artus HBV RG PCR Kit Instrukcja użytkownika

Transkrypt

1 artus HBV RG PCR Kit Instrukcja użytkownika 24 (nr. kat ) 96 (nr. kat ) Zestaw ilościowy do diagnostyki in vitro Do użycia z artus 3000 i Rotor-Gene 3000 Marzec 2007 wersja , PL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R PL Sample & Assay Technologies

2 artus HBV RG PCR Kit Znak firmowy i zrzeczenie się odpowiedzialności QIAGEN, QIAamp, artus (QIAGEN Gruppe); artus 3000 (QIAGEN Hamburg); Rotor-Gene (Corbett Research); COBAS TaqMan (Roche Diagnostics). Zarejestrowane nazwy, znaki firmowe itd. Uzywane w tym dokumencie nawet, jeżeli nie są specjalnie oznaczone nie mogą być uznawane jako niechronione przez prawo. artus HBV RG PCR Kit i QIAamp DSP Virus Kit są oznaczonymi certyfikatem CE zestawami diagnostycznymi zgodnymi z Europejską Dyrektywą Diagnostyczną In Vitro 98/79/EC. Niedostępne we wszystkich krajach. Zakup artus PCR Kits łączy się z limitowaną licencją na użycie w procesie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)dla ludzkiej i weterynaryjnej diagnostyki in vitro w połączeniu z termocyklerem, którego to użycie w zautomatyzowanym wykonywaniu procesu PCR jest objęte płatną z góry kwotą licencyjną poprzez opłatę do Applied Biosystems lub w czasie zakupu np. autoryzowanego termocyklera. Proces PCR jest chroniony zagranicznymi odpowiednikami U.S. Patents Nos. 5,219,727 and 5,322,770 and 5,210,015 and 5,176,995 and 6,040,166 and 6,197,563 and 5,994,056 and 6,171,785 and 5,487,972 and 5,804,375 and 5,407,800 and 5,310,652 and 5,994,056 należącymi do F.Hoffmann-La Roche Ltd QIAGEN, wszelkie prawa zastrzeżone.

3 Spis treści 1. Zawartość Przechowywanie Dodatkowo wymagane materiały i urządzenia Ogólne środki ostrożności Informacje o patogenie Podstawy Real-Time PCR Opis produktu Protokół Czynności przedanalityczne: pobieranie, przechowywanie i transport materiału do badań Pobieranie materiału do badań Przechowywanie próbek Transport próbki Substancje interferujące Izolacja DNA Kontrola wewnętrzna Oznaczenie ilościowe Przygotowanie PCR Programowanie aparatów artus 3000 lub Rotor-Gene Analiza danych Rozwiązywanie problemów Specyfikacja Czułość analityczna Specyficzność Zakres liniowy artus HBV RG PCR Kit 03/2007 3

4 11.4 Precyzja Bezbłędność Odtwarzalność Ocena diagnostyczna Ograniczenia w stosowaniu testu Informacja bezpieczeństwa Kontrola jakości Referencje Objaśnienie symboli artus HBV RG PCR Kit 03/2007

5 artus HBV RG PCR Kit Zestaw przeznaczony do ilościowego oznaczania DNA wirusa HBV w osoczu z EDTA na aparacie artus 3000 lub Rotor-Gene Zawartość Etykiety i zawartość Numer artykułu reakcje Numer artykułu reakcje Niebieski HBV RG/TM Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Czerwony Czerwony Czerwony Czerwony Czerwony HBV RG/TM QS 1 1 x 10 5 IU/µl HBV RG/TM QS 2 1 x 10 4 IU/µl HBV RG/TM QS 3 1 x 10 3 IU/µl HBV RG/TM QS 4 1 x 10 2 IU/µl HBV RG/TM QS 5 1 x 10 1 IU/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Zielony HBV RG/TM IC 1 x µl 2 x µl Biały Woda (czystości do PCR) 1 x µl 1 x µl QS = Standard Ilościowy * IC = Kontrola wewnętrzna 2. Przechowywanie Składniki zestawu artus HBV RG PCR Kit powinny być przechowywane w -20 C i w tej temperaturze są trwałe do daty umieszczonej na etykiecie. Powinno się unikać częstego rozmrażania i zamrażania (>2x), ponieważ może to zmniejszyć czułość. Jeśli zestaw ma być używany nieregularnie, odczynniki powinny być zamrożone w porcjach. W temperaturze +4 C nie powinny być przechowywane dłużej niż 5 godzin. * Standard jest sklonowanym produktem PCR w którym stężenie zostało skalibrowane przy użyciu pierwszego międzynarodowego standardu HBV (WHO). artus HBV RG PCR Kit 03/2007 5

