Magdalena Pieniężna-Ćwirko. Rozprawa doktorska. Promotor: Prof. dr hab. n. med. Stanisław Pomianowski

Transkrypt

1 Magdalena Pieniężna-Ćwirko Ocena wpływu podania autogennych czynników wzrostu na przebudowę przeszczepów kostnych w stawach rzekomych trzonów kości przedramienia Rozprawa doktorska Promotor: Prof. dr hab. n. med. Stanisław Pomianowski Klinika Chirurgii Urazowej Narządu Ruchu i Ortopedii CMKP Otwock

2 Spis treści Skróty... 3 Wstęp... 3 Złamania trzonów kości przedramienia epidemiologia i leczenie... 4 Budowa tkanki kostnej... 9 Macierz zewnątrzkomórkowa... 9 Komórki tkanki kostnej Biologia gojenia tkanki kostnej Czynniki wzrostu biorące udział w gojeniu i remodelowaniu tkanki kostnej Czynniki ryzyka zaburzeń zrostu kostnego Leczenie zaburzeń zrostu Biologia przeszczepów kostnych Osocze bogatopłytkowe (PRP) Zastosowanie PRP w zaburzeniach zrostu kości długich Hipoteza badania Cel pracy Materiał kliniczny Metodyka badań Analiza statystyczna Wyniki Dyskusja Wnioski Wnioski dodatkowe Streszczenie Abstract Bibliografia Wszystkie ryciny stanowią materiał własny Kliniki Chirurgii Urazowej Narządu Ruchu i Ortopedii CMKP. 2

3 Skróty PRP platelet rich plasma (osocze bogatopłytkowe) OPN osteopontyna ON - osteonektyna VEGF vascular endothelial growth factor (czynnik wzrostu śródbłonka naczyń) EDGF - endothelial derived growth factor (nabłonkowy czynnik wzrostu) FGF - fibroblast growth factor (czynnik wzrostu fibroblastów) IGF - Insulin-like growth factor (insulinopodobny czynnik wzrostu) TNF - tumor necrosis factor (czynnik martwicy nowotworów) TGF transforming growth factor (transformujący czynnik wzrostu) BMP - bone morphogenetic protein (morfogenetyczne białko kości) GDF - growth differentiation factor (różnicujący czynnik wzrostu) PDGF platelet derived growth factor (płytkopochodny czynnik wzrostu) EGF - epidermal growth factor (naskórkowy czynnik wzrostu) HGF - hepatocyte growth factor (czynnik wzrostu hepatocytów) PGD2, PGE2, PGF2 - prostaglandyny D2, E2, F2 TXA2 tromboksan PGI2 - prostacyklina OPG osteoprotegeryna NLPZ niesteroidowe leki przeciwzapalne RZS reumatoidalne zapalenie stawów LIPUS - Low-intensity pulsed ultrasound (pulsacyjne ultradźwięki o niskim natężeniu) Wstęp Rozwój cywilizacji niesie ze sobą z jednej strony postęp dokonujący się stale w medycynie, w tym coraz doskonalsze metody leczenia w chirurgii urazowej narządu ruchu, z drugiej jednak strony przynosi mnogość urazów spowodowanych wypadkami komunikacyjnymi i zmianą stylu życia na coraz popularniejsze aktywne uprawianie sportów. Postęp w medycynie wydłuża też średnią długość życia, zwiększając liczbę osób narażonych na urazy typowe dla wieku starszego. Z jednej więc strony zwiększa się liczba urazów, z drugiej coraz wyższe są oczekiwania chorych w stosunku do możliwości powrotu do pełnej sprawności po urazach. Za tymi oczekiwaniami stale próbuje nadążyć rozwój nauk medycznych, szukając coraz to nowych metod leczenia. Coraz doskonalsze wydają się być metody operacyjne leczenia złamań, a jednak ciągle borykamy się z powikłaniami. Na podstawie wewnętrznej statystyki Kliniki Chirurgii Urazowej Narządu Ruchu i Ortopedii CMKP można oszacować, że w latach 80-tych ok. 5-10% złamań powikłanych było zaburzeniami zrostu, następnie w latach 90-tych 2-5%, obecnie jest to ok. 1-2%. W latach r. było to 1,1%. 3

4 W ostatnich latach trwają ciągłe badania nad biologicznym wspomaganiem leczenia tradycyjnego, wiele z nich koncentruje się na poziomie komórkowym, badając wpływ tzw. czynników wzrostu na poszczególne procesy zachodzące w organizmie w trakcie gojenia złamań oraz możliwości ich zastosowania w praktyce. Na podstawie licznych badań Lyncha pod koniec lat 80-tych i w latach 90-tych przyjęto, że podstawą uzyskania regeneracji tkanki kostnej jest tzw. triada Lyncha, czyli: obecność materiału będącego rusztowaniem komórek osteogennych, zdolnych do tworzenia tkanki kostnej oraz czynnika aktywującego, który ten proces zainicjuje.[1] [5] Idąc za tym trendem podjęłam próbę oceny celowości stosowania czynników wzrostu pod postacią osocza bogatopłytkowego w połączeniu z przeszczepami kostnymi w leczeniu zaburzeń zrostu kostnego, koncentrując się na jednej okolicy złamaniach trzonów kości przedramienia. Złamania trzonów kości przedramienia epidemiologia i leczenie Złamania trzonów kości przedramienia to około 1,2% wszystkich złamań. Spośród nich ponad połowa to złamania kości łokciowej (51,3%), w 23% złamania kości promieniowej i w 25,7% obu kości przedramienia.[6] Kości przedramienia tworzą układ połączony dystalnie i proksymalnie stawem promieniowo-łokciowym. Trzony obu kości połączone są ze sobą błoną międzykostną. Złamania trzonów kości przedramienia powinny dlatego być rozpatrywane w sposób szczególny jak złamania stawowe, gdyż wzajemna orientacja przestrzenna tych kości warunkuje prawidłową rotację przedramienia[7],[8] i wpływa istotnie na funkcję ręki. [6],[9] Najczęstszym mechanizmem urazu jest uraz bezpośredni, często będący urazem wysokoenergetycznym, związanym z wypadkami komunikacyjnymi, pobiciem, upadkiem z wysokości lub urazem sportowym. Z tego powodu często dotyczy osób młodych i powiązany bywa z istotnym uszkodzeniem tkanek miękkich, włącznie ze złamaniami otwartymi. Powyżej 50 roku życia złamania kości przedramienia występują 4x częściej u kobiet niż mężczyzn, podczas gdy u osób poniżej 40 roku życia występowanie u obu płci jest podobne. [10] Szczególnym typem złamania trzonu kości przedramienia jest złamanie Monteggia i złamanie typu Galeazzi. Złamanie Monteggia to z definicji złamanie trzonu kości łokciowej połączone ze zwichnięciem w stawie promieniowo-łokciowym bliższym. Złamanie typu Galeazzi jest to złamanie trzonu kości promieniowej powiązane ze zwichnięciem w stawie promieniowo-łokciowym dalszym. [6],[11] 4

5 Ryc. 1. Staw rzekomy trzonu kości promieniowej na bazie złamania typu Galeazzi. RTG AP i L Złamania nieprzemieszczone zdarzają się niezwykle rzadko z powodu wysokoenergetycznego charakteru złamań. Nieprzemieszczone izolowane złamanie trzonu kości łokciowej jest w praktyce jedynym wskazaniem do leczenia zachowawczego złamań trzonów kości przedramienia u dorosłych, poza ogólnymi przeciwwskazaniami do leczenia operacyjnego. [6] Spośród popularnie stosowanych metod leczenia operacyjnego złamań trzonów kości przedramienia wymienić można zespolenie płytkowe klasyczne (płyty kompresyjne), zespolenie płytkowe ze śrubami blokowanymi typu LCP (lockingcompression-plate), metody śródszpikowe (gwóźdź śródszpikowy, elastyczne pręty TEN), stabilizacja zewnętrzna. 5

