitryl i aceton migrują dosyć szybko przez płytkę RP-18W, około 4,5 minuty. Wyniki te wskazują na to, że może dojść do niekontrolowanego rozdzielenia substancji oznaczanej i pojawienia się innych plamek wskutek rozdzielania rozpuszczalników. Dlatego należy unikać mieszaniny wielu rozpuszczalników i dobierać proste fazy układy Rozdzielanie różnych postaci DPPH za pomocą chromatografii cienkowarstwowej /Separation of the different forms of DPPH by TLC/ Możliwość rozdzielenia różnych form DPPH zbadano stosując różne modyfikacje układu chromatograficznego (i) fazy stacjonarne (NP lub RP), (ii) fazy ruchome, (iii) temperaturę, (iv) nasycenie lub jego brak, komory, (v) krotność rozwijania oraz (vi) krotność niecałkowitego rozwijania. W Tabelach 2 (płytki NP) i 3 (płytki RP-18W) przedstawiono zależność współczynników retencji i opóźnienia różnych form rodnika DPPH od stężeń rozpuszczalników i współczynników Hildebranda faz ruchomych (Tabela 4).

44 44 Tabela 2. Wartości współczynników retencji (k) i opóźnienia (R f ) różnych form rodnika DPPH oraz stężeń rozpuszczalników i współczynników Hildebranda ( ) faz ruchomych w układzie faz normalnych. Table 2. The values of retention (k) and delay (R f ) coefficients of various forms of DPPH and concentrations of solvents, and the Hildebrand ( ) coefficients of mobile phases in the normal phase systems. Faza ruchoma Mobile phase Stężenie acetonu [%] R fdpph R fdpph-h k DPPH k DPPH-H heksan/aceton 14,52 7,6051 0,28 0,25 3,00 2,57 heksan/aceton 14,68 7,6087 0,36 0,31 2,23 1,78 heksan/aceton 14,82 7,6111 0,31 0,3 2,33 2,23 heksan/aceton 14,97 7,6139 0,24 0,21 3,76 3,17 heksan/aceton 15,11 7,6173 0,32 0,28 2,57 2,13 heksan/aceton 15,25 7,6213 0,39 0,34 1,94 1,56 heksan/aceton 15,97 7,6360 0,22 0,19 4,26 3,55 heksan/aceton 16,67 7,6469 0,24 0,205 3,88 3,17 heksan/aceton 17,36 7,6646 0,24 0,21 3,76 3,17 heksan/aceton 18,03 7,6786 0,17 0,145 5,90 4,88 heksan/aceton 18,69 7,6926 0,2 0,19 4,26 4,00 heksan/aceton 19,35 7,7027 0,32 0,28 2,57 2,13 heksan/aceton 20 7,7200 0,43 0,38 1,63 1,33 heksan/aceton 20,13 7,7224 0,31 0,27 2,70 2,23 heksan/aceton 20,26 7,7263 0,36 0,31 2,23 1,78 heksan/aceton 20,38 7,7280 0,28 0,26 2,85 2,57 heksan/aceton 20,51 7,7298 0,29 0,25 3,00 2,45 heksan/aceton 20,63 7,7329 0,34 0,3 2,33 1,94 heksan/aceton 24,81 7,8208 0,44 0,43 1,33 1,27 heksan/aceton 29,97 7,9294 0,52 0,49 1,04 0,92 heksan/aceton 34,98 8,0346 0,53 0,52 0,92 0,89 heksan/aceton 65,23 8, aceton 100 9,4000 0,96 0,99 0,04 0,01 heksan/aceton/ EtOH heksan/aceton/ EtOH 40 8,9200 0,98 0,98 0,02 0,02 35,71 8,4669 0,71 0,66 0,4 0,51 heksan/etoh 33,33 8,5991 0,8 0,8 0,25 0,25 2-propanol/ aceton/etoh 2-propanol/ aceton 27,78 9,1000 0,27 0,27 2,70 2,70 33,33 9,9323 0,24 0,24 3,17 3,17 2-propanol ,2000 0,89 0,89 0,12 0,12 acetonitryl/woda 11 12, acetonitryl/ MeOH 11 11, acetonitryl ,

45 45 Tabela 3. Wartości współczynników retencji (k) i opóźnienia (R f ) różnych form rodnika DPPH oraz stężeń rozpuszczalników i współczynników Hildebranda ( ) faz ruchomych w układzie faz odwróconych. Table 3. The values of retention (k) and delay (R f ) coefficients of various forms of DPPH and concentrations of solvents, and the Hildebrand ( ) coefficients of mobile phases in the reversed phase systems. Rozpuszczalniki Solvents Stężenie acetonu [%] R fdpph R fdpph-h k DPPH k DPPH-H heksan/aceton 14,68 7,6087 0,43 0,47 1,33 1,11 heksan/aceton 15,25 7,6213 0,34 0,39 1,96 1,57 heksan/aceton 15,40 7,6234 0,41 0,46 1,44 1,17 heksan/aceton 20,00 7,7200 0,5 0,55 2,17 1,81 heksan/aceton 20,26 7,7263 0,44 0,49 1,28 1,03 aceton 100 9, propanol ,2 0,86 0,86 0,16 0,16 acetonitryl ,8 0,95 0,98 0,05 0,02 Rozpuszczalniki Stężenie MeOH [%] R fdpph R fdpph-h k DPPH k DPPH-H acetonitryl/meoh 4,76 11,8524 0,95 0,99 0,05 0,01 acetonitryl/meoh 9,91 11,9089 0,96 0,99 0,04 0,01 acetonitryl/meoh 15,25 11,9683 0,96 0,98 0,04 0,02 acetonitryl/meoh 20,00 12,02 0,93 0,95 0,08 0,05 acetonitryl/meoh 33,33 12, ,95 0,96 0,05 0,04 MeOH ,9 0,91 0,94 0,1 0,07 Rozpuszczalniki Stężenie wody [%] R fdpph R fdpph-h k DPPH k DPPH-H MeOH/woda 1,96 13,0620 0,85 0,91 0,18 0,1 MeOH/woda 2,91 13,1430 0,86 0,9 0,16 0,11 MeOH/woda 3,85 13,2115 0,85 0,89 0,18 0,13 MeOH/woda 4,76 13, ,91 0,94 0,1 MeOH/woda 9,91 13,7019 0,83 0,87 0,2 0,15 MeOH/woda 13,04 13,9562 0,62 0,67 0,62 0,49 MeOH/woda 13,79 14,0169 0,61 0,66 0,64 0,51 MeOH/woda 14,53 14,0769 0,72 0,71 0,39 0,42 MeOH/woda 15,11 14,1239 0,65 0,69 0,54 0,45 MeOH/woda 15,25 14,1393 0,71 0,76 0,41 0,32 MeOH/woda 15,40 14,1474 0,65 0,7 0,54 0,43 MeOH/woda 15,54 14,1639 0,59 0,62 0,68 0,61 MeOH/woda 15,82 14,1814 0,66 0,7 0,51 0,43 MeOH/woda 15,97 14,196 0,63 0,69 0,59 0,45 MeOH/woda 16,67 14,2443 0,59 0,66 0,54 0,45 MeOH/woda 20,00 14,52 0,6 0,67 0,66 0,5 Rozpuszczalniki Stężenie wody [%] 0,07 R fdpph R f DPPH-H k DPPH k DPPH-H acetonitryl/woda 9,91 12,7108 0,92 0,95 0,08 0,05 acetonitryl/woda 14,38 13,1230 0,94 0,95 0,07 0,05 acetonitryl/woda 14,53 13,1368 0,85 0,95 0,18 0,05

46 46 acetonitryl/woda 14,68 13,1524 0,86 0,96 0,16 0,04 acetonitryl/woda 15,25 13,2076 0,94 0,96 0,07 0,04 acetonitryl/woda 31,03 14,6473 0,49 0,56 1,03 0,8 acetonitryl/woda 32,89 14,8259 0,4 0,45 0,9 1,22 acetonitryl/woda 33,33 14,8652 0,42 0,48 1,41 1,08 acetonitryl/woda 34,21 14,9473 0,53 0,42 0,9 1,36 acetonitryl/woda 35,48 15,0642 0,34 0,39 1,93 1,55 acetonitryl/woda 40,12 15,4910 0,26 0,34 2,78 1,96 Tabela 4. Wartości współczynnika Hildebranda czystych rozpuszczalników. Table 4. The values of Hildebrand parameters of pure solvents. Rozpuszczalnik /Solvent/ heksan aceton 2propanol etanol acetonitryl metanol woda 7,3 9,4 10,2 11,2 11,8 12,9 21 Dobierając rozpuszczalnik(i) o odpowiednim współczynniku Hildebranda można sterować retencją i selektywnością rozdzielania. Na Rys. 3 zostały przedstawione zależności współczynnika opóźnienia DPPH, R f, od współczynnika Hildebranda fazy ruchomej. Największe wartości R fdpph otrzymano dla współczynników Hildebranda równych ok y = x R² = R f y = 0,332x - 2,126 R² = 0,969 Rf heksan/aceton Rf ACN/MeOH ACN/MeOH/HOH y = -0,248x + 4,151 R² = 0, Rys. 3. Wpływ współczynnika Hildenbranda na wartości R f. Warunki chromatograficzne: płytka RP-18W, 20 C, wysycona komora. Fig. 3. The influence of Hildebrand parameter on R f values. Chromatographic conditions: plate - RP-18, temp C, chamber - saturated.

47 Dobór fazy ruchomej do rozdzielania dwóch form rodnika DPPH /Selection of the mobile for the separation of two forms of the DPPH radical/ Najlepsze rozdzielanie DPPH od DPPHH, zarówno na płytkach RP jak i NP, uzyskano dla mieszaniny dwuskładnikowej heksan aceton (80:20 v/v). Na płytkach RP zaobserwowano brak elucji (R f = 0) rodnika DPPH gdy fazą ruchomą był czysty heksan. Minimum retencji (R f = 1) i rozdzielenia z kolei otrzymano dla metanolu, acetonitrylu, acetonu, dichlorometanu oraz 2-propanolu. W przypadku mieszanin dwuskładnikowych takich jak metanol - woda od 5 do 10% wody następuje spadek współczynnika opóźnienia, od 0,9 do 0,8. Powyżej 20% wody plamka DPPH ulega całkowitemu rozmyciu. A zatem współczynnik opóźnienia maleje, wraz ze wzrostem stężenia rozpuszczalnika bardziej polarnego. Dodatek wody spowodował nieznaczne rozdzielenie dwóch form od siebie. Lepsze rozdzielenie otrzymano w układzie heksan aceton. Wraz ze wzrostem acetonu od 15-20% współczynnik opóźnienia wzrasta. Plamki pochodzące od obu form nie są do końca rozdzielone, ale obie barwy są bardzo wyraźne. Współczynnik opóźnienia mieści się w graniach 0,4-0,5. Stosowanie innych faz ruchomych, takich jak acetonitryl/woda czy acetonitryl/metanol nie poprawiało rozdzielania. Dodatek wody (10 do 15%) współczynnik opóźnienia. Wzrost zawartości wody powyżej 30% zmniejszał R f i zmieniał kolejność wymywania (DPPH-H > DPPH). Również na płytkach NP nie zaobserwowano elucji (R f = 0) dla heksanu. Dla acetonu, dichlorometanu, 2-propanolu, dichlorometanu/metanolu oraz dichlorometanu/etanolu zaobserwowano minimalną retencję (R f 1) DPPH. Najlepsze rozdzielenie otrzymano dla mieszaniny heksan/aceton (ok. 32% acetonu). Wzrost stężenia acetonu (powyżej 65%) likwiduje retencję (Rys. 4) R f c [%] Rys. 4. Zależność współczynnik opóźnienia (R f ) DPPH od stężenia acetonu. Warunki chromatograficzne: faza ruchoma aceton-woda, płytka - NP, temp C, komora - wysycona. Fig. 4. The dependence of delay factor (Rf) of DPPH on acetone concentration. Chromatographic conditions: mobile phase - acetone-water, plate - NP, temp C, chamber - saturated Rozdzielanie dwóch form rodnika DPPH za pomocą HPLC/UV /Separation of two forms of DPPH using HPLC/UV/ Do rozdzielania formy utlenionej od zredukowanej rodnika DPPH można zastosować wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Na rys. 5 przedstawiono chromatogram 1 mm DPPH po reakcji z kwasem galusowym (faza ruchoma - metanol/woda, 80:20, v/v) oraz skan płytki RP-18W rozwiniętej w mieszaninie heksan/aceton. Wynika z niego, że większą selektywnością charakteryzuje się HPLC niż TLC. Plamki TLC nie są dobrze rozdzielone. Dodatkowe piki/plamki spowodowane są przez zanieczyszczenia i/lub produkty utlenienia/redukcji DPPH.

48 mau Rozwijanie płytek /Developing of TLC plates/ Do najważniejszych metod rozwijania chromatogramów w TLC zaliczamy metodę mikrocyrkulacji, wstępującą, spływową (zstępującą), horyzontalną, dwukierunkową (2 D, dwuwymiarową), kołową [14, 15]. Dobór odpowiedniej techniki rozwijania w dużej mierze wpływa na retencję próbki. Do najczęściej stosowanych technik zalicza się stopniowe rozwijanie, rozwijanie wielokrotne, gradientowe, stref klinowych, poziome [16, 17]. Na Rys. 6 przedstawiono wielokrotne rozwijanie tej samej płytki NP za pomocą tego samego rozpuszczalnika. Okazało się, że technika ta jest nieskuteczna, nie uzyskano lepszego rozdzielenia DPPH (plamka fioletowa) od DPPH-H (plamka o barwie żółtej). To samo dotyczy rozwijania stopniowego i dwukierunkowego Retencja DPPH w komorze wysyconej i niewysyconej /Retention of DPPH in the saturated and unsaturated chamber/ Retencja próbki zależy od jej oddziaływania zarówno z fazą ruchomą jak i stacjonarną. Z kolei oddziaływanie składników obu tych faz zależy od stopnia wysycenia komory (zwilżenia fazy stacjonarnej). Duży wpływ na współczynnik retencji, k, ma stopień nasycenia komory parami rozpuszczalnika. Wykazano, że dla dwuskładnikowego rozpuszczalnika, heksan/aceton najlepiej jest zastosować płytkę w wysyconej komorze (rys. 7) min Rys. 5. HPLC chromatogram oraz skan płytki chromatograficznej TLC 1 mm DPPH po częściowej redukcji kwasem galusowym. Warunki chromatograficzne HPLC: kolumna - COSMOSIL 5 μm, 4,6 x 250 mm, 5C18 AR II (Waters), temp. - 5 o C, faza ruchoma - metanol/woda (80:20, v/v), szybkość przepływu - 1 ml/min, detektor - UV 517 nm. Warunki chromatograficzne TLC: płytka - RP-18W, obj. nastrzyku - 30 l, temp. - 5 o C, faza ruchoma - heksan/aceton (80:20% v/v), komora - wysycona. Fig. 5. HPLC chromatogram and scan of the TLC chromatographic plate of 1 mm DPPH after its partial reduction by gallic acid. Chromatographic conditions, HPLC: column - Cosmosil 5 mm, 4.6 x 250 mm, 5C18- AR-II (Waters), temp. - 5 C, mobile phase - methanol / water (80:20, v/v), flow rate - 1 ml/min., detector - UV 517 nm. Chromatographic conditions, TLC: plate - RP-18W, volume - 30 l, temp. - 5 C, mobile phase - hexane / acetone (80:20% v/v), chamber - saturated.

49 k 49 Rys. 6. TLC chromatogram 1 mm DPPH. Warunki chromatograficzne: płytka - NP, temp o C, faza ruchoma heksan/aceton (80:20% v/v), komora - wysycona. Fig. 6. TLC chromatogram of 1mM DPPH. Chromatographic conditions: plate - NP, temp o C, mobile phase hexane/acetone (80:20% v/v), chamber - saturated. 4 3 wysycona niewysycona k DPPH-H k DPPH Rys. 7. Zależność współczynnika retencji k utlenionej i zredukowanej formy rodnika DPPH od stanu wysycenia komory chromatograficznej. Fig. 7. The dependence of retention coefficient k of oxidized and reduced forms of DPPH on the state of saturation of the chromatographic chamber Wpływ temperatury na rozdzielenie dwóch form DPPH /Effect of temperature on the separation of the two forms of the DPPH radicals/ Temperatura wpływa na sprawność (zmniejszenie lepkości rozpuszczalnika), retencję i selektywność rozdzielania chromatograficznego. W Tabeli 5 przedstawiono zależność współczynnika retencji k od temperatury, w zakresie od 26 o C do +20 o C. Najwyższe współczynniki retencji otrzymano w -10 o C dla płytki RP-18W, zaś dla płytki NP w +5 o C. W trakcie trwania procesu chromatograficznego zmiana temperatury spowodowała wystąpienie różnych zmian w rozdzielczości i tempie migracji cząsteczek badanego związku.

50 50 Tabela 5. Wartość współczynnika retencji, k, oraz współczynnika selektywności, α, dla dwóch form rodnika DPPH na różnych płytkach w zależności od temperatury. Table 5.The retention, k, and selectivity, α, coefficients of two forms of DPPH radicals at different plates and temperatures. temperatura [ o C] RP k DPPH 1,35 1,41 1,52 3,12 2,50 1,28 k DPPH-H 1,16 1,19 1,28 2,50 2,03 1,03 α DPPH 1,16 1,19 1,19 1,25 1,23 1,24 NP k DPPH 2,32 3,60 2,69 2,79 5,48 3,33 k DPPH-H 2,00 2,91 2,22 2,32 4,04 2,79 α DPPH 1,16 1,24 1,21 1,20 1,36 1,19 Zależność współczynnika selektywności od temperatury opisuje równanie van t Hoffa: gdzie: α współczynnik selektywności, ΔΔH o, ΔΔS o zmiana entalpii i entropii procesu, k współczynnik retencji, R stała gazowa, T temperatura [K]. Brak liniowej zależności ln od 1/T sugeruje, że retencja DPPH nie jest opisana jednym mechanizmem oddziaływań. 4. Wnioski /Conclusions/ TLC można zastosować do rozdzielenia formy utlenionej rodnika DPPH od zredukowanej DPPH -H. Najkorzystniejsze warunki występują przy zastosowaniu dwuskładnikowej fazy ruchomej heksanu/acetonu (80:20% v/v) w układzie faz odwróconych. Temperatura ma wpływ na selektywność rozdzielania. W części 2 pracy przedstawiona zostanie możliwość zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA) różnych gatunków mięs. 5. Literatura /References/ [1] P. Socha, Zastosowanie zmiataczy wolnych rodników w leczeniu chorób przewodu pokarmowego i w leczeniu żywieniowym dzieci, Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie Dziecka, 3, 2, , [2] B.K. Głód, P. Piszcz, I. Kiersztyn, A. Lamert, P. Zarzycki, Zastosowanie HPLC do oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego, Postępy Chromatografii, Monografia nr 111, 41-66, wydawnictwo Akademia Podlaska, [3] V. Jakus, The role of free radicals, oxidative stress and antioxidant systems in diabetic vascular disease, BratislavskéLekárskeListy, 101, 10, , [4] E. Syweńki, M. Gryboś, Disease of Free Radicals, Chorobawolnychrodników, Advances in Clinical and Experimental Medicine, 14, 3, , [5] Ś. Ziemlański, M. Wartanowicz, Rola antyoksydantów żywieniowych w stanie zdrowia i choroby, Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie Dziecka, 1, 2/3, , 1999 [6] H. Puzanowska-Tarasiewicz, L. Kuźmicka, Tarasiewicz, Antyoksydanty a reaktywne formy tlenu, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 43, 1, 9-14, [7] A.R. Ndhlala, M. Moyo, J. V. Staden, Natural antioxidants: Fascinating or mythical biomolecules?, Molecules, 15, , [8] K. Mishra, H. Ojha, N. K. Chaudhury, Estimation of antiradical properties of antioxidants using DPPH assay: A critical review and results, Food Chemistry, 130, , [9] P. Molyneux, The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 26, 2, , 2004.

51 51 [10] P. Ionita, Is DPPH Stable Free Radical a Good Scavenger for Oxygen Active Species?, Chemical Papers, 59, 1, 11-15, [11] M. Zarzycka, Praca doktorska, Zastosowanie termostatowanej mikrochromatografii cienkowarstowej dla celów analizy farmaceutycznej, Zakład Toksykologii I Bioanalityki na Wy dziale Budownictwa i Inżynierii Środowiska Politechniki Koszalińskiej, Koszalin [12] J.C. Touchstone, J. C. Chen, K. M. Beaver, Improved separation of phospholipids In Thin Layer Chromatography, LIPIDS, 15, 1, 61-62, [13] Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, , Wydawnictwa Naukowo Techniczne, Warszawa [14] M.F. Striegel, J. Hill, Thiny-Layer Chromatography for Binding Media Analysis, The Getty Conservation Institute, Los Angeles, [15] L. Ciesla, M. Waksmundzka-Hajnos, Multidimensional and multimodal separations by HPTLC in phytochemistry, in High Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC), M.M. Srivastava, Ed., Springer, Berlin, Germany, 69-92, [16] J. Sherma, B. Fried, Handbook of Thin-Layer Chromatography, Marcel Dekker, Inc, New York, [17] R. Kocjan, Chemia analityczna. Podręcznik dla studentów. Analiza instrumentalna 2, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa [18] M. Kowalczyk, Praca doktorska, Cholany jako układy samoorganizujące się w technikach rozdzielczych, Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk, Warszawa [19] P.M. Wantusiak, P. Piszcz, M. Skwarek, B.K. Głód, Właściwości antyoksydacyjne miodów wyznaczone metodami chromatograficznymi,, 3, 2, , [20] B.K. Głód, P.M. Wantusiak, P. Piszcz, E. Lewczuk, P.K. Zarzycki, Application of micro-tlc to the total antioxidant potential (TAP) measurement. Food Chemistry, 173, , 2015.

