(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2014/40 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61L 27/38 ( ) C12N 5/078 ( ) C12N 7/00 ( ) A61L 27/24 ( ) A61F 2/00 ( ) A61L 27/36 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Kompozycja do indukowania regeneracji tkanek poprzez aktywację bogatego w płytki osocza (PRP) oraz sposób jej wytwarzania (30) Pierwszeństwo: KR (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2012/35 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2015/03 (73) Uprawniony z patentu: Sewon Cellontech Co., Ltd, Seoul, KR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 HYUN-SHIN PARK, Seoul, KR JI-CHUL YU, Seoul, KR JU-HEE PARK, Seoul, KR JANG-HOON KIM, Seoul, KR HUN KIM, Seoul, KR SAE-BOM LEE, Seoul, KR JAE-DEOG JANG, Seoul, KR CHEONG-HO JANG, Seoul, KR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji do indukowania regeneracji tkanek poprzez aktywację bogatego w płytki osocza (PRP, ang. platelet rich plasma) roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I oraz sposobu jej wytwarzania. W szczególności kompozycja według niniejszego wynalazku może tworzyć rodzaj żelu zawierającego PRP i może być przenoszona na jakiekolwiek uszkodzenia wymagające regeneracji tkanek w przypadkach takich, jak leczenie ubytku kości i leczenie ran i odpowiednio, PRP może być aktywowane do indukowania czynnika wzrostu, który jest przydatny dla regeneracji tkanek z żelem PRP dla dogodnego i szybkiego osiągnięcia skutecznej regeneracji tkanek. Tak więc sposób jest bardzo przydatny w wysokim wzmacnianiu wiarygodności stosowania PRP na uszkodzenia i prezentowaniu konsumentom dobrego wizerunku. Stan techniki [0002] Jak ogólnie wiadomo bogate w płytki osocze (PRP) jest materiałem autologicznym oddzielonym z pełnej krwi przez wirowanie w gradiencie stężeń i jest substancją nieaktywną, która zawiera dużą ilość zatężonych płytek w stosunkowo małej ilości osocza i zawiera leukocyty w wysokim stężeniu. [0003] Inaktywowane płytki wewnątrz naczynia krwionośnego utrzymują okrągły kształt podczas krążenia w naczyniu krwionośnym. Wiadomo, że płytki mają żywotność około 10 dni i są obecne w ilości około 2 4x10 8 w odniesieniu do 1 ml krwi. [0004] Płytki w PRP są aktywowane przez substancje zawarte w pełnej krwi, a następnie uwalniają czynnik wzrostu i różne substancje aktywne. Substancje aktywujące obejmują kolagen, trombinę, difosforan adenozyny (ADP) and epinefrynę. Szczególnie kolagen i trombina są znani jako silni agoniści. Wiadomo, że kolagen indukuje aktywację płytek przez ich adhezję i specyficzną sekwencję w płytkach jak przedstawiono na Fig. 1. [0005] Gdy czynniki aktywujące aktywują płytki, płytki uwalniają czynnik wzrostu z powodu degranulacji ich ziarnistości alfa. Czynniki odgrywają istotną rolę w inicjowaniu gojenia rany. Uwalniane tu czynniki wzrostu obejmują płytkowy czynnik wzrostu (PDGF-AB, ang. platelet derived growth factor), transformujący czynnik wzrostu (TGF-b1, ang. transforming growth factor-b1), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF, ang. vascular endothelial growth factor), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, ang. epidermal growth factor), insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF, ang. insulin-like