6 3. Dodatkowo wymagane materiały i urządzenia Jednorazowe rękawiczki bezpudrowe Zestaw do izolacji DNA (zob. 8.2 Izolacja DNA) Pipety (regulowane) Sterylne końcówki z filtrem do pipet Wytrząsarka (Vortex mixer) Wirówka z rotorem do probówek o poj. 2 ml artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 Oprogramowanie artus 3000 wersja lub Rotor-Gene wersja Probówki do PCR o poj. 0,1 ml przeznaczone do 72-dołkowego rotora (0.1 ml Strip Tubes and Caps, nr. kat.: ; 0.1 ml tubes, Corbett Research, nr. kat.: ST-1001) Opcjonalnie: probówki do PCR o poj. 0,2 ml przeznaczone do 36- dołkowego rotora (0.2 ml PCR Tubes, nr. kat.: ; 0.2 ml tubes, Corbett Research, nr. kat.: SE-1003F) Blok chłodzący (72-/96-Well Loading Block, nr. kat.: / ; 72/96 well loading block, Corbett Research, nr. kat.: / ) 4. Ogólne środki ostrożności Użytkownik powinien zwrócić szczególną uwagę, aby: Do pipet używać sterylnych końcówek z filtrem Przechowywać dodatni materiał (próbki, kontrole i materiał po amplifikacji) oddzielnie od innych odczynników i dodawać go do mieszaniny reakcyjnej w innym, oddzielnym pomieszczeniu Przed rozpoczęciem badania dokładnie rozmrozić wszystkie odczynniki w temperaturze pokojowej Po rozmrożeniu wymieszać składniki i krótko odwirować Pracować szybko używając lodu lub bloku chłodzącego (72/96 well loading block) 4 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

7 5. Informacje o patogenie Wirus Hepatitis B (HBV) jest przenoszony głównie za pośrednictwem krwi i produktów krwiopochodnych, jednak możliwe są również inne drogi zakażenia: na skutek kontaktów seksualnych, drogą oralną oraz w okresie okołoporodowym. U zakażonych pojawia się złe samopoczucie, brak apetytu, wymioty i problemy żołądkowe. U około 10 20% pacjentów pojawia się gorączka, świąd, bóle stawowe i mięśniowe. W ciągu 2 do 14 dni od zakażenia rozwija się żółtaczka, której może towarzyszyć swędzenie. U ok. 1% przypadków zachorowań pojawia się piorunujące zapalenie wątroby i często jest śmiertelne. U 5 10% chorych wirus HBV może powodować zapalenie wątroby, marskość lub nowotwór. 6. Podstawy Real-Time PCR Wykrywanie patogenu przy pomocy reakcji PCR jest oparte na amplifikacji specyficznego regionu genomu badanego patogenu. W Real-Time PCR produkt amplifikacji jest wykrywany przy pomocy fluorescencyjnych barwników. Są one zazwyczaj przyłączone do sond oligonukleotydowych, które dołączają się specyficznie do amplifikowanego produktu. Monitorowanie intensywności fluorescencji podczas reakcji PCR (tj. w czasie rzeczywistym) pozwala na wykrycie patogenu i określenie jego ilości bez konieczności ponownego otwierania próbek po reakcji PCR (Mackay. 2004). 7. Opis produktu Zestaw artus HBV RG PCR Kit jest gotowym do użycia systemem do wykrywania HBV DNA przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w aparacie artus 3000 lub Rotor-Gene HBV RG/TM Master zawiera odczynniki i enzymy do specyficznej amplifikacji regionu 134 bp genomu HBV i bezpośredniego wykrywania specyficznego amplikonu w kanale fluorescencyjnym Cycling A.FAM urządzenia artus 3000 lub Rotor-Gene Dodatkowo zestaw artus HBV RG PCR Kit zawiera drugi, heterologiczny system amplifikacji do identyfikacji możliwej inhibicji PCR. artus HBV RG PCR Kit 03/2007 5

8 Stanowi on kontrolę wewnętrzną (Internal Control) w kanale fluorescencyjnym Cycling A.JOE. Limit detekcji HBV-PCR (patrz 11.1 Czułość analityczna) nie jest zredukowany. Dostarczane zewnętrzne kontrole dodatnie (HBV RG/TM QS 1-5) pozwalają na określenie wiremii. Dalsze informacje zamieszczono w punkcie 8.4 Oznaczenie ilościowe. 8. Protokół 8.1 Czynności przedanalityczne: pobieranie, przechowywanie i transport materiału do badań Ostrzeżenie: wszystkie próbki powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne. Uwaga: Obecne badania wskazują, że osocze EDTA lub cytrynianowe jest najlepszym materiałem do wykrywania wirusa HBV, w związku z tym zaleca się użycie tego materiału do badania przy korzystaniu z zestawu artus HBV RG PCR Kit. Wewnętrzna walidacja zestawu artus HBV RG PCR Kit została wykonana przy użyciu próbek ludzkiego osocza EDTA. Inne próbki materiału nie zostały zwalidowane. Do preparowania próbki należy używać tylko zalecanego zestawu do izolacji kwasu nukleinowego (patrz 8.2 Izolacja DNA). Należy ściśle przestrzegać używania zalecanego materiału do badań, szczegółowych instrukcji dotyczących pobierania, transportu i przechowywania próbek Pobieranie materiału do badań Każde pobranie krwi powoduje naruszenie naczyń krwionośnych (tętnic, żył, kapilar). Dlatego też do pobierania krwi powinny być używane materiały nieszkodliwe i sterylne, specjalnie do tego przeznaczone. Do pobierania krwi żylnej nie powinno się używać zbyt cienkich igieł. Należy ją pobierać ze zgięcia łokciowego, przedramienia lub zewnętrznej powierzchni dłoni przy użyciu standardowych probówek z EDTA o pojemności 5 10 ml z czerwoną nakrętką (np. firmy Sarstedt lub innych producentów). Krew w probówce 6 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

