(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61L 27/26 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 17/11 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: KOMPOZYCJA DO NAPRAWY TKANKI CHRZĘSTNEJ I SPOSÓB JEJ WYTWARZANIA (30) Pierwszeństwo: KR (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 12/3 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 17/09 (73) Uprawniony z patentu: Sewon Cellontech Co., Ltd, Seoul, KR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 CHEONG-HO JANG, Seoul, KR JI-CHUL YU, Seoul, KR SAE-BOM LEE, Seoul, KR HYUN-SHIN PARK, Seoul, KR HYUN-JO KIM, Seoul, KR JAE-DEOG JANG, Seoul, KR SE-KEN YEO, Yongin, KR JU-HEE PARK, Seoul, KR SEOK-JUNG KIM, Seoul, KR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-62/VAL EP B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej i sposobu jej wytwarzania, dokładniej biomateriały, takie jak kolagen i fibryna miesza się, tak aby umożliwić naprawę uszkodzonej tkanki chrzęstnej do stanu umożliwiającego przeszczepienie na tkankę i wywołuje się skuteczną regenerację, w ten sposób umożliwiając zmniejszenie stresu związanego z operacją u ludzi i zwierząt przy jednoczesnym wywoływaniu względnie szybkiej i wydajnej naprawy i regeneracji chrząstki i, w efekcie, umożliwiając zasadniczo polepszenie jakości i niezawodności produktu i wywarcie dobrego wrażenia na pacjentach. Opis powiązanej dziedziny [0002] Chrząstka stawowa występująca na wielu powierzchniach stawowych jest niezwykle śliskim i błyszczącym materiałem, którego rola polega na zmniejszaniu tarcia i zapewnianiu odporności na zużycie stawów w trakcie działania stawów. Tarcie wywierane na chrząstkę stawową jest zwiększone, gdy chrząstka stawowa jest uszkodzona i chrząstka stawowa ulega zużyciu i erozji, oraz występuje ból i zaburzenie czynności, a uszkodzenie chrząstki w stawie prowadzi do wystąpienia choroby zwyrodnieniowej stawów. Przyczyny uszkodzenia chrząstki obejmują uraz, taki jak upadek, bezpośrednie uderzenie lub siłę obracającą lub choroby takie jak zapalenie stawu, martwicę kości, zapalne zapalenie stawu lub oddzielającą martwicę kostno-chrzęstną, a objawy obejmują ból, obrzęk i ograniczenie zakresu ruchów. W ciągu ostatnich dziesięcioleci przeprowadzono wiele badań dotyczących fizjologicznej regeneracji chrząstki stawowej w celu leczenia uszkodzenia chrząstki stawowej i stosowano szereg terapii. [0003] Jednakże, zgodnie z doniesieniami, do tej pory stosuje się zwykłe leczenie, takie jak fizjoterapię lub leczenie farmakologiczne do leczenia uszkodzenia chrząstki stawowej, gdyż nie można było uzyskać regeneracji tkanek chrząstki stawowej. Stosuje się leczenie operacyjne i nieoperacyjne. Gorące i zimne okłady oraz lek, taki jak NLPZ i dostawowe wstrzyknięcie steroidów są przykładami leczenia nieoperacyjnego, które prowadzi jedynie do łagodzenia objawów i nie osłabia choroby. Zabiegi naprawcze, takie jak chirurgiczne oczyszczenie, metoda mikrozłamań, artroplastyka z nawiercaniem/abrazyjna, autologiczny przeszczep chrzęstno-kostny, implantacja chondrocytów i wymiana chrząstki stawowej stanowią leczenie operacyjne. [0004] Ostatnio podjęto szereg prób leczenia operacyjnego, w których biomateriały nanoszono na obszar ubytku chrząstki. [000] Biomateriały są zgodne z organizmem ludzkim i nie wykazują jakiegokolwiek odrzucania. Te biomateriały mogą zastępować lub prowadzić do regeneracji uszkodzonej tkanki i narządów do prawidłowej tkanki i prawidłowych narządów. Z tego powodu rośnie zainteresowanie biomateriałami, które mogą być użyte do zastąpienia lub regeneracji uszkodzonej tkanki i narządów. [0006] Organizm ludzki odrzuca obce materiały. Z tego powodu zastąpienie części narządu ludzkiego innymi materiałami jest bardzo trudne. Biomateriały przyczyniają się do postępu chirurgii medycznej, gdyż biomateriały wykazują powinowactwo biologiczne do organizmu ludzkiego. [0007] Istnieją dwa typy biomateriałów, biomateriały syntetyczne i naturalne, które można stosować do wytwarzania implantacyjnych urządzeń medycznych do diagnostyki i leczenia. [0008] Metale, materiały nieorganiczne, materiały ceramiczne, polimery syntetyczne należą do biomateriałów syntetycznych, które nie wykazują odrzucania, ale nie są żywe.

