(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 3/32 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/13 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Zawierająca fibrynę półstała mieszana kompozycja osteoblastyczna do leczenia złamań kości i sposób jej wytwarzania () Pierwszeństwo: KR (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/09 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/09 (73) Uprawniony z patentu: Sewon Cellontech Co., Ltd., Seoul, KR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 HYUN-SHIN PARK, Seoul, KR JAE-DEOG JANG, Seoul, KR CHEONG-HO CHANG, Seoul, KR SOO-JIN JUNG, Guri, KR SAE-BOM LEE, Seoul, KR CHANG-KWON KO, Seoul, KR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP.Z O.O. SKR. POCZT WARSZAWA Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [Dziedzina wynalazku] [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej, do zrostu kostnego i sposobu jej wytwarzania. Dokładniej niniejszy wynalazek dotyczy półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego, która dostarcza terapeutycznego czynnika obejmującego mieszaninę osteoblastów i fibrynę, a która może być wstrzyknięta do uszkodzonej części w celu uzyskania zrostu kostnego w leczeniu poważnego złamania kości; oraz sposobu jej wytwarzania [Stan techniki] [0002] Generalnie proste złamanie kości może być w sposób wystarczający leczone opatrunkiem gipsowym przez kilka tygodni, ale ciężkie złamanie kości lub ubytek kostny wymagają przeszczepu kostnego. [0003] Preferowanym przez wielu lekarzy sposobem przeszczepu kostnego jest autoprzeszczep, co wiąże się z pobraniem kości z części ciała pacjenta, szczególnie grzebienia kości biodrowej, następnie przeszczepieniem do uszkodzonego miejsca w ciele pacjenta. Sposób ten może dostarczyć wspaniałych wyników wskutek przeszczepienia własnej kości pacjenta. Jednak taki autoprzeszczep wiąże się niekorzystnie z techniką operacyjną, której towarzyszy bardzo ciężki ból i obecność różnych potencjalnych problemów towarzyszących, z prawdopodobieństwem wystąpienia tkliwości i utraty czucia w regionie pobrania kości, konieczność dodatkowej operacji chirurgicznej dla przeszczepu kostnego, a zatem długi czas hospitalizacji i powrotu do zdrowia, prowadzący do wzrostu kosztów medycznych. W dodatku nie ma w organizmie wystarczających dodatkowych kości do przeszczepu i tym samym autoprzeszczep stwarza wiele trudności w zapewnieniu części donorowych dostarczających kość do przeszczepienia. Donoszono, że w przypadku chirurgii kręgosłupa wymagającej wielu przeszczepów kości, występowanie powikłań spowodowanych autoprzeszczepem kości jest wysokie i wynosi nawet około 23%. [0004] Alloprzeszczep, który był stosowany do złagodzenia tych defektów wykazywanych przez autoprzeszczep, wykorzystuje przede wszystkim kości ze zwłok i jest korzystny ze względu na brak konieczności dodatkowej wtórnej operacji w przypadku przeszczepu kostnego, ale wykazuje poważne wady, takie jak osłabienie wytrzymałości kości w trakcie procesu sterylizacji, występowanie odrzucania przeszczepu i prawdopodobieństwo infekcji chorobami zakaźnymi, takimi jak zapalenie wątroby i AIDS. W dodatku alloprzeszczep ma wady, takie jak słabe działania kościotwórcze, reakcja immunologiczna, absorbcja kości i powtórne złamanie odpowiednich kości, które ograniczają jego zastosowanie do bardzo wąskiego zakresu. W związku z tym zastosowanie tej techniki chirurgicznej zmalało od końca 1993, ponieważ Food & Drug Administration zaostrzył przepisy banku tkanek kostnych przeciw zakażeniu. [000] Tymczasem wstrzykiwanie szpiku kostnego jest metodą opartą na twierdzeniu, zaproponowanym przez Hugginsa (1931), Friedensteina (1973) i Ashtona (1980), w którym komórki osteoprogenitorowe ze szpiku kostnego indukują i ułatwiają tworzenie kości. W leczeniu złamań kości przeprowadza się na ogół samo wstrzykiwanie szpiku kostnego, ale również przeprowadza się je w połączeniu z przeszczepem kostnym. W przeciwieństwie do innych technik przeszczepu kostnego, wstrzykiwanie szpiku kostnego nie pociąga za sobą chirurgicznego cięcia skóry do pobrania części i w ten sposób jest korzystne z powodu braku powikłań w miejscu pobrania oraz komplikacji lub niepożądanych działań ubocznych. [0006] Następnie, chociaż opublikowano pewne znakomite wyniki w wielu przypadkach klinicznego stosowania, stwierdzono, że wstrzyknięcie szpiku kostnego nie jest korzystne, ponieważ jest oparte na błędnych przesłankach podstaw teoretycznych, z racji, że znaczna część wyników otrzymanych jest 1

3 niespójna między sobą, ilość szpiku kostnego możliwa do pobrania z jednego miejsca jest ograniczona, a ponadto liczba komórek osteoprogenitorowych obecnych w szpiku jest znacznie ograniczona. 1 [Ujawnienie] [Problem techniczny] [0007] Niniejszy wynalazek został zatem przedstawiony w świetle powyższych problemów, a przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego i sposobu jej wytwarzania. Kompozycja ta wykazuje brak klinicznego odrzucenia przeszczepu dzięki wstrzyknięciu mieszaniny osteoblastów i fibryny do miejsca, gdzie zabiegamy o zrost kostny i daje możliwość osiągnięcia skutecznego i szybkiego zrostu kostnego. Przez wstrzyknięcie kompozycji według wynalazku, którą w pewnym stopniu ukształtowano, następuje zmniejszenie problemów związanych z prawdopodobieństwem tworzenia tkanki kostnej w niepożądanych regionach wynikającym z wędrówki wstrzykniętych osteoblastów z miejsca zrostu kości, a następnie ich rozprzestrzeniania się w inne miejsca drogą krwi, co mogłoby mieć miejsce przy wstrzyknięciu zawiesiny samych osteoblastów. [0008] Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego i sposobu jej wytwarzania, która umożliwi przeprowadzenie operacji chirurgicznej z minimalnym cięciem, kiedy osteoblasty i fibryna są wstrzyknięte w miejscu, gdzie oczekiwany jest zrost kości, która umożliwi osiągnięcie zrostu kostnego przez proste i skuteczne wstrzyknięcie mieszanej kompozycji osteoblastów i fibryny bez cięcia odpowiadających uszkodzeniom okolic określanych przy wykorzystaniu promieni Rtg [Rozwiązanie techniczne] [0009] Zgodnie z aspektem niniejszego wynalazku powyższe i inne przedmioty można osiągnąć przez dostarczenie sposobu wytwarzania półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego, obejmującego: izolowanie osteoblastów z tkanki kostnej i hodowanie/namnażanie izolowanych osteoblastów w DMEM (podłoże Eagle a w modyfikacji Dulbecco a, ang. Dulbecco's Modified Eagle's Medium) lub α-mem (podłoże minimalne, modyfikacja alfa, ang. Minimum Essential Medium, Alpha modification) z wytworzeniem zawiesiny osteoblastów; i mieszanie otrzymanej zawiesiny osteoblastów z czynnikiem koagulacji z wytworzeniem terapeutycznego czynnika osteoblastycznego. [00] Czynnikiem koagulacji jest tu mieszanina trombiny i fibrynogenu. [0011] Etapy wytwarzania czynnika terapeutycznego obejmują rozpuszczenie liofilizowanej trombiny w ciekłym DMEM lub α-mem, a następnie mieszanie 1 do 0 IU/ml rozpuszczonej trombiny z mieszanym roztworem osteoblastów; i rozpuszczenie liofilizowanego fibrynogenu w ciekłym DMEM lub α-mem, a następnie mieszanie do 0 mg/ml rozpuszczonego fibrynogenu z mieszanym roztworem osteoblastów, z domieszaną do niego trombiną. [0012] Zgodnie z innym aspektem niniejszego wynalazku, dostarczono kompozycję osteoblastyczną wykonaną wyżej wymienionym sposobem wytwarzania półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego. 2