52 CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp Judyta KOSIŃSKA 1, Grażyna GAŁĘZOWSKA 1,2, Sebastian ZALEWSKI 1, Marian KAMIŃSKI 1* 1 Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, ul, Narutowicza 11/12 2 Zakład Toksykologii Środowiska, Wydział Nauk o Zdrowiu z Oddziałem Pielęgniarstwa i Instytutem Medycyny Morskiej i Tropikalnej, Gdański Uniwersytet Medyczny, Gdańsk, ul. Dębowa 23 * Autor do korespondencji, markamin@pg.gda.pl Chromatografia cienkowarstwowa i technika TLC-FID w badaniach składu grupowego, szczególnie, tłuszczów i produktów ich konwersji Streszczenie: Praca dotyczy zbadania celowości stosowania oraz określenia korzystnych warunków wykorzystania "klasycznej" chromatografii cienkowarstwowej w normalnych układach faz (NP-TLC) oraz techniki chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo - jonizacyjną (TLC-FID) na pręcikach kwarcowych, jako technik zapewniających oznaczanie składu grupowego, w badaniach nad: - ustaleniem optymalnych warunków rozdzielania grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji z zastosowaniem kolumnowej chromatografii elucyjnej w warunkach normalnych układów faz (NP-HPLC), albo w warunkach kolumnowej chromatografii wykluczania z jednoczesną adsorpcją o charakterze oddziaływań polarnych (GPC/SEC-NP), - oceną składu grupowego, tzn. orientacyjnym oznaczaniem składu grupowego tego rodzaju produktów, - oceną składu frakcji eluatu, tzn. oceny czystości kolekcjonowanych składnik ów rozdzielanych techniką HPLC w skali semi-preparatywnej / preparatywnej. W niniejszej pracy zwrócono też uwagę na możliwość wykorzystania klasycznej techniki NP-TLC do wstępnych badań nad opanowaniem korzystnych warunków wykorzystania wysokosprawnej kol umnowej elucyjnej chromatografii cieczowej wykluczania sterycznego (GPC-SEC) i słabej adsorpcji o charakterze oddziaływań polarnych, w normalnych układach faz (NP), tzn., wykorzystywania w sposób optymalny warunków GPC-SEC-NP do grupowego rozdzielania w/w produktów. Badania dotyczyły również określenia optymalnych warunków stosowania techniki TLC -FID do określania składu grupowego na przykładzie rozdzielania i oznaczania zawartości składników niektórych tłuszczów i produktów ich konwersji, a także, obecności i zawartości grup składników w technicznym FAME, tzn., estrach metylowych kwasów tłuszczowych, jako pochodnym tłuszczów roślinnych bio-komponencie paliwowym, dodawanym do naftowego oleju napędowego do zasilania silników Diesla. Wnioski z badań i studiów niniejszej pracy dotyczą techniki NP-TLC lub NP-TLC-FID. Są też aktualne dla badań nad wykorzystaniem chromatografii kolumnowej wykluczania z jednoczesną adsorpcją GPC-SEC-NP do rozdzielania grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji, a także dla badań nad podobnymi warunkami rozdzielania innych złożonych mieszanin związków chemicznych, z wykorzystaniem adsorpcji w normalnych układach faz, lub jednocześnie wykluczania i słabej adsorpcji. Wyniki pokazują istotne korzyści ze stosowania techniki TLC, w "pilotowych" badaniach nad doborem korzystnych warunków wykorzystywania wysokosprawnej chromatografii cieczowej wykluczania z jednoczesną kontrolowaną niskoenergetyczną adsorpcją, zwłaszcza z zastosowaniem normalnych układów faz, tzn. warunków GPC-SEC-NP. Słowa kluczowe: chromatografia cienkowarstwowa w normalnych układach faz NP-TLC, chromatografia cienkowarstwowa z detekcją płomieniowo-jonizacyjną TLC-FID, rozdzielanie grupowe, tłuszcze i produkty ich konwersji, nielotne frakcje i produkty naftowe. Thin-layer chromatography and TLC-FID technique in studies concerning group composition of, especially, fats and products of their conversion Abstract: The work investigates a desirability of application and discusses determination of favorable conditions of "classic" normal phase thin-layer chromatography (NP-TLC) and thin layer chromatography with flame ionization detection (TLC-FID) on quartz rods as techniques enabling to determine group composition, in studies concerning: - determination of optimal conditions for group separation of fats and products of their conversion by means of normal - phase liquid chromatography (NP-HPLC) or size exclusion liquid chromatography with simultaneous adsorption of polar interactions character (GPC/SEC-NP), - evaluation of group composition, i.e. approximate determination of group composition of this type of products, - evaluation of eluate fraction composition, i.e. assessment of collected components purity, separated by HPLC in a semi-preparative/preparative scale. In submitted work an attention was paid to possibilities of using classic NP-TLC for preliminary studies to select favorable conditions applicable for high performance size exclusion liquid chromatography (GPC -SEC) and weak adsorption of a polar interactions character, in normal phase (NP) systems, i.e. applying the conditions of GPC -SEC-NP group separation of aforementioned products in optimal manner.

53 53 The research was also aimed to determine the optimal conditions of TLC-FID technique used to specify the group composition basing on an example of presence determination and separation of some fats components and products of their conversion, as well as, the presence and content of group components in a technical FAME, i.e. fatty acid methyl esters, as derivatives of vegetable fats bio-fuel component added to diesel fuel used in diesel engines. The conclusions of the research and studies concerns NP-TLC or NP-TLC-FID technigues. They are also valid for researches discussing the usage of high performance size exclusion chromatography with simultaneous adsorption GPC-SEC-NP for group separation of fats and products of their conversion, as well as, for researches based on similar separation conditions of other complex mixtures, using adsorption in normal phase systems, or simultaneously exclusion and weak adsorption. The results indicate significant benefits which arise from usage of TLC technique, in the "pilot" studies concerning the selection of favorable conditions for size exclusion high performance liquid chromatography with simultaneous and controlled low energy adsorption, especially by using the normal-phase, i.e. GPC-SEC-NP conditions. Key words: normal-phase thin-layer chromatography NP-TLC, thin-layer chromatography with flame ionization detection TLC-FID, group separation, fats and products of their conversion, non-volatile fractions and petroleum products. 1. Wprowadzenie (Introduction) Klasyczna chromatografia cienkowarstwowa (TLC, ang. Thin Layer Chromatography), będąca odmianą chromatografii planarnej, jest stosowana powszechnie od lat 30-tych XX-wieku. W ostatnich latach od czasu wprowadzenia tzw. skanerów, zwłaszcza typu UV-VIS DAD przeżywa kolejny "renesans". Chromatografia cienkowarstwowa posiada ogrom ną liczbę różnego rodzaju zastosowań rozdzielczych, w tym, w zastosowaniach mikro-preparawynych, a szczególnie, analitycznych m.in. w ochronie zdrowia, badaniach leków, żywności, wyciągów roślinnych, grzybowych, w różnych gałęziach gospodarki i innych, a także w badaniach naukowych [1 16]. Największa grupa zastosowań, jak to wynika z literatury, dotyczy analityki zawartości określonych związków chemicznych, albo grup związków chemicznych w rozdzielanych mieszaninach. Wyraźnie mniej aplikacji technika TLC znalazła w zastosowaniu wyłącznie do rozdzielania grupowego. W tym przypadku jest ona wykorzystywana przede wszystkim jako metodyka tzw. odcisku palca (ang. fingerprinting), w badaniach złożonych mieszanin wieloskładnikowych, o niskolotnych albo nielotnych składnikach, np. do identyfikacji niskolotnych produktów naftowych w monitoringu środowiska czy diagnozowaniu miejsc przecieków w instalacjach procesowych rafinerii ropy naftowej itp. [17]. Technikę TLC można również wykorzystać, jako narzędzie do identyfikacji źródeł skażenia środowiska. Z jej pomocą możemy np. szybko odróżniać skażenie środowiska niskolotnymi produktami pochodzenia naftowego od powęglowych, czy spożywczych, lub o innym charakterze [18, 19]. Innym niezwykle ważnym obszarem zastosowań techniki chromatografii cienkowarstwowej, NP-TLC oraz RP-TLC, jest łatwe oraz względnie mało kosztowne uzyskanie informacji o korzystnych warunkach rozdzielania określonych mieszanin z zastosowaniem HPLC [20 26]. Technika TLC jest wykorzystywana tutaj: - do szybkiego "szacowania" składu złożonych mieszanin, zwłaszcza składu grupowego, a także zawartości określonych składników / grup składników w różnego typu mieszaninach. W pracy doktorskiej J. Gudebskiej [27] technika TLC była wykorzystywana m. in. w celu ko ntroli składu grupowego eluatu, a tym samym, w celu identyfikacji jakościowej grup związków, znajdujących się we frakcjach odbieranych z kolumny według zmodyfikowanej normy PN-72/C [28]. - w badaniach nad wstępnym doborem optymalnych warunków rozdzielania techniką HPLC/UPC, tzn., rodzaju fazy stacjonarnej, fazy ruchomej, czy doboru odpowiedniego składu eluentu w izokratycznych warunkach rozdzielania, a także do optymalizacji przygotowania próbki/wsadu do rozdzielania. Na rysunku 1 przedstawiono schematyczne porównanie stopnia rozdzielenia poszczególnych grup składników dla oleju bazowego SAE30 (parafiny nie widoczne w świetle ultrafioletowym, fluoryzujące pod wpływem światła o długości fali 365 nm monoaromaty jednopierścieniowe, podstawione alifatycznie/alicyklicznie węglowodory aromatyczne jasnofioletowa plamka w górnej części płytki, di aromaty pasmo intensywnie fioletowe pośrodku płytki, poliaromaty skupione powyżej plamki nałożonej i żywice plamka fioletowo-brązowa pozostająca na starcie), przy zastosowaniu warunków elucyjnego rozdzielania techniką sorpcji -desorpcji z elucją stopniową w kolumnie szklanej z żelem krzemionkowym jak w metodzie PN -72/C-04025, oraz po jej zmodyfikowaniu [27]. - potencjalnie może być wykorzystywana przy doborze i opracowaniu optymalnych warunków realizacji procedur wielokolumnowego (multi column - NC) i wielowymiarowego (multidimensional - nd) rozdzielania skomplikowanych mieszanin, szczególnie z elucją izokratyczną.

54 54 λ = 254 nm 1 2 Czoło eluentu (nc 6 /nc 7 ) Węglowodory nasycone (Saturates) Niedostateczne rozdzielenie (Incomplete separation) Jednopierścieniowe węglowodory aromatyczne (mono-aromatics) Dwupierścieniowe węglowodory aromatyczne (di-aromatics) Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (di-aromatics) Żywice (Resins) Start Rys. 1. Chromatogramy NP-TLC frakcji odebranych z kolumny chromatograficznej według PN-72/C (1) i zmodyfikowanej PN-72/C04025 (2) dla oleju bazowego SAE 30. Faza stacjonarna żel krzemionowy. Faza ruchoma n-heksan (nc 6 ) [27]. Fig.1. NP-TLC chromatograms of fractions collected from column chromatography according to PN-72/ C (1) and modified PN-72/C04025 (2) for SAE 30 base oil. Stationary phase silica gel. Mobile phase n-hexane (nc 6 ) [27]. Technika TLC może być również pom ocna do wstępnego doboru korzystnych warunków z elucją gradientową, chociaż w tym przypadku korzyści z jej stosowania są znacznie mniejsze. Szczególnie istotne znaczenie ma też informacja o tym, czy wszystkie nielotne i niskolotne składniki rozdzielanej mieszaniny są eluowane z kolumny z wykorzystaniem eluentu o określonym składzie oraz sile elucyjnej, w tym, o składzie odpowiadającym końcowemu składowi eluentu w warunkach elucji gradientowej. Z wykorzystaniem TLC można też uzyskać informacje o nierozpuszc zalności bądź bardzo niskiej rozpuszczalności określonych składników w eluencie. Jeżeli mimo kilkukrotnej elucji eluentem o określonym składzie na starcie pozostaje plamka składników mieszaniny, która zupełnie nie poruszyła się, wówczas: - ma miejsce tak wysoko energetyczna adsorpcja, która powinna zostać uznana za chemisorpcję [19], albo, - ma miejsce całkowity brak rozpuszczalności określonych składników rozdzielanej mieszaniny w zastosowanym eluencie [19]. Mieszanina taka, wprowadzona do kolumny, spowoduje wyraźne przytkanie/zatkanie kolumny, a w rezultacie wytrącenia się nierozpuszczalnych składników, albo dezaktywację części/całej powierzchni sorpcyjnej kolumny, pod wpływem trwałej sorpcji bardzo silnie sorbowanych składników rozdzielanej mieszaniny. Składniki takie nie będą desorbowane nawet przez zastosowanie eluentu o najwyższej sile elucyjnej, zarówno w warunkach zwykłego przepływu eluentu w kolumnie (NF), jak i w warunkach zwrotnego przepływu eluentu w kolumnie (EBF) [19]. Obecnie technika TLC-FID, swoje zastosowanie znajduje główne w rozdzielaniu grupowym i badaniu składu grupowego wieloskładnikowych, rozpuszczalnych w eluencie, niskolotnych lub nielotnych materiałów organicznych, w ich analityce technicznej oraz kontroli jakości. Służy głów nie do szacunkowego badania składu grupowego w/w produktów/materiałów, w tym tłuszczów i produktów ich konwersji [29 34]. W badaniach "lipidów", w tym tłuszczów i ich pochodnych, wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej [35 41] ma miejsce zarówno w sposób tradycyjny, tzn. w normalnych układach faz (NP- TLC), jak i jednak znacznie rzadziej z zastosowaniem w sposób nietypowy odwróconych układów faz (RP). W normalnych układach faz stosowane są nadal naturalne adsorbenty, głównie żel krzemionkowy, ale też chociaż znacznie rzadziej tlenek glinu, krzemian magnezu, ziemia okrzemkowa oraz bezwodne, nisko i średnio polarne, jedno lub kilku składnikowe, eluenty. W ostatnich latach coraz szersze zastosowanie także w TLC znajdują adsorbenty typu NP, o grupach funkcyjnych związanych wiązaniami

55 55 siloksanowymi, na powierzchni porów żelu krzemionkowego. Są to sorbenty typu DIOL, NH2, CN, AMID, SCX, SAX, o grupach funkcyjnych odpowiednio: alkilo-, lub arylo- diol, amina, nitryl, amid, kwas sulfonowy, czy zasada amoniowa i inne, np. cyklodekstryny, kwas holowy, acetylocholina i inne w zasadniczej większości związane na powierzchni porów wewnątrz-ziarnowych. W podobny sposób wykorzystuje się również fazy stacjonarne do odwróconych układów faz (RP -TLC). Przy czym, raczej wyłącznie o fazie stacjonarnej typu C18 (oktadekan związany wiązaniem siloksanowym na powierzchni żelu krzemionkowego). Niekiedy też z wykorzystaniem faz stacjonarnych typu CN zastosowanych z bezwodnym, nisko- i średnio-polarnym eluentem. Jak dotychczas, bardzo rzadko prowadzi się tego rodzaju badania z wykorzystaniem TLC i grup funkcyjnych typu C8, lub PHENYL i innych, związanych z żelem krzemionkowym. W związku ze szczególnie wysoką hydrofobowością tłuszczów i części produktów ich konwersji szczególnie triacylogliceroli (TAG) oraz różnego rodzaju estrów kwasów tłuszczowych, czy esterów steroli, a w konsekwencji brakiem ich rozpuszczalności w polarnych rozpuszczalnikach organicznych, mających nawet niewielkie zawartości wody, a także w wodzie, w warunkach rozdzielania z wykorzystaniem sorbentów do RP-TLC, nie stosuje się jakiegokolwiek dodatku wody do eluentu, tak podczas rozdzielania jednoetapowego, jak i w pierwszym etapie rozdzielania kilkuetapowego. W takim przypadku składnikami eluentu są: acetonitryl (AcCN), bezwodny metanol (MeOH) (rzadziej bezwodny etanol, który jest higroskopijny) czy izopropanol (IzOH), aceton (ACT), dichlorometan (DCM), dichloroetan (DCE), chloroform, etery, albo ich mieszaniny. Jest oczywiste, że w warunkach normalnych układów faz (NP), podwyższanie polarności eluentu, powoduje wzrost jego siły elucyjnej, a podwyższanie polarności fazy stacjonarnej, powoduje wzrost energii oddziaływań składników układu rozdzielczego z powierzchnia sorpcyjną fazy stacjonarnej. Natomiast, zastosowanie faz stacjonarnych do chromatografii faz odwróconych z bezwodnym eluentem, jest przyczyną innych oddziaływań tak na powierzchni fazy stacjonarnej, jak i w przestrzeni eluentu, niż w warunkach, gdy eluent zawiera wodę. Znacznie większą rolę odgrywają wówczas oddziaływania kwadrupolowe oraz dyspersyjne, niż ma to miejsce w obecności wody w eluencie. Wówczas, gdy rozdzielana mieszanina zawiera oprócz składników lipofilowych głównie triacylogliceroli (TAG), czy "karotenów", "poliacetylenów", "izoprenoidów", lub tokoferoli itp. składników też składniki polarne, np. glicerynę, monoacyloglicerole i względnie polarne, jak, wolne kwasy tłuszczowe, czy diacyloglicerole, lub polifenole, karotenoidy, albo sterole wówczas w TLC, zarówno w normalnych (NP), jak i odwróconych (RP) układach faz, stosuje się wielo- (dwu, lub trójstopniowe) rozdzielanie [17] albo rozdzielanie dwuwymiarowe [42 45]. Przykłady rozdzielania trójstopniowego, w przypadku rozdzielania nielotnych produktów naftowych, przedstawiono na rysunku 2. Rys. 2. Fotografie chromatogramów TLC po 3-stopniowej elucji w kierunku malejącej siły elucyjnej eluentu: eluent 1 dichlorometan:metanol 95:5 (v/v) 3,5 cm, eluent 2 toluen 5,5 cm, eluent 3 heksan 9 cm, wizualizacja: a) λ = 254 nm, b) λ = 366 nm; próbki: SAE30 olej bazowy SAE30; BS olej bazowy Bright Stock; CON ciężki olej napędowy; OO olej opałowy; PA pozostałość atmosferyczna; PP pozostałość próżniowa; Jet paliwo turboodrzutowych silników lotniczych; LOTOS olej smarowy mineralny LOTOS [17]. Fig. 2. Photographs of TLC chromatograms after 3-step elution carried out towards decreasing elution strength: eluent 1 dichloromethane:methanol 95:5 (v/v) 3.5 cm, eluent 2 toluene 5.5 cm, eluent 3 hexane 9 cm, visualization: a) λ = 254 nm, b) λ = 366 nm; samples: SAE30 base oil SAE30; BS base oil BrightStock; CON heavy fuel oil; OO heating oil; PA atmospheric residue; PP vacuum residue; Jet aircraft fuel; LOTOS mineral oil LOTOS [17]. Rozdzielanie wielostopniowe może odbywać się na dwa sposoby, zależnie od charakteru rozpuszczalności składników rozdzielanej mieszaniny w eluentach stosowanych w kolejnych etapach elucji, podobnie jak to opracował swego czasu autor i współpracownicy dla rozdzielania grupowego tzw. pozostałości próżniowych z destylacji ropy naftowej, asfaltów, czy tzw. "smół powęglowych" [19]. Postępuje się z zasady w ten sposób, by pierwszym eluentem był taki, w którym wszystkie składniki /grupy składników

56 56 rozdzielanej mieszaniny dobrze się rozpuszczają. Np. w przypadku mieszaniny zawierającej TAG'i, DAG'i, MAG'i, WKT oraz glicerynę, szczególnie, gdy zawartość dwóch ostatnich grup składników nie jest śladowa, to pierwszym eluentem powinien być eluent, w którym wszystkie w/w grupy składników się rozpuszczają, tzn., np. tetrahydrofuran (THF), dioksan, aceton, butanon (MEK metylo-etylo-keton), czy etoksyetanol itp. lub mieszanina tych składników z nisko polarnym składnikiem eluentu, np. z dichlorometanem, chloroformem, eterem di-etylowym (Et-O-Et), eterem metylowo-tertbutylowym (MTBE), etrem etylowotertbutylowym (ETBE), n-heksanem (nc 6 ), octanem etylu itp. składnikami eluentu. W przypadku gdy stosowany eluent ma niską siłę elucyjną w konkretnych, zastosowanych warunkach rozdzielania, to elucję wykonuje się na prawie całą wysokość płytki TLC, albo pręcika TLC -FID. Natomiast, w przypadku zastosowania eluentu o wysokiej sile elucyjnej elucję wykonuje się na 1/3 do 2/3 wysokość płytki TLC / pręcika TLC-FID. Tzn., elucję wykonuje się na tym niższą wysokość płytki, im większą siłę elucyjną posiada eluent, będący dobrym rozpuszczalnikiem wszystkich składników rozdzielanej mieszaniny. W kolejnych etapach elucji stosuje się eluenty o odpowiednio: wyższej, albo niższej sile elucyjnej, niekoniecznie będące dobrymi rozpuszczalnikami wszystkich składników / grup składników rozdzielanej mieszaniny oraz elucję na o tyle wyższym dystansie, na płytce TLC, im niższa jest siła elucyjna zastosowanego eluentu. Należy jednak pamiętać, że w technice TLC nigdy nie może być stosowany eluent, w którym jakiś składnik mieszaniny zupełnie się nie rozpuszcza! Dla porządku, należy też wspomnieć o potencjalnej możliwości wykorzystywania warunków oddziaływań hydrofilowych (HILIC) w chromatografii cienkowarstwowej TLC-HILIC. Warunki te, znajdują jednak zastosowanie tylko do rozdzielania polarnych składników / grup składników o względnie dobrej rozpuszczalności w wodzie. W przypadku składników tłuszczów i produktów ich konwersji dobrze rozpuszcza się w wodzie tylko gliceryna. W związku z czym, warunki HILIC nie mają zastosowania w rozdzielaniu tłuszczów i produktów ich konwersji, tak w warunkach TLC, jak i HPLC lub UPLC. W chromatografii adsorpcyjnej na retencję i selektywność rozdzielania ma wpływ temperatura. Jednakże, szczególnie w normalnych układach faz z bezwodnymi eluentami, ale też i z hydrofobowymi fazami stacjonarnymi, gdy eluent nie zawiera wody, na retencję i selektywność rozdzielania ma wpływ aktywność powierzchni sorpcyjnej adsorbentu, a także stopień nasycenia komory TLC oparami eluentu i stopień równowagi na/w bezpośrednim sąsiedztwie powierzchni sorpcyjnej między warstwą adsorbatu a oparami eluentu. W konsekwencji, w bezwodnych warunkach układów faz normalnych, a także w warunkach hydrofobowych faz stacjonarnych tak, z bezwodnymi, jednoskładnikowymi, jak i z wieloskładnikowymi, eluentami bezpośrednie przenoszenie optymalnych warunków oraz otrzymywanych wówczas parametrów retencji (k) i selektywności ( ) podczas rozdzielania TLC do chromatografii kolumnowej (HPLC), nie prowadzi do identycznych wartości współczynnika retencji (k). Ogólnie można stwierdzić, że określony eluent nawet jednoskładnikowy ma zawsze niższą, czasem tylko niewiele niższą, siłę elucyjną w warunkach NP-TLC, niż w warunkach NP-HPLC [19,26]. Niektórzy badacze donoszą, że w przypadku gdy wartość współczynnika retencji (k) obliczona na podstawie R f z zależności (1), wynosi k TLC : k TLC = (1-R f )/R f (1) gdzie R f, to współczynnik retencji w chromatografii cienkowarstwowej, obliczany jako stosunek drogi migracji środka plamki/pasma wzdłuż płytki TLC, do drogi migracji czoła eluentu wyznaczany dla jednostopniowej elucji w TLC, to: k HPLC = a k TLC (2) gdzie: a Є < 1 ; 1/2 > (3) czyli, wartość k określonego składnika / grupy eluowanych składników, dla warunków NP HPLC może być nawet dwukrotnie niższa, niż w warunkach TLC [25]. Wynika to z okoliczności, że w warunkach NP -TLC, eluent nie znajduje się w równowadze z powierzchnią sorpcyjną fazy stacjonarnej (zróżnicowane wartości tzw. stopnia nasycenia komory TLC parami składników eluentu), gdy równowaga taka, tzn., miedzy składnikami eluentu, powierzchnią fazy stacjinarnej kolumny - w warunkach chromatografii kolumnowej i elucji izokratycznej ze stałym składem eluentu - ma miejsce. Dodatkowo, duży wpływ na to ma adsorpcja wody na powierzchni sorpcyjnej płytek, a jej ilość jest różna, w różnych warunkach prowadzenia badań (zależna od wilgotności względnej powietrza), co za tym idzie, może nastąpić częściowa dezaktywacja fazy stacjonarnej [26]. W przypadku bezwodnych eluentów i hydrofobowych faz stacjonarnych, także ma miejsce podobna reguła, z tym że, dla względnie wysoce hydrofobowych "analitów", różnice wartości k TLC i k HPLC są bardzo niewielkie. Przyczyną tego jest mniejszy wpływ warunków rozdzielenia na właściwości sorpcyjne fazy stacjonarnej w przypadku rozdzielania substancji średnio i nisko polarnych [26]. W warunkach TLC może też mieć miejsce tzw. efekt demiksji. Zjawisko to obserwujemy gdy składniki, dwu- lub wieloskładnikowego eluentu, różnią się znacznie siłą elucyjną. Dodatkowo, istotne znaczenie ma też jednoczesna różnica lepkości poszczególnych składników eluentów. Następuje powstawanie tzw. frontu demiksji, tzn. granicy frontu elucji eluentu bogatego w składnik o wyraźnie wyższej sile elucyjnej, często o dodatkowo wyższej lepkości i napięciu powierzchniowym. Wówczas wyniki rozdzielania w układach rozdzielczych TLC, szczególnie NP-TLC, mogą mieć tylko orientacyjne znaczenie dla przewidywani a rozdzielania w NP-HPLC.