9 powinna być delikatnie wymieszana (nie wstrząsać!) zaraz po pobraniu poprzez 8-krotne obracanie probówki do góry nogami. Uwaga: nie należy używać krwi pobranej na heparynę (patrz punkt Substancje interferujące) Przechowywanie próbek Pełna krew powinna być rozdzielona na osocze i elementy morfotyczne poprzez odwirowanie (20 minut przy x g) w ciągu 6 godzin od pobrania. Oddzielone osocze powinno być przeniesione do sterylnych probówek z polipropylenu. Czułość oznaczenia może być obniżona, jeśli próbki zostaną zamrożone w sposób rutynowy lub będą przechowywane przez dłuższy okres czasu. Wirus w postaci kapsydu zawierającego DNA jest stabilny przez wiele dni w temperaturze +4 C, wiele tygodni w temperaturze -20 C i przez wiele miesięcy lub lat w temperaturze -70 C * Transport próbki Pobrane próbki powinny być transportowane w bezpiecznym pojemniku transportowym, zgodnie z zasadami. Pozwala to na uniknięcie potencjalnego niebezpieczeństwa infekcji spowodowanego wyciekiem materiału. Próbki powinny być transportowane zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi transportu materiału zakaźnego. Próbki powinny być wysłane w ciągu 6 godzin. Nie zaleca się przechowywania pobranych próbek. Jeśli to możliwe próbki należy wysłać pocztą, zgodnie z obowiązującymi przepisami dotyczącymi transportu materiału zakaźnego. Zaleca się transport próbek kurierem. Próbki krwi powinny być transportowane w temp. +2 C - +8 C, a oddzielone osocze w głębokim zamrożeniu (-20 C). * Arbeitskreis Blut, V17 ( ), Bundesgesundheitsblatt 11/1997, S International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations, 41st Edition, artus HBV RG PCR Kit 03/2007 7

10 8.1.4 Substancje interferujące Podwyższone wartości bilirubiny ( 15 mg/dl) i lipidów ( 800 mg/dl) oraz hemoliza nie mają wpływu na wynik. Heparyna ( 10 IU/ml) wpływa na PCR. Próbki pobrane do probówek zawierających heparynę jako antykoagulant nie powinny być używane. Również nie należy pobierać próbek od pacjentów heparynizowanych. 8.2 Izolacja DNA Różni producenci oferują zestawy do izolacji DNA. Objętość próbki do izolacji DNA zależy od użytego protokołu. Izolację DNA należy wykonać zgodnie z instrukcją producenta. Zalecany jest następujący zestaw do izolacji: Materiał badany Zestaw do izolacji kwasu nukleinowego Numer katalogowy Producent Nośnikowe RNA Osocze EDTA QIAamp DSP Virus Kit (50) QIAGEN Dołączony do zestawu Użycie nośnikowego RNA jest krytyczne dla efektywności ekstrakcji i, co za tym idzie, ilości pozyskanego DNA lub RNA. W celu zwiększenia stabilności nośnika RNA dostarczonego w zestawie QIAamp DSP Virus Kit zaleca się postępowanie zgodnie z informacją w ulotce na temat rozpuszczania i przechowywania nośnika RNA (rozdział Przygotowywanie odczynników i buforów ). Jeżeli używa się protokołu izolacji z użyciem buforów zawierających etanol przed etapem elucji należy wykonać dodatkową procedurę wirowania w celu usunięcia pozostałości etanolu (3 minuty przy rpm). Zabezpiecza to przed możliwą inhibicją PCR. Ważne: kontrola wewnętrzna zestawu artus HBV RGCR Kit może być użyta bezpośrednio w procedurze izolacji. Proszę upewnij się, że załączasz jedną negatywną próbkę osocza do procesu izolacji. Odpowiedni sygnał wewnętrznej kontroli jest podstawą dla oceny izolowania (zob. 8.3 Kontrola wewnętrzna). 8 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