4 1 2 [Korzystne działania] [0013] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem półstała, zawierająca fibrynę, kompozycja osteoblastyczna do zrostu kostnego, o budowie opisanej powyżej, i sposób jej wytwarzania, umożliwia przeszczep kostny, bez klinicznego odrzucania przeszczepu, przez wstrzyknięcie mieszaniny osteoblastów i fibryny do miejsca, gdzie oczekujemy zrostu kostnego i umożliwia osiągnięcie skutecznego i szybkiego zrostu kostnego przez wstrzyknięcie kompozycji, którą w pewnym stopniu ukształtowano, aby złagodzić problemy związane z prawdopodobieństwem tworzenia tkanki kostnej w niepożądanych regionach, wynikającym z wędrówki wstrzykniętych osteoblastów z miejsca zrostu kości, a następnie z ich rozprzestrzenianiem się w inne miejsca drogą krwi, co mogłoby mieć miejsce przy wstrzyknięciu zawiesiny samych osteoblastów. [0014] W dodatku niniejszy wynalazek umożliwia przeszczepianie kości przez przeprowadzenie operacji chirurgicznej z minimalnym cięciem, kiedy osteoblasty i fibryna są wstrzyknięte w miejscu, gdzie oczekiwany jest zrost kości, która umożliwi osiągnięcie zrostu kostnego przez proste i skuteczne wstrzyknięcie mieszanej kompozycji osteoblastów i fibryny bez cięcia odpowiadających uszkodzeniom okolic, określanych przy wykorzystaniu promieni Rtg. [Opis figur] [001] Powyższe i inne aspekty, właściwości oraz inne korzyści niniejszego wynalazku będą bardziej zrozumiałe z poniższego szczegółowego opisu w powiązaniu z załączonymi rysunkami, w których: Fig. 1 jest schematem poglądowym przedstawiającym kaskadę polimeryzacji fibryny; Fig. 2 jest schematycznym diagramem przedstawiającym polimeryzację fibrynowej macierzy; Fig. 3 jest schematem blokowym przedstawiającym sposób wytwarzania półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastów do zrostu kostnego zgodnie z niniejszym wynalazkiem; Fig. 4 jest zdjęciem przedstawiającym wstrzyknięcie mieszaniny fibryny i osteoblastów po wprowadzeniu do złamania o wielkości 1 mm w kości przedramienia królika; Fig. jest zdjęciem rentgenowskim zrobionym 6 tygodni po wstrzyknięciu półstałego terapeutycznego czynnika osteoblastycznego zawierającego mieszaninę fibryny i osteoblastów po wprowadzeniu do złamania o wielkości 1 mm w kości przedramienia królika; Fig. 6 jest zdjęciem histologicznego skrawka tkanki barwionego hematoksyliną-eozyną, zrobionym 6 tygodni po wstrzyknięciu półstałego terapeutycznego czynnika osteoblastycznego, zawierającego mieszaninę fibryny i osteoblastów, po wprowadzeniu do złamania o wielkości 1 mm w kości przedramienia królika; Fig. 7 jest zdjęciem histologicznego skrawka tkanki barwionego trójchromianem Massona, zrobionym 6 tygodni po wstrzyknięciu półstałego terapeutycznego czynnika osteoblastycznego zawierającego mieszaninę fibryny i osteoblastów po wprowadzeniu do złamania o wielkości 1 mm w kości przedramienia królika; 3 40 [Najlepsza postać realizacji wynalazku] [0016] Dalej półstałą, zawierającą fibrynę, kompozycję osteoblastów do zrostu kostnego według niniejszego wynalazku i sposób jej wytwarzania opisano bardziej szczegółowo w odniesieniu do załączonych rysunków. [0017] W celu przezwyciężenia niedogodności wykazywanych przez terapie konwencjonalne do leczenia uszkodzeń i chorób kości, takie jak przeszczepianie implantów i kości, metoda przeszczepiania na uszkodzoną część autologicznych osteoblastów nieposiadająca niepożądanych działań ubocznych, przez hodowanie osteoblastów, została rozwinięta wraz z udoskonaleniem terapii konwencjonalnych jako istotny sposób leczenia. 3