growth factor) i tym podobne. Ponadto PRP uwalnia cytokiny itd. w warunkach in vitro, w ten sposób syntetyzując DNA fibroblastów. Zwiększa to wytwarzanie kolagenu, tym samym umożliwia organizowanie się struktury kolagenu. [0006] Jednak stosowanie PRP w postaci ciekłej utrudnia wstrzyknięcie PRP do rany i wiąże się ucieczką do otaczających tkanek. Zatem konieczne jest opracowanie żelowego krzepnięcia towarzyszącego właściwościom fizycznym. Ostatnio przeprowadza się głównie badania z zastosowaniem trombiny do żelowania. Jednak donoszono, że przy zastosowaniu trombin (głównie pochodzenia bydlęcego), które są białkiem pochodzenia zwierzęcego, obserwowano reakcję immunologiczną, taką jak toczeń. Innymi słowy trombina jest znana jako czynnik o problemach klinicznych związanych z przeciwciałem. Trombina jest najsilniejszym składnikiem działającym jako aktywator płytkowy. Jednak stosowanie trombiny wymaga przeciwciał przeciw trombinie, protrombiny, czynnika V i kardiolipiny. Ponadto przez badania na zwierzętach stwierdzono występowanie problemów klinicznych takich, jak krwawienie pooperacyjnie i zespół 1

3 autoimmunologiczny. Mimo, że problemy te występują rzadko, nie mogą one być pomijane w badaniach. Stosowanie trombiny może powodować rozprzestrzenienie się uszkodzonej rany, nieprawidłową wytrzymałość żelu lub tym podobne. [0007] Ponadto, z powodu wysokiej kurczliwości aktywującej żel trombiny, istnieje trudność w chirurgicznej procedurze wypełniania przestrzeni rany. Zatem znaczenie materiału zastępującego trombinę zostało zauważone. [0008] Kolagen jest sztywnym białkiem włóknistym i głównym białkowym składnikiem tkanki łącznej ssaków. Stanowi 30% lub więcej białek całkowitych. Kolagen zapewnia kształt, wytrzymałość i elastyczność tkanki oraz spełnia różne funkcje takie, jak rusztowanie tkanki, adhezja komórkowa, migracja komórkowa, wytwarzanie naczyń krwionośnych, morfogeneza tkanek, naprawa tkanek i tym podobne. Kolagen, jako silny agonista płytek, aktywuje płytki i powoduje agregację płytek. Włóknisty kolagen silniej indukuje aktywację płytek i wspiera większą adhezję płytkową niż kolagen rozpuszczalny. Mimo, że powód takiej różnicy nie został jasno stwierdzony, przypuszcza się, że istnieje możliwość, że włóknisty kolagen wiąże się z cząsteczką zwiększającą działanie aktywowanych płytek krwi. [0009] Kolagen typu I stanowi większość tkanki łącznej u ssaków. Ponadto, jako naturalne rusztowanie, jest najbardziej aktywnie badanym w dziedzinach medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Ze względu na te zalety kolagenu typu I pełni on rolę aktywującą płytki zastępując trombinę i utrzymując kształt. [0010] Publikacja patentowa US B1 przedstawia kompozycję do indukowania regeneracji tkanek przez aktywowanie PRP roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I. Ujawnienie Problem techniczny [0011] Zatem niniejszy wynalazek został opracowany w świetle wyżej wymienionych problemów i dostarcza kompozycje do indukowania regeneracji tkanek przez aktywację bogatego w płytki osocza (PRP) oraz sposobu jej wytwarzania. Niniejszy wynalazek dostarcza następujące rozwiązania. Po pierwsze w celu zmniejszenia reakcji immunologicznej i problemów klinicznych, stosowany jest kolagen typu I, gdyż stosowane