6 Ryc. 2. Zespolenie złamania trzonu kości promieniowej sp. gwoździa śródszpikowego ryglowanego staw rzekomy. RTG AP i L Obecnie wydaje się, że złotym standardem leczenia złamań trzonów kości przedramienia jest otwarta repozycja z anatomicznym nastawieniem odłamów i stabilne zespolenie metodą płyty blokowanej LC-DCP (limited contact dynamic compression plate). [12] [19] 6

7 Ryc. 3. Złamanie trzonów obu kości przedramienia i zespolenie metodą LCP. RTG AP i L Ze względu na ograniczone możliwości uzyskania anatomicznej repozycji i wysoki odsetek zaburzeń zrostu zespolenie śródszpikowe nie jest zalecanym postępowaniem operacyjnym w przypadku złamań trzonów kości przedramienia u dorosłych.[18],[20] 7

8 Pręty elastyczne TEN dedykowane są leczeniu operacyjnemu dzieci do ok. 15 roku życia i ok. 50kg masy ciała. Ryc. 4. Zespolenie złamania trzonów obu kości przedramienia sp. TEN. RTG AP i L Stabilizację zewnętrzną stosuje się najczęściej jako rozwiązanie czasowe 8

9 w przypadku masywnego uszkodzenia tkanek miękkich lub złego stanu ogólnego chorego. Do metod historycznych zaliczyć można pręty Rusha, gwóźdź Hackethal-Epiblock, ZESPOL. Budowa tkanki kostnej Tkanka kostna jest rodzajem tkanki łącznej. Dzięki obecności soli mineralnych wyróżniającymi ją spośród innych typów tkanki łącznej charakterystycznymi cechami są twardość, sztywność i wytrzymałość na odkształcenia. Jak wszystkie tkanki łączne zbudowana jest z macierzy zewnątrzkomórkowej oraz elementów komórkowych: osteocytów, osteoblastów, osteoklastów oraz pluripotencjalnych komórek osteogennych. Komórki stanowią około 5% jej masy. [21] Macierz zewnątrzkomórkowa Macierz zewnątrzkomórkowa składa się z części organicznej, czyli osteoidu (około 25% jej masy) oraz nieorganicznej, czyli soli mineralnych (około 60-70% jej masy). Osteoid zbudowany jest z włókien kolagenowych, głównie kolagenu typu I, syntetyzowanego w osteoblastach. Włókna kolagenowe, łącząc się ze sobą, tworzą beleczki kostne. Poza kolagenem w skład osteoidu wchodzą inne białka, takie jak osteonektyna, osteopontyna, osteokalcyna, proteoglikany, czynnik morfogenetyczny kości (BMP) oraz inne peptydy. [21] Osteopontyna (OPN) jest sialoproteiną produkowaną przez wiele komórek w organizmie, w tym przez osteocyty, osteoblasty, komórki progenitorowe, fibroblasty, mioblasty, komórki nabłonkowe i wiele innych. Występuje obficie w macierzy zewnątrzkomórkowej kości. Jej produkcja stymulowana jest przez kalcitriol. Białko to ma istotny wpływ na regulację metabolizmu tkanki kostnej.[22] [26] Osteonektyna (ON) jest glikoproteiną wydzielaną przez osteoblasty, fibroblasty, makrofagi i wiele innych komórek. W tkance kostnej inicjalizuje mineralizację, pobudza formowanie kryształów i wiąże wapń oraz kolagen. Pobudza produkcję i aktywność metaloproteinaz. Pobudza różnicowanie osteoblastów.[27],[28] Osteokalcyna jest białkiem produkowanym wyłącznie przez osteoblasty. Jest najobficiej występującym niekolagenowym białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej kości. Pobudza formowanie tkanki kostnej, wiąże wapń oraz hydroksyapatyt, pobudza aktywność osteoblastów. Z powodu swoich właściwości i obfitego występowania w tkance kostnej, znajduje zastosowanie jako marker obrotu tkanką kostną. [29] [32] Badania in vitro wykazały wpływ osteopontyny i osteokalcyny na wielkość, kształt 9

10 i orientację przestrzenną hydroksyapatytu oraz regulację aktywności osteoklastów i osteoblastów.[22],[23],[33] [35] Mają one również możliwość rozpraszania energii poprzez swoje połączenia międzycząsteczkowe, zmniejszając ryzyko złamań. [26] Nieorganiczna część macierzy zewnątrzkomórkowej to tzw. minerał kości czyli hydroksyapatyt (hydroksyfosforan wapnia) tworzący drobne kryształy oraz bezpostaciowy bruszyt. Bruszyt obficiej występuje w kościach płodowych. [21] Mechaniczne właściwości kości uzależnione są od proporcji zawartości minerału, wody i elementów organicznych. Im więcej minerału, a mniej wody, tym sztywniejsza staje się kość, lecz równocześnie bardziej łamliwa. [36] Komórki tkanki kostnej 1. Osteoblasty Są to komórki kościotwórcze. Powstają z komórek macierzystych mezenchymatycznych szpiku kostnego. Syntetyzują i wydzielają kolagen typu I, białka niekolagenowe osteonektynę, osteokalcynę, hydrolazy, w tym kolagenazę, prostaglandyny, prostacyklinę. Posiadają receptory m.in. dla parathormonu i witaminy D3.[21] 2. Osteocyty Kiedy osteoblasty otoczone zostaną zmineralizowaną macierzą zewnątrzkomórkową, przekształcają się w osteocyty. Bezpośrednio wokół komórek pozostaje wolna niezmineralizowana przestrzeń, czyli kanaliki kostne. Znajdują się w nich wypustki cytoplazmatyczne osteocytów i przebiega tam transport substancji odżywczych i metabolitów.[21] 3. Osteoklasty Są wielojądrzastymi komórkami linii monocytarno-makrofagalnej, pochodzącymi ze szpiku.[37] Ich główną funkcją jest niszczenie kości. Wydzielają hydrolazy i fagocytują niszczoną kość. Nie wydzielają kolagenazy w przeciwieństwie do osteoblastów. Nie mają też receptorów dla parathormonu ani witaminy D3.[21] Biologia gojenia tkanki kostnej Gojenie tkanki kostnej jest procesem podobnym do gojenia uszkodzeń innych tkanek z grupy tkanki łącznej. Tym, co wyróżnia tkankę kostną spośród wszystkich innych jest to, iż goi się bez pozostawienia blizny.[37] Efektem końcowym prawidłowo przebiegającego procesu naprawczego jest regenerat kostny, którego budowa oraz właściwości fizyczne nie różnią się od zdrowej tkanki. Gojenie złamań podzielić można na dwa rodzaje pierwotne, w którym szczelinę przełomu od początku wypełnia tkanka kostna oraz wtórne, na podłożu chrzęstnym, analogicznie do procesu występującego w okresie rozwojowym. [11] 10