3 [0009] Opracowano i wprowadzono do handlu biomateriały naturalne, takie jak fibryna, kolagen, kwas hialuronowy i chitozan. [00] Materiałami, które tworzą organizm ludzki i podtrzymują życie są biologiczne polimery i komórki. Reprezentatywnymi przykładami są polisacharydy i białka występujące w organizmie ludzkim. Jeśli nie dochodzi do odrzucenia immunologicznego, mogą występować w stanie podobnym do stanu naturalnego i oczekuje się, że doprowadzą do regeneracji ludzkich narządów, które wykazują czynność wzrostową. Tkanki naturalne można stosować jako biomateriał medyczny, który może nadawać funkcje biologiczne nieorganicznym i syntetycznym materiałom polimerowym. Można uzyskać zgodność biologiczną między otaczającymi tkankami a nieorganicznymi biomateriałami przeszczepionymi do organizmu ludzkiego przez tkanki naturalne i dodatkowo tkanki naturalne mogą nadawać funkcje biologiczne nieorganicznym biomateriałom. [0011] Zgodna biologicznie i biodegradowalna fibryna jest stosowana jako naturalny klej i jako środek przeciwkrwotoczny. Fibryna jest wchłaniana przez kilka tygodni w trakcie gojenia rany. Donoszono, że fibryna nie wywiera działań ubocznych, takich jak zapalenie, odpowiedź immunologiczna, martwica miąższu i przerost włókien. [0012] Fibryna w postaci naturalnej podpory dla komórek fibroblastów, odgrywa istotną rolę w gojeniu ran. [0013] Koncepcja produktów fibryny powstała w latach 70 XX wieku, a pierwszy handlowy produkt fibrynowy został sprzedany w Europie w 1982 r. i jest sprzedawany po dziś dzień. W ostatnich badaniach wykazano, że fibryna może być stosowana jako podpora w inżynierii tkankowej i przeprowadzono optymalizację w szeregu dziedzin medycyny, takich jak ortopedia, stomatologia i neurochirurgia. [0014] Kolagen stanowi grupę białek i występuje w skórze, ścięgnie/więzadle, naczyniu krwionośnym, kości i chrząstce. Jedną trzecią całego białka u ssaków stanowi kolagen. [00] Opisano ponad różnych typów kolagenu, należy do nich kolagen typu I, który występuje w skórze, ścięgnie/więzadle i kości, stanowiąc około 90% całkowitego kolagenu. [0016] Kolagen składa się z potrójnej helisy, której masa cząsteczkowa wynosi daltonów (każda helisa ma masę 0000 daltonów). Najmniejszy aminokwas, glicyna, występuje w co trzeciej pozycji(-gxy-; X i Y to dowolne aminokwasy) cząsteczki kolagenu. Z tego powodu całkowita zawartość glicyny w kolagenie to jedna trzecia wszystkich aminokwasów. Kolagen zawiera hydroksyprolinę i zawartość hydroksyproliny jest równa % wszystkich aminokwasów. Hydroksyprolina jest stosowana do analizy ilościowej kolagenu. [0017] Kolagen jest stosowany w szeregu dziedzin medycyny, takich jak środki ściągające, opatrunek na rany, sztuczne naczynia i środki do zmniejszania zmarszczek. Pierwszy kolagenowy środek ściągający, Aviten, w postaci proszku, wyodrębniony ze skóry cielęcia, opracowano w 1974 r. i jest stosowany po dziś dzień. [0018] Istnieją 3 sposoby zastosowania kolagenu jako surowca. Stosowany jest czysty kolagen, kolagen poddany obróbce przez pozbawienie tkanki komórek/usunięcie komórek z tkanki i zmieniony kolagen. [0019] Czysty kolagen ma małą wytrzymałość na rozciąganie, w związku z czym nie zaleca się jego stosowania jako szwu pomimo jego wysokiej trwałości i czystości. Kolagen ma niższą wytrzymałość na rozciąganie i na rozerwanie niż inne polimery, w związku z czym inne materiały, takie jak GAG lub biologicznie zgodne polimery syntetyczne (PGA/PLA) są dodawane do kolagenu w celu polepszenia jego wytrzymałości. [00] Kolagen ma wiele zalet, takich jak niska antygenowość, wysoka zgodność biologiczna i biowchłanialność, wywoływanie przylegania komórek, wzrostu komórek, różnicowania komórek, krzepnięcie krwi, działanie ściągające i zgodność biologiczna z innymi polimerami.