bogate w płytki osocze (PRP) razem z białkiem pochodzenia zwierzęcego, to jest trombiną (głównie pochodzenia bydlęcego) jest przyczyną reakcji immunologicznej i problemów klinicznych. Po drugie do leczenia ubytku kości i gojenia ran, jest pobierana mała ilość pełnej krwi, a PRP jest oddzielane z pełnej krwi i wstrzykiwane w mieszaninie z kolagenem typu I. Innymi słowy bogate w płytki osocze (PRP) jako materiał autologiczny i atelokolagen, powodując niewiele reakcji immunologicznych, stosuje się w celu wyeliminowania klinicznego odrzucenia. Po trzecie PRP jest dogodnie i szybko oddzielane na miejscu dla celów procedury chirurgicznej i jest wstrzykiwane w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I, tak że skuteczną regenerację tkanek można uzyskać u pacjentów z ciężkimi uszkodzeniami lub pacjentów poddawanych powtórnym operacjom. Po czwarte, gdy PRP, zebrane według niniejszego wynalazku, jest stosowane w obszarze wymagającym regeneracji tkanek w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I, kolagen typu I aktywuje PRP, indukując czynniki wzrostu przydatne dla regeneracji tkanek z żelu PRP. Jest to skuteczne i umożliwia osiągnięcie dogodnej i szybkiej regeneracji tkanek. Szczególnie po piąte wykrzepianie kolagenu typu I jako agonisty z PRP może uwalniać podobną lub większą liczbę czynników wzrostu zgodnie z rodzajami czynników wzrostu, niż w przypadku wykrzepiania trombiny jako agonisty z PRP. To indukuje bardziej skuteczną regenerację tkanek. Dodatkowo, po szóste, PRP pobrane zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest wstrzykiwane w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I w obszary 2

4 wymagające leczenia ubytku kostnego lub gojenia rany, osiągając w ten sposób skuteczną regenerację tkanek. W końcu, po siódme, w rezultacie, wynalazek bardzo wzmacniania wiarygodność stosowania PRP na uszkodzenia i prezentowanie konsumentom dobrego wizerunku. Rozwiązanie techniczne [0012] Zgodnie z aspektem niniejszego wynalazku, jest tu dostarczany sposób wytwarzania kompozycji do indukowania regeneracji tkanek przez aktywowanie bogatego w płytki osocza (PRP), przy czym sposób, jak określono w zastrzeżeniach, obejmuje etapy, oddzielania PRP z pełnej krwi; mieszania PRP z roztworem chlorku wapnia; i mieszania mieszaniny PRP i roztworu chlorku wapnia z kolagenem typu I. Korzystne efekty [0013] Jak szczegółowo opisano powyżej, w niniejszym wynalazku, w celu zmniejszenia reakcji immunologicznej i problemów klinicznych, stosowany jest kolagen typu I, gdyż stosowane bogate w płytki osocze (PRP) razem z białkiem pochodzenia zwierzęcego, to jest trombiną (głównie pochodzenia bydlęcego) jest przyczyną reakcji immunologicznej i problemów klinicznych. [0014] W opisanym powyżej układzie technicznym według niniejszego wynalazku, do leczenia ubytków kości i gojenia ran, jest pobierana mała ilość pełnej krwi, a PRP jest oddzielane z pełnej krwi i wstrzykiwane w mieszaninie z kolagenem typu I. Innymi słowy bogate w płytki osocze (PRP) jako materiał autologiczny i atelokolagen powodujący niewiele reakcji immunologicznych, stosuje się w celu wyeliminowania klinicznego odrzucenia. [0015] Również w niniejszym wynalazku PRP jest dogodnie i szybko oddzielane w miejscu procedury chirurgicznej i jest