57 57 Warto też zwrócić uwagę na korzyści, ale także niedogodności, techniki cienkowarstwowej chromatografii cieczowej z detekcją płomieniowo -jonizacyjną TLC-FID, tzn., odmiany chromatografii cienkowarstwowej (TLC), z zastosowaniem kwarcowych pręcików pokrytych mikro-ziarnistą, specjalnie spreparowaną fazą stacjonarną z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (FID). Jest to technika umożliwiająca otrzymanie jedno- lub kilkustopniowego rozdzielenia w/g zasady chromatografii cienkowarstwowej, a następnie "ilościowych" rezultatów oznaczenia zawartości organicznych niskolotnych składników i grup składników badanej mieszaniny w formie pików chromatograficznych, dzięki przeprowadzeniu wysuszonego pręcika TLC z rozdzielonymi frakcjami składników rozdzielanej mieszaniny "immobilizowanych" na powierzchni sorpcyjnej, przez płomień powietrzno-wodorowy wewnątrz głowicy detekcyjnej detektora płomieniowo-jonizacyjnego FID [42, 46 48]. Schemat ideowy zasady działania i detekcji systemu TLC-FID zamieszczono na rysunku 3. Należy mieć świadomość, że uzyskanie zadowalającej precyzji oznaczania składu mieszanin związków organicznych techniką TLC-FID, wymaga bardzo starannej powtarzalności wykonania wszystkich etapów badania oraz znacznej wprawy operatora. Mimo to, oznaczenia są wielokrotnie mniej dokładne i znacznie mniej precyzyjne, niż ma to miejsce w chromatografii gazowej z detekcją płomieniowo -jonizacyjną (GC-FID) [49]. Wynika to z okoliczności wprowadzania do płomienia detektora TLC-FID składników badanej mieszaniny, znajdujących się na powierzchni fazy stacjonarnej w postaci stałej, ewentualnie ciekłej, a nie jak w technice GC-FID, w postaci oparów w gazie nośnym. W przypadku GC-FID, sygnał detekcyjny w postaci prądu elektrycznego spowodowanego przez strumień karbokationów CH 2 + powstaje natychmiast w przestrzeni detekcyjnej. W detektorze typu TLC-FID musi najpierw nastąpić odparowanie "analitu" z powierzchni sorpcyjnej, jego piroliza (w części spalanie), a kolejno dopiero wytworzenie w/w karbokationów. Przy typowej prędkości przemieszczania pręcika wynoszącej ok. 2 mm/sek, prowadzi to do uzyskiwania wielokrotnie niższej czułości detektora TLC-FID, niż GC-FID. W konsekwencji badanie składu mieszanin techniką TLC-FID może dotyczyć tylko składników występujących w badanej mieszaninie na względnie wysokim poziomie zwartości, a granica oznaczalności (LOQ) wynosi orientacyjnie od 0.05 % m/m, do ok 0.5 % m/m. Jest tym niższa, im większa jest prędkość ruchu pręcika przez płomień. Rys. 3. Schemat stanowiska pomiarowego TLC-FID Iatroscan i procedury postępowania w czasie oznaczania składu grupowego tą metodą. Fig. 3. The scheme of TLC-FID Iatroscan measurement site and procedures applied while determining the group composition by this method. Badanie składu mieszanin związków organicznych techniką klasycznej chromatografii TLC z fotometrycznym oznaczaniem intensywności plamek jest, jednakże, bardziej utrudnione, często też jeszcze mniej dokładne i mniej precyzyjne, niż techniką TLC-FID. Przede wszystkim jednak, w warunkach wykonywania oznaczeń z zastosowaniem "klasycznej" TLC, nie można wykorzystać metodyki "prostej normalizacji", jaką często stosuje się w TLC-FID.

58 58 W technice klasycznej chromatografii cienkowarstwowej (TLC) - w przypadku gdy anality nie wykazują barwy w świetle widzialnym - mamy do dyspozycji kilka metod wizualizacji plamek/pasm na powierzchni płytek, dzięki czemu można wykonać analizę obrazu i na podstawie jej wyników, wykonać oznaczenie masy / stężenia analitu / analitów. Są to: 1. Oświetlanie powierzchni płytek za pomocą lampy emitującej promieniowanie UV 365 nm (koniecznie w okularach ochronnych, absorbujących całkowicie światło w zakresie UV!). W takim przypadku widoczna jest fluorescencja wzbudzona przez światło 365 nm, widoczna w zakresie widzialny m tych składników rozdzielanej mieszaniny, które zjawisko fluorescencji wykazują w sposób naturalny. Jest to metoda wizualizacji o szczególnie wysokiej czułości. 2. Wykorzystanie płytek "F 254 ", lub "F " z trwale obecnym w bardzo niewielkich ilościach, immobilizowanym na powierzchni sorpcyjnej płytki TLC luminoforem, którym często bywa siarczek cynku (ZnS), lub innego rodzaju fluoresceina. Nie ma ona, jednocześnie, wpływu na retencję i selektywność rozdzielania. Luminofor, pod wpływem odpowiedniego rodzaju światła UV, zapewnia powstawanie białej, zielonkawej, żółtawej, albo innej barwy luminescencji powierzchni sorpcyjnej płytki TLC, w zakresie światła widzialnego. Płytka TLC umieszczona po rozwinięciu i wysuszeniu, w świetle odpowiedniego rodzaj u lampy UV ("niskociśnieniowej" głównie 254 nm lub "średnio-ciśnieniowej" głównie 280 i 365 nm) pokazuje obraz obecności plamek tych składników rozdzielanej mieszaniny, które absorbują odpowiednie światło UV w formie "szarości" o zróżnicowanej intensywności proporcjonalnej do masy/zawartości badanego składnika w obrębie plamki. Nie jest to sposób o wysokiej czułości, jednak stosunkowo uniwersalny, gdyż bardzo wiele organicznych związków chemicznych posiada struktury molekularne absorbujące światło UV o długości fali 254 nm. Niektóre, także 365 nm. 3. Jedną ze stosowanych metod wizualizacji w TLC, jest chemiczne wywoływanie barwy plamek, w zakresie światła widzialnego. Należy wyróżnić dwie odrębne metodyki: a) Wywoływanie "uniwersalne", ale o niezbyt wysokiej czułości i o nie najlepszej powtarzalności rezultatów "ilościowych", tzn., - Wywoływanie brązowej / żółto-brązowej barwy plamek w oparach jodu (I 2 ) rysunek 4, - Wywoływanie zaczernienia, albo zszarzenia plamek składników mieszaniny na płytce poprzez spryskanie jej powierzchni przy pomocy nebulizera, mgłą stężonego kwasu siarkowego H 2 SO 4. Uniwersalność w/w metodyk jest jednak ograniczona. Sprowadza się do wywoływania barwy plamek tylko organicznych związków chemicznych, jednak nie węglowodorów nas yconych (alkanów i cykloalkanów), a w przypadku olefin, posiadających jedynie pojedyncze wiązania podwójne, czułość jest bardzo niewielka. Barwę łańcuchów alifatycznych, albo cykloalifatycznych, można wywołać poprzez spryskiwanie wysuszonej płytki TLC, roztworem siarczanu berberyny [50], jednak i w tym przypadku czułość jest bardzo mała. Rys. 4. Przykład chromatogramów uzyskanych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, TLC. Fotografie płytek TLC: po lewej Si 60 F 254, po prawej RP 18 F 254. Eluent: THF. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. 1- TAG, 2-DAG, 3-MAG, 4-WKT, 5-olej rzepakowy. Próbki 1-3 oleiniany, próbka 4 kwas erukowy. Stężenie wszystkich próbek wynosiło 10 mg/ml, na płytkę TLC nanoszono po 5 µl każdej z próbek [51]. Fig. 4. Examplary chromatograms obtained by means of thin layer chromatography, TLC. Photographs of TLC plates: on the left Si 60 F 254, on the right RP 18 F 254. Eluent: THF. Meaning of lines: a solid line - spots visible at 254 nm, brown spots - spots visible after development in iodine vapor. 1-TAG, 2-DAG, 3-MAG, 4- WK, 5-rapeseed oil. Samples 1-3 oleates, sample 4 - erucic acid. Concentration of all samples was equal 10 mg/ml, on the TLC plate was applied 5 µl of each sample [51].

59 59 b) "Specyficzne" metodyki wywoływania barwy określonych grup związków chemicznych, albo jonów, tak organicznych, jak i nieorganicznych o określonych grupach funkcyjnych lub jonach, albo wręcz określonych indywiduów chemicznych dzięki przeprowadzeniu na powierzchni sorbentu reakcji chemicznych, prowadzących do utworzenia pochodnych wykazujących barwę w świetle widzialnym, albo znacznie częściej, wykazujących fluorescencję (rzadziej luminescencję lub fosforescencję) w świetle widzialnym, pod wpływem oświetlenia płytki światłem UV 254 nm, lub/i 365 nm. W ostatnich latach metodyki te nie są już raczej rozwijane, posiadają jednak bardzo bogatą literaturę, wśród której należy przede wszystkim, wyróżnić prace J.F.K. York'a [52 54]. Ostatniego rodzaju procedury wywoływania barwy opracowano również dla tłuszczów i ich pochodnych, jednakże, w ramach badań niniejszej pracy nie będą one stosowane. Badania niniejszej pracy, w zakresie wykorzystywania techniki klasycznej chromatografii cienkowarstwowej, mają charakter nie-ilościowy, dlatego ograniczono się do wykorzystania wywoływania barwy plamek parami jodu. Celem badań niniejszej pracy jest określenie celowości stosowania oraz ustalenie korzystnych warunków wykorzystania technik "klasycznej" chromat ografii cienkowarstwowej (TLC) w normalnych (NP - TLC F 254 ) z wykorzystaniem żelu krzemionkowego jako adsorbentu oraz żelu krzemionkowego ze związanymi grupami C18 ( RP-TLC F 254 ), a także chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo - jonizacyjną (NP-TLC-FID), w badaniach nad opanowaniem optymalnych warunków rozdzielania grupowego oraz badania składu grupowego i otrzymywania grup składników będących tłuszczami i produktami ich konwersji, a także, wykorzystania tych technik rozdzielczych i analitycznych, jako metodyk "fingerprintingu" i szacunkowego badania składu grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji. Odległym jednakże, jak się wydaje, coraz bardziej realnym - celem tej serii badań, jest opracowanie optymalnych warunków stosowania kolumnowej wysokosprawnej elucyjnej chromatografii cieczowej (HPLC/UPC) w trybie wielokolumnowym i wielowymiarowym, oraz w sposób zautomatyzowany, w rozdzielaniu, identyfikacji i oznaczaniu składu, tzn. oznaczaniu zawartości poszczególnych izomerów acylogliceroli - w tym z rozdzielaniem ich izomerów optycznych, a także izomerów cis i trans. Opanowanie takich metodyk rozdzielania i oznaczania, powinno także umożliwić, otrzymywanie wysokiej czystości składników tłuszczów i ich pochodnych, jako grup składników albo indy widuów chemicznych, w skali semi - preparatywnej lub preparatywnej. 2. Część doświadczalna (Experimental) 2.1. Materiały i próbki: W badaniach wykorzystano: aluminiowe płytki TLC silica gel 60 F 254 oraz TLC silica gel 60 RP-18 F 254 s, pręciki kwarcowe Chromarod SIII pokryte żelem krzemionkowym, metanol cz.d.a. POCh (Polska), chlorek metylenu cz.d.a. POCh (Polska), n-heksan do HPLC Merck (Niemcy), tetrahydrofuran cz.d.a. POCh (Polska), izopropanol cz.d.a. POCh, kwas trifluorooctowy 99% Sigma-Aldrich (Niemcy) Sprzęt i wyposażenie: Komory do chromatografii cienkowarstwowej; analizator TLC-FID IATROSCAN produkcji Iatron Labs. (Japonia). Uzupełnienie wyposażenia stanowiły: automatyczny dozownik próbek SES 3200/IS-01, suszarka pręcików TLC TK-8, przetwornik analogowo-cyfrowy i oprogramowanie do obróbki danych Chomik (Polska), urządzenie do wizualizacji plamek na płytkach TLC z lampą UV 254/365nm Procedura prowadzenia badań TLC / TLC-FID: W badaniach techniką TLC-FID, wykorzystano analizator IATROSCAN oraz pręciki kwarcowe Chromarod SIII pokryte żelem krzemionkowym. W przypadku klasycznej techniki TLC wykorzystano płytki pokryte żelem krzemionkowym typu H60 oraz typu RP, w obu przypadkach zawierającym wskaźnik fluorescencyjny odpowiednio typu typu F254. Fazę ruchomą lub składniki fazy ruchomej, stanowiły: dichlorometan (DCM), toluen (T), chloroform, izomeryzat, n-heksan (n-c6), metanol (MeOH), izopropanol (izooh) oraz ich mieszaniny. Elucję wykonywano: rozwijanie trójstopniowe (dichlorometan:metanol 95:5 v/v, toluen, n -heksan w dwóch kierunkach, tj. w kierunku rosnącej oraz malejącej siły elucyjnej), rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 95:5v/v + 0,075% TFA), rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 97:3 v/v + 0,075% TFA), rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 95:5 v/v + 0,5% CH 3 COOH), rozwijanie jednostopniowe (n-heksan:izopropanol 97:3 v/v + 0,5% CH 3 COOH). W celu cofnięcia dysocjacji kwaśnej rozdzielanych związków chemicznych stosowano kwas trifluorooctowy jako dodatek do eluentu w stężeniu 0,075% lub kwas octowy w stężeniu 0,5%. Bezpośrednio przed każdym rozdzielaniem, ramkę z pręcikami aktywowano w płomieniu wodorowym detektora FID,

60 60 trzykrotnie w czasie 35s, 50s, 50s, natomiast płytki TLC wygrzewano w suszarce w temp. 110 C, w czasie 5 h. Aktywowane płytki TLC oraz ramki z pręcikami TLC-FID przechowywano przez 10 min w eksykatorze, w celu ochłodzenia. Plamki nakładano z wykorzystaniem automatycznego aplikat ora, dozując 1 l roztworu o stężeniu 0,5 mg badanej mieszaniny/ml heksanu. W celu przyśpieszenia odparowywania rozpuszczalnika, powierzchnię pręcika/płytki ogrzewano strumieniem ciepłego powietrza. Po nałożeniu plamek zarówno pręciki jak i płytki TLC suszono przez 5 minut w suszarce, w temperaturze 50ºC, po czym umieszczano je na 10 min w eksykatorze. Po tym czasie wieszano nad rozpuszczalnikiem w komorze chromatograficznej (10 minut) i poddawano rozwijaniu. Schemat stanowiska przedstawiono na rysunku 3. Detekcja z zastosowaniem techniki TLC-FID następowała podczas przejścia każdego pręcika, w czasie 35 sekund, przez płomień wodorowy detektora FID z jednoczesną cyfrową rejestracją sygnału z elektrometru. Na rysunku 5 przedstawiono widok ramki z pręcikami TLC Chromarods SIII, umieszczonej w komorze detektora, analizatora Iatroscan. W przypadku techniki TLC, po rozwinięciu płytek, wykonywano wizualizację pod lampą UV przy 254nm oraz 365nm. Rozdzielnie i oznaczania każdej próbki wykonano trzykrotnie. Rys. 5. Widok ramki z dziesięcioma pręcikami TLC umieszczonej w komorze detektora FID, w aparacie Iatroscan. Fig. 5. View of frame with ten rods placed in the TLC-FID chamber in Iatroscan apparatus. 3. Wyniki i dyskusja (Results and discussion) Technika TLC i TLC-FID w rozdzielaniu grupowym niskolotnych produktów naftowych Na rysunku 6-tym zamieszczono przykład dwóch chromatogramów TLC-FID, przedstawiających rezultaty rozdzielania grupowego na pręcikach Chromarods SIII i detekcji za pomocą detektora FID w aparacie IATROSCAN, odpowiednio: oleju bazowego typu bright stock, otrzymanego w rezultacie rafinacji pozostałości próżniowej z ropy naftowej na rys. 6A oraz pozostałości z destylacji próżniowej, z której brighstock został otrzymany rys. 6B. Elucja była wykonywana po dwukrotnej aktywacji pręcika w płomieniu wodorowym w czasie 35 i 50s, n-heksanem (nc6) na dystansie ok. 95% długości warstwy fazy stacjonarnej, toluenem (T) na dystansie ok. 55% wysokości tej warstwy oraz mieszaniną dichlorometan-metanol w stosunku objętościowym 95:5 (v/v) (DCM/MeOH 95:5), na dystansie ok. 30%. Z tym, że w przypadku brightstocku w kolejności malejącej siły elucyjnej, tzn kolejno: nc6, T, DCM -MeOH 95:5, a w przypadku pozostałości próżniowej, w kierunku spadku siły elucyjnej na tym samym dystansie wysokości jak dla oleju bazowego. Piki na tych chromatogramach to, odpowiednio: a,a frakcja węglowodorów alifatycznych i alicyklicznych, z nieznaczną, najprawdopodobniej zawartością jednopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z rozbudowanymi strukturami alifatycznymi i alicyklicznymi, co powoduje brak możliwości adsorpcyjnych oddziaływań pierścienia aromatycznego z powierzchnią sorbentu, b,b nielotne jednopierścieniowe węglowodory aromatyczne w ten sposób podstawione alifatycznie i alicyklicznie, że możliwa jest sorpcja pierścienia aromatycznego do powierzchni aktywnego żelu krzemionkowego, c,c jedno- i dwu- oraz wyżej-pierścieniowe podstawione alifatycznie i alicyklicznie węglowodory aromatyczne o powinowactwie sorpcyjnym do powierzchni SiO 2 zbliżonym do 1-metylonaftalenu, fenantrenu, pirenu, benzo(a)pirenu itp.; d,d tzw. żywice (resins) węglowodory polarne, zawierające w strukturze molekularnej pierwiastki inne niż C/H, tzn. N, O, SH, Ni, Fe; e asfalteny podstawione alifatycznie/alicyklicznie wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne,

61 61 zawierające grupy karboksylowe i inne struktury z N, S, O, o dotychczas bliżej nie określonych, skomplikowanych strukturach molekularnych, jednocześnie nierozpuszczalne w n-alkanach. Technika TLC-FID okazała się niezwykle przydatna w badaniach składu grupowego nisko lotnych i nielotnych frakcji i produktów naftowych różnego rodzaju, otrzymywanych podczas operacji destylacji próżniowej ropy naftowej, w tym z pozostałości próżniowej. Ta technika okazuje się też przydatna dla rozdzielania oraz badania składu grupowego innego rodzaju wieoskładnikowych mieszanin, organicznych związków chemicznych. Przy czym dobór warunków rozdzielania jest uprzednio wykonywany z zastosowaniem klasycznej techniki cienkowarstwowej chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Technika TLC jest też przydatna do wstępnego doboru warunków rozdzielania grupowego dla techniki HPLC/UPLC (UPC), mimo podanych powyżej ograniczeń z prostym przenoszeniem parametrów retencji i selektywności z techniki TLC do HPLC/UPLC. Rys. 6. Przykład chromatogramu TLC-FID po 3-stopniowej elucji gdzie eluentami były dichlorometan:metanol 95:5 (v/v), toluen, heksan, A) olej bazowy Bright Stock, elucja w kierunku wzrostu siły elucyjnej kolejnych eluentów; B) pozostałość próżniowa, elucja w kierunku spadku siły elucyjnej kolejnych eluentów. Fig. 6. TLC-FID chromatograms after 3-step elution where the eluents were dichloromethane:methanol 95:5 (v/v), toluene, hexane, A) base oil Bright Stock, elution carried out towards increasing elution strength; B) atmospheric residue, elution carried out towards decreasing elution strength. Dobór warunków rozdzielania grupowego acylogliceroli i ich pochodnych Wstępny dobór składników i składu eluentu dla chromatografii kolumnowej w układach faz normalnych wykonano z zastosowaniem zwykłej chromatografii cienkowarstwowej (TLC) z płytkami z żelem krzemionkowym. Wpłynęło to na skrócenie czasu i zmniejszenie kosztów badań, ponieważ jak wiadomo na jednej płytce TLC można rozdzielać kilka próbek równocześnie. Dodatkowo, widać czy w przypadku zastosowania określonych eluentów na starcie nie pozostają plamki substancji bardzo silnie sorbowanych. Wartości liczbowe parametrów Rf i k uzyskanych dla różnych warunków rozdzielania acylogliceroli (TAG, DAG, MAG), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), kwasów tłuszczowych (FA) w układzie faz normalnych z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelem krzemionkowym (SiO 2 - F 254 ) zestawiono w Tabeli 1. Zamieszczono tam także wartości k obliczone na podstawie Rf. Badania obejmowały wykorzystanie różnych zawartości izopropanolu w eluencie, jako modyfikatora zwiększającego silę elucji fazy ruchomej, jak również dodatku do eluentu dwóch rodzajów kwasu- octowego i trifluorooctowego. W przypadku stosowania żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej, korzystne jest zastosowanie silniejszego eluentu mieszaniny heksanu i izopropanolu w stosunku objętościowym 95:5 oraz modyfikatora kwasowego kwasu trifluorooctowego. W przypadku stosowania pręcików z naniesioną fazą stacjonarną konieczne jest aktywowanie powierzchni pręcików przez poddanie ich ogrzewaniu i jednoczesnym spalaniu zanieczyszczeń w płomieniu wodorowym (3 razy przez 50 sekund).

62 62 Tabela 1. Wartości współczynników Rf oraz k dla mono-, di-, tri-acylogliceroli (MAG, DAG, TAG), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), kwasów tłuszczowych (FA) oraz glicerolu; faza stacjonarna: SiO 2 - F 254, faza ruchoma: zgodnie ze wskazaniem w tabeli. Table 1. The values of Rf and k for mono-, di-, tri-acylglycerols (MAG, DAG, TAG), fatty acid methyl esters (FAME), fatty acids (FA) and glycerol; stationary phase: SiO 2 - F 254, mobile phase: as indicated in table. Substancje (Substances) płytki nieaktyw ow ane (non-activated plates) 97% n-heksanu, 3% izopropanolu (97% of hexane, 3% of isopropanol) WARTOŚCI Rf i k (Rf and k values) 95% n-heksanu, 5% izopropanolu (95% of hexane, 5% of isopropanol) 0,5%CH 3COOH 0,075% TFA 0,5% CH 3COOH 0,075% TFA płytki aktyw ow ane (activated plates) Rf k Rf k Rf k Rf k Rf K TAG 0,28 2,57 0,48 1,1 0,56 0,8 0,57 0,8 0,58 0,7 DAG 0,05 19,0 0,21 3,8 0,30 2,3 0,33 2,0 0,35 1,9 MAG 0,04 24,0 0,11 8,1 0,16 5,3 0,21 3,8 0,23 3,3 FAME 0,02 49,0 0,03 32,3 0,13 6,7 0,04 24,0 0,18 4,6 FA 0 0 0,04 24,0 0 0,40 1,5 Glicerol (glycerol) Badania z zastosowaniem chromatografii cieczowej z wykorzystaniem pręcików pokrytych sorbentem oraz detektora płomieniowo- jonizacyjnego TLC-FID Z przeglądu literatury wynika, iż chromatografia planarna jest powsz echnie stosowana do rozdzielania grupowego frakcji mono-, di-, tri-acylogliceroli (MAG, DAG, TAG), kwasów tłuszczowych (FA), estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) [30, 55]. Przykład chromatogramu TLC-FID rozdzielania mieszaniny wzorców lipidów oraz mieszaniny wzorców acylogliceroli i kwasów tłuszczowych przedstawiono na rysunku 7. Natomiast na rysunku 8 zamieszczony został przykładowy chromatogram rozdzielania próbki pobranej z naturalnego zbiornika słodkowodnego zawierającej lipidy. Rys. 7. Chromatogramy TLC-FID oraz TLC-FPD: A) mieszaniny wzorców lipidów : 1. Ester cholesterolu, 2. TAG, 3. Cholesterol, 4. Fosfatydyloetanolamina, 5. Fosfatydylocholina, 6. Fosfatydyloinozytol, 7. Sfingomielina, 8. Lizofosfatydylocholina; warunki rozdzielania: pręciki Chromarod SIII; elucja: 1) chloroform -metanol-woda-25%amoniak 47:20:2,5:0,28 7cm. 2) heksan-eter dietylowy 63:7 10cm. B) mieszaniny wzorców glicerydów : 1. TAG (tripalmitynian), 2. FA (kwas palmitynowy), 3. 1,3-DAG (1,3-dimirystynian), 4. 1,2-DAG (1,2-dipalmitynian), 5. MAG (monopalmitynian); warunki rozdzielania: pręciki Chromarod SIII; elucja: benzen / chloroform / kwas octowy 50:20:0,7 10cm [55]. Fig. 7. TLC-FID and TLC-FPD chromatograms: A) lipids standards mixture: 1. Cholesterol ester, 2. TAG, 3. Cholesterol, 4. Phosphatidyl ethanolamine, 5. Phosphatidyl choline, 6. Phosphatidyl inositol, 7. Sphingomyelin, 8. Lysophosphatidyl choline; separation conditions: Chromarod SIII rods; elution: 1st. Chloroform -Methanol-Water- 25%Ammonia 47:20:2.5:0.28 7cm; 2nd. Hexane-Diethyl ether 63:7 10cm; B) glycerides standards mixture: 1. TAG (tripalmitin), 2. FA (palmitic acid), 3. 1,3-DAG (1,3-dimyristin), 4. 1,2-DAG (1,2-dipalmitin), 5. MAG (monopalmitin); separation conditions: Chromarod SIII rods; elution: Benzene / Chloroform / Acetic acid 50:20:0.7 10cm [55].