11 Gojenie pierwotne ma miejsce w sytuacji, gdy odłamy zostają dopasowane do siebie tak dokładnie, aby kanały osteonów prawidłowo się stykały. W praktyce jest to niezwykle trudne do osiągnięcia i większość złamań goi się na podłożu chrzęstnym. W procesie gojenia złamań wyróżnia się 3 okresy: okres zapalny (tworzenie się skrzepu), okres naprawy (powstawanie ziarniny, następnie faza chondrogenezy i osteogenezy) i okres przebudowy (zamiana grubowłóknistej tkanki kostnej splotowatej w dojrzałą kość blaszkowatą, który zachodzi dzięki współistnieniu procesu resorpcji i kościotworzenia.). [11] Ryc. 5. Okresy gojenia złamań. Rycina własna. W pierwszej kolejności w wyniku urazu dochodzi do przerwania ciągłości naczyń w wyniku uszkodzenia tkanki kostnej, co skutkuje wynaczynieniem krwi w okolicy złamania. Uruchomiona zostaje kaskada krzepnięcia i tworzy się skrzep. Powstaje czop płytkowy i następuje degranulacja ziarnistości alfa, beta i gamma płytek krwi oraz uwolnienia ich zawartości. Z płytek krwi uwalniane są liczne substancje czynne, takie jak: enzymy proteolityczne, tromboksan, serotonina, płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), transformujący czynnik wzrostu (TGFβ) i inne cytokiny, omówione w następnym rozdziale. [11],[38] 11

12 Przerwanie krążenia prowadzi do szybkiego obumarcia obszarów tkanki kostnej po obu stronach szczeliny złamania. Obumieranie komórek powoduje powstanie aseptycznej reakcji zapalnej. W okolicę złamania migrują makrofagi, limfocyty oraz granulocyty. Komórki te są źródłem kolejnych cytokin, takich jak interleukiny, prostaglandyny, TNF i inne. Komórki fazy zapalnej i ich mediatory pełnią funkcję fagocytarną, tworząc podstawę do mającej nastąpić później fazy naprawy. Poprzez uwalniane cytokiny biorą udział w rekrutacji i aktywacji komórek tworzących następnie ziarninę i formujących kostninę. Komórki mezenchymy, stymulowane przez ww. czynniki penetrują skrzep, różnicują w fibroblasty i rozpoczynają syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej. Macierz ta zawiera kolagen typu III, I, V i tworzy dobrze unaczynioną luźną tkankę łączną ziarninę. Ziarnina ta tworzy rusztowanie dla komórek osteogenezy. Od adekwatnego ukrwienia zależy, czy formowanie kostniny przebiegać będzie prawidłowo. W przypadku niedoboru ukrwienia powstaje tkanka chrzęstna. Angiogeneza zależna jest od wielu cytokin, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), nabłonkowy czynnik wzrostu (EDGF), czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF) I i II, czynnik martwicy nowotworów (TNF ) i transformujący czynnik wzrostu beta (TGF ). Następnie do ziarniny migrują osteoklasty, które resorbują martwą tkankę, uwalniając równocześnie z niej czynniki takie jak białka morfogenetyczne kości (BMP), TGF, IGF. Substancje te stymulują osteoblasty do syntezy białek tworzących macierz kostną. Nadmiar tych czynników jest wiązany przez białka macierzy i magazynowany w postaci latentnej, a następnie wykorzystywany w dalszym procesie osteogenezy. Macierz kostna jest największym rezerwuarem TGF spośród wszystkich tkanek, które z kolei pobudza dalej osteoblasty do tworzenia substancji organicznych macierzy, a następnie osiadania w niej pod postacią sieci osteocytów. W odpowiedzi na stymulujący bodziec mechaniczny zgodnie z prawem Wolffa- Delpecha następuje remodelowanie nowo powstałej tkanki łącznej i uzyskiwanie pełni funkcji mechanicznej.[37] Czynniki wzrostu biorące udział w gojeniu i remodelowaniu tkanki kostnej Czynniki wzrostu są to proteiny wydzielane przez komórki. Mają one funkcję modułów sygnałowych poprzez swój charakter autokrynny, parakrynny i endokrynny. Promują różnicowanie się komórek, wpływają na adhezję komórkową, proliferację i migrację komórek. 12

13 Należą do nich: 1. Transformujący Czynnik Wzrostu beta (TGF- ) Jest to grupa około 40 różnych, spokrewnionych ze sobą białek. TGF- ma wpływ na większość komórek organizmu na każdym etapie jego rozwoju. Należy do tej grupy 5 izoform TGF-, morfogenetyczne białka kości (BMP), różnicujące czynniki wzrostu (GDF), aktywiny, inhibiny i substancja Müllera. Działanie TGF- polega na hamowaniu wzrostu większości komórek epitelialnych, endotelialnych oraz krwiotwórczych i antagonizmie w stosunku do takich czynników jak EGF i PDGF. Konkretny wpływ na daną komórkę jest uzależniony od środowiska i typu komórki. Sygnał przesyłany jest poprzez związanie się ligandu TGF- z receptorem I i II przezbłonowym komórki docelowej, o charakterze kinazy serynowotreoninowej, co aktywuje kaskadę reakcji chemicznych w cytoplazmie z udziałem białek Smad, w rezultacie prowadząc do aktywacji transkrypcji specyficznej sekwencji genów w jądrze komórkowym. [39],[40] TGF- stymuluje chemotaksję fibroblastów, makrofagów, limfocytów i neutrofilów, a więc bierze udział w procesach naprawy tkanek oraz stanu zapalnego. Czynnik ten ma również hamujący wpływ na rozwój komórek nowotworowych. W układzie kostno-stawowym TGF- reguluje proliferację i ekspresję chondrocytów, osteoblastów i osteoklastów. Może wywierać wpływ zarówno pobudzający, jak i hamujący. [41] Kości i płytki krwi zawierają prawie 100 razy więcej TGF- niż inne tkanki, a w osteoblastach znajduje się największa liczba receptorów dla TGF-. TGF-β receptor błonowy SMAD cytoplazma jądro komórkowe fibroblasty makrofagi limfocyty neutrofile chondrocyty osteoblasty osteoklasty komórki nowotworowe Ryc. 6. Schemat działania TGF-. Rycina własna. 13

14 1.1. Białka Morfogenetyczne Kości (BMP) Jest to grupa ponad 20 białek należących do nadrodziny TGF-. [42] Nazwa pochodzi od ich zdolności do ektopowego tworzenia kości, lecz może być nieco myląca, ponieważ białka te uczestniczą nie tylko w tworzeniu kości i chrząstki, ale również w rozwoju narządów wewnętrznych. Ich działanie obejmuje proliferację komórek, apoptozę, różnicowanie i morfogenezę. Stymulują każdy etap tworzenia kości chemotaksję komórek progenitorowych, mitozę, różnicowanie i proliferację chondrocytów i osteoblastów oraz tworzenie macierzy zewnątrzkomórkowej i remodelling. [37] Receptory dla BMP należą do grupy receptorów kinazy serynowo/treoninowej. Najważniejsze funkcje BMP, biorących udział w kościotworzeniu i remodellingu: a. BMP-2 osteoindukcja, różnicowanie osteoblastów, apoptoza b. BMP-3 najobficiej występuje w kościach, hamuje osteogenezę c. BMP-4 osteoindukcja, rozwój płuc i oczu d. BMP-5 chondrogeneza e. BMP-6 różnicowanie osteoblastów, chondrogeneza f. BMP-7 osteoindukcja, rozwój nerek i oczu g. BMP-8 osteoindukcja h. BMP-14 chondrogeneza, wspomaga gojenie ścięgien i tworzenie kości 2. Insulinopodobny Czynnik Wzrostu (IGF-I i IGF-II) Głównym źródłem IGF jest wątroba oraz fibroblasty, są one również syntetyzowane w komórkach kości i uwalniane z macierzy kostnej. IGF-II jest czynnikiem najobficiej występującym w tkance kostnej, jednak silniejsze działanie wykazuje IGF-I. [42] Produkcja IGF w kości stymulowana jest przez parathormon i hormon wzrostu. IGF stymulują komórki osteoblastyczne do proliferacji i różnicowania, ale zależy to od stopnia dojrzałości tych komórek. Dodatkowo IGF wspierają tworzenie macierzy zewnątrzkomórkowej, stymulując syntezę kolagenu typu I oraz białek niekolagenowych oraz hamują degradację kolagenu poprzez hamowanie ekspresji kolagenazy przez osteoblasty. IGF stymulują również transport nieorganicznych fosforanów w komórkach osteogennych. IGF wpływają też aktywująco na osteoklasty. [43] Interleukina 6 (IL-6) zwiększa resorpcję kości przez rekrutację osteoklastów, prawdopodobnie na drodze zwiększania ekspresji IGF-I w osteoblastach. Prostaglandyna E2 (PGE2) i prostacyklina (PGI2) syntetyzowane miejscowo w kościach, w wyniku działania obciążeń mechanicznych stymulują ekspresję IGF w osteocytach i osteoblastach, pobudzając remodelling. [37] 14