wstrzykiwane w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I, tak że skuteczną regenerację tkanek można uzyskać u pacjentów z ciężkimi uszkodzeniami lub pacjentów poddawanych powtórnym operacjom. [0016] Również, gdy PRP, zebrane według niniejszego wynalazku, jest stosowane w obszarze wymagającym regeneracji tkanek w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I, kolagen typu I aktywuje PRP, indukując czynniki wzrostu przydatne w regeneracji tkanek z żelu PRP. Jest to skuteczne i umożliwia osiągnięcie dogodnej i szybkiej regeneracji tkanek. [0017] W szczególności, w niniejszym wynalazku, wykrzepianie kolagenu typu I jako agonisty z PRP może uwalniać podobną lub większą ilość czynników wzrostu zgodnie z rodzajami czynników wzrostu, niż w przypadku wykrzepiania trombiny jako agonisty z PRP. Indukuje to bardziej skuteczną regenerację tkanek. [0018] Ponadto, PRP pobrane zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest wstrzykiwane w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I w obszary wymagające leczenia ubytku kostnego lub gojenia rany, osiągając w ten sposób skuteczną regenerację tkanek. [0019] W końcu, w rezultacie, wynalazek bardzo wzmacniania wiarygodność stosowania PRP na uszkodzenia i prezentowanie konsumentom dobrego wizerunku. Krótki opis figur [0020] Powyższe i inne przedmioty, właściwości i korzyści niniejszego wynalazku staną się bardziej widoczne z poniższego szczegółowego opisu w powiązaniu z załączonymi rysunkami, na których: Fig. 1 przedstawia model, w którym adsorpcja i aktywacja przebiega sekwencyjnie, a agregacja postępuje w wyniku interakcji pomiędzy płytkami a białkami podśródnabłonkowymi; 3

5 Fig. 2 przedstawia zdjęcia 1 ml wzbogaconego w płytki osocza (PRP) oddzielonego z pełnej krwi w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I, gdzie na Fig. 2(a), zawartość roztworu chlorku wapnia wynosi 0,25 mg/ml, na Fig. 2(b), zawartość roztworu chlorku wapnia wynosi 0,3 mg/ml, a na Fig. 2(c), zawartość roztworu chlorku wapnia wynosi 0,5 mg/ml; i Fig. 3 przedstawia zdjęcia hodowli w konwencjonalnej mieszaninie trombiny (A) i mieszaninie kolagenu typu I według wynalazku (B). Szczegółowy opis wynalazku [0021] Korzystna postać wykonania niniejszego wynalazku, w celu zilustrowania tych wyników, będzie opisana poniżej szczegółowo w odniesieniu do załączonych figur. [0022] Według niniejszego wynalazku kompozycja do indukowania regeneracji tkanek przez aktywowanie wzbogaconego w płytki osocza (PRP) i sposób jej wytwarzania skonfigurowano jak przedstawiono na Fig. 2 i 3. [0023] W poniższym opisie niniejszego wynalazku, szczegółowy opis znanych funkcji i konfiguracji zastosowanych w niniejszym opisie zostanie pominięty, gdy zostanie ustalone, że szczegółowy opis znanych funkcji i konfiguracji może zaciemniać niepotrzebnie przedmiot wynalazku. [0024] Również terminy opisane poniżej są określone z uwzględnieniem ich funkcji w wynalazku, które mogą różnić się w zależności od celów producenta lub tradycyjnego użytkowania. Zatem ich definicje mogą opierać się na opisie niniejszej specyfikacji. [0025] Po pierwsze, w niniejszym wynalazku, kompozycja do indukowania regeneracji tkanek przez aktywowanie wzbogaconego w płytki osocza (PRP) jest wytwarzana w następujących