5 [0018] Jednak do osiągnięcia wcześniejszego zrostu kostnego, niezbędne jest mieszanie osteoblastów z macierzą, przez co większa różnorodność uszkodzeń może być leczona, a tym samym możliwe jest leczenie większej liczby chorób kości, w przypadku których brak jest terapeutycznych korzyści ze wstrzyknięcia płynnej zawiesiny osteoblastów, składającej się tylko z osteoblastów. [0019] Można powiedzieć, że półstały terapeutyczny czynnik osteoblastyczny do zrostu kości, który jest mieszaniną osteoblastów i fibryny, jest bardziej zaawansowanym produktem od sposobu wstrzyknięcia ciekłej zawiesiny osteoblastów, który opiera się na terapii komórkowej. Konwencjonalny sposób wstrzyknięcia ciekłej zawiesiny osteoblastów, który wiąże się z przeszczepianiem samych osteoblastów, może być stosowany tylko w ograniczonych rodzajach uszkodzeń kości i może przysparzać problemów, związanych z prawdopodobieństwem tworzenia tkanki kostnej w niepożądanych regionach, wynikającym z wędrówki wstrzykniętych osteoblastów z miejsc kościotworzenia, a następnie z ich rozprzestrzenianiem się w inne miejsca drogą krwi. Przeciwnie półstały terapeutyczny czynnik osteoblastyczny zawierający fibrynę zgodnie z niniejszym wynalazkiem składa się z mieszaniny osteoblastów i fibryny, dlatego może również szybciej i skuteczniej leczyć szerszy zakres złamań i poważnych chorób kości. [00] Donoszono, że klej fibrynowy sprzyja neowaskularyzacji na modelach zwierzęcych (Schlag G. Clinical Orthopedics, 1988) i jest bardzo skuteczny w zwiększaniu stosowalności sposobów stosowanych w przeszczepianiu materiałów do wszczepiania zastępujących kości, takich jak zdemineralizowany proszek kostny, bioaktywne szkło, hydroksyapatyt i granulki korala, przy przeprowadzaniu chirurgicznej operacji przeszczepienia takich materiałów. [0021] W dodatku klej fibrynowy służy jako skuteczny nośnik dostarczający bioaktywatorów macierzy kostnej. Jako przykłady takich bioaktywatorów można wymienić TGF-β-1 (transformujący czynnik wzrostu beta-1, ang. Transforming growth factor-beta-1) i BMP związane z TGF-β (białko morfogenetyczne kości związane z transformującym czynnikiem wzrostu β-1, ang. Transforming growth factor-beta related Bone morphogenetic protein). Ostatnio fibrynowemu klejowi poświęcono wiele uwagi jako składnikowi macierzy, który skutecznie dostarcza komórki, w zastosowaniach inżynierii tkankowej (Huang Q. Tissue Engineering 02). W niniejszej kompozycji wyżej wymienione właściwości kleju fibrynowego prowadzą do szybkiego procesu zrostu kości związanego z mieszaniem osteoblastów z klejem fibrynowym, jako materiałem macierzy, przed jego zastosowaniem do zrostu kości. [0022] Odnosząc się do figur, Fig. 1 przedstawia schemat poglądowy przedstawiający kaskadę polimeryzacji fibryny, a Fig. 2 schematycznie przedstawia polimeryzację fibrynowej macierzy. [0023] Leczenie złamanej kości powinno być poprzedzone unieruchomieniem złamanych regionów i powinno się zapewnić odpowiednie ukrwienie i zastosowanie odpowiedniego obciążenia w regonie złamania kości. Złamanie kości, gdy już nastąpi, zwykle jest związane z uszkodzeniem skóry, mięśni, więzadeł, naczyń krwionośnych, nerwów i otaczających stawów. [0024] Rozpatrując histologicznie, proces gojenia złamanej kości wiąże się z trzema fazami, tj. fazą zapalenia, naprawy i przebudowy, a stany te nie są ściśle rozgraniczone, ale postępują w sposób ciągły zachodząc na siebie. [002] Faza zapalenia jest stanem, w którym komórki w kostnej macierzy, naczynia krwionośne oraz również tkanki miękkie, takie jak okostna i otaczające złamaną kość mięśnie, są uszkodzone z powodu urazu, który wywołał złamanie, powodując tworzenie krwiaka w jamie szpikowej i pod okostną. Czynniki zapalenia uwalniane z uszkodzonych komórek martwiczych prowadzą do wazodylatacji i wysięku osocza, 4