15 3. Płytkopochodny Czynnik Wzrostu (PDGF) Jest to wszechobecny czynnik mitogenny i chemotaktyczny, wydzielany przez wiele typów komórek. Pierwotnie odkryty został jako cytokina produkowana przez płytki krwi, gromadzona w ziarnistościach i wydzielana po aktywacji komórki. [41] PDGF wydzielane jest we wczesnej fazie formowania skrzepu [42]. Stymuluje chemotaksję neutrofili, makrofagów, komórek progenitorowych, VEGF i IL-6 w okolicę złamania celem regulacji angiogenezy i pobudzania gojenia się kości. [44] PDGF jest wydzielany przez płytki krwi podczas wczesnych faz gojenia złamania. Działa również mitogennie na osteoblasty. [37] 4. Czynnik Wzrostu Fibroblastów (FGF) Jest to grupa polipeptydów wiążących heparynę, wywierających wpływ mitogenny na fibroblasty i wpływających na regulację funkcji chondrocytów i osteoblastów. Kwaśny FGF (a-fgf) występuje w dużych stężeniach w kości i jest ważnym czynnikiem regulacji gojenia złamań. Zasadowy FGF (b-fgf) jest syntetyzowany przez osteoblasty i gromadzony w macierzy kości, stymuluje gojenie złamania poprzez wpływ na angiogenezę, aktywację chondrocytów i osteoblastów. [37] 5. Naskórkowy Czynnik Wzrostu (EGF) Jest to grupa mitogenów, powszechnie występujących w organizmie, wytwarzanych głównie przez makrofagi i neutrofile. Obficie występuje w ślinie, mleku, moczu, przewodzie pokarmowym, płynie owodniowym. Należą do tej grupy białka takie jak transformujący czynnik wzrostu alfa (TGF- ), betacelulina (BTC), epiregulina (EPR), neureguliny (NRG 1-4), naskórkowy czynnik wzrostu wiążący heparynę (HB-EGF). Czynnik ten ma działanie angiogennym i pobudzającym fibroblasty. Przekazywanie sygnału następuje poprzez receptory związane z kinazą tyrozynową. [45] [47] 6. Czynnik Wzrostu Śródbłonka Naczyń (VEGF) Jest to kluczowy czynnik wzrostu dla angiogenezy w trakcie kostnienia zarówno śródchrzęstnego jak i błoniastego. Synteza VEGF w komórkach pobudzana jest poprzez hipoksję. 15

16 VEGF posiada 7 izoform, dla każdej z nich istnieją w komórkach docelowych specyficzne receptory. Receptory dla VEGF obecne są zarówno na komórkach śródbłonka, jak i monocytach, neuronach, chondrocytach i osteoblastach. Czynnik ten stymuluje również przemianę monocytów w osteoklasty poprzez mechanizm parakrynny oraz pobudza migrację komórek mezenchymalnych i ich przemianę w komórki osteogenne. VEGF ma wpływ również intrakrynny na komórki osteogenne, które go wydzielają. [48] [51] 7. Czynnik Wzrostu Hepatocytów (HGF) Czynnik ten produkowany jest przez komórki podścieliska. HGF stymuluje hematopoezę, początkuje śródkomórkowy wzrost stężenia wapnia w pierwotnych osteoklastach, hamuje resorpcję kości, jest produkowany również przez osteoklasty, a jego synteza w osteoblastach może być indukowana przez PDGF i FGF. Odgrywa rolę w remodellingu kości, indukując biologiczne odpowiedzi w osteoklastach i osteoblastach poprzez tworzenie pętli autokrynnoparakrynnej. [37] 8. Czynnik martwicy nowotworów (TNF- ) Jest to cytokina biorąca udział w ostrej fazie stanu zapalnego. Jest produkowana przez makrofagi, limfocyty CD4, neutrofile, eozynofile, komórki NK, komórki tuczne, neurony, komórki endotelialne, fibroblasty, miocyty i inne. TNF- reguluje apoptozę komórek, która odgrywa istotną rolę w remodellingu kostnym. Ligandem dla rodziny czynników TNF jest RANKL, który jest regulatorem przeżywalności komórek, w tym przypadku osteoblastów. [52],[53] 9. Prostaglandyny Prostaglandyny to lipidy powstające dzięki cyklooksygenazie z kwasu arachidonowego. Należą do nich PGD2, PGE2, PGF2, TXA2 (tromboksan), PGI2 (prostacyklina). Produkowane są praktycznie przez wszystkie komórki organizmu i ich wpływ na tkanki jest bardzo różnorodny. 16

17 W tkance kostnej prostaglandyny, zwłaszcza PGE2 regulują resorpcję kostną poprzez stymulację różnicowania osteoklastów, aktywację RANKL oraz inhibicję ekspresji osteoprotegeryny (OPG) na osteoblastach. Pośredniczą w tych procesach takie cytokiny jak TNF-, FGF, BMP-2 oraz interleukiny IL-1, IL-6, IL-11, IL17. Z drugiej strony PGE2 stymuluje tworzenie kości poprzez stymulację różnicowania osteoblastów. W tych procesach z kolei uczestniczy BMP-2. [54],[55] Czynniki ryzyka zaburzeń zrostu kostnego Zrost opóźniony można rozpoznać wtedy, gdy po upływie czasu w którym typowo dla danej kości powinien nastąpić zrost, nie stwierdza się go klinicznie ani radiologicznie. [11] Typowy czas zrastania się trzonów kości przedramienia to około tygodni. [16],[56] [58] Staw rzekomy rozpoznać można gdy brak jest radiologicznego postępu zrostu co najmniej 3 miesiące po przewidywanym okresie zrostu. [6] Stawy rzekome można podzielić na hipertroficzne i hipotroficzne/atroficzne. Z reguły stawy rzekome atroficzne związane są z zaburzeniami krążenia miejscowego i brakiem potencjału gojenia, natomiast stawy rzekome hipertroficzne najczęściej wynikają z braku adekwatnej stabilizacji złamania. [11] Ryc. 7. Staw rzekomy hipertroficzny trzonu kości promieniowej. RTG AP i L 17

18 Ryc. 8. Staw rzekomy atroficzny trzonu kości promieniowej. RTG AP i L Czynniki wpływające negatywnie na zrost kostny podzielić można na zależne od chorego, zależne od urazu, zależne od chirurga. Czynnikami zależnymi od chorego są m.in. palenie papierosów, niedobory wapnia, witaminy D, witaminy C (zespoły złego wchłaniania np. po operacjach resekcyjnych w obrębie przewodu pokarmowego[37]), działanie uboczne leków[59] (antykoagulanty, steroidy, NLPZ, metotreksat[60]), promieniowanie,[61],[62] choroby ogólnoustrojowe (cukrzyca[63], osteoporoza, RZS[64]). Czynnikami zależnymi od urazu są m.in. lokalizacja złamania, rozległość uszkodzenia tkanek miękkich, złamanie otwarte, wieloodłamowy charakter złamania, wysokoenergetyczne złamania.[61],[65],[66] Do czynników zależnych od chirurga zaliczyć można m.in. niedostateczne nastawienie odłamów, niewystarczająco stabilne zespolenie, brak kompresji odłamów, okaleczający dostęp operacyjny/uszkodzenie ukrwienia jatrogenne, interpozycja tkanek miękkich.[11] Leczenie zaburzeń zrostu W leczeniu zaburzeń zrostu kostnego pod postacią zrostu opóźnionego lub stawu rzekomego stosuje się różnorodne metody wspomagania zrostu, do których zaliczyć można zarówno metody operacyjne, metody biologiczne oraz metody fizyczne (LIPUS[67], elektrostymulacja, fala uderzeniowa[44]). 18