etapach: oddzielanie PRP z pełnej krwi; mieszanie PRP z roztworem chlorku wapnia; i mieszanie mieszaniny PRP i roztworu chlorku sodu z kolagenem typu I. [0026] Jednocześnie, w niniejszym wynalazku, kompozycja może być różnie stosowana i może być wytwarzana w różnych postaciach. [0027] Ponadto, należy rozumieć, że wynalazek nie jest ograniczony do konkretnych postaci wykonania, opisanych w szczegółowym opisie i obejmuje modyfikacje, ekwiwalenty i rozwiązania alternatywne w ramach istoty i zakresu załączonych zastrzeżeń niniejszego wynalazku. [0028] Poniżej, operacyjne efekty sposobu, według wynalazku, wytwarzania kompozycji do indukowania regeneracji tkanek przez aktywowanie PRP, zgodnie z konfiguracją powyżej, zostaną opisane. [0029] Po pierwsze, sposób według wynalazku obejmuje etap oddzielania PRP z pełnej krwi. [0030] W niniejszym opisie, etap oddzielania PRP z pełnej krwi obejmuje etap zbierania 10 ml krwi od zwierzęcia lub pacjenta do probówki próżniowej zawierającej 3,2 % cytrynianu sodu, i przede wszystkim wirowanie pobranej pełnej krwi ( g) przez 3 do 5 minut. [0031] Następnie, w ramach konfiguracji, ciecz znad osadu (warstwa osocza) obejmująca kożuszek jest zebrana. [0032] Zebrana ciecz znad osadu (warstwa osocza) obejmująca kożuszek jest przeniesiona do nowej probówki próżniowej tępą igłą i powtórne wirowanie (4500~5000 g) przez 4 do 6 minut. [0033] Następnie, zatężone PRP w dolnej warstwie (od dna do wysokości około 1 ml probówki) jest zebrane tępą igłą. [0034] Również sposób według wynalazku obejmuje etap mieszania PRP z roztworem chlorku wapnia. 4

6 1. EP [0035] W niniejszym opisie, w etapie mieszania PRP z roztworem chlorku wapnia, około 1 ml PRP zebrany w etapie oddzielania PRP z pełnej krwi jest mieszany raz z roztworem chlorku sodu o stężeniu 0,30-0,55 mg/ml przez trójdrożną złączkę. [0036] Również sposób według wynalazku obejmuje etap mieszania mieszaniny PRP i roztworu chlorku wapnia z kolagenem typu I tak, aby wytworzyć kompozycję do indukowania regeneracji tkanek przez aktywowanie PRP. [0037] W niniejszym opisie, etap mieszania mieszaniny PRP i roztworu chlorku wapnia z kolagenem typu I obejmuje etap pozostawienie kolagenu typu I w temperaturze pokojowej. [0038] Wówczas, mieszanina PRP i roztworu chlorku wapnia jest mieszana z nieprzezroczystym (mętnym) kolagenem typu I o stężeniu mg/ml, cztery razy za pomocą połączenia przez trójdrożną złączkę. [0039] Następnie, mieszanina PRP i mieszanina kolagenu typu I, załadowana do strzykawki, jest wstrzykiwana do wszystkich obszarów wymagających regeneracji tkanek w przypadkach takich, jak leczenie ubytku kości i gojenie ran. [0040] Korzystnie kolagen typu I ma stężenie mg/ml. [0041] Ponadto, kolagen typu I jest korzystnie pozostawiony w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut. [0042] Przykłady według niniejszego wynalazku zostaną opisane poniżej. [Przykład 1] [0043] Po pierwsze, zestaw do oddzielania PRP wytworzono jak poniżej. 