6 tym samym powodując ostry obrzęk. Po fazie zapalenia przejście do fazy naprawy następuje wraz z początkiem tworzenia nowej macierzy. [0026] Faza naprawy rozpoczyna się wraz z organizacją krwiaka utworzonego w złamanych miejscach. Krwiak tworzy rusztowanie fibrynowe, które następnie otrzymuje komórki naprawcze. Wówczas czynniki wzrostu lub inne białka wytworzone przez te komórki naprawcze indukują migrację i proliferację komórkową oraz tworzą naprawczą macierz, co jest pierwszym etapem odbudowy złamanej kości. Większość komórek tworzących tkanki kostne podczas gojenia złamania kości pojawia się w miejscu złamania wraz z ziarniną i tworzy kostninę, która składa się z tkanki włóknistej, chrząstki i kości tkanych, wokół miejsca złamania. Mineralizacja kostniny jest zapoczątkowywana przez kolejne działania komórek kościotwórczych. Macierz, która jest syntetyzowana przez te kościotwórcze komórki zawiera dużą liczbę regularnie rozmieszczonych włókien kolagenowych typu I, które stwarzają warunki do odkładania kompleksów fosforanu wapnia w tych przestrzeniach. Jednak ta faza naprawcza nie jest etapem, w którym zrost kostny jest zakończony, a tym samym powstała niedojrzała kostnina złamania posiada słabszą wytrzymałość kostną niż normalna tkanka kostna. Ponadto w trakcie etapu przebudowy kostnina złamania nabywa wytrzymałość taką jaką wykazuje normalna tkanka kostna. [0027] Co do etapu przebudowy, kości tkane wraz z kostniną są zastępowane przez dojrzałe kości blaszkowate, a niepotrzebna i zbędna kostnina jest stopniowo absorbowana. W oparciu o wyniki badania radioizotopowego można zauważyć, że zwiększona aktywność radioizotopów utrzymuje się w miejscu złamania przez dłuższy okres czasu, nawet po zakończeniu zrostu kostnego i powrocie funkcji miejsca złamania do normalnego stanu, jak pokazuje zdjęcie rentgenowskie. Ponadto etap przebudowy trwa przez kilka lat po osiągnięciu klinicznego zrostu złamania kostnego. [0028] Fig. 3 przedstawia schemat blokowy ilustrujący proces wytwarzania półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego zgodnie z niniejszym wynalazkiem. [0029] Odnosząc się teraz do Fig. 3, sposób wytwarzania półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego zgodnie z niniejszym wynalazkiem, obejmuje izolowanie osteoblastów z tkanki kostnej i hodowanie/namnażanie izolowanych osteoblastów w DMEM (podłoże Eagle a w modyfikacji Dulbecco a) lub α-mem (podłoże minimalne, modyfikacja alfa) w celu wytworzenia zawiesiny osteoblastów (S0); i mieszanie otrzymanej zawiesiny osteoblastów z czynnikiem koagulacji, w celu wytworzenia terapeutycznego czynnika osteoblastycznego (S0). [00] Czynnikiem koagulacji jest tu mieszanina trombiny i fibrynogenu. [0031] Etapy wytwarzania czynnika terapeutycznego obejmują rozpuszczenie liofilizowanej trombiny w ciekłym DMEM lub α-mem, a następnie mieszanie 1 do 0 IU/ml rozpuszczonej trombiny z mieszanym roztworem osteoblastów (S2); i rozpuszczenie liofilizowanego fibrynogenu w ciekłym DMEM lub α-mem, a następnie mieszanie do 0 mg/ml rozpuszczonego fibrynogenu z mieszanym roztworem osteoblastów, z domieszaną do niego trombiną (S2). [0032] Tymczasem stężenie trombiny determinuje czas polimeryzacji fibryny. Zatem czas polimeryzacji fibryny może być skrócony w zakresie od 4 godzin do 3 sekund, zależnie od stężenia trombiny. Trombina była stosowana w stężeniu takim, że kompozycja według niniejszego wynalazku przybierała postać zapobiegającą przenikaniu osteoblastów i czynników koagulacji z uszkodzonych miejsc, w przypadku wstrzyknięcia w miejsce złamania kości. Wstrzyknięcie kompozycji w uszkodzone miejsce prowadzi do szybkiego tworzenia macierzy i tworzone są optymalne pory fibrynowej macierzy do tworzenia kości przez osteoblasty.