4 [0021] Jednakże właściwości fizyczne i cechy charakterystyczne dotyczące utrzymywania objętości są gorsze i czysty kolagen jest drogi. [0022] Fibryna wykazuje umiarkowane właściwości pod względem objętości, sprężystości i przylegania oraz także wykazuje działanie ściągające. Z tego powodu fibryna jest skutecznym biomateriałem do naprawy i regeneracji tkanki chrzestnej. [0023] Chrząstka stawowa nie jest tkanką unaczynioną i jest pozbawiona unerwienia, i w przeciwieństwie do innych tkanek mezenchymalnych ma bardzo ograniczoną zdolność samoistnego gojenia. Dlatego jednym z celów niniejszego wynalazku jest dostarczenie substancji odżywczych, które stosuje się do regeneracji tkanki chrzęstnej przez dodanie składników podłoża do hodowli chondrocytów. [0024] Po uszkodzeniu tkanki chrzęstnej stawu, nie może ona ulec prawidłowej regeneracji w organizmie. Pacjent odczuwa ograniczenia codziennego funkcjonowania przez silny ból, a gdy staje się to przewlekłe dochodzi do śmiertelnej choroby zwyrodnieniowej stawów, która uniemożliwia normalne życie pacjenta. Odpowiednio w USA i w Europie wykonywanych jest ponad artroplastyk oraz operacji polegających na wymianie całego stawu. [002] Z tego powodu istnieje zapotrzebowanie na prosty zabieg do leczenia obszaru ubytku chrząstki przez zastosowanie lub przeszczepienie biomateriałów, takich jak kolagen i fibryna. Te sposoby leczenia obszaru ubytku chrząstki są bardzo skuteczne na wczesnym etapie uszkodzenia chrząstki. Kiedy takie leczenie prowadzi się na wczesnym etapie uszkodzenia chrząstki, może ono zmniejszyć liczbę pacjentów wymagających operacji polegającej na wymianie stawu kolanowego. Dzięki takiemu leczeniu zapobiegawczemu dojdzie także do zmniejszenia liczby przypadków choroby zwyrodnieniowej stawów. [0026] Uprzednio nie donoszono o kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej przez zastosowanie biomateriałów, takich jak kolagen i klej fibrynowy oraz o sposobach ich stosowania do leczenia. WO 0/ A1 jest ukierunkowany na kompozycję do leczenia chrząstki, zawierającą mieszaninę chondrocytów i trombiny oraz macierz z fibrynogenem zawierającą fibrynogen. WO 01/37889 A2 jest ukierunkowany na materiał zastępujący kość, zawierający miękką macierz, żywe komórki i macierz do leczenia Streszczenie wynalazku [0027] Niniejszy wynalazek jest dostarczony, aby rozwiązać problemy ze stanu techniki. Pierwszym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie kompozycji do naprawy chrząstki składającej się z roztworu fibrynogenu i aprotyniny, trombiny i roztworu stabilizującego oraz roztworu kolagenu. Drugim jest skuteczna regeneracja uszkodzonej tkanki chrzęstnej przez przeszczepialną postać składającą się z biomateriałów takich jak kolagen i fibrynogen. To leczenie zmniejsza obciążenie związane z operacją i wywołuje regenerację i odbudowę obszaru ubytku chrząstki. Trzeci polega na tym, że niniejszy sposób umożliwia proste leczenie obszaru ubytku chrząstki. Czwartym jest zmniejszenie liczby pacjentów, którzy wymagają operacji stawu przez wczesne leczenie obszaru ubytku chrząstki. Piątym jest zmniejszenie liczby pacjentów, którzy wymagają operacji stawu przez leczenie zapobiegawcze. Szóstym jest dostarczenie kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej i sposobu wytwarzania tej kompozycji, tak aby polepszona jakość i niezawodność produktu wywarła dobre wrażenie na pacjentach. [0028] Aby osiągnąć te cele, niniejszy wynalazek dostarcza sposób wytwarzania kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej, obejmujący etapy: (a) rozpuszczenie liofilizowanego fibrynogenu w roztworze aprotyniny; (b) rozpuszczenie liofilizowanej trombiny w roztworze stabilizującym; (c) mieszanie wzbogaconego roztworu kolagenu z trombiną i roztworem stabilizującym; i umieszczenie roztworu (a) fibrynogenu po jednej stronie podwójnego zestawu, a roztworu (c) zawierającego roztwór kolagenu po drugiej stronie, a następnie mieszanie (a) i (c), przy czym czas żelowania po wymieszaniu (a) i (c) wynosi 3 minuty, a