63 63 Rys. 8. Chromatogram TLC-FID otrzymany dla próbki, zawierającej głównie okrzemki z rodziny Asterionella sp., Fragilaria sp., and Tabellaria sp., pobranej z nowofundlandzkiego strumienia w maju 2005r., poprzez holowanie sieci o drobnych oczkach (20 µm). Iatroscan warunki rozdzielania: przepływ powietrza 2,0 L/min, H ml/min. HC węglowodory; SE/WE estry sterolowe i woskowe; KET ketony; TAG triacyloglicerole; FFA wolne kwasy tłuszczowe; ALC alkohole; ST sterole; DAG diacyloglicerole; AMPL lipidy polarne rozpuszczalne w acetonie; PL fosfolipidy; NLM materiał nie-lipidowy [za zgodą 56]. Fig. 8. TLC-FID chromatogram of a net-tow sample (20-μm mesh, consisted mainly of the pennate diatoms Asterionella sp., Fragilaria sp., and Tabellaria sp., taken from a Newfoundland stream in May, Iatroscan conditions: air flow 2.0 L/min, H2: 190 ml/min. HC hydrocarbon; SE/WE steryl and wax esters; KET ketone; TAG triacylglycerol; FFA free fatty acid; ALC alcohol; ST sterol; DAG diacylglycerol; AMPL acetone-mobile polar lipids; PL phospholipid; NLM nonlipid material [with the consent of 56]. Widać, że technika TLC-FID może być bardzo przydatna do badań składu grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji, co jest przedmiotem badań niniejszej pracy. Powyższe wnioski z przeglądu literatury zmobilizowały do wykonania badań techniką TLC-FID w celu sprawdzenia czy nie okaże się ona konkurencyjna wobec techniki NP-HPLC w badaniach składu grupowego materiałów zawierających tłuszcze i wybrane produkty ich konwersji. W przypadku pozytywnych wyników możnaby stosować w/w techniki zamiennie, w zależności od wyposażenia laboratorium i dostępności odpowiedniej aparatury. Przykłady chromatogramów otrzymanych z zastosowaniem TLC -FID w badanich składu grupowego oleju palmowego bielonego oraz handlowego FAME przedstawiono na rysunkach 9 i 10. Wykonane badania wykazały, że zastosowanie techniki TLC-FID do rozdzielania acylogliceroli i ich pochodnych wymaga bardzo powtarzalnej realizacji procedury postępowania. Zmiana czasu kondycjonowania pręcików w komorze nad rozpuszczalnikiem nie wpływa na przeciętne udziały powierzchni pików poszczególnych grup substancji, lecz pogarsza się powtarzalność wyników oznaczeń. Natomiast, takie parametry, jak zawartość wody w eluencie, a szczególnie czas przebywania pręcików nas powierzchnią eluentu, w jego oparach, oraz stężenie próbki nanoszonej na pręcik, mają wpływ na stopień rozdzielenia pików. Otrzymane wyniki wykazują, że precyzja oznaczeń składu grupowego oznaczania MAG, DAG, TAG, FAME, FA metodą TLC-FID, wyznaczona dla odchylenia standardowego, mieści się w granicach około 5% (± 2,5%) zawartości oznaczanych grup związków chemicznych i jest wyraźnie gorsza od rezultatów otrzymanych techniką HPLC. Rozdzielanie i analityka z wykorzystaniem wysokosprawnej kolumnowej chromatografii cieczowej (HPLC) jak również chromatografii cienkowarstwowej TLC-FID stanowi doskonały wybór dla badań składu grupowego różnych materiałów. Klasyczna chromatografia cienkowarstwowa (TLC) pozwala jednakże tylko na jakościowe zapoznanie się ze składem grupowym badanego materiału. Przedstawione procedury są konkurencyjne do procedury przedstawionej w normie EN [57], w której zanieczyszczania FAME oznacza się z wykorzystaniem kapilarnej chromatografii gazowej (CGC) i prekolumnową derywatzacją metanolem kwasów tłuszczowych powstałych w rezultacie hydrolizy do lotnych, metylowych pochodnych.

64 64 Rys. 9. Chromatogram TLC-FID rozdzielania składników olej palmowy-bielony z zastosowaniem żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej na kwarcowych pręcikach SIII, eluent: mieszanina n-heksan : izopropanol 95: 5 (v/v) z 0,075% TFA, gdzie: A monoacyloglicerole (MAG), B FAME, C diacyloglicerole (DAG), D triacyloglicerole (TAG). Fig. 9. TLC-FID chromatogram of "blanched palm oil" components separation using silica gel as a stationary phase on quartz rods SIII, eluent: n-hexane : isopropanol 95: 5 (v/v) with 0.075% TFA, A monoacylglycerols (MAG). B FAME, C diacylglycerols (DAG), D triacylglycerols (TAG). Rys. 10. Chromatogram TLC- FID rozdzielania składników handlowego FAME z zastosowaniem żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej na kwarcowych pręcikach SIII, eluent: mieszanina n-heksan : izopropanol 95: 5 (v/v) z 0,075% TFA, gdzie: A kwasy tłuszczowe i glicerol. B monoacyloglicerole (MAG), C FAME, D diacyloglicerole (DAG), E triacyloglicerole (TAG). Fig. 10. TLC-FID chromatogram of commercial "FAME" components separation using silica gel as a stationary phase on the quartz rods SIII, eluent: n-hexane : isopropanol 95: 5 (v / v) with 0.075% TFA, A - fatty acids and glycerol, B monoacylglycerols (MAG), C FAME, D diacylglycerols (DAG), E triacylglycerols (TAG). Badania techniką TLC i TLC-FID oraz odniesienie ich rezultatów do HPLC, dla typowego rozdzielania grupowego oraz dla rozdzielania w warunkach GPC/SEC-NP/RP Badania realizowane z zastosowaniem techniki chromatografii cienkowarstwowej (TLC) żel krzemionkowy, DIOL, CN, NH 2, RP18 z i bez fluoresceiny 254 nm, miały dwa cele: wyjaśnienie, czy inne fazy stacjonarne, niż powszechnie stosowane w grupowym rozdzielaniu lipidów i produktów konwersji tłuszczów, nie posiadają na tyle bardziej korzystnej selektywności, by było celowe zastąpienie nimi żelu krzemionkowego w rozdzielaniu g rupowym tej klasy produktów i materiałów, techniką HPLC, albo klasycznej preparatywnej chromatografii kolumnowej, a także, wyjaśnienie na drodze doświadczalnej, czy i w jakim stopniu technika TLC, może być przydatna w doborze optymalnej fazy stacjonarnej, składników oraz składu eluentu do rozdzielania grupowego lipidów i produktów konwersji tłuszczów w warunkach chromatografii wykluczania, z jednoczesną adsorpcją.

65 65 Uzyskane wyniki potwierdziły znaną z literatury zasadę celowości stosowania techniki TLC do doboru najbardziej korzystnych składników eluentu oraz do wstępnego doboru optymalnego składu eluentu do rozdzielania grupowego w warunkach, tak chromatografii w normalnych układach faz (NP) do grupowego rozdzielania lipidów i produktów konwersji w tłuszczu, a także choć w mniejszym stopniu przydatność TLC do rozdzielania składników poszczególnych grup, z zastosowaniem hydrofobowej fazy stacjonarnej C18 F 254 oraz bezwodnych eluentów o różnych zakresach polarności (RP-TLC F 254 ). Szczególnie celowe jest stosowanie do takich badań płytek HPTLC (szczególnie typu F 254 ), z żelem krzemionkowym, jako fazą stacjonarną, o drodze rozwijania chromatogramu TLC w zakresie 3 6 cm, i dokonywanie kilkuetapowej wizualizacji, tzn. fotografii cyfrowej, w celu dokumentow ania, a także wykonania cyfrowego przetwarzania obrazu w zwykłe chromatogramy. Wizualizację oraz fotografie cyfrowe płytek wykonywano po kolejnych etapach rozwijania i wysuszeniu płytki: pod lampą UV 254 nm widoczne są plamki / pasma składników, absorbujące światło niskociśnieniowej lampy rtęciowej, gdy ich zawartość w dozowanej na płytkę próbce, przekracza ok. 0,1 0,5 % m/v, albo znacznie niższe zawartości, jeśli substancja, albo grupa substancji wykazuje fluorescencję / luminescencję pod wpływem światła lamy rtęciowej niskociśnieniowej ( 254 nm ); pod lampą UV 360 nm widoczne są tylko plamki/pasma składników fluoryzujących pod wpływem światła lampy rtęciowej 365 nm najczęściej fluorescencja niebieska, w przypadku węglowodorów aromatycznych. Po ostatnim etapie rozwijania płytki oraz jej wysuszeniu dokonywano wizualizacji po ekspozycji płytki w oparach jodu w czasie ok. 10 minut w temperaturze pokojowej (możliwość zaobserwowania obecności dużej części nielotnych organicznych składników / grup składników próbki, występujących w stężeniu w mieszaninie badanej, wyższym od ok. 0,1 0,5%. Po ekspozycji płytki w parach jodu i wizualizacji w świetle widzialnym, a następnie, odparowaniu jodu (co najmniej 24 godziny), możliwe jest ewentualne zastosowanie, dodatkowo, spryskania, albo zanurzenia płytki w odpowiednim roztworze wywołującym barwę, albo fluorescencję / luminescencję lipidów i produktów ich konwersji, albo tylko wybranych grup związków chemicznych, lub określonych substancji, w celu ich wizualizacji i oceny stężenia. Istnieje bardzo bogata literatura metodyczna w tym zakresie. Do tego rodzaju badań, można z przekonaniem polecić publikacje i podręczniki prof. H. Jork a i współpracowników [52 54]. W ramach opisywanych tu badań, selektywne wywoływanie wykonywano tylko w przypadku niektórych badanych próbek, tzn., tylko w celu wizualizacji i oceny stężenia polioxy-glicerydów, nad-kwasów tłuszczowych, czy cholesterolu i innych steroli (wyniki nie prezentowane w tej pracy). Natomiast, w przypadku wszystkich badań wykonywanych techniką TLC, dokonywano wizualizacji płytek w świetle UV-254 nm, 360 nm, a na końcu w świetle widzialnym, po uniwersalnym wywołaniu barwy plamek na płytce TLC za pomocą par jodu, dokonując ekspozycji każdej płytki TLC, zawsze w takich samych warunkach i przez taki sam okres czasu. 4. Wnioski końcowe (Conclusions) Bazując na danych literatury oraz na wykonanych badaniach, dobrano warunki rozdzielania grupowego wzorców, reprezentujących główne składniki tłuszczów i produktów ich konwersji, a także, dla wieloskładnikowych próbek z różnych etapów procesu technologicznego przetwarzania tłuszczów, otrzymanych z zakładów tłuszczowych oraz z zakładów wytwarzających/stosujących FAME. Zastosowano chromatografię cienkowarstwową w normalnych układach faz z żelem krzemionkowym, jako fazą stacjonarną NP-TLC-F 254 i NP-HPTLC-F 254, a także technikę NP-TLC-FID na pręcikach Chromarod SIII, gdy faza stacjonarna to warstewka mikro-ziarnistego żelu krzemionkowego o specjalnej preparatyce na pręcikach kwarcowych o średnicy 2mm. Studia i badania dotyczyły też chromatografii cienkowarstwowej z n - oktedecylosiloksanem (C18) jako fazą stacjonarną płytki aluminiowe RP-TLC-F 254 i RP-HPTLC-F 254, pokryte fazą stacjonarną C18. Wykorzystywano warunki elucji izokratycznej jedno-, lub kilkustopniowej, z jedno- lub dwu składnikowymi eluentami o różnych składach, dostosowanych do celu rozdzielania. Na podstawie wyników studiów literatury oraz wykonanych badań, należy sformułować następujące wnioski, aktualne nie tylko dla tłuszczów i produktów ich konwersji, ale także dla rozdzielania różnego rodzaju innych złożonych mieszanin związków chemicznych, z wykorzystaniem wykluczania i słabej adsorpcji (GPC-SEC-NP lub GPC-SEC-RP): - Ze wszech miar korzystne jest wykorzystywanie techniki TLC, w badaniach "pilotowych" nad doborem korzystnych warunków wykorzystania wysokosprawnej, kolumnowej chromatografii cieczowej, tak typowej adsorpcyjnej, jak i w warunkach jednoczesnego wykluczania oraz kontrolowanej adsorpcji polarnej w normalnych układach faz, tzn., warunków GPC-SEC-NP; - Jest także celowe wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej z niepolarną, hydrofobową fazą stacjonarną typu C18 oraz organicznych bezwodnych eluentów o różnej polarności dla określenia optymalnych warunków rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji z wykorzystaniem faz

66 66 stacjonarnych typu C18 oraz bezwodnych eluentów o różnej polarności, a także do badania wykluczania i słabej adsorpcji w warunkach hydrofobowych (lipofilowych) (GPC-SEC-RP); - Technika TLC-FID, oddaje nieocenione usługi w rozdzielaniu grupowym oraz ocenie składu grupowego tłuszczów i produktów ich konwersji. Podobnie jak w badaniach tego typu innych nielotnych, albo bardzo nisko-lotnych skomplikowanych mieszanin związków chemicznych [58 62]; - Natomiast, wykorzystywanie techniki TLC-FID w badaniach "pilotowych" nad doborem korzystnych warunków wykorzystania wysokosprawnej, kolumnowej chromatografii cieczowej w warunkach jednoczesnego wykluczania oraz kontrolowanej adsorpcji w normalnych układach faz (GPC-SEC-NP), nie wydaje się celowe, tak ze względu, tak na stosunkowo wysokie koszty stosowania, jak i względnie dużą praco- i czasochłonność wykonania badań; - Odległym, jednakże jak się wydaje coraz bardziej realnym celem opisywanych badań, jest opracowanie optymalnych warunków stosowania kolumnowej wysokosprawnej elucyjnej chromatografii cieczowej (HPLC / UPC) w trybie wielokolumnowym (NC) i wielowymiarowym (nd) oraz w sposób zautomatyzowany, w rozdzielaniu, identyfikacji, oznaczaniu, a także otrzymywaniu w skali semi-preparatywnej lub preparatywnej, wysokiej czystości składników tłuszczów i ich pochodnych jako grup składników, albo, indywiduów chemicznych. Conclusions Conditions for group separation of chemical standards, representing main constituents of fats and products of their conversion, as well as, multi -component samples obtained from different stages of fats processing, were selected basing on literature data and conducted studies. During studies normal-phase thin layer chromatography (with silica gel as stationary phase) NP-TLC-F 254 i NP-HPTLC-F 254, and NP-TLC- FID technique utilizing Chromarod SIII rods were used. Studies and research were also concerning thin layer chromatography with n-octadecyl-siloxane (C18) as the stationary phase aluminum plates "RP-TLC-F 254 " and "RP-HPTLC-F 254 ", covered with C18 stationary phase. Isocratic elution conditions were used in one- or several steps mode, with one- or two- component mobile phases having different compositions, adapted to the purpose of separation. Based on the results of literature studies and conducted research utilizing GPC-SEC-NP or GPC-SEC- RP, the following conclusions which are valid not only for fats and products of their conversion, but also for separation of many other complex mixtures, can be drawn: - It is highly advantageous to use TLC technique in "pilot" studies performed to select favorable conditions for high performance liquid column chromatography, in typical adsorption mod e, as well as during simultaneous exclusion and controlled polar adsorption in normal phase systems, ie., GPC SEC-NP conditions; - It is also advisable to use thin-layer chromatography with a non-polar, hydrophobic stationary phase, type C18, and organic anhydrous mobile phases of different polarity to determine the optimum conditions for the separation of fats and products and to examine exclusion and poor adsorption in hydrophobic (lipophilic) conditions (GPC-SEC-RP); - TLC-FID is an inestimable technique in group separation and group composition analysis of fats and products of their conversion. TLC-FID is also very useful in other studies of this type, concerning non-volatile or low-volatile very complex mixtures of chemical compounds [58-62]; - On the other hand, the usage of TLC-FID technique in "pilot" studies applied to selection of favorable separation conditions for high performance liquid column chromatography under simultaneous exclusion and controlled adsorption in normal phase (GPC-SEC-NP), does not seem to be appropriate, because this technique is relatively time-consuming, quite expensive in use, as well as, labour-consuming; - A distant, but - as it seems - more and more real aim of this research is to develop optimal conditions for high performance elution chromatography (HPLC/UPC) in a multi-column (NC), multidiemsional (ND), and automated manner, for separation, identification and determination, as well as, production of fats and products of their conversion in semi-preparative or preparative scale, as pure chemical compounds or groups of compounds. Podziękowania Acknowledgements Prace były finansowane przez Narodowe Centrum Nauki numer rejestracyjny projektu badawczego: N N , numer umowy: 4172/B/P01/2009/37, pt. "Wykorzystanie chromatografii wykluczania i adsorpcji do rozdzielania i oznaczania grupowego lipidów i produktów konwersji w tłuszczach jadalnych".

67 67 Literatura (Literature) 1. Y. W. Wang, T. F. Yen, Rapid separation and characterization of fuels by Thin Layer Chromatography, Journal of Planar Chromatography, 3 (1990) Vreven F., Neue Perspektiven in der chemischen Analytik von Bindemitteln wie Bitumen und Teer, New perspectives in the chemical analytics of binders such as bitumen and tar, Asphalt, 1 (1994). 3. K. Dunn, G.V. Chilingarian, H. Lian, Y.Y. Wang, T.F.Yen, Chapter 11 Analysis of Asphalt and Its Components by Thin-Layer Chromatography, Developments in Petroleum Science, 40, part B (2000) S. Chattopadhyay, S. Das, R. Sen, Rapid and precise estimation of biodiesel by high performance thin layer chromatography, Applied Energy, 88 (2011) S. Agatonovic-Kustrin, Ch. M. Loescher, Qualitative and quantitative high performance thin layer chromatography analysis of Calendula officinalis using high resolution plate imaging and artificial neural network data modeling, Analytica Chimica Acta, 798 (2013) M. A. Hawrył, M. Waksmundzka-Hajnos, Two-dimensional thin-layer chromatography of selected Polygonum sp. extracts on polar-bonded stationary phases, Journal of Chromatography A, 1218 (2011) M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, Badania nad doborem najkorzystniejszego składu eluentu do rozdzielania metabolitów wtórnych z grupy naftochinonów i flawonoidów z zastosowaniem chromatografii planarnej w normalnym i odwróconym układzie faz, A research on the composition of the eluent for separation of plant metabolites by reverse phase planar chromatography,, 3:1 (2011) H. A. Khan, I. A. Arif, J. B. Williams, A. M. Champagne, M. Shobrak, Skin lipids from Saudi Arabian birds, Saudi Journal of Biological Sciences (2013), 9. M. J. Baran, P. K. Zarzycki, Szybka metoda frakcjonowania lipidów i substancji niepolarnych w piórach ptaków z wykorzystaniem termostatowanej mikrochromatografii planarnej (micro-tlc), Fast method for fractionation of lipids and related non-polar substances from birds feathers using thermostated micro-tlc,, 3:1 (2011) P. K. Zarzycki, M. M. Ślączka, E. Włodarczyk, M. J. Baran, Micro-TLC Approach for Fast Screening of Environmental Samples Derived from Surface and Sewage Waters, Chromatographia, 76 (2013) P. K. Zarzycki, M. M. Ślączka, M. B. Zarzycka, M. A. Bartoszuk, E. Włodarczyk, M. J. Baran, Temperature-controlled micro-tlc: A versatile green chemistry and fast analytical tool for separation and preliminary screening of steroids fraction from biological and environmental samples, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 127 (2011) M. Jeleń, B. Morak-Młodawska, K. Pluta, Thin-layer chromatographic detection of new azaphenothiazines, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 55 (2011) D. D. Joshi, Herbal Drugs and Fingerprints, 2012 Evidence Based Herbal Drugs, Springer India 2012, A. Puscas, A. Hosu, C. Cimpoiu, Application of a newly developed and validated high-performance thin-layer chromatographic method to control honey adulteration, Journal of Chromatography A, 1272 (2013) M. Kucharska, J. Grabka, A review of chromatographic methods for determination of synthetic food dyes, Talanta, 80 (2010) A. A. Herod and M.-J. Lazaro, Thin-Layer (Planar) Chromatography, Encyclopedia of Separation Science. 17. J. Kosińska, G. Boczkaj, J. Gudebska, M. Kamiński, Fingerprinting niskolotnych frakcji i produktów naftowych techniką cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC) w identyfikacji przecieków procesowych oraz skażenia środowiska, Fingerprint comparison of low-volatile petroleum products by means of Thin Layer Chromatography (TLC) for identification of process leakages and environmental pollution, 5:2 (2013) Z. Wang, M. Fingas, D. S. Page, Oil spill identification, Journal of Chromatography A 843 (1999) M. Kamiński, wyniki niepublikowanych badań własnych, the results of own unpublished studies. 20. M. Jaszczołt, G. Boczkaj, A. Lewandowski, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kamiński, Badania nad doborem najkorzystniejszego składu eluentu do rozdzielania metabolitów wtórnych z grupy naftochinonów i flawonoidów z zastosowaniem chromatografii planarnej w normalnym i odwróconym układzie faz, A research on the composition of the eluent for separation of plant metabolites by reverse chase planar chromatograchy, 3:1 (2011) W. Gołkiewicz, M. Jaroniec, Continuous TLC as a pilot technique for optimization of gradient HPLC. 1. Theoretical considerations for stepwise gradient TLC with binary mobile phase, Journal of High Resolution Chromatography 1:5 (1978) abstract.