7 1 2 [Postać wykonania wynalazku] [0033] Dalej działania półstałej, zawierającej fibrynę, kompozycji osteoblastycznej do zrostu kostnego zgodnie z przykładem według niniejszego wynalazku, będą opisane bardziej szczegółowo w odniesieniu do załączonych rysunków. [0034] Najpierw, osteoblasty izolowano z odpowiednich tkanek i hodowano w DMEM lub α-mem przez 4 tygodnie, w celu namnożenia wystarczającej ilości osteoblastów. Następnie, otrzymane osteoblasty zawieszono w DMEM lub α-mem w celu wytworzenia zawiesiny osteoblastów. [003] Do wytworzenia fibrynowego kleju o czystości odpowiedniej do zastosowań medycznych, tężejącego w temperaturze pokojowej, fibrynogen rozpuszczono przez dodanie właściwej ilości ciekłego DMEM lub α- MEM do fiolki zawierającej liofilizowany fibrynogen. [0036] W dodatku rozpuszczono również trombinę przez dodanie właściwej ilości ciekłego DMEM lub α- MEM do fiolki zawierającej liofilizowaną trombinę. [0037] Wtedy rozpuszczoną trombinę dodano w 1/ objętości do płynnej zawiesiny osteoblastów i dobrze zmieszano. [0038] Zawiesinę osteoblastów zmieszaną z trombiną mieszano z taką samą ilością fibrynogenu, w celu wytworzenia 00 μl kompozycji osteoblastów. [0039] królików New Zealand White, ważących około 3 kg, bez względu na płeć, przydzielono do grupy kontrolnej, w której przeszczepiano kość i grupy doświadczalnej, w której przeszczepiano półstałą kompozycję osteoblastów zawierającą fibrynę do zrostu kostnego. Każda grupa składała się z 1 królików. [0040] Zgodnie z podejściem Henry'ego wykonano podłużne cięcie na przedramieniach królików, tym samym odsłaniając trzon kości promieniowej, a następnie przy użyciu piły dokonano uszkodzenia kości o wielkości 1 mm, następnie z uszkodzonego obszaru kości całkowicie usunięto okostną. [0041] W grupie kontrolnej z kości długiej pobrano wcześniej kość gąbczastą i przeszczepienie kości przeprowadzono w obszarze uszkodzonej kości, następnie zeszyto skórę i tkankę podskórną. [0042] W grupie doświadczalnej, skórę i tkankę podskórną zeszyto ostrożnie tak, że obszar uszkodzonej kości stał się wolną przestrzenią, a kompozycję osteoblastów wstrzyknięto trzy tygodnie później, jak pokazano na Fig. 4. [0043] Po zrobieniu zdjęć rentgenowskich w 3, 6 i 9 tygodniu od rozpoczęcia doświadczenia, oceniano zrost kostny przez przypisanie odpowiedniej liczby punktów obszarom proksymalnym i dystalnym osteotomii i obszarowi uszkodzonej kości zależnie od stopnia jego zrostu kostnego oraz sumy punktów w ten sposób zdobytych. Tabela 1 Punkty Sposób określania zrostu złamania kości dla uszkodzeń Proksymalny obszar osteotomii Dystalny obszar osteotomii Część bliska ubytkowi 3 Zrost Zrost Zrost 2 Umiarkowany most kostny (> 0%) 1 Słaby most kostny (< 0%) Umiarkowany most kostny (> 0%) Słaby most kostny (< 0%) Umiarkowany most kostny (> 0%) Słaby most kostny (< 0%) 0 Brak zrostu Brak zrostu Brak zrostu 6

8 Tabela 2 Wyniki przeszczepienia kości po dziewięciu tygodniach w grupie kontrolnej i grupie doświadczalnej Grupa kontrolna Grupa doświadczalna Doskonały (8-9) Dobry (6-7) 1 2 Dostateczny (4-) - - Słaby (2-3) - - Bez efektu (0-1) [0044] Fig. przedstawia zdjęcie rentgenowskie zrobione 6 tygodni po wstrzyknięciu półstałego terapeutycznego czynnika osteoblastycznego, zawierającego mieszaninę fibryny i osteoblastów, po wprowadzeniu do złamania o wielkości 1 mm w kości króliczego przedramienia i można zauważyć, że osiągnięto całkowity zrost złamania kości. [004] Fig. 6 przedstawia zdjęcie histologicznego skrawka tkanki barwionego hematoksyliną-eozyną, zrobione 6 tygodni po wstrzyknięciu półstałego terapeutycznego czynnika osteoblastycznego zawierającego mieszaninę fibryny i osteoblastów, po wprowadzeniu do złamania o wielkości 1 mm w kości króliczego przedramienia, gdzie obserwowano wytworzoną wyspę kostną. [0046] Fig. 7 przedstawia zdjęcie histologicznego skrawka tkanki