1) Probówka próżniowa zawierająca 3,2 % cytrynianu sodu 2) uchwyt na probówkę próżniową 3) igła probówko próżniowej 4) probówka próżniowa (zwykłego rodzaju) 5) 3 ml strzykawka 6) tępa igła [0044] Z komponentów wymienionych powyżej, można wywnioskować sposób rozdzielania PRP. Po pierwsze, 1) Od pacjenta zostaje pobrane 10 ml pełnej krwi do probówki próżniowej zawierającej 3,2 % cytrynianu sodu. 2) Pełna krew umieszczona w probówce próżniowej jest wirowana ( g) przez 3 do 5 minut. W niniejszym opisie, przyspieszenie grawitacyjne i czas separatora odśrodkowego są ustawiane na optymalne poziomy dla oddzielenia z pełnej krwi hemocytów, kożuszka i osocza. 3) Potem zamknięcie próżniowej probówki zostaje otwarte, ciecz znad osadu (warstwa osocza) obejmująca kożuszek zostaje zebrana i przeniesiona do nowej probówki próżniowej (zwykłego rodzaju) przy użyciu strzykawki dostarczonej z tępą igłą. 4) Osocze obejmujące kożuszek, przeniesione do nowej probówki próżniowej, jest wirowane ( g) przez 4 do 6 minut. W niniejszym opisie, przyspieszenie grawitacyjne i czas separatora odśrodkowego są ustawiane na optymalne poziomy dla zatężenia PRP w osoczu. 5) Potem zamknięcie próżniowej probówki zostaje otwarte, PRP zatężone w dolnej warstwie probówki (od dna do wysokości około 1 ml probówki) jest zebrane przy użyciu strzykawki z tępą igłą. 6) W celu określenia wydajności oddzielania 1 ml oddzielonych płytek z 10 ml pełnej krwi, ze swoistym markerem powierzchniowym płytek tj. CD41 i swoistym markerem powierzchniowym leukocytów tj. CD45 poddaje się reakcji. Następnie stosuje się cytometrię przepływową do pomiaru liczby komórek z ekspresją. W rezultacie liczba płytek oddzielonego PRP wynosi 5,8 do 7,6 razy więcej niż liczba wyjściowa. W 5

7 rekomendacjach klinicznych wymagana liczba musi być 4,0 do 6,0 razy (około płytek/ml) wyższa niż podstawowa na objętość 6 ml pełnej krwi. Zatem sposób oddzielenia PRP spełnia zalecenia. Również liczba leukocytów wynosi 2,8 do 4,2 więcej niż wyjściowa. Zatem w stosowaniu PRP jest spodziewane działanie przeciwwirusowe. [0045] Ponadto, jak wskazano w poniższej Tabeli, pełna krew jest wirowana (1: g, 3 do 5 minut, 2: g, 4 do 6 minut) dwa razy tak, by oddzielić 1 ml PRP. Wówczas, swoisty marker powierzchniowy płytek tj. CD41 i swoisty marker powierzchniowy leukocytów tj. CD45 poddaje się reakcji. Następnie stosuje się cytometrię przepływową do pomiaru liczby komórek z ekspresją. W rezultacie liczba płytek oddzielonego PRP wynosi 5,8 do 7,6 razy więcej niż liczba wyjściowa, a liczba leukocytów wynosi 2,8 do 4,2 więcej niż wyjściowa. [Tabela 1] Próbka Liczba płytek (x 10 8 /ml) Leukocyty (x 10 6 /ml) Wyjściowo w pełnej krwi W PRP (wielokrotność wyjściowej) Wyjściowo w pełnej krwi W PRP (wielokrotność wyjściowej) Próbka 1 2,46 14,81 (6,02) 8,7 29.7(3,41) Próbka 2 1,18 11,27 (6,20) 4,3 14,9(3,50) Próbka 3 2,11 15,24 (7,22) 5,0 20,9(4,18) Próbka 4 2,62 16,15 (6,16) 12,1 39,3(3,27) Próbka 5 1,94 11,58 (6,00) 4,6 12,9(2,80) Próbka 6 2,36 20,09 (5,81) 6,2 25,2(4,06) Próbka 7 2,55 17,48 (6,85) 6,4 30,7(4,80) Próbka 8 1,77 13,52 (7,64) 4,8 17,9(3,73) Próbka 9 2,13 15,6 (7,32) 5,0 17,9(3,58) Średnia 2,19 15,08 (6,88) 6,3 23,3(3,7) [Przykład 2] [0046] Zestaw do podawania mieszaniny PRP, roztworu chlorku wapnia i kolagenu typu I jest przygotowany jak poniżej. 1) 1 ml, 3 ml strzykawki 2) Trójdrożna złączka 2) roztwór chlorku wapnia 3) mg/ml kolagenu typu I [0047] Z komponentów wymienionych powyżej, można wywnioskować sposób podawania mieszaniny PRP, roztworu chlorku wapnia i kolagenu typu I. Po pierwsze, 1) Strzykawkę napełnioną 1 ml PRP połączono ze strzykawką napełnioną roztworem chlorku wapnia o stężeniu 0,30-0,55 mg/ml poprzez trójdrożną złączkę i materiały zmieszano od razu. [0048] Innymi słowy Fig. 2 przedstawia zdjęcia 1 ml wzbogaconego w płytki osocza (PRP) oddzielonego z pełnej krwi w mieszaninie z roztworem chlorku wapnia i kolagenem typu I, gdzie na Fig. 2(a), zawartość 6