5 maksymalne naprężenie przekracza N, jak zmierzono reometrem CR-00DX, przy czym stężenie fibrynogenu mieści się w zakresie od 3 do mg/l, stężenie roztworu aprotyniny jest równe 00 KIU/ml, stężenie trombiny jest równe 29,41 IU/ml, stężenie roztworu stabilizującego jest równe 0,6 mg/ml, a stężenie kolagenu jest równe 13,23 mg/ml, przy czym roztwór stabilizujący wytwarza się przez dodanie chlorku wapnia do podłoża hodowlanego DMEM do hodowli komórek chrząstki, a podłoże hodowlane DMEM zawiera sole, aminokwasy i witaminy. [0029] Niniejszy wynalazek zapewnia skuteczną regenerację uszkodzonej tkanki chrzęstnej przez przeszczepialną postać składającą się z biomateriałów, takich jak kolagen i fibrynogen i ten sposób zmniejsza obciążenie związane z operacją i wywołuje się szybką i skuteczną regenerację i odbudowę obszaru ubytku chrząstki. [0030] Niniejszy wynalazek dostarcza prosty sposób leczenia obszaru ubytku chrząstki. [0031] Niniejszy wynalazek zapewnia zmniejszenie liczby pacjentów, którzy wymagają operacji stawu przez wczesne leczenie obszaru ubytku chrząstki. [0032] Dodatkowo niniejszy wynalazek zapewnia zmniejszenie liczby pacjentów, którzy wymagają operacji stawu przez leczenie zapobiegawcze. [0033] Niniejszy wynalazek dostarcza polepszoną jakość i niezawodność produktu, które wywierają dobre wrażenie na pacjentach. Krótki opis rysunków [0034] FIG. 1 przedstawia sposób wytwarzania kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej według niniejszego wynalazku. FIG. 2 przedstawia zdjęcie pokazujące stosowanie podwójnego zestawu zawierającego kompozycję do naprawy tkanki chrzęstnej według niniejszego wynalazku. FIG. 3 przedstawia zdjęcie pokazujące nanoszenie kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej według niniejszego wynalazku na obszar ubytku chrząstki u zwierzęcia (świni). FIG. 4 przedstawia zdjęcia, na których pokazano obserwacje wzrokowe wyników doświadczalnych odnośnie nanoszenia kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej według niniejszego wynalazku na obszar ubytku chrząstki u zwierzęcia (królika). FIG. przedstawia zdjęcia, na których pokazano obserwacje histopatologiczne wyników doświadczalnych odnośnie nanoszenia kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej według niniejszego wynalazku na obszar ubytku chrząstki u zwierzęcia (królika). FIG. 6A i 6B przedstawiają zdjęcia pokazujące żelowanie roztworu według odpowiednio niniejszego wynalazku i stanu techniki. FIG. 7A i 7B przedstawiają zdjęcia z mikroskopu fluorescencyjnego pokazujące żywotność komórek chrząstki. Szczegółowy opis wynalazku [003] W dalszej części zostaną szczegółowo opisane postacie niniejszego wynalazku wraz z załączonymi Fig. [0036] Na FIG. 1- przedstawiono kompozycję do naprawy tkanki chrzęstnej i sposób wytwarzania tej kompozycji według niniejszego wynalazku oraz jej nanoszenia. [0037] Gdy szczegółowe wyjaśnienie dotyczące powiązanej znanej dziedziny i konfiguracji technicznej w sposób zbędny powoduje niejasność w odniesieniu do istoty niniejszego wynalazku, szczegółowe wyjaśnienia pominięto. [0038] I definicje w niniejszym wynalazku należy interpretować na podstawie zawartości niniejszego wynalazku, ponieważ określenia mogą być interpretowane zgodnie z zamierzeniem producenta lub zwyczajem. [0039] Po pierwsze niniejszy wynalazek dostarcza stały materiał z użyciem biomateriałów takich jak kolagen i fibrynogen, a także dostarcza wytwarzanie i zastosowanie roztworu stabilizującego, który zapewnia odżywianie w środowisku do regeneracji chrząstki, a na-

6 stępnie dostarcza się kompozycję do naprawy tkanki chrzęstnej, którą wytwarza się w kilku etapach. [0040] Szczegółowo, etapy wytwarzania kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej obejmują (a) rozpuszczenie liofilizowanego fibrynogenu w roztworze aprotyniny; (b) rozpuszczenie liofilizowanej trombiny w roztworze stabilizującym; (c) mieszanie wzbogaconego roztworu kolagenu z trombiną i roztworem stabilizującym; i umieszczenie roztworu (a) fibrynogenu po jednej stronie podwójnego zestawu, a roztworu (c) zawierającego kolagen po drugiej stronie, a następnie mieszanie (a) i (c), przy czym czas żelowania po wymieszaniu (a) i (c) wynosi 3 minuty, a maksymalne naprężenie przekracza N, jak zmierzono reometrem CR-00DX, przy czym stężenie fibrynogenu mieści się w zakresie od 3 do mg/l, stężenie roztworu aprotyniny jest równe 00 KIU/ml, stężenie trombiny jest równe 29,41 IU/ml, stężenie roztworu stabilizującego jest równe 0,6 mg/ml, a stężenie kolagenu jest równe 13,23 mg/ml, przy czym roztwór stabilizujący wytwarza się przez dodanie chlorku wapnia do podłoża hodowlanego DMEM do hodowli komórek chrząstki, a podłoże hodowlane DMEM zawiera sole, aminokwasy i witaminy, i wstrzykiwanie do uszkodzonej tkanki chrzęstnej. [0041] Chlorek wapnia w stężeniu 0,26 