barwionego trójchromianem Massona, zrobione 6 tygodni po wstrzyknięciu mieszaniny fibryny i osteoblastów do złamania o wielkości 1 mm w kości króliczego przedramienia, i może być to potwierdzone, że kolagen został wytworzony wzdłuż uprzednio określonych wzorów, tym samym odpowiadając postępowi w tworzeniu kości i tworzeniu naczyń krwionośnych pomiędzy nimi (czerwona eliptyczna przerywana linia). [0047] Tak więc, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dostarczono tu przeszczep kostny bez immunologicznego odrzucania, poprzez mieszanie osteoblastów z fibryną i wstrzykiwanie mieszaniny do uszkodzonych części w celu uzyskania zrostu kości, gdy zrost kostny nie postępuje z powodu ciężkiego złamania kości, przy czym przeszczep wykazuje skuteczne i szybkie działanie na zrost kostny przez wstrzyknięcie kompozycji, która do pewnego stopnia była kształtowana. 2 [Zastosowanie przemysłowe] [0048] Jak wynika z powyższego, półstała zawierającą fibrynę kompozycja osteoblastyczna do zrostu kostnego, według niniejszego wynalazku, o budowie opisanej powyżej, i sposób jej wytwarzania, umożliwia przeszczep kostny, bez klinicznego odrzucania przeszczepu, przez wstrzyknięcie mieszaniny osteoblastów i fibryny do miejsca, gdzie oczekujemy zrostu kostnego i umożliwia osiągnięcie skutecznego i szybkiego zrostu kostnego przez wstrzyknięcie kompozycji, którą w pewnym stopniu ukształtowano w celu złagodzenia problemów związanych z prawdopodobieństwem tworzenia tkanki kostnej w niepożądanych regionach, wynikającym z wędrówki wstrzykniętych osteoblastów z miejsca zrostu kości, a następnie z ich rozprzestrzenianiem się w inne miejsca drogą krwi, co mogłoby mieć miejsce przy wstrzyknięciu zawiesiny samych osteoblastów. [0049] W dodatku niniejszy wynalazek umożliwia zrost kostny, przy czym możliwe jest przeprowadzenie operacji chirurgicznej z minimalnym cięciem, kiedy osteoblasty i fibryna są wstrzyknięte w miejscu, gdzie oczekiwany jest zrost kości, która umożliwi osiągnięcie zrostu kostnego przez proste i skuteczne 7

9 1 wstrzyknięcie mieszanej kompozycji osteoblastów i fibryny, bez cięcia odpowiadających uszkodzeniu okolic określonych przy wykorzystaniu systemu promieniowania, takiego jak promienie X. [000] Chociaż korzystne postaci wykonania niniejszego wynalazku ujawniono dla celów poglądowych, specjaliści w dziedzinie zauważą, że możliwe są różne modyfikacje, dodatki i substytucje. Zastrzeżenia patentowe 1. Zawierająca fibrynę półstała kompozycja osteoblastyczna do leczenia złamania kości, przy czym kompozycja jest wytwarzana sposobem obejmującym: hodowanie/namnażanie izolowanych z tkanki kostnej osteoblastów w podłożu minimalnym w modyfikacji alfa (alfa MEM) z wytworzeniem zawiesiny osteoblastów; i mieszanie otrzymanej zawiesiny osteoblastów z czynnikiem koagulacji z wytworzeniem terapeutycznego czynnika osteoblastycznego, przy czym czynnikiem koagulacji jest mieszanina trombiny i fibrynogenu, a etapy wytwarzania czynnika terapeutycznego obejmują: rozpuszczenie liofilizowanej trombiny w ciekłym alfa-mem, a następnie mieszanie 1 do 0 IU/ml rozpuszczonej trombiny z mieszanym roztworem osteoblastów; i rozpuszczenie liofilizowanego fibrynogenu w ciekłym alfa-mem, a następnie mieszanie do 0 mg/ml rozpuszczonego fibrynogenu z mieszanym roztworem osteoblastów z domieszaną do niego trombiną. 8

10 Składnik II Trombina Fibrynogen Fibryna (monomer) Fibryna (rozpuszczalna) Fibryna (nierozpuszczalna) Składnik I Fibrynogen Trombina Fibryna monomer Polimer fibryny (niska mechaniczna wytrzymałość) Polimer Fibryny (stabilizowany) = Fibrynowe Protofibryle 9

11 Przygotowanie zawiesiny Mieszanie z trombiną Mieszanie z fibrynogenem Koniec

12 11

13 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Literatura niepatentowa cytowana w opisie Schlag G. Clinical Orthopedics, 1988, [00] Huang Q. Tissue Engineering, 02, [0021] 12