11 8.3 Kontrola wewnętrzna Kontrola wewnętrzna (HBV RG/TM IC) jest dostarczarna wraz z zestawem. Pozwala to zarówno na kontrolę procedury izolacji DNA oraz na sprawdzenie potencjalnej inhibicji reakcji PCR (patrz Rys. 1). W takim wypadku, należy dodać Kontrolę wewnętrzną (IC) do izolacji w proporcji 0,1 µl na 1 µl objętości eluatu. Na przykład, używając QIAamp DSP Virus Kit, DNA jest eluowane w 60 µl buforu AVE. Stąd początkowo należy dodać 6 µl Kontroli wewnętrznej (IC). Jeśli przykładowo prowadzisz elucję w 20 µl wtedy użyj korespondującej z nią ilości, wynoszącą 2 µl. Ilość Kontroli wewnętrznej zależy jedynie od objętości eluatu. Kontrola wewnętrzna (IC) i nośnikowe RNA (zob. 8.2 Izolacja DNA) powinny zostać dodane wyłącznie do mieszaniny badanej próbki i buforu lizującego lub bezpośrednio do buforu lizującego. Kontroli wewnętrznej (IC) nie wolno dodawać bezpośrednio do badanej próbki. Jeśli kontrolę IC dodano do buforu lizującego należy pamiętać, że mieszanina IC i buforu lizującego/nośnikowego RNA musi być przygotowywana na świeżo i cały czas używana (przechowywanie mieszaniny w temperaturze pokojowej lub w lodówce może prowadzić do utraty kontroli wewnętrznej IC i do redukcji efektywności ekstrakcji). Nie wolno dodawać kontroli wewnętrznej i nośnikowego RNA bezpośrednio do badanej próbki. Oczyszczanie uważa się za skuteczne jeśli wartość Ct kontroli wewnętrznej w negatywnej próbce osocza izolowanego przy użyciu zestawu QIAamp DSP Virus Kit wyniesie Ct = 29 ± 3 (próg: 0,03) na aparacie artus 3000 lub Rotor-Gene Ustalone rozproszenie zależy od zmienności urządzenia i od oczyszczenia. Wysokie odchylenie wskazuje na problem z oczyszczeniem. W takim przypadku oczyszczanie powinno być sprawdzone i jeśli jest to konieczne, wykonane ponownie. W przypadku pytań lub innych problemów należy skontaktować się z serwisem technicznym. Kontrola wewnętrzna może być opcjonalnie użyta jedynie do sprawdzenia potencjalnych inhibicji reakcji PCR (patrz Rys. 2). W takim wypadku, należy dodać 2 µl Kontroli wewnętrznej na każdą reakcję bezpośrednio do 30 artus HBV RG PCR Kit 03/2007 9

12 µl HBV RG/TM Master. Dla każdej reakcji PCR należy użyć 30 µl Master Mix * przygotowanego według powyższego opisu, a następnie dodać 20 µl oczyszczonej próbki. Jeśli przygotowuje się reakcje PCR dla kilku próbek, należy zwiększyć objętości HBV RG/TM Master oraz Kontroli wewnętrznej odpowiednio do ilości przygotowywanych próbek (patrz punkt 8.5 Przygotowanie PCR). 8.4 Oznaczenie ilościowe Dołączone standardy ilościowe (HBV RG/TM QS 1-5) należy traktować tak jak wyizolowane próbki i używać do badania takiej samej objętości (20 µl). Aby wykonać krzywą standardową w aparacie artus 3000 lub Rotor- Gene 3000, należy użyć wszystkich pięciu standardów ilościowych i zdefiniować je w oknie menu Edit Sample jako standardy, każdy o odpowiednim stężeniu (zobacz artus 3000 Software Manual lub Rotor- Gene Manual, wersja 4.6). Krzywa standardowa przygotowana zgodnie z powyższym zaleceniem może być używana w kolejnych badaniach, pod warunkiem że przynajmniej jeden standard o takim samym stężeniu (czyli jeden z pięciu użytych do wykonania krzywej standardowej) zostanie wykorzystany podczas bieżącej procedury. W tym celu należy zaimportować wcześniej wykonaną krzywą standardową (patrz artus 3000 Software Manual lub Rotor-Gene Manual, wersja 4.6). Należy jednak pamiętać, że ta metoda ilościowa może prowadzić do odchyleń w wynikach z powodu zmienności między różnymi cyklami PCR. Uwaga: Standardy ilościowe są podane w IU/µl. Należy użyć następującego równania do przeliczenia wyniku otrzymanego z krzywej standardowej na IU/ml objętości badanej próbki: Wynik (IU/ml) = Wynik (IU/µl) x objętość eluatu (µl) Objętość próbki (ml) * Wzrost objętości spowodowany dodaniem Kontroli wewnętrznej jest do pominięcia przy przygotowywaniu reakcji PCR. Czułość detekcji nie ulega osłabieniu. 10 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