19 Spośród spektrum możliwości leczenia operacyjnego zaburzeń zrostu kostnego wymienić należy odświeżenie i oczyszczenie z tkanek bliznowatych szczeliny złamania, udrożnienie jamy szpikowej, dekortykację, wymianę zespolenia w razie braku adekwatnej stabilizacji, dynamizację zespolenia w razie braku kompresji odłamów, ewentualną poprawę repozycji odłamów, uzupełnienie ubytków kostnych przeszczepami auto- lub allogennymi. 19

20 Ryc. 9. Staw rzekomy trzonów obu kości przedramienia przed i po operacji naprawczej. RTG AP i L 20

21 Ryc. 10. Staw rzekomy z poprzedniej ryciny po wygojeniu i po usunięciu zespolenia. RTG AP i L 21

22 Do biologicznych metod wspomagania gojenia tkanki kostnej należą podawanie miejscowe czynników wzrostu w postaci zarówno osocza bogatopłytkowego jak i rekombinowanych, miejscowe podawanie szpiku kostnego autologicznego, komórek macierzystych, ogólnoustrojowo stosowane bisfosfoniany, parathormon[44], suplementacja witaminy D i wapnia.[68],[69] Suplementację przeszczepami kostnymi można zaliczyć zarówno do mechanicznego (osteokondukcja) jak i biologicznego wspomagania zrostu kostnego (cechy osteoindukcyjne i osteogenne).[59] Biologia przeszczepów kostnych Przeszczepy kostne stosowane są w medycynie od XIX wieku. Jako pierwszy zastosowanie allogenicznego przeszczepu kostnego opisał w 1878r. Mac Evan. Udokumentowane zastosowanie autologicznego przeszczepu kostnego jako pierwszy podał Axhausen w 1907r. i Barth w 1908r. [11] Z definicji przeszczepem kostnym autogennym jest tkanka kostna pobrana z jednej części szkieletu i przemieszczona w inne miejsce tego samego osobnika. Przeszczep kostny allogeniczny jest tkanką kostną przeszczepioną pomiędzy genetycznie nieidentycznymi osobnikami tego samego gatunku. [11] Istnieje wiele różnic w biologii przeszczepów kostnym auto- i allogenicznych. Wynikają one zarówno z immunologicznych właściwości przeszczepów allogenicznych, jak i ze sposobu ich konserwacji. Przeszczepy kostne autogenne najczęściej pobierane są z okolicy talerza biodrowego. Wiąże się to z możliwością zaistnienia powikłań po pobraniu przeszczepu, takich jak uszkodzenie naczyń, uszkodzenie moczowodu, przepuklina, ból przewlekły, uszkodzenie nerwów, zakażenie, złamanie, niestabilność miednicy, wady kosmetyczne, krwiak i przeszczepienie nowotworu. [70] Ryzyko powikłań wynosi nawet do 63,6%, z czego 56,4% to powikłania zaliczane do małych. [71] Po pobraniu przeszczepu kostnego autogennego dochodzi z powodu uszkodzenia ukrwienia do szybkiego obumierania komórek zawartych w nim, jednak mimo to uważa się, że przeszczepy te mają działanie zarówno osteokondukcyjne (stanowią rusztowanie dla powstawania nowej tkanki kostnej), jak i osteoindukcyjne (z powodu zawartości w macierzy kostnej białek BMP) oraz osteogenne (obecność w okostnej i szpiku komórek macierzystych z linii komórek kostnych). [72] [74] Po implantacji przeszczepu autogennego w miejsce docelowe następuje jego rewaskularyzacja poprzez inwazję drobnym naczyń włosowatych biorcy w miejsce resorbowanej przez osteoklasty obumierającej tkanki kostnej dawcy. Szybciej rewaskularyzacja następuje w przypadku kości gąbczastej niż korowej z powodu jej struktury. Mniejszy wymiar przeszczepu również przyspiesza jego wgajanie. Dodatkowymi czynnikami wpływającymi na tempo wgajania jest wiek biorcy, 22

23 uwarunkowania genetyczne oraz położenie przeszczepu czyli stopień kontaktu przeszczepu z tkanką kostną biorcy. [11] Przeszczepy kostne allogeniczne pobierane są od dawcy w specjalnych ośrodkach specjalizujących się w tej dziedzinie. Tkankę kostną należy pobrać od dawcy idealnie 6-12 godzin po śmierci, nie później natomiast niż 24 godziny. Następnie konieczna jest sterylizacja i konserwacja przeszczepu oraz odpowiednie warunki do jego przechowywania. Najczęściej przeszczepy kostne sterylizowane są radiacyjnie oraz mrożone i przechowywane w oparach ciekłego azotu. W ośrodku docelowym przechowywanie odbywa się w warunkach zwykłej zamrażarki. Po rozmrożeniu nie mogą być ponownie zamrożone i powinno się to odbywać bezpośrednio przed użyciem.[11] Liofilizacja pozbawia przeszczepy zdolności osteoindukcyjnych z powodu utraty BMP z komórek, ich rola jest więc jedynie osteokondukcyjna. Preparaty świeżo mrożone należą do grupy tzw. przeszczepów biostatycznych, czyli kości bez żywych komórek, lecz zawierających BMP, tym samym posiadających zdolności osteoindukcyjne. [75] Przeszczepy kostne allogeniczne wywołują odpowiedź immunologiczną w organizmie biorcy, która spowalnia proces wgajania/przebudowy tych przeszczepów. Jest to głównie odpowiedź komórkowa, ponieważ sterylizacja radiacyjna praktycznie eliminuje odpowiedź humoralną. [76] Odrzucenie przeszczepu kostnego jest histologicznie wyrażane przez uszkodzenie drobnych naczyń, proces zapalny, w tym napływ limfocytów, otorbienie, resorpcja obwodowa, pomostowanie kostniny, brak zrostu i złamanie zmęczeniowe. [77] Osocze bogatopłytkowe (PRP) Osocze bogatopłytkowe jest preparatem krwiopochodnym, pozyskiwanym z frakcji osocza autogenicznej krwi obwodowej, w którym zawartość płytek krwi jest wyższa niż podstawowa. [78] Pozyskuje się go poprzez odwirowanie krwi obwodowej chorego i aktywowanie powstałej frakcji bogatopłytkowej. Typowa próbka krwi pełnej zawiera ok. 93% czerwonych krwinek, 6% płytek krwi i 1% białych krwinek. [79] Długość życia płytek krwi to 7-10 dni. Pozyskiwanie PRP polega w swojej idei na zredukowaniu czerwonych krwinek do 5% i zagęszczeniu płytek krwi do 94%. Uważa się, że leczniczy wpływ PRP osiągnięty zostaje przy stężeniu minimum płytek/ l krwi. Przy średniej zawartości płytek/ l oznacza to zagęszczenie około 5-krotne.[80] Aktywowane chlorkiem wapnia i trombiną płytki krwi tworzą żel oraz uwalniają ze swoich ziarnistości tzw. czynniki wzrostu, takie jak PDGF, TGF-, IGF, VEGF, FGF, EGF. [81] 23