68 W. Gołkiewicz, TLC as a pilot technique for the optimization of gradient HPLC II. Use of data obtained from RP-18 plates for the prediction of gradient programs in reversed-phase liquid chromatography, Chromatographia 14:11 (1981) T. Tuzimski, Thin-Layer Chromatography (TLC) as Pilot Technique for HPLC. Utilization of Retention Database (Re) vs. Eluent Composition of Pesticides, Chromatographia 56 (2002) J. K. Różylo, M. Janicka, R. Siembida, Advantages of TLC as a Pilot Technique for HPLC, Journal of Liquid Chromatography 17:17 (1994) abstract. 25. E. Soczewiński, T. Wawrzynowicz, Thin-layer chromatography as a pilot technique for the optimization of preparative column chromatography, Journal of Chromatography A 218 (1981) S. Reuke, H.E. Hauck, Thin-layer chromatography as a pilot technique for HPLC demonstrated with pesticide samples, Fresenius Journal of Analytical Chemistry 351 (1995) J. Gudebska, rozprawa doktorska pt. Chromatografia cieczowa w oznaczaniu składu grupowego olejów bazowych i asfaltów drogowych, PhD thesis entitled: Liquid chromatography for the determination of group composition of base oils and road bitumens, Gdańsk (1999) Norma PN-72/C Oznaczanie składu grupowego węglowodorów metodą chromatografii elucyjnej, PN-72/C Standard Determination of hydrocarbons group composition by elution chromatography. 29. R.J. Hamilton, Thin-layer chromatography flame ionization detection for lipid analysis (chapter 1.4) in Lipid Analysis in Oils and Fats, Springer Science & Business Media (2012). 30. L. Striby, R. Lafont, M. Goutx, Improvment in the Iatroscan thin-layer chromatography flame ionisation detection analysis of marine lipids. Separation and quantitation of mono- and diacylglycerols in standards and natural samples, Journal of Chromatography A 849 (1999) S. Zhou, Quantitation of Lipid Classes by Thin-Layer Chromatography with Flame Ionization Detection, Current Protocols in Food Analytical Chemistry D:D1:D1.6 (2003) D J.-L. Sebedio, Utylization of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection for Lipid Analyses (chapter 4) in New Trends in Lipid and Lipoprotein Analyses, The American Oil Chemists Society (1995). 33. T. Ohshima, R.G Ackman, New Dvelopments in Chromarod/Iatroscan TLC-FID: Analysis of Lipid Class Composition, Journal of Planar Chromatography 4 (1991) A. Timmins, R. G. Ackman, TLC-FID with Special Reference to Marine Lipids and Other High- Molecular-Weight Organic Compounds(chapter 11) in Lipid Analysis and Lipidomics: NewTechniques and Applications, American Oil Chemists' Society Publishing (2006) P. Dudley, R. Anderson, Separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thin-layer chromatography, Lipids 10 (1975) R. Wilson, J.R. Sargent, High-res olution separation of polyunsat urat ed fatty acids by argentation thinlayer chromatography, Journal of Chromatography A 623 (1992) B. Fuchs, R. Suess, K. Teuber, M. Eibisch, J. Schiller, Lipid analysis by thin-layer chromatography a reviev of the current state, Journal of Chromatography A 1218 (2011) J.J. Myher, A. Kuksis, General strategies in chromatographic analysis of lipids, Journal of Chromatography B 671 (1995) D. Allan, S. Cockroft, A modified procedure for thin-layer chromatography of phospholipids, Journal of Lipid Research 23 (1982) Casimir C. Akoh, David B. Min (ed.), Food Lipids. Chemistry, Nutrition and Biotechnology, second ed. revised and expanded, Marcel Dekker, Inc., USA, (2002). 41. M. Buchgraber, F. Ulberth, H. Emons, E. Anklam, Triacylglycerol profiling by using chromatographic techniques (a review), European Journal of Lipid Science and Technology 106 (2004) R.J. Hamilton, Lipid analysis using thin-layer chromatography and the Iatroscan (chapter 1) in Lipid Analysis in Oils and Fats, Springer Science & Business Media (2012). 43. G. Gałęzowska, M. Kamiński, Nowa metoda oznaczania komponentów skomplikowanych mi eszanin typu specyfiki farmaceutyczne z wykorzystaniem rozdzielania grupowego i wielowymiarowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej, New method of complex mixtures like pharmaceutical specifics determination using multidimensional high performance liquid chromatography and group type separation, 3:1 (2011) G. Boczkaj, M. Jaszczołt, M. Kamiński, Nowe metodyki oznaczania dodatków do paliw z zastosowaniem rozdzielania wielowymiarowego, New procedures for fuel additives determination by multidimensional separation systems, 3:1 (2011) K. Awai, R. Matsuoka, Y. Shioi, Lipid and fatty acid compositions of Symbiodinium strains, Proceedings of the 12th International Coral Reef Symposium, 6A Cell and molecular biology of symbiosis, Cairns, Australia (9-13 July 2012). 46. M. Ranny, Methods of Thin-Layer Chromatography with Flame Ioniz ation Detection (TLC-FID) in Thin- Layer Chromatography with Flame Ionization Detection, Springer Science & Business Media, (2012).

69 M. Kamiński, J. Gudebska, T. Górecki, R. Kartanowicz, Optimized conditions for hydrocarbon group type analysis of base oils by thin-layer chromatography flame ionisation detection, Journal of Chromatography A 991 (2003) B.-J. Yang; L. Zheng; X.-T. Han; M.-G. Zheng, Development of TLC-FID technique for rapid screening of the chemical composition of microalgae diesel and biodiesel blends, Fuel 111 (2013) T. Hooper, Ch. C. Parrish, Profiling neutral lipids in individual fish larvae by using shortcolumn gas chromatography with flame ionization detection, Limnology and Oceanography: Methods 7 (2009) V. L. Bebolla, L. Membrado, M. P. Domingo, P. Henrion, R. Garriga, P. González, F. P. Cossío, A. Arrieta, J. Vela, Quantitative Applications of Fluorescence and Ultraviolet Scanning Densitometry for Compositional Analysis of Petroleum Products in Thin -Layer Chromatography, Journal of Chromatographic Science 37 (1999) J. Kosińska, wyniki niepublikowanych badań własnych, the results of own unpublished studies. 52. H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer, Thin-Layer Chromatography. Reagents and Detection Methods, Volume 1a Physical and Chemical Detection Methods: Fundamentals, Reagents I, VCH, Weinheim, C. Weins, H. Jork, Toxicological evaluation of harmful substances by in situ enzymatic and biological detection in high-performance thin-layer chromatography, Journal of Chromatography A 750 (1996) H. Struck, H. Karg, H. Jork, Thin-layer chromatographic determination of testosterone and delta4- androstene-3,17-dione from bovine foetal testicular tissue, Journal of Chromatography A 36 (1968) IATROSCAN technical information from catalogue IATROSCANTM MK-6 TLC-FID/FPD Dual Detestion System, Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. 56. C.C. Parrish, Determination of Total Lipid, Lipid Classes, and Fatty Acids in Aquatic Samples in Lipids in Freshwater Ecosystems, edited by M.T. Arts, B.C. Wainman, Springer-Verlag New York, Inc., New York (1998) Norma PN-EN Produkty przetwarzania olejów i tłuszczów Estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME) - Oznaczanie zawartości wolnego i ogólnego glicerolu oraz mono -, di- i triacylogliceroli, PN-EN Standard Fat and oil derivatives Fatty Acid Methyl Esters (FAME) Determination of free and total glycerol and mono-, di-, tri-glyceride content (2003). 58. B.N. Barman, Hydrocarbon-Type Analysis of Base Oils and Other Heavy Distillates by Thin-Layer Chromatography with Flame-lonization Detection and by the Clay-Gel Method, Journal of Chromatographic Science 34 (1996) S. Bharati, R. Patience, N. Mills, T. Hanesand, A new North Sea oil-based standard for Iatroscan analysis, Organic Geochemistry 26 (1997) J. Vela, L. Membrado, V.L. Cebolla, A.C. Ferrando, Suitability of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection with Regard to Quantitative Characterization of Different Fossil Fuel Products. II. Calibration Methods Concerning Quantitative Hydrocarbon -Group Type Analysis, Journal of Chromatographic Science 36 (1998) V.L. Cebolla, J. Vela, L. Membrado, A.C. Ferrando, Coal-Tar Pitch Characterization by Thin-Layer Chromatography with Flame Ionization Detection, Chromatographia 42 (1996) B.N. Barman, Behavioral differences between group I and group II base oils during thermo-oxidative degradation, Tribology International 35 (2002)

70 CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp Judyta KOSIŃSKA 1, Monika ŚMIEŁOWSKA 1, Marian KAMIŃSKI 1* 1 Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, ul, Narutowicza 11/12 * Autor do korespondencji, markamin@pg.gda.pl Badania nad rozdzielaniem grupowym technikami sorpcji i chromatografii. Część I Wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) dla doboru warunków rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji technikami kolumnowymi. Streszczenie: Przeprowadzono badania wyjaśniające wpływ eluentu oraz fazy stacjonarnej na wartość parametrów elucji mono-, di-, triacylogliceroli oraz wolnych kwasów tłuszczowych, eluowanych w warunkach cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC). Celowo wykorzystano sorbenty inne niż kopolimer styrenu i di -winylobenzenu (SDVB). Starano się dobrać taki eluent, aby możliwe było rozdzielanie tłuszczów za pomocą chromatografii wykluczania z kontrolowaną sorpcją. W przyszłości rozwiązania te powinny zastąpić drogie kolumny z wypełnieniem SDVB. Modyfikując warunki rozdzielania można znacznie zmieniać rozdzielczość i selektywność układów rozdzielczych. Dobór optymalnego składu eluentu i programu elucji powinien być dokonywany z zastosowaniem techniki TLC, co znacznie przyspiesza dobór optymalnych warunków separacji. Słowa kluczowe: chromatografia cieczowa, TLC, GPC/SEC, rozdzielanie tłuszczów, oddziaływania sorpcyjne Studies on group separation using sorption and chromatographic techniques. Part I Usefulness of thin layer chromatography (TLC) in conditions pre-selection for separation of fats and their conversion products using column techniques. Abstract: This paper shows results of investigations explaining influence of the type of the eluent and the nature of the stationary phase for elution parameters of model compounds eluted in the thin layer chromatography (TLC) conditions. Separation of mono-, di-, triglycerides and free fatty acids was performed using TLC plates dedicated to normal phase chromatography (silica gel Si60 F 254 ) and reversed phase chromatography (oktadecylosilan phase RP18 F254 ). Single-step elutions using eight selected eluents of varying elution strength were carried out. Performed studies revealed that certain modifications of separation conditions can lead to changes in resolution and selectivity of separation systems. Studies were conducted to create model separation systems and to examine which model system gives such good results of tested compounds separation that it is worth to transfer the best conditions to a larger scale to studies using column liquid chromatography. Sorbents other than a copolymer of styrene and divinylbenzene (SDVB) were used intentionally, and the aim was to select an appropriate eluent which would allow for separation of fats using size exclusion chromatography with controlled sorption. In the future, this solution should replace expensive SDVB packed columns. Key words: liquid chromatography, TLC, GPC/SEC, separation of fats, sorption interactions 1. WSTĘP (Introduction) Podczas poszczególnych etapów otrzymywania tłuszczów jadalnych wymagana jest ścisła kontrola jakości, w tym składu produktu końcowego. Kontrola powinna też obejmować tłuszcze podczas ich przetwarzania oraz użytkowania. Ma to znaczenie między innymi ze względu na możliwość powstawania izomerów trans o potencjalnym działaniu rakotwórczym, wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, c zy produktów polimeryzacji, hydrolizy lub/i utleniania tłuszczów. Poza tym analityka tłuszczów jadalnych dostarcza informacji na temat składu w zakresie kwasów tłuszczowych oraz zawartości naturalnych składników o cenionych walorach żywieniowych (kwasy ome ga-3, tokoferole, fitosterole) oraz pozwala na kontrolowanie usunięcia substancji zbędnych, których obecność może stanowić zagrożenie zdrowia konsumenta (m. in. pozostałości pestycydów, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), trwałe zanieczyszczenia organiczne (TZO)) [1-3].

71 71 Przeprowadzanie kontroli jakości tłuszczów, czy produktów ich konwersji, wymaga zapewnienia odpowiednich procedur i narzędzi. W badaniach tłuszczów i produktów ich konwersji pod względem składu, w zakresie kwasów tłuszczowych, stosowane obecnie, znormalizo wane metodyki i procedury, w przeważającej większości wykorzystujące kapilarną chromatografię gazową (CGC), są pracochłonne na etapie przygotowania próbki do badań (zmydlanie, tworzenie estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME)). Wykonanie oznaczeń składu wymaga bardzo sprawnej kolumny i jest czasochłonne. Analityka tłuszczów i produktów ich konwersji związana jest z potrzebą posiadania dostatecznie czystych wzorców. Te otrzymuje się dzięki wieloetapowemu rozdzielaniu z tłuszczów czy produktów ich konwersji albo dzięki syntezie i wydzieleniu czystych składników z mieszaniny poreakcyjnej na drodze rozdzielania. Wiąże się to z potrzebą stworzenia warunków, pozwalających na selektywne rozdzielanie, oznaczanie, a także otrzymywanie wzorców analitycznych w postaci czystych indywiduów chemicznych określonych acylogliceroli, kwasów tłuszczowych i innych składników. W Tab.1. zestawiono oraz scharakteryzowano najważniejsze znormalizowane metodyki wykorzystujące rozdzielanie chromatograficzne w analityce tłuszczów i ich pochodnych. W przypadku badań nad zastosowaniem sorpcyjnej kolumnowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC do rozdzielania oraz oznaczania tłuszczów, ich pochodnych i produktów konwersji, warto wykorzystać cienkowarstwową chromatografię cieczową jako technikę pilotową (przy wykorzystaniu sorbentów tak polarnych, jak i hydrofobowych oraz eluentów o zróżnicowanej sile elucyjnej). Chromatografia cienkowarstwowa była przed laty powszechnie stosowana. Obecnie jest nadal używana do rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji, a przede wszystkim do orientacyjnej oceny składu. Zastosowanie normalnego układu faz (NP) pozwala na rozdzielanie grup związków chemicznych o różnej polarności. W odwróconych układach faz (RP) ma miejsce selekcja cząst eczek lipidów i ich pochodnych, które należą do tej samej klasy w zakresie polarności, ale różnią się hydrofobowością. Najczęściej używaną fazą stacjonarną w technice NP -TLC jest żel krzemionkowy, czasem tlenek glinu lub ziemia okrzemkowa (szczególnie dawniej). Obecnie prym wiodą żel krzemionkowy modyfikowany chemicznie grupami R-NH 2, R-CN, DIOL dla warunków NP lub C-18, C-8, grupami alkilofenylowymi dla warunków RP [13]. Interesującym zastosowaniem jest użycie jako fazy stacjonarnej w chromatografii cienkowarstwowej, a także w kolumnowej, sorbentów impregnowanych azotanem (V) srebra, kwasem borowym lub kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). W tab. 2. przedstawiono najważniejsze zastosowanie wyżej wspomnianych impregnowanych sorbentów. Technika cienkowarstwowej chromatografii cieczowej TLC (Thin Layer Chromatography) posiada niewątpliwe zalety w postaci prostoty wykonania badań, niskich kosztów sprzętu, niewielkiego zużycia eluentów. Plamki na chromatogramach TLC można obserwować pod lampą UV 254 nm (płytki typu F-254 z fluoresceiną ) albo 365 nm (wykazujące fluorescencję struktury aromatycznej) lub wywoływać żółtobrunatną barwę adduktów I 2 w oparach jodu nie dotyczy to jednak składników obecnych w bardzo niskich lub śladowych zawartościach. Istotnymi wadami TLC jest względnie niska rozdzielczość oraz często niska czułość. Bardzo trudna realizacja elucji gradientowej, którą zastępuje się w praktyce najczęściej elucją skokową. Technika TLC jest też nieprzydatna do rozdzielania i badania lotnych związków chemicznych. Wpływ stopnia nasycenia komory chromatograficznej parami eluentu na rozdzielanie analitów, przenoszenie warunków rozdzielania pod względem wartości parametrów, takich jak: współczynnik retencji (k), współczynnik selektywności (α) w warunkac h NP-TLC powoduje, że przenoszenie tych parametrów z TLC do chromatografii kolumnowej NP - HPLC nie daje identycznych rezultatów [18]. Najczęściej w HPLC wartości k są wyższe niż dla TLC. Mimo to, cienkowarstwowa chromatografia cieczowa dostarcza istotnych informacji na temat zależności składu eluentu i rodzaju fazy stacjonarnej, tzn. wpływu parametrów układu chromatograficznego na rozdzielanie. Technika TLC może i powinna być stosowana jako technika pilotowa w doborze optymalnych warunków elucji i rozdzielania dla techniki HPLC.

72 72

73 73 Tab. 2. Zastosowanie impregnowanych sorbentów w rozdzielaniu tłuszczów za pomocą TLC lub HPLC w zależności od zastosowanego impregnatu fazy stacjonarnej Tab. 2. The use of impregnated sorbents in the separation of fats by TLC or HPLC depending on the applied impregnant of the stationary phase Impregnat Zastosowanie Publikacje Azotan (V) srebra Rozdzielanie tłuszczów na grupy związków chemicznych, posiadające tę samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych, tzn. rozdzielanie izomerów cis/trans. [14-15] Kwas borowy Rozdzielanie izomerów diacylogliceroli oraz izomerów [13,16] fosfolipidów. Kwas etylenodiaminotetraoctowy Rozdzielanie fosfolipidów kwasowych. [17] W tej pracy uwzględniono żel krzemionkowy oraz sorbent typu C18 oktadekan związany wiązaniem siloksanowym z żelem krzemionkowym (tzw. RP18), jako fazy stacjonarne oraz związki chemiczne należące do różnych grup w zakresie polarności oraz hydrofobowości, jako substancje modelowe. Tabela związków modelowych obejmuje także substancje lotne (Tabela 3). Badania niniejszej pracy dotyczą przede wszystkim tłuszczów i produktów ich konwersji, tzn. acylogliceroli, kwasów tłuszczowych i gliceryny. Zostały też wykonane badania w odniesieniu do niżej polarnych i bardziej hydrofobowych wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) oraz nisko dyspersyjnych polistyrenów, a także reprezentantów innych grup, bardziej polarnych i mniej hydrofobowych związków chemicznych, rozpuszczalnych w różnym stopniu w rozpuszczalnikach organicznych. Kolejne prace będą dotyczyły bardziej szczegółowo innych grup związków chemicznych i innych rodzajów sorbentów. Cele programu badań, których jeden z etapów zrealizowano w tej pracy, to: 1. Opracowanie ogólnych zasad grupowego rozdzielania, techniką kolumnowej elucji wysokosprawnej (HPLC) lub ultrasprawnej (UPC) chromatografii cieczowej, organicznych związków chemicznych, rozpuszczalnych w określonych rozpuszczalnikach organicznych, z uwzględnieniem parametrów elucji i retencji związków chemicznych o szerokim zakresie polarności i hydrofobowości, począwszy od bardzo nisko polarnych składników ropy naftowej i jej produktów, badanych przez nasz zespół od wielu lat w zakresie rozdzielania grupowego, poprzez acyloglicerole (TAG triacyloglicerole, DAG diacyloglicerole, MAG monoacyloglicerole), wolne kwasy tłuszczowe (WKT) i ich estry metylowe (FAME) czy etylowe (FAEE), ketony, alkohole, aldehydy, kwasy karboksylowe, hydroksykwasy i keto kwasy oraz ich estry, amidy, imidy itp., a także naftochinony, polifenole i inne metabolity roślinne, grzybowe lub bakteryjne z uwzględnieniem rozpuszczalnych w acetonitrylu aminokwasów, peptydów oraz białek, czy kwasów nukleinowych i nukleotydów. Badania niniejszej serii prac nie obejmują związków chemicznych rozpuszczalnych wyłącznie w wodzie lub roztworach buforowych, tzn. cukrów, amin biogennych itp. Przedmiotowe rozdzielania grupowe ma być docelowo realizowane technik a HPLC w skali semi - preparatywnej lub preparatywnej oraz przede wszystkim ma dotyczyć otrzymywania w czystej postaci wybranych indywiduów organicznych związków chemicznych, jako tzw. wzorców analitycznych, a także w formie użytkowej, np. dla dokładnego badania ich właściwości fizykochemicznych, jako substratów do dalszych syntez, a być może także jako naturalnych składników leków. Technika cienkowarstwowej elucyjnej chromatografii cieczowej z polarną fazą stacjonarną (NP) albo hydrofobową fazą stacjonarną C18 (RP), służy tu jako metodyka badań pilotowych, informująca o orientacyjnych wartościach parametrów elucji (R f ), retencji (k) i selektywności ( ) dla określonego rodzaju faz stacjonarnych i odpowiednich dla nich eluentów o różnych wartościach siły elucji dla określonego sorbentu i eluowanych składników modelowych rozdzielanych mieszanin. 2. W przypadku wielu mieszanin rozdzielanych związków chemicznych pochodzenia naturalnego, rozdzielanie grupowe, będące przedmiotem niniejszej serii prac powinno być w pierwszym etapie wykonywane techniką HPLC z zastosowaniem klasycznych warunków lipofilowego wykluczania. W tym celu stosuje się obecnie kosztowne kolumny HPLC najczęściej wypełnione porowatym, kulistym kopolimerem styrenu i di-winylobenzenu (SDVB) o określonej średniej wartości średnic porów wewnątrzziarnowych. Płytki TLC pokryte warstwą tego rodzaju sorbentu nie są dostępne, w tym także z tej przyczyny, że dla realizacji elucji i rozdzielania w warunkach wykluczania (GPC-SEC Gel Permeation Chromatography / Size Exclusion Chromatography) musiałyby być one bardzo długie, tak więc badania techniką klasycznej GPC-SEC będą wykonywane wyłącznie techniką kolumnową. Mimo to niektóre warunki rozdzielania techniką GPC-SEC z zastosowaniem tetrahydrofuranu (THF), ewentualnie innych rozpuszczalników, jak dichlorometanu (DCM), acetonu, dimetylosulfotlenku (DMSO), dimetyloformamidu (DMF), jako eluentu mogą być też modelowane z zastosowaniem techniki TLC, szczególnie z płytkami typu C18 lub Phenyl (np. oddziaływania hydrofobowe lub kwadrupolowe na powierzchni sorpcyjnej). Dotyczy to

74 74 układów TLC z płytkami z fazą stacjonarną C18 albo Phenyl czy CN oraz z eluentami wykazującymi bardzo wysokie siły elucji względem fazy typu C18 lub Phenyl lub CN, tzn. z zastosowaniem THFu, acetonu, metyloetyloketonu (2-butanonu), eteru tert -butylowo-metylowego (MTBE) lub eteru tert -butylowo-etylowego (ETBE), eteru diizopropylowego (ip-o-ip) lub dietylowego (Et -O-Et) albo DCMu lub chloroformu (CHCl 3 ), jako eluentów. Wówczas otrzymane wnioski można najprawdopodobniej przenieść do warunków wykorzystania SDVB do elucji i rozdzielania. Ta kwestia jest także przedmiotem niniejszej serii publikacji. Wstępne wnioski zastosowania RP-TLC do modelowania GPC-SEC-SDVB zamieszczono także w niniejszej pracy. 3. Należy jednak stwierdzić, że podstawowym celem tej części badań niniejszej serii prac, jest idea zastąpienia kolumn SDVB, kolumnami typu C18 lub Phenyl albo CN, w badaniach z wykorzystaniem GPC/SEC w warunkach lipofilowych. Powodzenie jest uwarunkowane dobraniem takiego składu eluentu, albo takiego eluentu jednoskładnikowego, że zapewni on brak oddziaływań sorpcyjnych, także o charakterze van der Waalsa, wszystkich składników eluowanych mieszanin z powierzchnią fazy stacjonarnej typu C18 lub Phenyl lub CN, tzn. energia oddziaływania eluentu z fazą stacjonarną winna być co najmniej rząd wyższa, niż energia oddziaływań któregokolwiek ze składników rozdzielanej mieszaniny. Najprawdopodobniej nie jest to możliwe w przypadku elucji wysokowrzących i niskopolarnych składników ropy naftowej, ale powinno być możliwe w przypadku gliceryny, acylogliceroli, WKT, a być może i FAME. Wówczas, ze wszech miar celowe by było zastąpienie w warunkach GPC-SEC SDVB za pomocą C18 lub Phenyl. Dodatkowo, niekiedy korzystny może być taki dobór składu eluentu w warunkach wykorzystania hydrofobowych faz stacjonarnych HPLC do chromatografii wykluczania z jednoczesnymi słabymi oddziaływaniami sorpcyjnymi (GPC-SEC-RP) by bardziej hydrofobowe a jednocześnie mniejsze cząsteczki były nieco silniej sorbowane na powierzchni fazy stacjonarnej, niż większe i niżej hydrofobowe molekuły. Taka sytuacja może mieć miejsce w przypadku niektórych polifenole, gdy pochodne mniejszego naftalenu, mają więcej grup hydroksylowych czy karboksylowych lub tlenowyc h niż pochodne większego fenantrenu czy antracenu, albo pirenu. Jednakże odwrotne sytuacje są znacznie częstsze, tzn. gdy ze wzrostem masy cząsteczkowej / wielkości cząsteczek wzrasta ich hydrofobowość i jednocześnie spada polarność. Wówczas bardziej korzystne od warunków GPC-SEC-RP, powinny być warunki GPC-SEC-NP! 4. Najważniejszym elementem celu serii przygotowywanych publikacji jest zbadanie możliwości oraz zakresu przydatności jednoczesnego wykorzystania do rozdzielania grupowego warunków wykluczania oraz słabej polarnej adsorpcji GPC-SEC-NP. Takie postępowania powinno mieć ogromny zakres zastosowań, ponieważ prawie regułą jest, że w zakresie określonych grup organicznych związków chemicznych ma miejsce wzrost ich polarności i spadek hydrofobowości w miarę zmniejszania się wielkości cząsteczek. Typowym przykładem są: TAG/DAG/MAG, czy FAME/WKT, czy poliglikole, czy poliestry, lub polifenole o takich samych lub rosnących liczbach grup hydroksylowych oraz grup karboksylowych ze zmniejszaniem się cząsteczek, a także alkohole alifatyczne, ketony alifatyczne, kwasy karboksylowe, kwasy -karboksylowe, - ketokwasy itd. Wówczas stosowanie warunków klasycznej chromatografii wykluczania wymaga bardzo długiej i bardzo wysoce sprawnej kolumny do rozdzielania związków chemicznych mało różniących się wielkością cząsteczki. Na przykład, dla rozdzielania etanolu, metanolu i wody do linii bazowej w warunkach klasycznej chromatografii wykluczania, potrzeba kolumny o co najmniej N= półek teoretycznych, gdy z zastosowaniem optymalnych warunków GPC-SEC-NP wystarczy około półek teoretycznych. Podstawowym zadaniem niniejszej pracy, oprócz zaprezentowania i uzasadnienia powyższych idei, jest jak opisano powyżej. Celem niniejszej, pierwszej z serii kilku prac, jest zbadanie zależności między parametrami retencji i selektywności, a także wpływu rozpuszczalności w eluencie, wybranych związków chemicznych, traktowanych jako substancje modelowe reprezentujące określone grupy związków chemicznych, eluowane i rozdzielane w warunkach sorpcji-desorpcji oraz chromatografii techniką cienkowarstwowej chromatografii cieczowej TLC, a rodzajem fazy stacjonarnej i składem eluentu. Przy czym, w badaniach należy wziąć pod uwagę także problem ewentualnej ograniczonej rozpuszczalności składników badanych mieszanin w stosowanych eluentach, szczególnie składników względnie polarnych w niskopolarnych eluentach lub odwrotnie. Dalekosiężnym celem niniejszej serii publikacji jest opracowanie zasad ogólnych oraz nowych/zaktualizowanych procedur wielowymiarowego (nd) i wielokolumnowego (NC) rozdzielania wieloskładnikowych mieszanin w celu otrzymywania czystych grup związków chemicznych lub czystych indywiduów. 2. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA (Experimental) 2.1. Rozpuszczalniki i eluenty (Solvents and eluents)