13 Proszę pamiętaj, że ważną sprawą jest początkowa masa próbki, która to powinna zostać wprowadzona w powyższym równaniu. Musi to być uwzględnione gdy pojemność próbki została zmieniona przed ekstrakcją kwasu nukleinowego (przykładowo zmniejszenie objętość przez odwirowanie albo wzrost objętości przez uzupełnienie do wymaganej dla izolacji objętości). Istotne: Przewodnik dla ilościowej analizy systemów artus na temat artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 jest dostępny na stronie (Noty techniczne dla oznaczania ilościowego na artus 3000 lub Rotor-Gene 3000). 8.5 Przygotowanie PCR Należy się upewnić, czy blok chłodzący (akcesoria artus 3000 lub Rotor-Gene 3000) został schłodzony do temperatury +4 O C i umieścić żądaną ilość probówek do PCR w bloku chłodzącym. W każdym cyklu PCR należy umieścić przynajmniej jeden standard ilościowy oraz kontrolę negatywną (woda do reakcji PCR). Aby wykonać krzywą standardową, należy użyć wszystkich dołączonych standardów ilościowych (HBV RG/TM QS 1-5) w każdym cyklu PCR. Przed każdym użyciem wszystkie odczynniki powinny być całkowicie rozmrożone, wymieszane (przy użyciu pipety lub vortexu) i delikatnie odwirowane. W celu monitorowania procedury izolacji i sprawdzenia możliwej inhibicji PCR można użyć kontroli wewnętrznej i należy ją dodać już do izolacji (patrz 8.3 Kotrola wewnętrzna). W tym przypadku, proszę posłuż się wskazanym schematem pipetowania (dla schematu ogólnego zob. Rys. 1): artus HBV RG PCR Kit 03/

14 1. Przygotowanie mieszaniny Ilość próbek 1 12 HBV RG/TM Master 30 µl 360 µl HBV RG/TM IC 0 µl 0 µl Master Mix Całkowita objętość 30 µl 360 µl 2. Przygotowanie reakcji PCR Master Mix 30 µl 30 µl każda Próbka badana 20 µl 20 µl każda Całkowita objętość 50 µl 50 µl każda Aby użyć kontroli wewnętrznej wyłącznie do sprawdzenia inhibicji PCR, należy ją dodać bezpośrednio do HBV RG/TM Master. W tym przypadku proszę użyj następującego schematu pipetowania (zob. widok schematyczny Rys. 2): 1. Przygotowanie mieszaniny Ilość próbek 1 12 HBV RG/TM Master 30 µl 360 µl HBV RG/TM IC 2 µl 24 µl Master Mix Całkowita objętość 32 µl * 384 µl * 2. Przygotowanie reakcji PCR Master Mix 30 µl * 30 µl każda * Próbka badana 20 µl 20 µl każda Całkowita objętość 50 µl 50 µl każda Do każdej probówki PCR należy dodać pipetą po 30 µl mieszaniny Master Mix, następnie po 20 µl eluowanej próbki DNA i dokładnie wymieszać poprzez kilkakrotne nabieranie i usuwanie z pipety. Odpowiednio, należy użyć 20 µl przynajmniej jednego standardu ilościowego (HBV RG/TM QS 1-5) jako kontroli pozytywnej i 20 µl wody (Water, PCR grade) jako kontroli negatywnej. Zamknąć probówki PCR. Urządzenie Rotor-Gene wymaga pierścienia blokującego (akcesoria artus 3000 lub Rotor-Gene 3000), który powinien być umieszczony na wierzchu rotora, w celu uniknięcia przypadkowego otwierania się probówek podczas wirowania. * Wzrost objętości spowodowany dodaniem kontroli wewnętrznej (IC) jest do pominięcia przy przygotowywaniu reakcji PCR. Czułość detekcji nie ulega osłabieniu. 12 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

15 Dodawanie kontroli wewnętrznej do procedury oczyszczania Oczyszczanie Próbka badana/bufor lizujący Mieszanina + 0,1 µl IC* na 1 µl objętości eluatu 20 µl oczyszczonej próbki* 30 µl artus Master* Probówka do reakcji PCR artus 3000 lub Rotor-Gene Rys. 1: Schemat jednoczesnej kontroli procedury oczyszczania i inhibicji PCR. * Należy się upewnić, że roztwory zostały całkowicie rozmrożone, wymieszane i krótko odwirowane. artus HBV RG PCR Kit 03/