mg/ml jest zawarty w roztworze stabilizującym. [0042] Końcowe stężenie chlorku wapnia w roztworze stabilizującym mieści się w zakresie od 0,1 do 0, mg/ml. [0043] A końcowe stężenie chlorku wapnia w kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej mieści się w zakresie od 2,78 do 3,12 mg/ml. [0044] Wytwarzanie roztworu stabilizującego w niniejszym wynalazku zostanie wyjaśnione szczegółowo w następujący sposób. - Chlorek wapnia dodaje się do podłoża hodowlanego DMEM stosowanego w hodowli chondrocytów w celu otrzymania roztworu stabilizującego. Podłoże hodowlane DMEM zawiera sole, aminokwasy i witaminy. Stężenie chlorku wapnia mieści się w zakresie od 0,2 do 6 mg/ml. - Końcowe stężenie chlorku wapnia w kolagenie i w roztworze stabilizującym mieści się w zakresie od 0,1 do 0, mg/ml. - Stężenie chlorku wapnia w roztworze stabilizującym wyznacza się przez czas żelowania i maksymalny zakres naprężenia. Czas żelowania jest równy 3 minuty, a maksymalne naprężenie przekracza N. - Minimalny zakres roztworu stabilizującego oznacza minimalny zakres stosowany do warunków hodowli, a 0, mg/ml chlorku wapnia oznacza udowodniony maksymalny zakres do stabilizacji. Końcowe stężenie chlorku wapnia, które wpływa na komórki, stosowane w handlowym kleju fibrynowym wynosi od 2,78 do 3,12 mg/ml. [004] Stężony kolagen wytwarza się w następujący sposób; Korzystnie stosuje się wysoce wzbogacony kolagen. [0046] Kolagen (poniżej mg/ml) sterylizuje się przez zastosowanie filtru 0,22 µm, a następnie zagęszcza w warunkach aseptycznych. [0047] Masa cząsteczkowa kolagenu jest równa około daltonów, a długość cząsteczki kolagenu jest równa około 300 nm, tak że filtracja jest trudna, gdy stężenie kolagenu przekracza mg/ml. [0048] Kolagen jest zagęszczany w zakresie do 0 mg/ml. [0049] Zagęszczanie kolagenu zaczyna się od mg/l i możliwe jest kontynuowanie do 0 mg/ml (rozpuszczalne i oznaczalne stężenie). [000] Dializę i diafiltrację stosuje się do zagęszczania kolagenu lub stosuje się metodę wirowania w określonym ph i temperaturze. Zagęszczany kolagen umieszcza się w strzykawce do dalszego stosowania. [001] Mieszanie kolagenu, fibrynogenu i roztworu stabilizującego zilustrowano na FIG. 2.

7 6 - Rozpuścić liofilizowany fibrynogen zawarty w produkcie w postaci kleju fibrynowego w 2 cm 3 roztworu aprotyniny, a następnie umieścić roztwór w strzykawce. - Rozpuścić liofilizowaną trombinę w 2 cm 3 roztworu stabilizującego, a następnie umieścić roztwór w strzykawce 0,4 cm 3. - Zagęszczony roztwór kolagenu (3%, 3 cm 3 ) miesza się z roztworem trombiny, a następnie roztwór umieszcza się w strzykawce 2 cm 3. - Roztwór fibrynogenu/aprotyniny i roztwór kolagenu/trombiny umieszcza się w podwójnym zestawie, a następnie nanosi się na obszar ubytku chrząstki. - W sprzedaży w kilku krajach dostępne są różne produkty fibrynogenowe (w postaci kleju fibrynowego), a w tabeli 1 wymieniono produkty dostępne w sprzedaży w Korei. Czynnik krzepnięcia Katalizator krzepnięcia Inhibitor trombolizy wytwarzanie Kraj fibrynogen z osocza ludzkiego trombina z osocza ludzkiego czynnik XIII z osocza ludzkiego Tabela 1. GreenPlast Green Cross Republika Korei Nazwa produktu Beriplast ZLB Behring GmbH Niemcy Tissucol/ Tisseel Baxter AG Austria mg/ml 71,~126, 6~1 70~1 IU/ml 400~ ~ U/ml 44~88 40~80 ~0 chlorek wapnia mg/ml,6~6,24,9,88 aprotynina KIU/ml [002] W innych krajach dostępne są także Hemassel (Kanada), Quixil (Izrael), Bolheal (Japonia), Biocol (Francja) i Vanguard (USA). [003] Postacie kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej i sposób jej wytwarzania wyjaśniono w następujący sposób. [004] Po pierwsze, niniejszy wynalazek dostarcza biomateriały, takie jak kolagen i fibryna, które miesza się, tak aby umożliwić naprawę uszkodzonej tkanki chrzęstnej do stanu umożliwiającego przeszczepienie na tkankę i wywołuje się skuteczną regenerację, w ten sposób umożliwiając zmniejszenie stresu związanego z operacją u ludzi i zwierząt przy jednoczesnym wywołaniu względnie szybkiej i wydajnej naprawy i regeneracji chrząstki. W dalszej części zostaną opisane szczegółowo postacie niniejszego wynalazku. Postać 1 [00] Sposób nanoszenia kolagenu i kleju fibrynowego na obszar ubytku chrząstki u zwierzęcia (cel: potwierdzenie możliwości nanoszenia kolagenu i kleju fibrynowego na obszar ubytku chrząstki u świni). - Po unieruchomieniu nogi świni w uchwycie, chrząstkę uszkadza się wiertłem (2 x 1, cm 2 ).