8 roztworu chlorku wapnia wynosi 0,25 mg/ml, na Fig. 2(b), zawartość roztworu chlorku wapnia wynosi 0,3 mg/ml, a na Fig. 2(c), zawartość roztworu chlorku wapnia wynosi 0,5 mg/ml. W niniejszym wynalazku, dla agregacji płytek w mieszaninie roztworu chlorku wapnia i kolagenu typu I, optymalne stężenie chlorku wapnia korzystnie wynosi od 0,30 do 0,55 mg/ml. [0049] Jon wapnia (Ca 2+ ) jako składnik roztworu chlorku wapnia odgrywa rolę w konwersji rozpuszczalnego w nierozpuszczalny w krzepnięciu krwi. Taka właściwość jonu wapnia (Ca 2+ ) indukuje agregację płytek mieszaniny 1 ml oddzielonego PRP i kolagenu typu I. Zatem jeśli stężenie roztworu chlorku wapnia do agregacji płytek krwi wynosi 0,25 mg/ml lub mniej, agregacja płytek nie następuje. Z drugiej strony jeśli stężenie wynosi 0,55 mg/ml lub więcej, uszkodzenie komórkowe jest spowodowane ciśnieniem osmotycznym. 2) Kolagen typu I o stężeniu mg/ml jest pozostawiany w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut tak, aby zmienić kolagen rozpuszczalny w kolagen włóknisty. W niniejszym opisie, powód przetrzymywania kolagenu typu I w temperaturze pokojowej jest następujący: po pierwsze, kolagen typu I ogrzewa się tak, że kolagen typu I w stanie kolagenu rozpuszczalnego może być przekształcony w kolagen włóknisty (ang. fibrillarcollagenated); po drugie, nie ma prawie żadnej różnicy w ilościach uwalnianych czynników wzrostu pomiędzy mieszaniną włóknistego kolagenu typu I z PRP, a mieszaniną kolagenu typu I w stanie kolagenu rozpuszczalnego z PRP; i po trzecie, ogólnie, włóknisty kolagen typu I może skuteczniej indukować agregację płytek i wspierać adhezję płytek, niż rozpuszczalny kolagen. 3) Strzykawka napełniona mieszaniną 1 ml PRP i roztworem chlorku wapnia jest połączona z tą samą ilością włóknistego kolagenu typu I o stężeniu mg/ml poprzez trójdrożną złączkę i substancje miesza się ze sobą cztery razy. 4) Mieszanina PRP, roztworu chlorku wapnia i kolagenu typu I, umieszczona w strzykawce, jest wstrzykiwana do wszystkich obszarów wymagających regeneracji tkanki w przypadkach takich jak leczenie ubytku kostnego i gojenie rany. [Przykład 3] [0050] 1) Mieszanina PRP, roztworu chlorku wapnia i kolagenu typu I, umieszczona w strzykawce, jest wprowadzana do okrągłodennej szklanej probówki. 2) Mieszanina jest utrzymywana w 37 C w inkubatorze przez 15 minut i wykrzepiana. W niniejszym opisie, poprzez utrzymywanie mieszaniny w 37 C w inkubatorze, możliwe jest uzyskanie tych samych warunków jak te, gdy mieszanina jest podawana do obszaru tkanek i wykrzepiana. 