16 Dodawanie kontroli wewnętrznej do mieszaniny artus Master 2 µl IC* 30 µl artus Master* Oczyszczanie 32 µl Master Mix* 20 µl oczyszczonej próbki* 30 µl Master Mix* Probówka do reakcji PCR artus 3000 lub Rotor-Gene Rys. 2: Schemat kontroli inhibicji PCR. * Należy się upewnić, że roztwory zostały całkowicie rozmrożone, wymieszane i krótko odwirowane. 14 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

17 8.6 Programowanie aparatów artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 Dla wykrywania HBV DNA utwórz profil temperatury na twoim artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 według następujących pięciu kroków (zob. Rys. 3-7). A. Ustawianie głównych parametrów oznaczenia Rys. 3 B. Początkowa aktywacja Hot Start Enzyme Rys. 4 C. Amplifikacja DNA Rys. 5 D. Regulacja czułości kanału fluorescencji Rys. 6 E. Rozpoczynanie cyklu artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 Rys. 7 Wszystkie specyfikacje odnoszą się do oprogramowania artus 3000 wersja lub Rotor-Gene, wersja Więcej informacji na temat programowania artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 można znaleźć w instrukcji użytkownika artus 3000 Software Manual lub Rotor- Gene Manual, wersja 4.6. Na rysunkach omawiane ustawienia zostały zaznaczone czarną ramką. Po pierwsze należy wpisać objętość reakcji PCR w oknie menu New Experiment Wizard (zob. Rys. 3): Rys. 3: Ustawianie głównych parametrów oznaczenia. artus HBV RG PCR Kit 03/

18 Programowanie profilu temperatury wykonuje się przez aktywację przyciskiem Edit w następnym oknie menu New Experiment Wizard (patrz Rys. 4 i 5) Rys. 4: Początkowa aktywacja Hot Start Enzyme. Rys. 5: Amplifikacja DNA. 16 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

19 Zakres detekcji kanałów fluorescencji jest uzależniony od intensywności fluorescencji w probówkach PCR. Dostosowanie zakresów wykonuje się w oknie menu Auto Gain Calibration Setup (aktywacja w oknie menu New Experiment Wizard w zakładce Calibrate). Temperaturę kalibracji należy dostosować do temperatury denaturacji w programie amplifikacji (patrz Rys. 6). Rys. 6: Regulacja czułości kanału fluorescencji. artus HBV RG PCR Kit 03/

20 Przyrost wartości oznaczany w kanale kalibracji jest automatycznie zapisywany i wykazywany w ostatnim oknie menu procedury programowania (patrz Rys. 7). Rys. 7: Rozpoczynanie cyklu artus 3000 lub Rotor-Gene artus HBV RG PCR Kit 03/2007

21 9. Analiza danych Analiza danych jest wykonywana przy użyciu oprogramowania artus 3000 lub Rotor-Gene, zgodnie z zaleceniem producenta (artus 3000 Software Manual lub Rotor-Gene Manual, wersja 4.6). Możliwe jest uzyskanie następujących wyników: 1. Sygnał detekcji jest wykrywany w kanale fluorescencji Cycling A.FAM. Wynik badania jest pozytywny: próbka zawiera DNA HBV. W tym przypadku, wykrywanie sygnału w Cycling A.JOE kanał jest zbędne, ponieważ wysokie początkowe stężenia HBV DNA (pozytywny sygnał w kanale Cycling A.FAM) mogą doprowadzić do zredukowanego albo nieobecnego sygnału fluorescencji Kontroli wewnętrznej w kanale Cycling A.JOE (kompetycja). 2. W kanale fluorescencji Cycling A.FAM nie wykrywa się żadnego sygnału. W tym samym czasie pojawia się sygnał kontroli wewnętrznej w kanale Cycling A.JOE. W próbce nie wykryto obecności DNA HBV. Wynik badania można uznać za negatywny. W przypadku negatywnego wyniku badania HBV PCR wykrycie sygnału kontroli wewnętrznej wyklucza inhibicję PCR. 3. Nie wykryto sygnału detekcji w kanale Cycling A.FAM ani w Cycling A.JOE. Nie można postawić żadnej diagnozy. W rozdziale 10. Rozwiązywanie problemów należy znaleźć informacje na temat źródeł błędów i sposobach ich rozwiązywania. Na rysunkach 8 i 9 pokazano przykłady pozytywnej i negatywnej reakcji PCR. artus HBV RG PCR Kit 03/

22 Rys. 8: Detekcja standardów ilościowych (HBV RG/TM QS 1-5) w kanale fluorescencyjnym Cycling A.FAM. NTC: non-template control (kontrola negatywna). Rys. 9: Detekcja kontroli wewnętrznej (IC) w kanale fluorescencji Cycling A.JOE z jednoczesną amplifikacją standardów ilościowych (HBV RG/TM QS 1 5). NTC: non-template control (kontrola negatywna). 20 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