24 Ryc. 11. Degranulacja płytek krwi. Rycina własna. Pierwsze publikacje i odkrycia związane z osoczem bogatopłytkowym sięgają lat 1970, kiedy prace nad żelami fibrynowymi prowadził Matras, następnie kolejni badacze. [81],[82] Nazwa PRP oraz czynniki wzrostu kojarzone są głównie z pierwszymi publikacjami Marxa z 1998r. [83] Wtedy rozpoczął się szybki rozwój zastosowania PRP, z początku w chirurgii szczękowotwarzowej oraz medycynie regeneracyjnej, obecnie zaś różne formy czynników wzrostu stosowane są wielu dziedzinach medycyny, w tym szeroko w ortopedii i medycynie sportowej. Wraz z szerzeniem stosowania preparatów osocza bogatopłytkowego zaczęto zwracać uwagę na nieścisłości terminologiczne oraz obecność dodatkowych elementów tych preparatów, tak jak obecność leukocytów. [84] [89] 24

25 Należałoby obecnie wyróżnić kilka rodzajów preparatów osocza bogatopłytkowego w zależności od zawartości leukocytów i fibryny. Podział zaproponowany przez Dohana w 2009 roku obowiązuje do dzisiaj: [86] 1. P-PRP (Pure Platelet-Rich-Plasma) inaczej LP-PRP (Leukocyte-Poor Platelet-Rich-Plasma) produkt ubogoleukocytarny z niską gęstością sieci fibrynowej, może występować w formie płynnej lub żelowej, do produkcji stosowana jest plazmafereza 2. L-PRP (Leukocyte- and Platelet-Rich-Plasma) produkt zawierający poza płytkami krwi również leukocyty, tzw. kożuszek leukocytarno-płytkowy, o niskiej gęstości sieci fibrynowej, może występować w formie płynnej lub żelowej, najszerzej rozpowszechniony rodzaj osocza bogatopłytkowego, szeroko stosowany w ortopedii i medycynie sportowej Ryc. 12. Kożuszek leukocytarno-płytkowy po odwirowaniu krwi pełnej. Rycina własna. 3. P-PRF (Pure Platelet-Rich-Fibrin) produkt nie zawierający leukocytów i o wysokiej gęstości sieci fibrynowej, nie nadaje się do iniekcji, występuje w formie stałej/gęstego żelu 4. L-PRF (Leukocyte- and Platelet-Rich-Fibrin) produkt zawierający leukocyty oraz gęstą sieć fibrynową, występuje w formie stałej/gęstego żelu 25

26 Zastosowanie PRP w zaburzeniach zrostu kości długich 1. Modele zwierzęce W 2015r. opublikowana została metaanaliza dotycząca zastosowania PRP jako czynnika przyspieszającego zrost kostny w zaburzeniach zrostu kości długich na modelu zwierzęcym. Brano pod uwagę wyłącznie badania z grupą kontrolną. Zidentyfikowano 29 publikacji spełniających kryteria włączenia. 89% prac raportowało znaczącą poprawę w szybszym gojeniu kości w badaniu histologicznym. 100% prac raportowało istotne zwiększenie kościotworzenia w obrazie radiologicznym przy zastosowaniu PRP. 80% prac raportowało istotny wzrost obszaru kostnego w mikro tomografii komputerowej. 100% prac raportowało większą sztywność dla defektów, w których zastosowano PRP. Wnioskiem z tej metaanalizy jest udowodnienie działania PRP jako biologicznego wspomagania zrostu kostnego kości długich na modelu zwierzęcym.[90] 2. Badania kliniczne Podsumowania dotychczasowych doniesień na temat zastosowania PRP w leczeniu zaburzeń zrostu kości długich podjął się Roffi i wsp. (2017r.) Dokonał systematycznej analizy badań opublikowanych w latach Zidentyfikował 64 publikacje, z czego 45 stanowiło przedkliniczne badania in-vivo a 19 badania kliniczne. W 91,1% wyniki wskazywały na korzyść ze stosowania PRP w zaburzeniach zrostu kości długich, przy czym 84,4% przy zastosowaniu analizy histologicznej, 75,0% przy analizie radiologicznej i 72,7% biomechanicznej. Zwrócił też uwagę na wielką heterogenność i niską jakość badań, co utrudnia ostateczną interpretację i sformułowanie zaleceń.[91] Hipoteza badania Podanie czynników wzrostu zawartych w PRP przyspiesza przebudowę przeszczepów kostnych i tym samym zwiększa skuteczność leczenia stawu rzekomego trzonów kości przedramienia. Cel pracy Celem pracy było zbadanie wpływu osocza bogatopłytkowego na czas osiągnięcia przebudowy przeszczepów kostnych w stawach rzekomych trzonów kości przedramienia u ludzi. 26

27 Liczba chorych Materiał kliniczny Materiał kliniczny stanowili wszyscy chorzy leczeni operacyjnie w Klinice Chirurgii Urazowej Narządu Ruchu i Ortopedii CMKP z powodu aseptycznego stawu rzekomego trzonów kości przedramienia w latach Zidentyfikowano 76 chorych spełniających kryteria włączenia do badania. Było to 49 mężczyzn w wieku lat (średnia 33,3 lat) i 27 kobiet w wieku lat (średnia 42,7 lat) wiek chorych (lata) M K Wykres 1. Epidemiologia grupy badanej Metodyka badań Dokonano retrospektywnej oceny kohorty historycznej (badanie obserwacyjne) analizując obecność lub brak zrostu kostnego jako pełnej przebudowy przeszczepów kostnych w obrazie radiologicznym w projekcjach standardowych przednio-tylnej i bocznej. Jako kryterium włączenia wyznaczono przebycie operacji naprawczej stawu rzekomego trzonu kości przedramienia z suplementacją przeszczepami kostnymi. Za kryteria wyłączenia uznano obecność lub podejrzenie zakażenia w obrębie stawu rzekomego, złamanie pierwotnie otwarte oraz czas obserwacji krótszy niż 30 dni. 27

28 Za punkt końcowy obserwacji uznano czas do osiągnięcia wygojenia stawu rzekomego. Jako czas obserwacji przyjęto 24 miesiące od wykonania zabiegu operacyjnego. Obserwacje u osób, u których nie zaobserwowano punktu końcowego zostały ocenzurowane (ucięte). Badano następujące czynniki: - PRP - rodzaj zastosowanych przeszczepów kostnych (mrożone lub autogenne) - metoda operacji stawu rzekomego (zastosowanie zespolenia LCP) - wiek - płeć. Analiza statystyczna Wykonano jednowymiarowe analizy porównujące charakterystykę pacjentów w zależności od wygojenia stawu rzekomego (testy t-studenta, testy zgodności chi2). Dokonano estymacji skumulowanego prawdopodobieństwa wygojenia stawu rzekomego w funkcji czasu metodą Kaplana-Meiera w podgrupach chorych klasyfikowanych na podstawie potencjalnych czynników sprzyjających. Oszacowano siłę związku PRP z osiągnięciem wygojenia stawu rzekomego przy pomocy ilorazu zagrożeń (ang. hazard ratio). Wykonano wieloczynnikowe analizy oceniające wpływ PRP na wygojenie stawu rzekomego po wykluczeniu wpływu pozostałych czynników. Wykorzystano analizę proporcjonalnych zagrożeń Coxa. W analizie statystycznej wykorzystano następujące metody: estymator Kaplana- Meiera do wykreślenia krzywych K-M (wyrażających prawdopodobieństwo osiągnięcia wygojenia w zależności od czasu obserwacji). Jednorodność krzywych została porównana przy pomocy testu logarytmicznych rang (log-rank). Obliczenia wykonano w Systemie SAS z wykorzystaniem następujących procedur: LIFETEST, FREQ, MEANS, PHREG. 28