8 Obszar ubytku chrząstki wypełnia się Thera Fill (wzbogaconym kolagenem) i Greenplast (klejem fibrynowym). Sposób wypełniania jest następujący. 1) Otworzyć Greenplast, a następnie dodać fibrynogen do roztworu aprotyniny przez wstrzyknięcie. 2) Dodać liofilizowaną trombinę do roztworu wapnia. 3) 0,1 ml roztworu trombiny/wapnia miesza się z 1 cm 3 Thera Fill z użyciem łącznika. 4) Roztwory 1) i 3) umieszcza się w podwójnym zestawie, a następnie nanosi się na obszar ubytku chrząstki. [006] Po naniesieniu obszar ubytku chrząstki obserwuje się przez minut. [007] (Wynik: po naniesieniu Thera Fill/kleju fibrynowego na obszar ubytku chrząstki stałe materiały formułuje się w ciągu minut i stałe materiały wykazują dobre cechy charakterystyczne dla praktyków. Patrz FIG. 3) Postać 2 [008] Doświadczenie polegające na nanoszeniu kolagenu i kleju fibrynowego na obszar ubytku chrząstki u królika (cel: potwierdzenie regeneracji chrząstki u królika przez zastosowanie kolagenu i kleju fibrynowego). [009] Po wywołaniu 4 mm ubytku chrząstki w regionie rowka rzepki u królika nowozelandzkiego (NZW), nanosi się kolagen i klej fibrynowy na obszar ubytku, a następnie po 4 tygodniach od naniesienia, przeprowadza się obserwacje gołym okiem i histopatologiczne (FIG. 4 i ). W doświadczeniu stosuje się kolagen (Thera Fill z sewoncellontech) i fibrynę (Tisseel z Baxter). [0060] Hematoksylinę-eozynę, safraninę-o, błękit alcjański, trichrom Massona i kolagen typu I/II stosuje się do wybarwienia do obserwacji histopatologicznych. [0061] (Wynik: potwierdzono w obserwacji gołym okiem, że doszło do odbudowania tkanek w obszarze ubytku, a w obserwacji histopatologicznej potwierdzono, że doszło do regeneracji tkanek w obszarze ubytku, w postaci tkanek chrząstki). [0062] Właściwości fizyczne roztworu stabilizującego zależne od stężenia chlorku wapnia zmierzono i podsumowano w następujący sposób A. Pomiar czasu żelowania i właściwości fizycznych w zależności od stężenia chlorku wapnia w roztworze stabilizującym. 1) Stężenie chlorku wapnia [0063] Stężenie końcowe (mg/ml) 0,26 0, 0, 0,0 0,01 0 Stężenie roztworu stabilizującego 4,4 3,38 1,69 0,84 0, ) Sposób nanoszenia [0064] - Przygotować roztwór kolagenu (3%, 3 cm 3 ) i klej fibrynowy (z Greenplast). - Fibrynogen w Greenplast miesza się z aprotyniną (1 cm 3 ). - Trombinę miesza się z roztworem stabilizującym (1 cm 3 ). - Roztwór kolagenu (3 cm 3 ) miesza się z trombiną (3 cm 3 ) i roztworem stabilizującym (0,4 cm 3 ). - Umieścić roztwór fibrynogenu (1 cm 3 ) i roztwór kolagenu (1 cm 3 ) w podwójnym zestawie, a następnie umieścić mieszaninę w cylindrycznej formie ( 12 X mm), aby otrzymać substancję stałą. 3) Stężenie chlorku wapnia / czas powstawania żelu i żelowanie. [006]

9 Stężenie (mg/ml) 8 Czas powstawania żelu (min) / żelowanie 0, 1 1, 2 3 0,26 * * ** ** *** 0,2 * * ** *** *** 0,1 * * ** ** *** 0,0 * * * * ** 0,01 * * * * ** 0 * * * * ** *: zawiera fazę ciekłą **: w trakcie żelowania ***: żelowanie ukończone [0066] Pomiar właściwości fizycznych zależnych od stężenia chlorku wapnia. - Do pomiaru właściwości fizycznych stałego materiału stosuje się reometr CR- 00DX. - Mierzone parametry: maksymalne naprężenie, wytrzymałość żelu i wytrzymałość na rozciąganie. - Odległość wprowadzenia: 0% wysokości próbki, 7, mm. - Szybkość: 