23 10. Rozwiązywanie problemów Brak sygnału kontroli pozytywnej (HBV RG/TM QS 1-5) w kanale fluorescencji Cycling A.FAM: Wybrany kanał fluorescencji do analizy danych PCR nie ma zastosowania w protokole. Do analizy danych należy wybrać kanał fluorescencyjny Cycling A.FAM dla HBV PCR oraz kanał Cycling A.JOE dla kontroli wewnętrznej (IC) PCR. Niepoprawne programowanie profilu temperatury artus 3000 lub Rotor-Gene Porównać profil temperatury z protokołem (patrz 8.6 Programowanie aparatów artus 3000 lub Rotor-Gene 3000). Niepoprawna konfiguracja reakcji PCR. Należy sprawdzić etapy pipetowania i porównać ze schematem (zob. 8.5 Przygotowanie PCR); w razie konieczności powtórzyć PCR. Warunki przechowywania dla jednego albo większej ilości składników zestawów nie pozostały w zgodzie z instrukcjami podanymi w punkcie 2. Przechowywanie lub ważność zestawu artus HBV RG PCR Kit wygasła. Proszę sprawdź warunki przechowywania i termin upływu ważności (zob. etykieta) odczynników i jeśli to konieczne użyj nowego. Brak lub słaby sygnał kontroli wewnętrznej negatywnej próbki badanej osocza, która przeszła procedurę oczyszczania przy użyciu zestawu QIAamp DSP Virus Kit (odchylenie większe niż Ct = 29 ± 3; threshold: 0,03) w kanale fluorescencji Cycling A.JOE i równoczesny brak sygnału w kanale Cycling A.FAM: Warunki PCR nie pasują do protokołu. Sprawdzić ustawienia PCR (zob. powyżej) i powtórzyć oznaczenie PCR przy poprawnych ustawieniach. Doszło do inhibicji reakcji PCR. Należy się upewnić, że zastosowano zalecaną procedurę izolacji (patrz) i dokładnie przestrzegać zaleceń producenta. artus HBV RG PCR Kit 03/

24 Należy się upewnić, że podczas procedury izolacji DNA przeprowadzono dodatkowy zalecany etap wirowania przed elucją w celu usunięcia pozostałości etanolu (patrz 8.2 Izolacja DNA). DNA zostało zgubione podczas procedury ekstrakcji. Jeśli kontrola wewnętrzna została dodana do procedury ekstrakcji, brak sygnału kontroli wewnętrznej IC może wskazywać na zgubienie DNA. Należy się upewnić, że zastosowano rekomendowaną metodę izolacji (patrz 8.2 Izolacja DNA) i ściśle przestrzegano zaleceń producenta. Warunki przechowywania dla jednego albo większej ilości składników zestawów nie pozostały w zgodzie z instrukcjami podanymi w punkcie 2. Przechowywanie lub ważność zestawu artus HBV RG PCR Kit wygasła. Proszę sprawdź warunki przechowywania i termin upływu ważności (zob. etykieta) odczynników i jeśli to konieczne użyj nowego. Sygnały kontroli negatywnych w kanale fluorescencji Cycling A.FAM z analitycznego PCR Zanieczyszczenie zdarzyło się podczas preparowania PCR. Powtórz PCR z nowymi odczynnikami. Jeśli możliwe, zamknij probówki PCR bezpośrednio po dodaniu próbki która ma być przetestowana. Dokładnie pipetuj kontrole pozytywne na końcu. Upewnij się, że przestrzeń pracy i instrumenty są dezaktywowane w regularnych odstępach czasu. Zanieczyszczenie zdarzyło się podczas izolacji. Powtórz izolację i PCR próbki która ma zostać przetestowana używając nowych odczynników. Upewnij się, że przestrzeń pracy i instrumenty są dezaktywowane w regularnych odstępach czasu. W przypadku dalszych pytań lub problemów proszę skontaktować się z naszym Działem Technicznym. 22 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