29 Wyniki Przeprowadzone analizy jednoczynnikowe wykazały istotny wpływ podawania PRP oraz zastosowania zespolenia LCP, a także wieku jako niezależnych czynników wpływających na czas przebudowy przeszczepów kostnych i tym samym przyspieszenie wygojenia stawu rzekomego. Średnia wieku chorych ogółem wynosiła 36,7 lat, przy czym średnia wieku w grupie chorych, którzy uzyskali zrost była prawie o 10 lat niższa niż w grupie chorych, którzy nie uzyskali zrostu kostnego w czasie obserwacji (34,0 lat vs. 42,5 lat), co pokazuje poniższa tabela. Różnica ta była istotna statystycznie z p=0,0146. Suplementację PRP stosowano u 55 chorych, z czego u 42 uzyskano zrost kostny w czasie obserwacji, natomiast u 13 chorych nie uzyskano zrostu w czasie obserwacji. Różnica ta była istotna statystycznie z p=0,0159. Zespolenie metodą LCP zastosowano u 39 chorych, spośród których 31 uzyskało a 8 nie uzyskało zrostu kostnego w czasie obserwacji. Różnica ta również była istotna statystycznie z p=0,0472. Analizy jednoczynnikowe wykazały natomiast, że zastosowany rodzaj przeszczepów kostnych (autogenne lub mrożone) nie miał istotnego wpływu na uzyskanie wygojenia stawu rzekomego (p=0,3887). Również płeć nie miała istotnego znaczenia (p=0,7861). Razem Zrost Bez zrostu P N=76 N=52 (68,4%) 24 (31,6%) Wiek 36,7 ± 14,3 34,0 ± 13,6 42,5 ± 14,3 0,0146 Płeć męska 49 (64,5%) 33 (63,5%) 16 (66,7%) 0,7861 Przeszczep 42 (55,3%) 27 (51,9%) 15 (62,5%) 0,3887 mrożony Przeszczep 34 (44,7%) 25 (48,1%) 9 (37,5%) autogenne PRP 55 (72,4%) 42 (80,8%) 13 (54,2%) 0,0159 LCP 39 (52%) 31 (59,6%) 8 (34,8%) 0,0472 Tab. 1. Analizy jednoczynnikowe 29

30 Jednowymiarowa analiza proporcjonalnego hazardu Coxa wykazała, że dwoma czynnikami istotnie wpływającymi na prawdopodobieństwo uzyskania wygojenia stawu rzekomego są podanie PRP i zastosowanie zespolenia LCP, przy czym podanie PRP zwiększa szansę na uzyskanie zrostu ponad 2,5-krotnie, a zastosowanie zespolenia LCP 1,8-krotnie. Hazard ratio [95% CI] P (iloraz szans) Wiek 0,984 [0,962 1,006] 0,1425 Płeć żeńska vs męska 1,368 [0,775 2,416] 0,2797 Przeszczep mrożony 0,776 [0,448-1,340] 0,3608 Przeszczep autogenne 1,291 [0,746 2,233] 0,3608 PRP 2,537 [1,261 5,103] 0,0090 LCP 1,834 [1,035 3,247] 0,0376 Tab. 2. Jednowymiarowa analiza proporcjonalnego hazardu Coxa Wielowymiarowa analiza proporcjonalnego hazardu Coxa z zastosowaniem selekcji zmiennych (metoda stepwise lub backward, w obu przypadkach uzyskano takie same wyniki) potwierdza również, iż podanie PRP zwiększa w sposób istotny szansę na osiągnięcie wygojenia stawu rzekomego 2,5 razy i jest to spośród analizowanych cech jedyny niezależny czynnik prognostyczny. Hazard ratio [95% CI] P (iloraz szans) PRP 2,493 [1,239 5,020] 0,0105 Tab. 3. Wielowymiarowa analiza proporcjonalnego hazardu Coxa z zastosowaniem selekcji zmiennych 30

31 Analizując wpływ podawania PRP na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji, wykazano, iż czynnik ten istotnie przyspiesza uzyskanie wygojenia (p=0,0069). W przypadku zastosowania PRP po 6 miesiącach zrost uzyskano u 41% chorych, po 12 miesiącach u 74% chorych, po 18 miesiącach u 84% chorych, a po 24 miesiącach u 88% chorych. Odpowiednio w przypadku, gdy nie podawano PRP zrost uzyskano po 6 miesiącach u 17% chorych, po 12 miesiącach u 45% chorych, po 18 miesiącach u 45% chorych, a po 24 miesiącach u 69% chorych. Wygojenie stawu rzekomego u 50% chorych uzyskano w przypadku podania PRP po 7 miesiącach (mediana 211 dni), a bez zastosowania PRP po 19 miesiącach (mediana 581 dni). Wykres 2. Wpływ podawania PRP na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji 31

32 Analizując prawdopodobieństwo osiągnięcia wygojenia w czasie obserwacji w zależności od rodzaju przeszczepu wykazano, że zastosowanie przeszczepów kostnych autogennych nie przyspiesza istotnie statystycznie uzyskania wygojenia stawu rzekomego (p=0,3586). W przypadku zastosowania przeszczepów kostnych autogennych uzyskano wygojenie po 6 miesiącach u 39% chorych, po 12 miesiącach u 72% chorych, po 18 miesiącach u 80% chorych, a po 24 miesiącach u 88%. W przypadku zastosowania przeszczepów kostnych mrożonych uzyskano wygojenie po 6 miesiącach u 30% chorych, po 12 miesiącach u 63% chorych, po 18 miesiącach u 70% chorych, a po 24 miesiącach u 79% chorych. Wygojenie stawu rzekomego u 50% chorych uzyskano w przypadku zastosowania przeszczepów kostnych autogennych po 8 miesiącach (mediana 246 dni), a w przypadku zastosowania przeszczepów mrożonych po 11 miesiącach (mediana 325 dni). Wykres 3. Prawdopodobieństwo osiągnięcia wygojenia w czasie obserwacji w zależności od rodzaju zastosowanego przeszczepu 32

33 Analizując prawdopodobieństwo osiągnięcia wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji w zależności od zastosowanej techniki operacyjnej wykazano, iż zastosowanie zespolenia LCP przyspiesza istotnie statystycznie wygojenie stawu rzekomego (p=0,0346). W przypadku zastosowania zespolenia LCP wygojenie stawu rzekomego zaobserwowano po 6 miesiącach obserwacji w 36%, po 12 miesiącach w 77%, po 18 miesiącach w 85%, a po 24 miesiącach w 92%. W porównaniu w grupie chorych, u których stosowane były inne metody zespolenia, wygojenie obserwowano odpowiednio po 6 miesiącach w 33%, po 12 miesiącach w 56%, po 18 miesiącach w 64% i po 24 miesiącach w 72%. Wygojenie stawu rzekomego u 50% chorych uzyskano w przypadku zastosowania zespolenia LCP po 9 miesiącach (mediana 271 dni), a w pozostałych przypadkach po 11 miesiącach (mediana 344 dni). Wykres 4. Prawdopodobieństwo osiągnięcia wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji w zależności od zastosowania zespolenia LCP 33