3) Wykrzepiona mieszanina jest umieszczana w 24-studzienkowym wysterylizowanym naczyniu do hodowli, do którego dodano with 1 ml DMEM i utrzymywano w 37 C w inkubatorze. [0051] Za pomocą wyżej opisanej metody, 10 ml pełnej krwi pobrano od pacjenta i poddano dwóm etapom wirowania w celu otrzymania 1 ml zatężonego PRP. PRP najpierw zmieszano z roztworem chlorku wapnia, a następnie zmieszano z kolagenem typu I. Dalej mieszaniny przeniesiono do wszystkich obszarów wymagających regeneracji tkanek w przypadkach takich jak leczenie ubytku kostnego i gojenie rany. W tym sposobie nie występuje kliniczne odrzucenie. Możliwe jest również oddzielenie PRP, mieszanie PRP z kolagenem typu I i dostarczenie mieszaniny, w krótkim czasie. Jest zatem możliwe skuteczne i szybkie indukowanie regeneracji tkanek, takiej jak leczenie ubytku kostnego i gojenie rany. [0052] W szczególności, Fig. 3 przedstawia hodowle, kiedy oddzielone PRP jest aktywowane zarówno trombiną jak i kolagenem typu I, a podłoże hodowlane jest utrzymywane w 5 % CO2 w inkubatorze (37 C). Po 7

9 15 dniach, większość konwencjonalnej mieszaniny trombiny (A) uległa degradacji. Z drugie strony, mieszanina kolagenu według wynalazku (B) zachowała swój początkowy kształt z niewielką zmianą wielkości w ciągu 15 dni. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kompozycji do indukowania regeneracji tkanki poprzez aktywację bogatego w płytki osocza (PRP), przy czym sposób obejmuje etapy: oddzielania PRP z pełnej krwi; mieszania PRP z roztworem chlorku wapnia; i mieszania mieszaniny PRP i roztworu chlorku sodu z kolagenem typu I; przy czym etap oddzielania PRP z pełnej krwi obejmuje etapy: zebrania 10 ml pełnej krwi od zwierzęcia lub pacjenta do probówki próżniowej zawierającej 3,2 % cytrynianu sodu i pierwszego wirowania pobranej pełnej krwi ( g) przez 3 do 5 minut; zebrania cieczy znad osadu (warstwa osocza) obejmującej kożuszek otrzymany przez wirowanie; przeniesienie tępą igłą zebranej cieczy znad osadu (warstwa osocza), obejmującej kożuszek, do nowej probówki próżniowej i powtórne wirowanie (4500~5000 g) przez 4 do 6 minut; i zebrania tępą igłą PRP zatężonego w dolnej warstwie (od dna do wysokości około 1 ml probówki). 2. Sposób według zastrz. 1, w którym w etapie mieszania PRP z roztworem chlorku sodu, około 1 ml PRP zebranego w procesie oddzielania PRP z pełnej krwi jest mieszany raz z roztworem chlorku sodu o stężeniu 0,30-0,55 mg/ml przez trójdrożną złączkę. 3. Sposób według zastrz. 1, w którym w etapie mieszania mieszaniny PRP i roztworu chlorku wapnia z kolagenem typu I obejmuje etapy: pozostawienia kolagenu typu I w temperaturze pokojowej; mieszania mieszaniny PRP i roztworu chlorku wapnia z kolagenem typu I o stężeniu mg/ml, w nieprzezroczystej fazie, cztery razy za pomocą połączenia przez trójdrożną złączkę; i wstrzykiwania mieszaniny PRP i kolagenu typu I, załadowanej do strzykawki do wszystkich obszarów wymagających regeneracji tkanek w przypadkach, takich jak leczenie ubytku kości i gojenie ran. 4. Sposób według zastrz. 3, przy czym kolagen typu I ma stężenie mg/ml. 5. Sposób według zastrz. 3, przy czym kolagen typu I jest utrzymywany w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut. 8

10 Fig.1 Krążące spoczynkowe płytki krwi Adhezja do odsłoniętego podśródbłonka Aktywacja i agregacja płytek Powstawanie mikropęcherzyków Nienaruszony śródbłonek vwf i kolagen Rozpad płytek Skrzeplina Sieć fibryny Fig.2 9

11 Fig.3 A: PRP aktywowane trombiną B: PRP aktywowane kolagenem 6 dni 9 dni 15 dni 10

12 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie US B1 [0010] 11