75 75 W badaniach zastosowano następujące eluenty: tetrahydrofuran cz.d.a. POCh (Polska), dichlorometan cz.d.a. POCh (Polska), n-heksan do HPLC Merck (Niemcy), izopropanol cz.d.a. POCh (Polska), aceton cz.d.a. POCh (Polska), eter tert-butylowo-metylowy do HPLC Merck (Niemcy) Substancje wzorcowe i próbki badane (Reference substances and examined samples) Monooleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), monopalmitynian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), dioleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), trioleinian glicerolu 99% Sigma-Aldrich (USA), kwas stearynowy 98,5% Sigma-Aldrich (USA), kwas erukowy 99% Dr Theodor Schuchardt (Niemcy), olej rzepakowy Kujawski (Polska) Płytki TLC (TLC plates) W części doświadczalnej dotyczącej cienkowarstwowej chromatografii cieczowej wykorzystano płytki aluminiowe do TLC: Si 60, F 254 Merck (Niemcy) oraz RP-18, F 254 Merck (Niemcy) Aparatura (Instruments) Zestaw do rozwijania chromatogramów cienkowarstwowych oraz wizualizacji plamek składający się z: komór chromatograficznych, strzykawki do nanoszenia próbek na płytki chromatograficzne w postaci plamek pod wyciągiem laboratoryjnym (dygestorium), lampy UV o dwóch zakresach długości promieniowania (254 nm oraz 365 nm) do wizualizacji chromatogramów, eksykator z jodem do wywoływania chromatogramów, eksykator z chlorkiem wapnia do przechowywania płytek; Zestaw do odparowania rozpuszczalnika w strumieniu azotu, w skład którego wchodzą: butla z gazem obojętnym (N 2 ); pokrywa firmy J.T. Baker (Niemcy) wykonana z poliamidu, wyposażona w igły oraz podłączenie gazu; metalowy statyw, w którym umieszcza się fiolki z próbkami; wypływ azotu umieszczony nad powierzchnią odparowywanej cieczy; Waga analityczna Radwag Metody postępowania (Methods) Procedura badania parametrów elucji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Wstępny dobór optymalnych warunków rozdzielania mono -, di-, triacylogliceroli oraz wolnych kwasów tłuszczowych wykonano, wykorzystując płytki TLC dedykowane chromatografii w normalnym (żel krzemionkowy Si60 F 254 ) oraz odwróconym (faza oktadecylosilanowa RP18 F254 ) układzie faz. Zastosowano zestaw ośmiu eluentów, charakteryzujących się różną, najczęściej względnie wysoką, siłą elucji: izopropanol (izooh), aceton (ACET), MTBE:izoprpoanol (MTBE:izoOH 3:1 v/ v), eter tert-butylowometylowy (MTBE), tetrahydrofuran (THF), dichlorometan (DCM), n -heksan:popan-2-ol (nc6:izooh 3:1 v/v), n-heksan (nc6). Jedynie n-heksan i dichlorometan charakteryzowały się niską siłą elucji w warunkach NP - TLC oraz nietypowymi oddziaływaniami sorpcyjnymi w przypadku RP-TLC (jak i inne eluenty w przypadku warunków RP brak wody w eluencie). Wykonano szereg elucji, dozując, na płytki obu rodzajów sorbentu, za pomocą strzykawki po 5 μl każdego z roztworów w dichlorometanie, tj.: mieszaniny polistyrenów, mieszaniny związków hydrofobowych z dodatkiem benzo-a-pirenu, mieszaniny związków polarnych, mieszaniny tłuszczów, oraz po 2 μl roztworów pojedynczych acylogliceroli, kwasu erukowego i próbki oleju rzepakowego w acetonie. Dozowanie wykonywano pod wyciągiem laboratoryjnym. Wysoka lotność CH 2 Cl 2 oraz acetonu zapewniała natychmiastowe odparowanie rozpuszczalnika oraz niewielkie wymiary plamek. Następnie płytki umieszczono w pozycji pionowej w komorach wysyconych parami poszczególnych rozpuszczalników. Po rozwinięciu chromatogramów płytki suszono, a efekty rozdzielania obserwowano pod lampą UV, emitującą promieniowanie o długości 254 oraz 365 nm tzw. wizualizacja w świetle UV. Dla każdego etapu wizualizacji plamek stosowano inny charakter linii obwiedni plamek, tzn. linia ciągła odpowiadała wizualizacji w świetle o długości 254 nm, natomiast linia przerywana wizualizacji w świetle o długości 365 nm. Ostatnim etapem wywoływania chromatogramów było umieszczenie płytek na 10 min. w eksykatorze z jodem (w oparach jodu) i obserwacja brązowych plamek, które powstały na skutek kontaktu z parami jodu. Warto nadmienić, iż brązowe zabarwienie plamek pojawiało się tylko wtedy gdy w strukturze danej substancji badanej obecne były wiązania podwójne w łańcuchu węglowym. Przykładowo, w przypadku kwasu erukowego obserwowano brązowe zabarwienie plamek, natomiast kwas stearynowy nie wykazywał tej

76 76 cechy. Wszystkie obserwacje uzyskane po rozwinięciu chromatogramów na płytkach TLC dokumentowano obrysowując plamki ołówkiem oraz wykonując fotografie. Retencję substancji rozdzielanych określono, obliczając współczynnik opóźnienia R f oraz współczynnik retencji k. Tab.3. Zestawienie badanych próbek. Tab.3. List of examined samples. Nazwa próbki Składniki Stężenie roztworu pojedynczego związku chemicznego TAG/DAG/MAG/WKT 1) trioleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml ZWIĄZKI POLARNE 1) metanol 2) etanol 3) woda 4) gliceryna 5) dimetyloformamid 6) kwas octowy 7) kwas mlekowy 8) kwas benzoesowy 9) aceton 2) dioleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml 3) monooleinian glicerolu 25 mg/ml 2,5 mg/ml 4) kwas erukowy 25 mg/ml 2,5 mg/ml --- po 1 mg/ml Stężenie każdego związku w roztworze mieszaniny związków chemicznych ZWIĄZKI NIEPOLARNE 1) benzen 2) ksylen 3) naftalen 4) antracen 5) metyloantracen 6) fenantren 7) piren 8) koronen 9) cykloheksan POLISTYRENY + STYREN 1) 2,75* po 1 mg/ml 2,1 mg/ml OLEJ RZEPAKOWY 2) 1,2*10 6 2,5 mg/ml --- 3) 1,2*10 5 2,12 mg/ml 4) 1,02*10 4 2,3 mg/ml 5) 0,95*10 3 4,3 mg/ml 6) styren 0,2 μl/ml Stężenie w roztworze: 25 mg/ml. 3. WYNIKI I DYSKUSJA (Results and discussion) Przedmiotem pracy jest przedstawianie wyników badań wyjaśniających wpływ eluentu oraz fazy stacjonarnej na wartość parametrów elucji, w tym, retencji wybranych modelowych związków chemicznych, reprezentujących poszczególne grupy, eluowanych w warunkach cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (TLC). Jest to pierwsza praca z serii prac poświęconych badaniom rozdzielania grupowego nisko, średnio i względnie wysoko polarnych organicznych związków chemicznych, realizowanym przez autorów już od kilku lat. Rozdzielano mono-, di-, triacyloglicerole oraz wolne kwasy tłuszczowe, wykorzystując płytki TLC dedykowane chromatografii w normalnym (żel krzemionkowy Si60 F 254 ) oraz odwróconym (faza oktadecylosilanowa RP18 F254 ) układzie faz. Przeprowadzono szereg elucji z wykorzystaniem ośmiu eluentów o zróżnicowanej sile elucyjnej, a także innych niż acyloglicerole grup organicznych związków chemicznych. W badaniach celowo wykorzystano sorbenty inne niż kopolimer styrenu i diwinylobenzenu oraz starano się dobrać odpowiedni eluent, aby możliwe było rozdzielanie tłuszczów za pomocą chromatografii wykluczania z kontrolowaną sorpcją.

77 77 Poniżej zestawiono rezultaty badań uzyskane z wykorzystaniem opisanych warunków chromatograficznych. Eluent: izopropanol Mobile phase: isopropanol A Eluent: aceton Mobile phase: acetone B Rys. 1. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: A) izopropanol, B) aceton. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 1. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si 60 F254, on the right RP 18 F254. Single-step elution mobile phase: A) isopropanol, B) acetone. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone. Eluent: MTBE:izopropanol (3:1 v/v) Mobile phase: MTBE:isopropanol (3:1 v/v) C Eluent: eter tert-butylowo-etylowy Mobile phase: methyl tert-butyl ether D Rys. 2. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: C) MTBE : izopropanol (3:1 v/v), D) MTBE. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 2. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si60 F254, on the right RP18 F254. Single-step elution mobile phase: C) MTBE : isopropanol (3:1 v/v), D) MTBE. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone.

78 78 Eluent: tetrahydrofuran Mobile phase: tetrahydrofuran E Eluent: dichlorometan Mobile phase: dichloromethane F Rys. 3. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: E) THF, F) DCM. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 3. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si60 F254, on the right RP18 F254. Single-step elution mobile phase: E) THF, F) DCM. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone. Eluent: n-heksan:izopropanol (3:1 v/v) Mobile phase: n-hexane:isopropanol (3:1 v/v) G Eluent: n-heksan Mobile phase: n-hexane H Rys. 4. Fotografie chromatogramów uzyskanych za pomocą TLC po wywołaniu plamek w parach jodu. Faza stacjonarna: po lewej Si 60 F254, po prawej RP18 F254. Rozwijanie jednostopniowe faza ruchoma: G) n-heksan : izopropanol (3:1 v/v), H) n-heksan. Oznaczenia: linia ciągła plamki widoczne przy 254 nm, linia przerywana plami widoczne przy 365 nm, plamki koloru brązowawego plamki widoczne po wywoływaniu w parach jodu. Rozdzielane próbki: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 kwas erukowy, 5 olej rzepakowy. Rozpuszczalnik próbek: aceton. Fig. 4. Photographs of chromatograms obtained by TLC after spots development in iodine vapor. Stationary phase: on the left Si60 F254, on the right RP18 F254. Single-step elution mobile phase: G) n-hexane : isopropanol (3:1 v/v), H) n-hexane. Symbols: solid line spots visible at 254 nm, dashed line spots visible at 365 nm, brownish spots spots visible after development in iodine vapor. Examined samples: 1 MAG, 2 DAG, 3 TAG, 4 erucic acid, 5 rapeseed oil. Sample solvent: acetone.

79 79 Tab. 4. Wartości współczynników R f dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu Si60. Tab. 4. The values of Rf coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile phases and Si60 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna Si60 (Si60 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,62 0,65 0,69 0,37 0,71 0 0,44 0 0,72 0,78 0,86 0,71 0,82 0,15 * 0,27 ** nc6 0,71 0 0,76 0,82 0,90 0,78 0,86 0,67 0,78 0 kwas 0,63 0,64 0,79 0,61 0,77 0,18 0,68 0 erukowy olej 0,76 0,82 0,86 0,78 0,86 0,68 0,78 0 rzepakowy * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane. Tab. 5. Wartości współczynników R f dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu RP18. Tab. 5. The values of Rf coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile phases and RP18 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna RP18 (RP18 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,67 0,68 0,84 0,71 0,85 0,36 0,74 0 0,62 0,60 0,86 0,83 0,88 0,75 * 0,71 ** nc6 0,86 0 0,41 0,41 0,89 0,86 0,89 0,82 0,88 0 kwas 0,63 0,64 0,84 0,80 0,85 0,70 0,83 0 erukowy olej rzepakowy 0,42 0,43 0,89 0,86 0,89 0,77 0,88 0 * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane.

80 80 Tab. 6. Wartości współczynników k dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu Si60. Tab. 6. The values of k coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile phases and Si60 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna Si60 (Si60 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,61 0,53 0,45 1,72 0, , ,39 0,28 0,16 0,41 0,22 5,58 * 2,76 ** nc6 0, ,32 0,22 0,11 0,27 0,16 0,49 0,29 -- kwas 0,58 0,56 0,27 0,61 0,30 4,64 0,48 -- erukowy olej 0,32 0,22 0,16 0,27 0,16 0,46 0,29 -- rzepakowy * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane. Tab. 7. Wartości współczynników k dla MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego uzyskane z zastosowaniem ośmiu różnych eluentów oraz sorbentu RP 18. Tab. 7. The values of k coefficients for MAG, DAG, TAG and sample of rapeseed oil, obtained for eight different mobile phases and RP 18 stationary phase. Próbka (Sample) MAG DAG TAG IzoOH ACET MTBE:izoOH 3:1v/v Faza stacjonarna RP18 (RP18 stationary phase) Eluent (Mobile phase) MTBE THF DCM nc6:izooh 3:1v/v 0,49 0,48 0,20 0,40 0,18 1,75 0, ,61 0,67 0,16 0,21 0,14 0,34 * 0,41 ** nc6 0, ,47 1,42 0,13 0,16 0,13 0,22 0,13 -- kwas 0,58 0,57 0,20 0,25 0,18 0,43 0,20 -- erukowy olej 1,39 1,35 0,13 0,16 0,13 0,31 0,13 -- rzepakowy * 1,2-izomer DAG, ** 1,3-izomer DAG. Stosowane skróty: IzOH = izopropanol, ACET = aceton, MTBE:izoOH = et er tertbutylowo-metylowy:izopropanol, MTBE = eter tert-butylowo-metylowy, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichlorometan, nc6:izooh = n-heksan:izopropanol, nc6 = n-heksan. * 1,2-isomer DAG, ** 1,3-isomer DAG. Abbreviations: IzOH = isopropanol, ACET = acetone, MTBE:izoOH = methyl tertbutyl ether:isopropanol, MTBE = methyl tert-butyl ether, THF = tetrahydrofuran, DCM = dichloromethane, nc6:izooh = n- hexane:isopropanol, nc6 = n-hexane. Na podstawie chromatogramów, które zostały zamieszczone w pracy (rys.1 4), jak również wartości współczynników R f i k (tab. 4 7), a także chromatogramów otrzymanych dla grup związków chemicznych: polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów (których szczegółowe wyniki zostaną przedstawione w kolejnej części tej serii prac), można wyciągnąć następujące wnioski: dla układu rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako Si 60 i ośmioma różnymi eluentami - dla grup związków chemicznych polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów: W przypadku zastosowania izopropanolu, jak również acetonu, jako fazy ruchomej uzyskano układ, gdzie występują oddziaływania o charakterze NP (polarna adsorpcja), wraz z którymi może występować

81 81 wykluczanie steryczne. Świadczy o tym zbliżona elucja polarnych i hydrofobowych związków chemicznych z delikatną przewagą większej retencji polarnych związków chemicznych. Ponadto niepolarne polistyreny uległy silnej adsorpcji, co nie powinno występować, gdyby miały miejsce tylko oddziaływania typu NP. Silna adsorpcja polistyrenów świadczy albo o występowaniu wykluczania sterycznego, albo o słabej rozpuszczalności tych związków chemicznych w eluencie. Silniejsza adsorpcja polarnych związków chemicznych, aniżeli hydrofobowych została zaobserwowana, gdy eluentem była mieszanina MTBE:izopropanolu (3:1 v/v), jednak żadna z tych mieszanin nie uległa rozdzieleniu. Polisty reny nie uległy elucji w ogóle, co potwierdziło słabą rozpuszczalność tych związków w izopropanolu, który jest składnikiem eluentu. Z koleji niewielka elucja polistyrenów (R f 0,025) została zaobserwowana dla MTBE jako fazy ruchomej. W tym przypadku miała również miejsce zwiększona adsorpcja polarnych związków chemicznych. Natomiast hydrofobowe związki chemiczne wykazały zwiększoną retencję i uzyskane zostało ich rozdzielenie. Podobne obserwacje odnotowano także, gdy użytym eluentem był THF. DCM powoduje z kolei zwiększoną retencję polarnych związków chemicznych (zostają na linii startu ), która może wynikać ze słabej rozpuszczalności niektórych związków chemicznych w DCM (np. woda). W przypadku hydrofobowych związków chemicznych, można zauważyć, że związki chemiczne silniej sorbowane zostają rozdzielone, natomiast te, wykazujące niższą retencję nie uległy rozdzieleniu. Polistyreny ulegają elucji, jednak nie rozdzielają się. Zaobserwowano, iż n-heksan posiada zbyt niską siłę elucji i/lub jest zbyt słabym rozpuszczalnikiem dla badanych związków chemicznych, aby przy zastosowaniu sorbentów Si 60 (jak również RP 18 ) rozdzieleniu uległy jakiekolwiek związki chemiczne, poza silnie hydrofobowymi. Jednakże dodatek izopropanolu do eluentu (n-heksan:izopropanol (3:1 v/v)), spowodował, że nastąpiło częściowe rozdzielenie hydrofobowych związków chemicznych, jednak polarne związki chemiczne pozostały nierozdzielone i posiadały retencję zbliżoną do najsilniej sorbowanych hydrofobowych związków chemicznych. - dla tłuszczów, tj. MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego: Podczas stosowania izopropanolu jako eluentu tłuszcze są eluowane zgodnie z malejącą masą cząsteczkową, za wyjątkiem kwasu erukowego (WKT), który to jest eluowany przed monooleinianem glicerolu (MAG). Elucja w tej samej kolejności, tj.: TAG, DAG, WKT, MAG miała także miejsce, gdy zastosowane zostały następujące fazy ruchome: MTBE, THF oraz n-heksan:izopropanol (3:1 v/v). Natomiast elucja całkowicie zgodna z malejącą masą cząsteczkową (tj. bez zamiany kolejności elucji MAG oraz WKT) miała miejsce w przypadku zastosowania acetonu jako fazy ruchomej. Dodatkowo, warunki tego rozdzielania okazały się bardziej korzystne niż w przypadku użycia izopropanolu, ponieważ uzyskano niższe wartości współczynników retencji (tab. 6), co sugeruje krótszy czas trwania analizy; dyskusyjna pozostała natomiast kwestia efektywnego rozdzielania DAG i TAG (mają zbliżone współczynniki retencji). Z kolei najniższymi wartościami współczynników retencji charakteryzowały się próbki rozdzielane w mieszaninie MTBE:izoOH (3:1v/v). W przypadku tego układu rozdzielczego prawdopodobnie występuje wykluczanie steryczne z sorpcją typu NP. Należałoby sprawdzić za pomocą kolumnowej chromatografii wykluczania czy możliwe jest rozdzielenie TAG i DAG, ponieważ z rezultatów uzyskanych za pomocą TLC wynika, iż retencja obu związków jest zbliżona. Gdy jako fazę ruchomą zastosowano MTBE zaobserwowano, iż tłuszcze zostały lepiej rozdzielone niż w przypadku zastosowania mieszaniny MTBE:izopropanol (3:1 v/v), jednak MAG uległ znacznie silniejszej adsorpcji, co może znacznie wydłużać czas analizy, gdyby opisywane warunki zostały przeniesione do kolumnowej chromatografii wykluczania. W przypadku zastosowania tego układu chromatograficznego w kolumnowej GPC, może być konieczne zastosowanie zaworu przepływu zwrotnego. Po zastosowaniu DCM jako eluentu, tłuszcze są eluowane w kolejności: trioleinian glicerolu; 1,3-dioleinian glicerolu; kwas erukowy; 1,2-dioleinian glicerolu. W przypadku zastosowania układu rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako Si 60 i DCM jako eluentem możliwe jest zatem rozdzielenie próbki DAG na dwa izomery, charakteryzujące się różną polarnością, przy czym izomer 1,3 - jest mniej polarny aniżeli izomer 1,2.Tłuszcze są lepiej rozdzielone niż w przypadku zastosowania tetrahydrofuranu jako eluentu, jednak WKT oraz obydwa izomery DAG uległy znacznie silniejszej adsorpcji, co może znacznie wydłużać czas analizy, gdyby opisywane warunki zostały przeniesione do kolumnowej chromatografii wykluczania. M onooleinian glicerolu zostaje na linii startu. W przypadku zastosowania tego układu chromatograficznego w kolumnowej GPC, również konieczne byłoby zastosowanie zaworu przepływu zwrotnego. Oddziaływania, jakie mają miejsce mają charakter układu NP (polarna adsorpcja). Współczynniki opóźnienia dla acylogliceroli i wolnych kwasów tłuszczowych, uzyskane po zastosowaniu mieszaniny n-heksan:izopropanol (3:1 v/v), wskazują na to, iż w kolumnowej GPC mogą się one dobrze rozdzielać. Oddziaływania, jakie mają miej sce w tym wypadku to prawdopodobnie wykluczanie steryczne z adsorpcją typu RP (hydrofobowa adsorpcja). Ponownie, n-heksan, stosowany bez dodatku izopropanolu, posiada zbyt niską siłę elucji i/lub jest zbyt słabym rozpuszczalnikiem dla badanych związków chemicznych, aby przy zastosowaniu sorbentów Si 60 i RP 18 rozdzieleniu uległy jakiekolwiek związki chemiczne, poza silnie hydrofobowymi. Po przeanalizowaniu wyników większości jednostopniowych elucji (poza tą, gdzie fazą ruchomą był właśnie n -heksan), zauważalne jest także, że głównym składnikiem obecnym w próbce oleju rzepakowego są triacyloglicerole. dla układ rozdzielczego z sorbentem oznaczonym jako RP 18 i ośmioma różnymi eluentami: - dla grup związków chemicznych polarnych, hydrofobowych oraz polistyrenów:

82 82 Układ rozdzielczy z izopropanolem jako eluentem charakteryzuje się występowaniem oddziaływań o charakterze RP (hydrofobowa adsorpcja). Hydrofobowe związki chemiczne są dobrze rozdzielone, a polarne związki chemiczne są szybko eluowane. Podobnie jak miało to miejsce w przypadku użycia sorbentu Si 60, wystąpiła silna adsorpcja polistyrenów, co potwierdza ich niską rozpuszczalność w izopropanolu. Po zastosowaniu acetonu jako eluentu, można zauważyć lepsze rozdzielenie związków hydrofobowych, a tak że delikatną elucję polistyrenów, co dementuje hipotezę, iż polistyreny miałyby się nie rozpuszczać w acetonie. Zauważalne jest, że w przypadku zastosowania MTBE, jak również THF, jako fazy ruchomej polistyreny ulegają elucji, natomiast gdy do eluentu dodany został izopropanol (MTBE:izopropanolu (3:1 v/v)) elucja nie zachodziła. W układzie rozdzielczym z mieszaniną MTBE:izopropanolu (3:1 v/v) zauważalna jest silniejsza sorpcja hydrofobowych związków chemicznych, niż polarnych, natomiast układ rozdzielczy bez dodatku izopropanolu do MTBE oraz ten, w którym eluentem jest THF, charakteryzuje się zbliżoną adsorpcją polarnych związków chemicznych i hydrofobowych. Jednak w tym przypadku, gdy fazą ruchomą jest MTBE, polarne związki chemiczne uległy nieco silniejszej adsorbcji. Zastosowanie DCM jako eluentu, powoduje spadek retencji hydrofobowych związków chemicznych w porównaniu do rezultatów uzyskanych przy zastosowaniu fazy stacjonarnej oznaczonej jako Si 60 i DCM jako eluentu, jednak związki chemiczne nie zostały całkowicie rozdzielone. Polarne związki chemiczne są sorbowane w sposób podobny jak przy zastosowaniu sorbentu Si 60. Obserwuje się jednak znacznie lepsze rozdzielenie polistyrenów. W przypadku zastosowania mieszaniny n-heksan:izopropanol (3:1 v/v) oraz sorbentu oznaczonego jako RP 18, zauważalne jest lepsze rozdzielenie hydrofobowych związków chemicznych, niż przy zastosowaniu sorbentu Si 60, podczas gdy polarne związki chemiczne wykazują znacznie niższą retencję. Polistyreny rozdzielają się w podobny sposób jak przy zastosowaniu sorbentu Si dla tłuszczów, tj. MAG, DAG, TAG oraz próbki oleju rzepakowego: W układach rozdzielczych, gdzie zastosowano izopropanol, jak również aceton jako fazę ruchomą acyloglicerole są eluowane zgodnie z rosnącą masą cząsteczkową i rosnącą hydrofobowością. Jednakże, w przypadku izopropanolu można ponownie zaobserwować odwróconą kolejność elucji WKT i MAG. Oba układy (zarówno ten z izopropanolem jak i acetonem) stwarzają lepsze warunki do rozdzielania tłuszczów niż Si 60, co można stwierdzić na podstawie otrzymanych wartości parametrów elucji. W przypadku gdy eluentem był MTBE lub THF acyloglicerole były eluowane w kolejności zgodnej z malejącą masą cząsteczkową i malejącą hydrofobowością. W przypadku stosowania MTBE ponownie moż na zaobserwować odwróconą kolejność elucji WKT i MAG, a oddziaływania, jakie występują mają charakter NP (polarna adsorpcja), ewentualnie z wykluczaniem sterycznym. Kwestia efektywnego rozdzielania MAG i WKT (mają takie same współczynniki retencji) pozostaje dyskusyjna w układzie rozdzielczym, w którym zastosowany został THF, a mechanizmem decydującym o rozdzielaniu jest wykluczanie steryczne. Układ ten wprawdzie charakteryzuje się niską retencją tłuszczów, jednak zbliżone współczynniki opóźnienia R f (tab. 7) świadczą o tym, że związki mogą ulegać elucji w bardzo zbliżonym czasie retencji i nie rozdzielać się należy to sprawdzić za pomocą kolumnowej chromatografii wykluczania. Gdy eluent zawierał dodatek izopropanolu (MTBE:izopropanol (3:1 v/v)) wśród tłus zczów, zauważono dominację wykluczania sterycznego z oddziaływaniami typu RP związki są eluowane w kolejności: TAG, DAG, MAG, WKT, czyli w kolejności podyktowanej malejącą masą cząsteczkową, natomiast dyskusyjna pozostaje kwestia efektywnego rozdzielania MAG i WKT (mają takie same współczynniki retencji). Należałoby sprawdzić czy acyloglicerole i wolne kwasy tłuszczowe ulegają rozdzieleniu przy zastosowaniu kolumnowej GPC w tych samych warunkach rozdzielczych. W przypadku zastosowania DCM jako fazy ruchomej tłuszcze były eluowane w kolejności: trioleinian glicerolu; 1,2-dioleinian glicerolu; 1,3-dioleinian glicerolu; kwas erukowy; monooleinian glicerolu, a oddziaływania, jakie miały miejsce to najprawdopodobniej wykluczanie steryczne, być może z oddziaływaniami o charakterze NP (polarna adsorpcja). Zastosowanie kolumnowej GPC do dokładniejszego zbadania charakteru oddziaływań, jakie mają miejsce, powinno zapewnić dobre rozdzielenie TAG; 1,2-DAG; MAG i WKT, jednak silna sorpcja MAG prawdopodobnie wymagać będzie zastosowania zaworu przepływu zwrotnego. Po zastodowaniu DCM jako eluentu dyskusyjna pozostaje natomiast kwestia efektywnego rozdzielania 1,3-DAG oraz WKT (zbliżone współczynniki retencji). W mieszaninie n-heksan:izopropanol (3:1 v/v), tłuszcze są eluowane w kolejności: TAG, DAG, WKT, MAG, a mechanizmem decydującym o rozdzielaniu prawdopodobnie jest wykluczanie steryczne. Gdy n-heksan jest pozbawiony dodatku izopropanolu, MAG i DAG zostają na linii startu, nie ulegając elucji w ogóle. Jedynie TAG oraz WKT wykazuje rozmycie plamki, co widoczne jest także po próbie rozdzielenia próbki oleju rzepakowego, gdzie stężenie TAG jest wysokie. Świadczy to o niezbyt wysokiej sile elucyjnej n-heksanu oraz o tym, że przyczyną braku elucji MAGów i DAGów jest ich słaba rozpuszczalność w eluencie.

83 83 Tab. 8. Prawdopodobnie występujące oddziaływania pomiędzy cząsteczkami rozdzielanych związków chemicznych a powierzchnią fazy stacjonarnej, występujące w badanych warunkach chromatograficznych TLC. Tab. 8. Probable interactions occurring, in examined TLC conditions, between molecules of separated compounds and the stationary phase surface. Eluenty (Mobile phase) Si60 Stosowane fazy stacjonarne (Stationary phases used) Izopropanol (isopropanol) GPC/SEC-NP lub NP-LC RP-LC Aceton (acetone) GPC/SEC-NP GPC/SEC-RP MTBE : izopropanol (3:1 v/v) (MTBE:isopropanol) (3:1 v/v) GPC/SEC-NP GPC/SEC-RP MTBE GPC/SEC-NP NP-LC lub GPC/SEC-NP THF NP-LC GPC/SEC DCM NP-LC GPC/SEC-NP lub GPC/SEC n-heksan : izopropanol (3:1 v/v) (n-hexane:isopropanol) (3:1 v/v) GPC/SEC-NP GPC/SEC n-heksan (n-hexane) - - W tab. 8 zestawiono podsumowanie wniosków cząstkowych na temat oddziaływań, jakie najprawdopodobniej mają miejsce w poszczególnych układach chromatograficznych. W przypadku, gdy charakter mechanizmu rozdzielania określono mianem wyłącznie, "wykluczania" (GPC/SEC), mamy do czynienia praktycznie z czystym wykluczaniem sterycznym rozdzielanych związków chemicznych. Gdy układ chromatograficzny posiada cechy układu GPC/SEC -NP, o rozdzielaniu związków chemicznych decyduje występowanie, obok wykluczania sterycznego, oddziaływań dyspersyjnych, dipolowych, polarnych oraz wodorowych, zaś gdy posiada cechy GPC/SEC-RP obok wykluczania sterycznego, występowanie oddziaływań van der Waalsa, a także o charakterze π-π, π-para elektronowa i kwadrupolowych. 4. WNIOSKI KOŃCOWE Technika TLC pozwoliła na uzyskanie orientacyjnych informacji na temat rozdzielczości i retencji badanych związków chemicznych. Z przeprowadzonych badań wynika, iż określone modyfikacje warunków kolumnowej chromatografii wykluczania mogą prowadzić do zmian rozdzielczości i selektywności układów rozdzielczych. Poznanie oddziaływań, jakie mają miejsce między cząsteczkami tłuszczów i produktów ich konwersji a powierzchnią fazy stacjonarnej oraz znalezienie optymalnego składu eluentu i programu elucji może i powinno być dokonywane z zastosowaniem techniki chromatografii cienkowarstwowej (TLC), co w zasadniczym stopniu przyspiesza oraz ułatwia dobór optymalnych warunków separacji. Następnie, zasadne jest przeniesienie najważniejszych wniosków do warunkó w wysokosprawnej chromatografii kolumnowej (HPLC), najpierw w skali modelowej, a następnie, preparatywnej. W ten sposób można w zasadniczym stopniu przyśpieszyć opracowanie optymalnych warunków rozdzielania grupowego oraz "szczegółowego" skomplikowanych mieszanin związków chemicznych, w tym, tłuszczów i produktów ich konwersji. Realizowane badania powinny w przyszłości pozwolić na opracowanie zautomatyzowanej aparatury do wielokolumnowego (NC) i wielowymiarowego (nd), preparatywnego rozdzielania tłuszczów i produktów ich konwersji.. Docelowo taka zautomatyzowana aparatura może posłużyć do otrzymywania użytkowych ilości "wzorców" tłuszczów i produktów ich konwersji. Podczas przenoszenia warunków rozdzielania zastosowanych podczas badań TLC do chromatografii kolumnowej (HPLC), należy pamiętać, iż w przypadku chromatografii cieczowej, w tym, w chromatografii wykluczania (GPC/SEC), najbardziej korzystne są warunki, gdy rozpuszczalnikiem składników rozdzielanej mieszaniny jest eluent, a w przypadku elucji gradientowej ciecz o składzie identycznym jak początkowy eluent w programie elucji. W warunkach klasycznej chromatografii wykluczania eluent, będący rozpuszczalnikiem mieszaniny dozowanej do kolumny powinien, dodatkowo, zapewnić minimalizację, a najkorzystniej brak oddziaływań sorpcyjnych wszystkich składników rozdzielanej mieszaniny z powierzchnią porów wypełnienia kolumny. Wówczas elucja z kolumny ma miejsce w kolejności od największych do najmniejszych cząsteczek. Największe mają do dyspozycji jako "drogę dyfuzji" tylko niewielką przestrzeń największych porów w wypełnieniu kolumny. Najmniejsze największą przestrzeń wszystkich porów największych, średnich i najmniejszych. Powyższe dotyczy klasycznej chromatografii wykluczania, a więc przy braku oddziaływań sorpcyjnych składników rozdzielanej mieszaniny z powierzchnią mikro -porów wypełnienia kolumny. Natomiast w przypadku, gdy skład eluentu oraz faza stacjonarna kolumny zostały w ten sposób dobrane, że oprócz efektu wykluczania, będą miały miejsce słabe oddziaływania adsorpcyjne, do tego korzystnie, tym silniejsze, im niższa masa molekularna rozdzielanych substancji - powinno to powodować wzrost rozdzielczości tak zaprojektowanego układu rozdzielczego, podobnie, jak to obserwowano podczas badań techniką TLC, opisanych w niniejszej pracy. RP18

84 84 Takie warunki powinny mieć wówczas miejsce, gdy powierzchnia sorpcyjna wypełnienia kolumny, charakteryzująca się określonym rozkładem wielkości porów dostosowanym do wielkości rozdzielanych cząsteczek. Jednocześnie jest nieco polarna, a eluent nie jest na tyle polarny, by zapewniał całkowitą eliminację adsorpcji. Gdy w takich warunkach rozdzielaniu grupowemu mają podlegać np. tri -, di- oraz monoacyloglicerole TAG/DAG/MAG, wówczas oczywista wydaje się być kolejność elucji: 1 TAG, 2 DAG, 3 MAG, ponieważ w tej kolejności wzrasta polarność w/w grup składników rozdzielanej mieszaniny. Jednakże, jak wykazały badania TLC, gdy mieszanina zawiera także wolne kwasy tłuszczowe (WKT), to kolejność elucji już nie jest oczywista, gdyż WKT są co prawda względnie mniejszymi cząsteczkami od TAG/DAG/MAG i w warunkach klasycznej GPC/SEC powinny być eluowane jako ostatnie, jednak są znacznie mniej polarne niż monoacyloglicerole (MAG'i). Kolejność elucji w warunkach GPC -NP może wówczas zależeć od polarności eluentu oraz od polarności fazy stacjonarnej. Istnieje możliwość doboru w ten sposób rodzaju fazy stacjonarnej oraz rodzaju eluentu, by mimo niezbyt wysokiej sprawności kolumny, tzn. ograniczonej liczbie półek teoretycznych, nie tylko miało miejsce rozdzielanie grupowe, ale by odwrócona została kolejność elucji dwóch ostatnich grup MAG/WKT. Badania wykonane techniką HPLC, których rezultaty będą przedmiotem kolejnej publikacji wykazały, że jest też możliwe, by miało miejsce częściowe rozdzielanie pod względem polarności w ramach poszczególnych grup, szczególnie w ramach grupy WKT i MAG'ów. Jednakże, kolumna HPLC, typu GPC/SEC -NP powinna wówczas charakteryzować się bardzo wysoką sprawnością (bardzo wysoka liczba półek teoretycznych (N)). Stąd, warunki GPC/SEC - NP są przydatne do wstępnego rozdzielania grupowego. Natomiast, "szczegółowe" rozdzielanie pod względem zróżnicowania polarności jest celowe w typowych warunkach NP -HPLC, z elucją gradientową. W przypadku rozdzielania bardzo skomplikowanych mieszanin, można, a czasem należy, najpierw dokonać rozdzielania "wstępnego" w warunkach HPLC - GPC-SEC-NP, a następnie poszczególne frakcje rozdzielać w warunkach NP-HPLC z elucją gradientową [A. Stołyhwo, wyniki niepublikowanych badań]. Jest to szczególnie celowe gdy celem rozdzielania jest preparatywne wydzielanie czystych związków chemicznych, albo określonych grup związków chemicznych. Odwrotna sytuacja będzie miała miejsce, gdy wraz ze spadkiem wielkości cząsteczek (spadkiem masy molekularnej) będzie miał miejsce wzrost hydrofobowości i spadek polarności składników, lub grup składników rozdzielanej mieszaniny. Taka sytuacja jest dość rzadka, jednak nie jest wykluczona. Wówczas korzystne może być powiązanie warunków chromatografii wykluczania z warunkami słabych oddziaływań hydrofobowych GPC/SEC-RP. Na zakończenie należy zwrócić uwagę, że badania ostatnich lat wykazują [18-21], że rozdzielanie poszczególnych izomerów acylogliceroli jest możliwe z wykorzystaniem HPLC i faz stacjonarnych typu C18 lub podobnych, o wysokim stopniu hydrofobowości powierzchni sorpcyjnej oraz z wykorzystaniem elucji gradientowej i z takimi bezwodnymi składnikami eluentu, jak, dichloroetan, dichlorometan, chloroform, acetonitryl itp. Jednocześnie kolumny "typu RP" powinny charakteryzujących się bardzo wysoką sprawnością oraz wysoką selektywnością. Badania nad zastosowaniem wysokosprawnej wielowymiarowej (nd) i wielokolumnowej (NC) chromatografii cieczowej do rozdzielania w skali semi-preparatywnej mieszanin tłuszczów i produktów ich konwersji, w celu otrzymywania czystych grup związków chemicznych / określonych indywiduów chemicznych są przedmiotem kolejnej przygotowywanej publikacji. Conclusions TLC technique allows to obtain approximate information about resolution and retention of the examined compounds. Partial conclusions summarizing interactions, which most probably take place in various chromatographic systems is presented in tab.12. In cases where the nature of the separation mechanism is denoted as GPC/SEC, only steric exclusion of separated chemical compounds takes place. When the chromatographic system has the characteristics of the GPC/SEC-NP, the separation of chemicals is based on occurrence of dispersion, dipole, polar and hydrogen interactions, next to steric exclusion. When the chromatographic system has the characteristics of the GPC/SEC-RP next to steric exclusion, there also occur van der Waals forces, as well as a π-π, π-electron pair and quadrupole ones. Our research shows that certain modifications of size-exclusion chromatography may lead to changes in resolution and selectivity of chromatographic systems. Good cognition and knowledge of interactions that take place between molecules of fats (and products of their conversion) and the surface of the stationary phase, as well as, finding an optimal mobile phase composition and elution program, can and should be done by means of thin layer chromatography (TLC), as TLC technique crucially accelerates and facilitates the selection of optimal conditions for separation. In next step, it is justifiable to transfer, first to model scale and than to preparative scale, the most important conclusions form TLC to high performance liquid chromatography (HPLC) conditions. In such a way, it is possible to significantly accelerate the process of optimal conditions selection for group and detailed separation of complex mixtures of chemical compounds, including fats and products of their conversion. In future, conducted studies should led to construction of an automated multi-column (NC) and multi-dimensional (nd) separation system which could be used for

85 85 preparative separation of fats and products of their conversion. Ultimately, such automated chromatographic system should have potential to be used in fats standards production. When transferring separation conditions used in the thin layer chromatography (TLC) to high performance liquid chromatography (HPLC), it should be noted that in the case of liquid chromatography, including exclusion chromatography (GPC/SEC), the solvent of the sample should be the same as mobile phase used. In case of a gradient elution the solvent should have identical composition as the initial mobile phase used in elution program. During classical size exclusion chromatography, the mobile phase has to ensure minimization, or preferably, absence of sorption interactions between all components of the sample being separated and the surface of the pores of the stationary phase. Then the elution of substances form the column takes place in the order from the largest to the smallest particles. The biggest ones have, as the diffusion path, only a small space of the largest pores of stationary phase at their disposal. Th e smallest ones have the biggest space the space of all pores (the largest, medium and smallest). The same applies to the "classical" size exclusion chromatography, when the sorption interactions between components of separated sample and the surface of the micro-pores of the column packing are absent. However, in the case where the mobile phase composition and the stationary phase of the column have been selected in such a way that, in addition to exclusion effects, weak adsorption interactions take plac e preferably, the stronger the lower the molecular weight of the separated sample is an increase of resolution in such 'designed' separation system should be obtained, as it was observed during the studies carried out by means of TLC and described in this paper. Such conditions should take place when the sorption area of stationary phase has a defined pore size, which is properly and adequately selected for the size of separated particles. At the same time, the stationary phase should be slightly polar, while the mobile phase is not sufficiently polar to provide complete elimination of adsorption. When tri -, di- and monoalyloglycerols are subjected to separation in described conditions, the order of elution seems to be obvious: 1 TAG, 2 DAG, 3 MAG, according to increasing polarity. However, as it was proved by TLC studies, when the examined sample contained also free fatty acids (FFA) the elution order was not so clear and obvious. However, FFA are relatively smaller particles than TAG/DAG/MAG and in case of classical GPC/SEC they should be eluted as the last ones, they are significantly less polar than monoacylglycerols (MAG). The elution order in GPC -NP conditions may depend on the polarity of the mobile phase and the polarity of the stationary phase. Despite of quite low efficiency of the column, i.e. a limited number of theoretical plates, there is a possibility to select a stationary phase type and a type of mobile phase in such a way to obtain good group separation and reversed elution order o f the last two groups, i.e. MAG/FFA. Studies carried out by HPLC technique, the results of which will be the subject of another paper, revealed that it is also possible to obtain group separation in relation to polarity, especially within the FFA and MAG groups. However, the GPC/SEC-NP HPLC columns should than have a very high efficiency (a very high number of theoretical plates (N)). Therefore, the GPC/SEC-NP conditions are useful for the initial group separation. In contrast, detailed separation, in rel ation to polarity differences, is advisable during classical NP-HPLC conditions with gradient elution. In the case of highly complex mixtures separation, it is possible or sometimes indispensable, to firstly perform initial separation by HPLC - GPC/SEC-NP, and then separate respective fractions by means of NP -HPLC with gradient elution [A. Stołyhwo, unpublished results of studies]. It is particularly advisable when the aim of the separation is to obtain pure chemical compounds or groups of compounds in preparative scale. Opposite situation will take place when during the particle size decrease (and the molecular mass decrease) the hydrophobicity of separated compounds (or group of compounds) will increase and their polarity will decrease. Such situation occurs infrequently, however is possible. Then, it may be profitable to link up the GPC/SEC conditions with the conditions of weak hydrophobic interactions GPC/SEC-RP. Finally, it should be noticed that recent studies [18-21] showed that the separation of individual acyloglycerol isomers is possible by means of HPLC and C18 (or similar) stationary phases, with gradient elution, and with anhydrous mobile phases such as dichloroethane, dichloromethane, chloroform, acetonitrile, etc. Simultaneously, the columns of RP-type should be characterized by a very high efficiency and high selectivity. Studies concerning usage of high performance multi -diemnsional (nd) and multicolumn (NC) liquid chromatography for separation of fats and products of their conversion in semi-preparative scale, in order to obtain pure chemical compounds or groups of compounds, are the subject of the next research paper. Podziękowania (Acknowledgements) Prace były finansowane przez Narodowe Centrum Nauki numer rejestracyjny projektu badawczego: N N , numer umowy: 4172/B/P01/2009/37, pt. "Wykorzystanie chromatografii wykluczania i adsorpcji do rozdzielania i oznaczania grupowego lipidów i produktów konwersji w tłuszczach jadalnych"

86 86 5. LITERATURA (Literature) 1. Praca zbiorowa pod red. R. Aparicio, J. Harwood, Handbook of olive oil, Springer, New York Praca zbiorowa pod red. F.D. Gunstone, J.L. Harwood, A. J. Dijkstra, The lipid handbook, CRC Press, New York T. Płatek, Wybrane problemy procesu rafinacji oleju rzepakowego, Tłuszcze Jadalne, 41 (2006) Norma PN-EN 14105: 2004 Produkty przetwarzania olejów i tłuszczów. Estry metylowe kwasó w tłuszczowych (FAME). Oznaczanie zawartości wolnego i ogólnego glicerolu oraz mono -, di i triacylogliceroli. 5. Norma PN-EN 14106: 2004 Produkty przetwarzania olejów i tłuszczów. Estry metylowe kwasó w tłuszczowych (FAME). Oznaczanie zawartości wolnego glicerolu. 6. Norma PN EN-ISO 5508: 1996 Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą GC. 7. Norma PN EN-ISO 6800: 2002 Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych pozycji 2 cząsteczek triacylogliceroli. 8. Norma PN EN-ISO 8420: 2004 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie zawartości związków polarnych. 9. Norma PN EN-ISO 9936: 2007 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie zawartości tokoferoli i tokotrienoli. Metoda HPLC. 10. Norma PN-EN ISO 12228: 2002 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie poszczególnych steroli i ich całkowitej zawartości. Metoda GC. 11. Norma PN-EN ISO 16931: 2009 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie zawartości spolimeryzowanych triacylogliceroli metodą chromatografii sitowej (HP SEC). 12. Norma PN-EN ISO 18395: 2008 Oleje i tłuszcze roślinne i zwierzęce. Oznaczanie mono-, di-, triacylogliceroli i glicerolu metodą chromatografii sitowej (HP SEC). 13. B. Fuchs, R. Suess, K. Teuber, M. Eibisch, J. Schiller, Lipid analysis by thin layer chromatography a review of the current state, Journal of Chromatography A, 1218 (2011) P. Dudley, R. Anderson, Separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thin -layer chromatography, Lipids, 10 (1975) R. Wilson, J.R. Sargent, High-resolution separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thinlayer chromatography, Journal of Chromatography A, 623 (1992) J.J. Myher, A. Kuksis, General strategies in chromatographic analysis of lipids, Journal of Chromatography B, 671 (1995) D. Allan, S. Cockroft, A modified procedure for thin-layer chromatography of phospholipids, The Journal of Lipid Research, 23 (1982) Praca zbiorowa pod red. J. L. Sebedio, E.G. Perkins, New trends in lipid and lipoprotein analyses, AOCS Press, Champaign M. Cerkowniiak, A. Puckowski, P. Stepnowski, M. Gołębiewski, The use of chromatographic techniques nfor the separation and the identification of insect lipids, Journal of Chromatography B, 937 (2013), F. Sakouhi, Ch.Absalon, H. Kallel, S. Boutkhchina, Comparative analysis of triacyloglicerols from Olea europea L.fruits using HPLC and MALDI-TOFS., European Journal of Lipid Science and Technology 2010, 112, P.Q. Tranchida, P. Donato, P. Dugo, G. Dugo, L. Mondello, Comprehensive chromatographic methods for the analysis of lipids, Trends in Analytical Chemistry, Vol 26, No,.3, 2007.