34 Analizując wpływ zastosowania zespolenia LCP na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji, w grupie chorych, którym podawano PRP, wykazano, iż czynnik ten nie przyspiesza istotnie statystycznie wygojenia (p=0,1401). W tej grupie chorych, w przypadku zastosowania zespolenia LCP wygojenie stawu rzekomego zaobserwowano po 6 miesiącach obserwacji w 40%, po 12 miesiącach w 81%, po 18 i po 24 miesiącach w 91%. W porównaniu w grupie chorych, u których podawano PRP, a zastosowane były inne metody zespolenia, wygojenie obserwowano odpowiednio po 6 miesiącach w 44%, po 12 miesiącach w 62%, po 18 miesiącach i po 24 miesiącach w 75%. Wygojenie stawu rzekomego u 50% chorych, którym podawano PRP i zastosowano zespolenie LCP, uzyskano po 8 miesiącach (mediana 246 dni), a w przypadku chorych, którym podawano PRP, lecz zastosowano inne metody zespolenia, po 7 miesiącach (mediana 211 dni). Wykres 5. Wpływ zastosowania zespolenia LCP na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji w grupie chorych, którym podawano PRP 34

35 Analizując wpływ zastosowania poszczególnych rodzajów przeszczepów kostnych (mrożonych lub autogennych) na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji, w grupie chorych, którym podawano PRP, wykazano, iż rodzaj zastosowanego przeszczepu ten nie wpływa istotnie statystycznie na uzyskanie wygojenia (p=0,6222). W grupie chorych, którym podawano PRP i zastosowano przeszczepy kostne autogenne wygojenie stawu rzekomego zaobserwowano po 6 miesiącach obserwacji w 41%, po 12 miesiącach w 76%, po 18 w 88% i po 24 miesiącach w 94%. W porównaniu w grupie chorych, którym podawano PRP i zastosowano przeszczepy kostne mrożone, wygojenie obserwowano odpowiednio po 6 miesiącach w 41%, po 12 miesiącach w 72%, po 18 miesiącach i po 24 miesiącach w 82%. Wygojenie stawu rzekomego u 50% chorych, którym podawano PRP i zastosowano przeszczepy kostne autogenne, uzyskano po 7 miesiącach (mediana 211 dni), tak samo, jak w przypadku chorych, którym podawano PRP, lecz zastosowano przeszczepy kostne mrożone (mediana 211 dni). Wykres 6. Wpływ rodzaju przeszczepów kostnych na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji w grupie chorych, którym podawano PRP 35

36 Analizując wpływ zastosowania poszczególnych rodzajów przeszczepów kostnych (mrożonych lub autogennych) na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji, w grupie chorych, u których zastosowano zespolenie LCP, wykazano, iż rodzaj zastosowanego przeszczepu ten nie wpływa istotnie statystycznie na uzyskanie wygojenia (p=0,8248). W grupie chorych, u których zastosowano zespolenie LCP i przeszczepy kostne autogenne wygojenie stawu rzekomego zaobserwowano po 6 miesiącach obserwacji w 29%, po 12 miesiącach w 76%, po 18 w 84% i po 24 miesiącach w 92%. W porównaniu w grupie chorych, u których zastosowano zespolenie LCP i przeszczepy kostne mrożone, wygojenie obserwowano odpowiednio po 6 miesiącach w 37%, po 12 miesiącach w 71%, po 18 miesiącach w 77% i po 24 miesiącach w 92%. Wygojenie stawu rzekomego u 50% chorych, u których zastosowano zespolenie LCP i przeszczepy kostne autogenne, uzyskano po 10 miesiącach (mediana 295 dni), a w przypadku chorych, u których zastosowano zespolenie LCP i przeszczepy kostne mrożone po 9 miesiącach (mediana 271 dni). Wykres 7. Wpływ rodzaju przeszczepów kostnych na prawdopodobieństwo wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji w grupie chorych, u których zastosowano zespolenie LCP 36

37 Analizując prawdopodobieństwo osiągnięcia wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji w zależności od badanych czynników, zaobserwowano tendencję (p=0,0574), iż w ciągu pierwszych 440 dni, kobiety uzyskują wygojenie szybciej niż mężczyźni, jednak w dwuletniej obserwacji ich końcowe prawdopodobieństwo uzyskania zrostu jest podobne (p=0,2769). Po 6 miesiącach 50% kobiet uzyskało wygojenie, podczas gdy jedynie 26% mężczyzn. Po roku różnica ta byłą już mniejsza 79% kobiet i 60% mężczyzn, po 18 miesiącach odpowiednio 85% kobiet i 69% mężczyzn, a po 2 latach 85% kobiet i 81% mężczyzn. Mediana wygojenia stawu rzekomego dla mężczyzn wynosiła 310 dni, a dla kobiet 200 dni. Wykres 8. Prawdopodobieństwo osiągnięcia wygojenia stawu rzekomego w czasie obserwacji w zależności od płci 37

38 Dyskusja Niewiele istnieje badań, których wyniki można porównać do powyższych. Większość publikacji na temat podawania osocza bogatopłytkowego w stawach rzekomych kości długich dotyczy iniekcji w szczelinę złamania, bez zastosowania przeszczepów kostnych. [92] [95] Kilku autorów opublikowało również badania, w których podawano osocze bogatopłytkowe w trakcie operacji rewizyjnej stawu rzekomego kości długich, jednak nie stosowano suplementacji przeszczepami kostnymi. Wyniki tych badań trudno odnieść do naszych. [96],[97] Sanchez i wsp. opublikował z kolei w 2009r. heterogenną serię 15 chorych, u których w ramach leczenia różnorodnych stawów rzekomych podawano osocze bogatopłytkowe zarówno w połączeniu z suplementacją przeszczepami kostnymi, jak i reosteosyntezą różnymi sposobami, jak i metodą iniekcji pod kontrolą fluoroskopii. Stwierdzono wygojenie wszystkich stawów rzekomych w czasie od 2 do 8 miesięcy, średnio 5. Brak grupy kontrolnej i heterogenność procedur oraz niejednolita grupa stawów rzekomych uniemożliwia porównanie do naszych obserwacji. [98] Calori i wsp. opublikował w 2008r. randomizowane prospektywne badanie na 120 chorych z różnorodnymi stawami rzekomymi, u który w ramach operacji rewizyjnej zastosowano suplementację osoczem bogatopłytkowym lub rekombinowanym BMP (rhbmp-7), w 54 przypadkach w połączeniu z przeszczepami kostnymi autogennymi, w pozostałych 66 przypadkach bez przeszczepów kostnych. Wygojenie stawu rzekomego stwierdzono w 86,7% przypadków zastosowania rhbmp-7 i w 68,3% zastosowania PRP, stwierdzając wyższość zastosowania BMP nad PRP. Niestety również w tym badaniu brak grupy kontrolnej, u której nie zastosowanoby żadnych czynników wzrostu, nie wiadomo również, jaki był procent wygojeń w zależności od tego, czy stosowano przeszczepy kostne. Również heterogenność stawów rzekomych, które obejmowały zarówno kości kończyny dolnej, jak i górnej, obniża wartość badania i uniemożliwia porównanie do naszych wyników. [99],[100] W 2007r. Chiang i wsp. opublikował serię 12 przypadków zastosowania przeszczepów kostnych autogennych w połączeniu z osoczem bogatopłytkowym w leczeniu atroficznych stawów rzekomych kości piszczelowej lub udowej. Stwierdził wygojenie stawu rzekomego u 11/12 chorych po średnio 5 miesiącach od operacji. Zaletą tego badania jest ograniczenie do jedynie stawów rzekomych kości piszczelowej i udowej, których biologia i biomechanika jest zbliżona. Znów brak jest jednak grupy kontrolnej, a porównanie czasu gojenia stawów rzekomych z obserwacji Chianga do badania naszego jest niemiarodajne, z powodu różnic w biomechanice kończyny górnej i dolnej. [101] W 2011r. Hakimi i wsp. opublikował wyniki badania, w którym u 17 chorych ze stawami rzekomymi różnych kości długich w trakcie operacji rewizyjnej zastosowano suplementację autogennymi przeszczepami kostnymi w połączeniu 38