0 mm/min, maksymalne naprężenie: kg. - Łącznik: nr 1, mm. Stężenie chlorku wapnia (mg/ml) (stężenie w końcowym produkcie) Maksymalne naprężenie (Maks. 1) Wytrzymałość żelu Wytrzymałość na rozciąganie N g.cm g/cm 0,26 19,3 1212,9 2493,7 0,2,1 1246,6 291,1 0,1 14,9 918,8 19,3 0,0 6,1 303,1 789,9 0,01 6,9 366,7 888,6 0,4 281,6 691,1 [0067] Sposób mieszania kolagenu i kleju fibrynowego z roztworem stabilizującym w obszarze ubytku chrząstki i pomiar właściwości fizycznych i potwierdzenie zdolności rozkładu (cel: odżywianie jest zablokowane, gdy chrząstki są już uszkodzone. Podłoże hodowlane DMEM, które stosuje się do hodowli komórek chrząstki, dodaje się, aby pomóc odbudować chrząstkę, a produkt zawierający kolagen utrzymuje kształt przez długi czas). 1) Wytwarzanie roztworu stabilizującego, którym jest podłoże hodowlane DMEM wzmocnione chlorkiem wapnia, które stosuje się do hodowli komórek chrząstki. Podłoże hodowlane DMEM zawiera sole, aminokwasy i witaminy. Roztworem stabilizującym jest roztwór wzmocniony chlorkiem wapnia, a jego stężenie mieści się w zakresie od 0,2 do 6 mg/ml. 2) Stężenie chlorku wapnia mieści się w zakresie od 0,1 do 0, mg/ml przy końcowym stosowaniu. 3) Niniejsze doświadczenie przeprowadzono w następujący sposób.

10 9 - Przygotować roztwór kolagenu (3%, 3 cm 3 ) i klej fibrynowy (Greenplast). - Fibrynogen w Greenplast miesza się z aprotyniną (1 cm 3 ). - Trombinę miesza się z roztworem stabilizującym (1 cm 3 ). - Roztwór kolagenu (3 cm 3 ) miesza się z trombiną/roztworem stabilizującym (0,4 cm 3 ). - Klej fibrynowy niezawierający kolagenu stosuje się w grupie porównawczej. - Umieścić roztwór fibrynogenu (1 cm 3 ) i roztwór kolagenu (1 cm 3 ) w podwójnym zestawie, a następnie umieścić mieszaninę w cylindrycznej formie ( 12 X mm), aby otrzymać substancję stałą. Końcowe stężenie chlorku wapnia wynosi 0,26 mg/ml. 4) Pomiar właściwości fizycznych - Do pomiaru właściwości fizycznych stałego materiału użyto reometru CR-00DX. - Mierzone parametry: maksymalne naprężenie, wytrzymałość żelu i wytrzymałość na rozciąganie. - Odległość wprowadzenia: 0% wysokości próbki, 7 mm. - Szybkość: 0 mm/min, maksymalne naprężenie: kg. - Łącznik: nr 1, mm. - Wyniki są następujące. Stały materiał zawierający kolagen jest nieprzezroczysty z zabarwieniem podobnym do zabarwienia chrząstki, a produkt w postaci kleju fibrynowego jest przezroczystym stały materiałem. Zdjęcia pokazujące żelowanie (żelowanie w ciągu 3 minut) Kolagen/roztwór stabilizujący (wg. niniejszego wynalazku) FIG. 6A Produkt w postaci kleju fibrynowego (stan techniki) FIG. 6B ) Potwierdzenie zdolności rozkładu - Stały materiał umieszcza się w podłożu hodowlanym (DMEM) i obserwuje się go przez jeden miesiąc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. - Podłoże hodowlane wymienia się codziennie lub co 2 dni. - Produkt w postaci kleju fibrynowego niezawierający kolagenu ulega rozpadowi w ciągu od 2 do 3 tygodni, ale stały materiał zawierający kolagen utrzymuje kształt przez ponad jeden miesiąc. [0068] Następnie jest doświadczenie dotyczące żywotności komórek chrząstki w kompozycji mieszaniny kolagenu i fibrynogenu. A) Wytworzenie kompozycji kolagenu i fibrynogenu zawierającej komórki chrząstki. 1) Fibrynogen w kleju fibrynowym (Tisseel) rozpuszcza się w roztworze aprotyniny (2 cm 3 ). 