87 CAMERA SEPARATORIA Volume 7, Number 1 / June 2015, pp Paweł PISZCZ, Magdalena TOMASZEWSKA, Bronisław K. GŁÓD* Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny w Siedlcach ul. 3 Maja 54, Siedlce *Autor do korespondencji, bkg@onet.eu O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Część II. Właściwości antyoksydacyjne mięsa. Streszczenie: Antyoksydanty są związkami zapobiegającymi lub opóźniające utlenianie zachodzące w organizmie ludzkim i produktach spożywczych. Te, które występują w żywności, są korzystne dla naszego zdrowia, wspomagają leczenie i profilaktykę chorób. Do tej pory niewiele jest informacji na temat żywności pochodzenia zwierzęcego. W mięsie po uboju dochodzi do niekontrolowanych reakcji chemicznych, obniżenia ph oraz powstawania nowych antyoksydantów. W trakcie przygotowywania mięsa do spożycia następują zmiany w mikrostrukturze tkanki łącznej i włókien mięśniowych, które w efekcie powodują zmiany właściwości antyoksydacyjnych. Celem pracy było (i) zbadanie możliwości oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego (CPA), odniesionego do rodnika DPPH, za pomocą TLC; (ii) zastosowanie opracowanej metody do oznaczania CPA wyrobów mięsnych oraz (iii) zastosowanie TLC jako fingerprint (odcisk palca) właściwości antyoksydacyjnych mięs. Słowa kluczowe: chromatografia cienkowarstwowa, TLC; 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl, DPPH; antyoksydanty; całkowity potencjał antyoksydacyjny, CPA, mięso. About the possibility of application of thin layer chromatography to the measurements of the total antioxidant potential. Part II. Antioxidant properties of the meat. Abstract: Antioxidants are compounds which prevent or delay the oxidation occurring in the human b ody and/or food products. Those, occurring in the food are advantageous for our health; enhance treatment and prevention of diseases. So far, there is little information on food of animal origin. In the meat after slaughter occurs uncontrolled chemical reactions decreased ph and the formation of new antioxidants. During the meat preparation for consumption changes occur in the microstructure of connective tissue and muscle fibers that have the effect on changes in their antioxidant properties. The aim of this study was (i) examine the possibility of determining of total antioxidant capacity (CPA), referred to the DPPH, by TLC; (ii) the application of this method for the determination of the CPA of meat and (iii) the use of TLC as a fingerprint of antioxidant properties of meats. Key words: thin layer chromatography, TLC; 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH; antioxidants; total antioxidant potential, TAP, meat. 1. Wprowadzenie (Introduction) Skład mięsa zależy od wieku, masy zwierzęcia, płci, gatunku i zmian jakie zachodzą w tuszy po uboju. Mięso zwierząt rzeźnych zawiera pełnowartościowe białka, niezbędne aminokwasy, które są potrzebne do budowy tkanek, a organizm człowieka nie jest w stanie sam sobie ich wytworzyć. Z żywieniowego punktu widzenia mięso jest także źródłem związków mineralnych oraz witamin. Ich zawartość waha się w zależności od poszczególnych mięśni i części tuszy ale także od sposobu żywienia i gatunku zwierzęcia. W ciągu 24 godzin ustala się glikogenoliza (rozkład glikogenu do glukozy lub glukozo-6-fosforanu) i końcowe ph (5,3-5,7). Poszczególne gatunki mięsa i ryb różnią się pomiędzy sobą barwą, wielkością i strukturą tkanki mięśniowej/tłuszczowej [1-3].

88 88 Istotną rolę w przeciwdziałaniu powstawania uszkodzeń wolnorodnikowych pełnią związki hamujące wytwarzanie rodników i/lub uczestniczące w przemianie ich w nieaktywne pochodne. Związki te, tworzą system antyoksydacyjny, a ze względu na mechanizm działania dzieli się je na enzymatyczne i nieenzymatyczne, niskocząsteczkowe (askorbinian, tokoferol, koenzym CoQ, glutation). Do antyoksydantów enzymatycznych zalicza się katalazę (CAT), peroksydazę glutationową (GPx) czy dysmutazę ponadtlenkową (SOD) [4-6]. Antyoksydanty dzielimy również na hydrofobowe (lipofilne), występujące w błonach komórkowych i lipoproteinach osocza, i hydrofilowe, występujące w cytoplazmie komórek i płynach pozakomórkowych [7]. Problemem analitycznym jest oznaczenie obu grup antyoksydantów. 2. Część Eksperymentalna (Experimental) Aparatura (Apparatus) Pomiary chromatograficzne techniką TLC wykonane zostały przy użyciu komór chromatograficznych typu DS II d (Chromdes, Lublin) o wymiarach 10 x 5 cm i 20 x 20 cm oraz płytek szklanych, pokrytych żelem krzemionkowym NP (Silicagel 60 i Silicagel 60 F 254S ) lub pokrytych żelem krzemionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (RP -18WF 254S ) (Merck, Niemcy) o wymiarach 5 x 10 cm i grubości 0,25 mm. Rejestracji i przetwarzania danych dokonano za pomocą skanera HP Scanjet G210 oraz pakietu oprogramowania ScionImage oraz ImageJ [8]. Odczynniki chemiczne (Chemicals/reagents) W trakcie badań wykorzystano odczynniki: n-heksan cz.d.a., etanol cz.d.a. 96,6 %, 2-propanol cz.d.a., wodoroortofosforan disodu, diwodoroortofosforan sodu (Chempur, Piekary Śląskie, Polska), aceton cz.d.a (Stanlab, Lublin), metanol HPLC grade (Honeywell, Niemcy), dichlorometan HPLC, 35 % kwas solny cz.d.a., kwas galusowy (POCh, Gliwice, Polska), acetonitryl Chromasolv, DPPH, 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (Sigma-Aldrich, Niemcy). Materiał badawczy (Materials) Jako materiał do badań zastosowano dwa rodzaje mięsa drobiowego (filet z indyka, filet z kurczaka), trzy rodzaje mięsa wołowego (szponder wołowy, cielęcinę, karkówkę wołową), trzy rodzaje mięsa wieprzowego (słoninę, schab wieprzowy, łopatkę wieprzową) oraz dwa gatunki ryb tłustych (łosoś wędzony, śledź). Mięso zostało zakupione w sklepach znajdujących się na terenie miasta Siedlce. Przygotowywanie mięsa (Meat preparation) Wszystkie roztwory wodne wykorzystane w badaniach przygotowano stosując wodę trójkrotnie destylowaną z kwarcu. Ekstrakty mięsa o stężeniu 0,5 g/ml przygotowano przez rozpuszczenie 2 g rozmrożonego, zmielonego mięsa (60 sek.) w 4 ml rozpuszczalnika (metanol, heksan, aceton, acetonitryl, dichlorometan, woda trójkrotnie destylowana, woda zakwaszona do ph 2). Ekstrakty mięsa umieszczano na płuczce ultradźwiękowej, sączono i odwirowano (3 min; obr./min). Tak przygotowany materiał do badań przechowywano szczelnie w foli aluminiowej w lodówce w temp. +5 o C. Oznaczania CPA w odniesieniu do rodnika DPPH (Determination of CPA related to the DPPH radical) W pracy stosowano 1 mm metanolowy roztwór DPPH. Na wstępie badań opracowano metodę rozdzielania formy zredukowanej od utlenionej rodnika DPPH na płytkach zarówno w układzie faz prostych jak i odwróconych. Zbadano wpływ warunków chromatograficznych na rozdzielanie: komora wysycona i niewysycona, fazy NP i RP -18W, wpływ temperatury, skład fazy ruchomej oraz technika wielokrotnego rozwijania. Opracowaną metodę [9] zastosowano do oznaczania CPA mięsa.

89 CPA DPPH [GAE] 89 Oznaczanie całkowitego stężenia polifenoli (Determination of the total polyphenols contentration) W mięsach oznaczono całkowitą zawartość polifenoli wykorzystując metodę fotometryczną Folina Ciocalteua (FC). Polifenole reagując z FCR wytwarzają niebiesko zabarwiony roztwór (λ = 765 nm). Barwa ta powstaje w wyniku redukcji dwóch kwasów, fosfomolibdenowego oraz fosfowolframowego [8]. Do kolby o objętości 5 ml odpipetowano 0,5 ml ekstraktu wodnego mięsa i dodano 0,5 ml odczynnika Folina Ciocalteua, odczekano 5 min., a następnie dodano 2 ml 20% Na 2 CO 3 i uzupełniono wodą kolbę do kreski. Na 30 min. mieszaninę odstawiono w ciemne miejsce. Pomiar wykonano w stosunku do ślepej próby przy 765 nm. Wykonano krzywą wzorcową kwasu galusowego (stężenie od 0 do 0,1 mg/ml). Wynik oznaczenia podano jako ekwiwalent kwasu galusowego w przeliczeniu na 1 g produktu. Pomiar CPA mięsa (Measurement of TAP of the meat) Właściwości antyoksydacyjne mięsa oznaczano mierząc intensywność plamki fioletowej (formy utlenionej DPPH ). Po reakcji redukcji rodnik zmienia zabarwienie na jasno-żółte (DPPH-H). Oznaczanie rodnika przeprowadzono za pomocą TLC. Reakcje pomiędzy rodnikiem, a próbką mięsa przeprowadzano na płytkach NP i RP-18W w temperaturze +20 o C, w komorze wysyconej, w której fazą ruchomą był heksan/aceton (1:0,254 v/v). Jako próbę kontrolną zastosowano mieszaninę roztworu DPPH w metanolu [9]. Do próbki mięsa o objętości 200 µl dodano 100 µl 1 mm metanolowego roztworu DPPH. Pomiar chromatograficzny wykonano po 5 minutach. Po tym czasie zaobserwowano zmianę barwy roztworu. Badaną próbkę mięsa z DPPH (5 μl) nanoszono na płytkę. Na rozwiniętej płytce zaobserwowano plamki pochodzące zarówno od formy utlenionej (fioletowa) jak i zredukowanej (żółta) rodnika DPPH oraz plamki pochodzące od antyoksydantów niereagujących z tym rodnikiem. Całkowitą zawartość antyoksydantów (CPA) w badanej próbce mięsa odczytano z krzywej wzorcowej wykonanej dla kwasu galusowego (w zakresie stężeń 0 0,02 mg/ml). Wynik oznaczenia podano jako ekwiwalent tego kwasu w przeliczeniu na 1 g produktu. 3. Wyniki i dyskusja (Results and Discussion) Dobór warunków pomiarowych (Measurement conditions) Wartości CPA różnych mięs uzyskane na płytkach NP i RP -18W porównano na Rys. 1. Wynika z niego, że w obu przypadkach otrzymano, w granicach niepewności pomiarowych, te same wyniki. Do dalszych badań wybrano płytki RP ze względu na lepsze rozdzielenie obu form DPPH cielęcina schab filet z kurczaka wołowina szponder łopatka wieprzowa filet z indyka łosoś wędzony N P RP Rys. 1. Fig. 1. CPA [GAE] mięs po 5 minutach ekstrakcji dichlorometanem. Warunki chromatograficzne: temperatura - 20 o C, faza ruchoma - heksan/aceton (80:20% v/v), ilość naniesionej próbki - 5 l. TAP [GAE] of meat after 5 min. extraction with dichloromethane. Chromatographic conditions: temperature - 20 o C, mobile phase - hexane/acetone (80:20% v/v), injection volume - 5 l.

90 CPA DPPH [GAE] CPA DPPH [GAE] 90 Właściwości antyoksydacyjne ekstraktów mięsnych (The antioxidant properties of the meat extracts) Stężenie antyoksydantów (stąd CPA DPPH ) zależy od czasu ekstrakcji (Rys. 2). Z jednej strony jego wydłużenie zwiększa współczynnik ekstrakcji, z drugiej zaś zwiększa prawdopodobieństwo utlenienia próbki. Dla różnych gatunków mięs uzyskano podobną zależność CPA od czasu ekstrakcji (Rys. 2) i od zastosowanego rozpuszczalnika (Rys. 3). Maksymalne wartości CPA uzyskano dla ok. 5 min. ekstrakcji. Powyżej 10 min. wartości CPA asymptotycznie dążą do stałej wartości. Największym CPA charakteryzuje się mięso wołowe (ok. 21 μg GA/1 g mięsa). Najsłabszymi właściwościami antyoksydacyjnymi charak teryzował się metanolowy ekstrakt łopatki wieprzowej (ok. 8,9 μg GA/1 g mięsa). Większe wartości CPA otrzymano dla rozpuszczalników bardziej polarnych SZPONDER WOŁOWY FILET z KURCZAKA ŁOPATKA WIEPRZOWA Czas ekstrakcji [min] Rys. 2. Fig. 2. Wpływ czasu ekstrakcji metanolem na płuczce ultradźwiękowej) na CPA DPPH [GAE]. The influence of extraction time (using methanol and ultrasonic bath) on TAP DPPH [GAE]. 20 ACETON METANOL HEKSAN Czas ekstrakcji [min] Rys. 3. Fig. 3. Wpływ czasu ekstrakcji na CPA DPPH [GAE] filetu z kurczaka. The influence of time extraction on TAP DPPH [GAE].

91 91 Wizualizacja za pomocą rodnika DPPH (Visualisation using the DPPH radical) Wizualizację płytek przeprowadzono w układzie faz odwróconych. Fazą ruchomą była mieszanina dwuskładnikowa: metanol/woda o stosunku objętościowym (95:5, v/v). Zastosowana faza ruchoma wymywa takie związki jak, witaminy E (α, β, γ tokoferole) oraz witaminę D [10]. Na płytkach RP-18W uzyskano najlepsze rozdzielanie tych właśnie związków. Na podstawie obecności i intensywności żółtych plamek można stwierdzić występowanie w badanych ekstraktach związków o właściwośc iach przeciwutleniających. Rodnik DPPH reaguje z antyoksydantami co powoduje odbarwienie fioletowego tła (Rys. 4). W metanolowych ekstraktach znajdują się zarówno polarne antyoksydanty (R f = 0,75 i 0,86 dla wołowiny i łososia), średnio polarne (mięso drobiowe - filet z kurczaka i indyka R f = 0,25), jak i niepolarne (R f = 0). Wołowina i łosoś wędzony charakteryzują się zbliżoną ilością i intensywnością plamek żółtych (Rys. 4) oraz wartością CPA DPPH. Z otrzymanych wyników można wywnioskować, że każda próbka zawiera bardzo podobne antyoksydanty, średnio polarne. Rys. 4. TLC chromatogram uzyskany w wyniku wizualizacji metanolowym roztworem DPPH dla próbek mięsnych ekstrahowanych metanolem. Warunki chromatograficzne: płytka RP-18W, faza ruchoma - metanol/woda (95:0,5, v/v), wizualizacja - 1 mm DPPH. (1 schab wieprzowy; 2 filet z indyka; 4 szponder wołowy; 5- łosoś wędzony; 6 filet z kurczaka; 8 łopatka wieprzowa; 9 cielęcina wieprzowa i 10 - karkówka wieprzowa) Fig. 4. TLC chromatogram obtained by visualization using methanolic solution of DPPH for meat samples extracted in methanol. Chromatographic conditions: plate - RP-18W, mobile phase - methanol/water (95:0,5, v/v), visualization - 1 mm DPPH. (1 - pork loin, 2 - turkey fillet, 4 - beef brisket, 5 - smoked salmon; 6 - chicken fillet; 8 - pork shoulder; 9 - veal and 10 - pork neck). Wpływ rozpuszczalnika ekstrakcyjnego CPA próbek (The influence of solvents on TAP values) Za właściwości antyoksydacyjne próbek mięsnych odpowiedzialne s ą różne związki, które rozpuszczalne są w różnych rozpuszczalnikach. Dlatego niemożliwe jest uzyskanie informacji o pełnej aktywności antyoksydacyjnej próbki po ekstrakcji tylko jednym rozpuszczalnikiem [11]. Na Rys. 5 przedstawiono całkowite stężenie poli fenoli w różnych gatunkach mięsa. Najniższa zawartość polifenoli występuje w karkówce wieprzowej (ok.6 GAE), a najwyższa zaś w wołowinie (szponder) 9,38 GAE i filecie z kurczaka 9,27 GAE. Oznacza to, że redukcja rodnika DPPH najprawdopodobniej spowodowana jest przez polifenole. Długotrwałe przechowywanie mięsa może wywołać chemiczne utlenienie polifenoli, a tak że niekontrolowane procesy enzymatyczne.

92 CPA DPPH [GAE] Zawartość polifenoli [mg GA / g mięsa] zawatość polifenoli [mg GAE/ g mięsa] łopatka wiep. łosoś w. cielęcina indyk kurczak wołowina Rys. 5. Zawartość polifenoli w mięsach. Warunki pomiarowe: pomiar fotometryczny 765 nm, stężenie mięsa - 0,05 g/ml. Wyniki przedstawiają średnią z 3 pomiarów. Fig. 5. The concentration of polyphenols in meats. Measuring conditions: photometric measurements at 765 nm, concentration of the meat g/ml. The results represent the average of 3 measurements. CPA DPPH różnych gatunków mięsa ekstrahowanych przez różne rozpuszczalniki przedstawiono na Rys. 6. Okazało się, że najsilniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi charakteryzuje się mięso łososia wędzonego po ekstrakcji heksanem. Z drugiej strony najniższe CPA otrzymano dla cielęciny ekstrahowanej acetonem. Łosoś wędzony bez względu na użyty do ekstrakcji rozpuszczalnik zawsze (w granicach niepewności pomiarowej) charakteryzuje się bardzo silnymi właściwościami antyoksydacyjnymi. Prawdopodobnie spowodowane jest to tym, że łosoś wędzony zawiera dym wędzarniczy, który ma działanie konserwujące i antybakteryjne. Substancjami czynnymi dymu są związki (pochodne gwajakolu i syringolu), które wykazują silne właściwości antyoksydacyjne [15]. W tym miejscu warto zauważyć, że CPA mięsa zależy od jego obróbki. Między innymi powstają tzw. MRPs (ang.: Maillard Reaction Products), czyli produkty reakcji Maillarda, tzn. reakcji między aminokwasami a cukrami. Obróbka może zwiększać aktywność antyoksydacyjną niektórych białek z powodu zmian jakie zachodzą w ich II i III rzędowej strukturze. Obróbka mięsa, zarówno do spożycia jak i do analizy może przyczynić się do utleniania antyoksydantów. W konsekwencji może dojść do degradacji endogennych antyoksydantów takich jak witamina C, E, polifenoli, tioli czy karotenoidów [12-14]. Zawartość antyoksydantów w różnych gatunkach mięs zależy od zastosowanego do ekstrakcji rozpuszczalnika. Najwięcej antyoksydantów zawiera mięso z łososia MeOH Woda Woda-HCl Heksan Aceton cielęcina filet z indyka karkówka łopatka filet z kurczaka wołowina łosoś wędzony Rys. 6. CPA DPPH [GAE] różnych gatunków. Warunki ekstrakcji i chromatograficzne jak na Rys. 5. Rys. 6. TAP DPPH [GAE] of different types of meat. Extraction and chromatographic conditions as on Fig. 5.

93 93 4. Literatura (Literature) [1] G.H. Zhou, X.L. Xu, Y. Liu, Preservation technologies for fresh meat A review, Meat Science, 86, , [2] W. Migdał, D. Wojtysiak, K. Palka, M. Natonek-Wiśniewska, I. Duda, A. Nawocień, Skład chemiczny i parametry tekstury wybranych mięśni tuczników rasy polskiej białej zwisłouchej ubijanych w różnym wieku, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 6 (55), , [3] T. Kołczak, Jakość wołowiny, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 1 (56), 5-22, [4] B.K. Głód, P. Piszcz, I. Kiersztyn, A. Lamert, P. Zarzycki, Zastosowanie HPLC do oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego, Postępy Chromatografii (Camera Separatotria), 1, 41-66, [5] H. Puzanowska-Tarasiewicz, L. Kuźmicka, M. Tarasiewicz, Antyoksydanty a reaktywne formy tlenu, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 43 (1), 9-14, [6] A.R. Ndhlala, M. Moyo, J.V. Staden, Natural antioxidants: Fascinating or mythical biomolecules? Molecules, 15, , [7] B. Gryszczyńska, M. Iskra, Współdziałanie antyoksydantów egzogennych i endogennych w organizmie człowieka, Nowiny Lekarskie, 77 (1), 50-55, [8] B.K. Głód, P.M. Wantusiak, P. Piszcz, E. Lewczuk, P.K. Zarzycki, Application of micro-tlc to the total antioxidant potential (TAP) measurement, Food Chemistry, 173, , [9] P. Piszcz, M. Tomaszewska, B.K. Głód, O możliwości zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania całkowitego potencjału antyoksydacyjnego. Cześć I. Dobór warunków chromatograficznych,, 7 (1), 41-51, [10] M.M. Srivastava (Ed.), High Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC), Springer-Verlag Berlin Heidelberg [11] D. Plust, Praca doktorska, Pojemność przeciwutleniająca wybranych surowców pochodzenia zwierzęcego, Akademia Rolnicza, Szczecin [12] A. Serpen, V. Gökmen, V. Fogliano, Total antioxidant capacities of raw and cooked meat, Meat Science 90, 60-65, [13] M. Hęś, J. Korczak, Wpływ produktów utleniania lipidów na wartość odżywczą białka, Nauka Przyroda Technologie, 1 (1), 1-15, [14] A. Michalska, H. Zieliński, Produkty reakcji Maillarda w żywności, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2 (51), 5-16, [15] A. Lebiedzińska, Łososie wędzone cennym źródłem składników odżywczych, Magazyn Przemysłu Rybnego, 2 (50), 33-36, 2006.

94 94 INSTRUKCJE DLA AUTORÓW W wydawane są artykuły oryginalne (nie publikowane wcześniej) oraz przeglądowe poświęcone różnym działom nauki, techniki i technologii rozdzielania. Dodatkowo publikowane będą listy do redakcji, informacje na temat aparatury naukowej, recenzje książek, reklamy, materiały firmowe, sprawozdania redakcji jak również informacje o konferencjach. Artykuł do CamSep przygotowany w edytorze Microsoft Word 2003 lub nowszy m (w formacie.doc lub.docx) zgodnie z przedstawionym poniżej opisem należy przesłać wraz z listem motywacyjnym na adres camera.separatoria@gmail.com. Nie ma ograniczenia co do długości artykułu. * * * Jan KOWALSKI, Anna KOWALSKA* (Arial 12 pkt., bold) 1 Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Instytut Chemii, Zakład Chemii Analitycznej, ul. 3 Maja 54, Siedlce, * Autor do korespondencji, camera.separatoria@gmail.com 2 Uniwersytet (Afiliacja Arial 9 pkt., normal bez boldu) Tytuł artykułu w języku polskim 12 pkt. Arial bold Streszczenie: (Arial 9 pkt. normal bold). Treść streszczenia Arial 9 pkt. kursywa bez boldu. Streszczenie polskojęzyczne powinno zawierać około znaków (ze spacjami). Należy w nim krótko wskazać czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. Słowa kluczowe: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą Tytuł artykułu w języku angielskim 12 pkt. Arial bold kursywa Abstract: (Arial 9 pkt. normal bold). Streszczenie anglojęzyczne Arial 9 pkt. kursywa bez boldu, powinno być rozszerzone, o objętości około znaków (ze spacjami). Powinno zawierać: wskazanie czego dotyczy artykuł, co jest w nim nowego oraz podsumowanie wniosków. Key words: 5-8 słów, bez skrótów i akronimów, Arial 9 pkt., bez boldu, kursywą Podtytuły ponumerowane Arial 12 pkt., bold (Wstęp, Część eksperymentalna, Wyniki i dyskusja, Podsumowanie lub Wnioski, Literatura itp.) wersja polska - normal i (angielska - kursywą), Śródtytuły ponumerowane Arial 11 pkt., bold, wersja polska i angielska - kursywą Wcięcia akapitowe na 1,0 cm, tekst podstawowy wyjustowany Arial 10 pkt., odstępy między wierszami pojedyncze. Nie wymuszać w żaden sposób podziałów wierszy. Wszystkie marginesy 2 cm. Wzory i rysunki należy sformatować jako obiekty wyśrodkowane przenoszone z tekstem. Wzory napisane w edytorze równań należy traktować jako element zdania np.: V t F R R (1)