2) Liofilizowaną trombinę rozpuszcza się w roztworze stabilizującym. 3) Roztwór kolagenu (Thera fill, 3 cm 3 ) miesza się z trombiną/roztworem stabilizującym (0,4 cm 3 ) z użyciem łącznika. 4) Umieścić 1, cm 3 zmieszanego kolagenu/trombiny/roztworu stabilizującego w strzykawce, a następnie roztwór miesza się z komórkami chrząstki (0, cm 3 (6,0 X 6 komórek/0, cm 3 )). Końcowe stężenie chlorku wapnia jest równe 0,24 mg/ml. ) Mieszaniny 1) i 4) odpowiednio umieszcza się w podwójnym zestawie, a następnie umieszcza się na 0 mm szalce Petriego. B) Doświadczenie potwierdzające żywotność komórek chrząstki w kompozycji.

11 1) Oddzielony produkt w postaci żelu przenosi się na 3 mm szlakę Petriego, a 3 ml podłoża hodowlanego DMEM dodaje się do szalki Petriego, a następnie prowadzi się inkubację w CO 2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 2) Podłoże hodowlane wymienia się dwa razy dziennie i inkubuje przez 3 dni. Skład podłoża hodowlanego obejmuje DMEM/F12, 1% gentamycynę, mg/ml ITS+Premix, 0 ug/ml kwasu askorbinowego, 1mM pirogronian sodu i 0 ng/ml BMP-2. 3) Do analizy stosuje się metodę z kalceiną-am. Analiza z kalceiną-am [0069] - Metoda: Przygotowuje się roztwór roboczy do określania żywotności (żywe/martwe) komórek, zawierający ml PBS, ul 4 mm kalceiny-am i ul 2 mm EthD-1. [0070] Podłoże hodowlane usuwa się z kompozycji inkubacyjnej, a następnie dodaje się 3 ml roztworu roboczego do określania żywotności (żywe/martwe) komórek. Inkubuje się całość przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przenosi na szklane szkiełko. Obserwuje się je pod mikroskopem fluorescencyjnym. [0071] Żywe komórki wybarwiają się zielono, a martwe komórki wybarwiają się na czerwono. - Wynik: Zdjęcia z mikroskopu fluorescencyjnego pokazujące żywotność komórek chrząstki na podstawie analizy z kalceiną-am [0072] Zdjęcia z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiono na FIG. 7A (początkowo (40X)) i FIG. 7B (po 3 dniach inkubacji (40X)). [0073] Obserwacja potwierdza, że po 72 godzinach w kompozycji, 90% komórek jest żywych. Zastrzeżenia patentowe Sposób wytwarzania kompozycji do naprawy tkanki chrzęstnej, obejmujący etapy: (a) rozpuszczenie liofilizowanego fibrynogenu w roztworze aprotyniny; (b) rozpuszczenie liofilizowanej trombiny w roztworze stabilizującym; (c) mieszanie wzbogaconego roztworu kolagenu z trombiną i roztworem stabilizującym; i umieszczenie roztworu (a) fibrynogenu po jednej stronie podwójnego zestawu, a roztworu (c) zawierającego kolagen po drugiej stronie, a następnie mieszanie (a) i (c), przy czym czas żelowania po wymieszaniu (a) i (c) wynosi 3 minuty, a maksymalne naprężenie przekracza N, jak zmierzono reometrem CR-00DX, przy czym stężenie fibrynogenu mieści się w zakresie od 3 do mg/l, stężenie roztworu aprotyniny jest równe 00 KIU/ml, stężenie trombiny jest równe 29,41 IU/ml, stężenie roztworu stabilizującego jest równe 0,6 mg/ml, a stężenie kolagenu jest równe 13,23 mg/ml, przy czym roztwór stabilizujący wytwarza się przez dodanie chlorku wapnia do podłoża hodowlanego DMEM do hodowli komórek chrząstki, a podłoże hodowlane DMEM zawiera sole, aminokwasy i witaminy. Uprawniony: Sewon Cellontech Co., Ltd Pełnomocnik: mgr inż. Agnieszka Marszałek Rzecznik patentowy

12 11

13 12

14 13

15 14

16