25 11. Specyfikacja 11.1 Czułość analityczna Analityczne ograniczenie wykrywania jak również analityczne ograniczenie wykrywania z uwagi na oczyszczenie (ograniczenia czułości) zostały oszacowane dla artus HBV RG PCR Kit. Analityczne ograniczenie wykrywania z uwagi na oczyszczenie jest określone za pomocą HBV pozytywnych klinicznych próbek w połączeniu z określoną metodą izolacji. Dla kontrastu, analityczne ograniczenie wykrywania jest określone bez użycia klinicznych próbek i niezależne od wybranej metody wydobycia, przy użyciu HBV DNA o znanym stężeniu. W celu określenia czułości analitycznej zestawu artus HBV RG PCR Kit przeprowadzono serię standardowych rozcieńczeń od 10 do 0,0003 HBV IU * /µl i analizowano je przy użyciu zestawu artus HBV RG PCR Kit. Testy były przeprowadzone w ośmiu powtórzeniach w ciągu 3 różnych dni. Wyniki określno przy użyciu analizy probit. Limit detekcji analitycznej zestawu artus HBV RG PCR Kit wynosi 0,02 IU/µl (p = 0,05). Oznacza to, że intnieje 95% prawdopodobieństwa, że ilość 0,02 IU/µl zostanie wykryta. Czułość analityczna z uwzględnieniem stopnia oczyszczenia (QIAamp DSP Virus Kit) dla zestawu artus HBV RG PCR Kit została określona przy użyciu serii rozcieńczeń 1-szego międzynarodowego standardu HBV (zgodnie z WHO) od 158 do nominalnie 0,4 IU/ml HBV w klinicznych próbkach osocza. Próbki te zostały poddane ekstrakcji DNA przy użyciu QIAamp DSP Virus Kit (objętość próbki do ekstrakcji: 0,5 ml, objętość eluatu: 26 µl). Każde z siedmiu rozcieńczeń było badane przy użyciu zestawu artus HBV RG PCR Kit w ciągu trzech różnych dni w ośmiu powtórzeniach. Wyniki zostały określone przy użyciu analizy probit. Graficzna ilustracja analizy probit została pokazana na Rys. 10. Limit detekcji analitycznej z uwzględnieniem stopnia oczyszczenia dla zestawu artus HBV RG PCR Kit wynosi 3,8 IU/ml (p = 0,05). To oznacza, że jest w 95% prawdopodobne, że ilość równa 3,8 IU/ml zostanie wykryta. * Standard jest sklonowanym produktem PCR, stężenie, którego zostało skalibrowane używając pierwszego standardu Międzynarodowego HBV (WHO). artus HBV RG PCR Kit 03/

26 Analiza probit: virus Hepatitis B (artus 3000 /Rotor-Gene 3000) Rys. 10: Czułość analityczna z uwzględnieniem procedury oczyszczania (QIAamp DSP Virus Kit) zestawu artus HBV RG PCR Kit (ABI PRISM 7000 SDS) Specyficzność Specyficzność zestawu artus HBV RG PCR Kit została zapewniona przede wszystkim przez selekcję primerów i sond, jak również przez optymalne dobranie warunków reakcji. Primery i sondy były sprawdzane pod kątem możliwych homologii do innych znanych sekwencji poprzez analizę porównawczą sekwencji. Wykrywalność istotnych genotypów była potwierdzana przez porównanie z bazą danych i przez badanie określonych genotypów metodą PCR na urządzeniu artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 (patrz poniższa Tabela 1). 24 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

27 Tabela 1: Testowanie specyficzności genotypów. Wirus Hepatitis B Genotypy Źródło HBV (kanał A.FAM) Kontrola wewnętrzna (kanał A.JOE) Hepatitis B-Virus A (USA) teragenix + + Hepatitis B-Virus B (Indonesia) teragenix + + Hepatitis B-Virus C (Indonesia) teragenix + + Hepatitis B-Virus C (Venezuela) teragenix + + Hepatitis B-Virus D (USA) teragenix + + Hepatitis B-Virus E (Cote D Ivoire) teragenix + + Hepatitis B-Virus F (Venezuela) teragenix + + Hepatitis B-Virus G (USA) teragenix + + Hepatitis B-Virus H (Nicaragua) teragenix + + teragenix corporation, Florida, USA Do dalszego testowania specyficzności użyto szczepów HBV ze znanymi różnicami w sekwencji regionu przedrdzeniowego genomu HBV (HBV Pre- Core Mutant Panel, Teragenix, Florida, USA). Wszystkie dziewięć zmutowanych szczepów zawartych w tym panelu podlega detekcji przy użyciu zestawu artus HBV RGPCR Kit. Ponadto specyficzność została zwalidowana przy użyciu 100 różnych próbek osocza HBV negatywnego. Próbki te nie generowały żadnych sygnałów w obecności HBV-specyficznych primerów i sond znajdujących się w odczynniku HBV RG/TM Master. W celu oznaczenia specyficzności artus HBV RG PCR Kit testowano grupę kontrolną wymienioną w poniższej tabeli (Tabela 2) poprzez badanie reakcji krzyżowych. Żaden z testowanych patogenów nie był reaktywny. Nie zaobserwowano reakcji krzyżowych w próbkach o mieszanej infekcji. artus HBV RG PCR Kit 03/

28 Tabela 2: Testowanie specyficzności kitu z potencjalnymi reakcjami krzyżowymi. Grupa kontrolna HBV (kanał A.FAM) Kontrola wewnętrzna (kanał A.JOE) Ludzki herpesvirus 1 (Herpes simplex virus 1) - + Ludzki herpesvirus 2 (Herpes simplex virus 2) - + Ludzki herpesvirus 3 (Varizella zoster virus) - + Ludzki herpesvirus 4 (Epstein Barr virus) - + Ludzki herpesvirus 5 (Cytomegalievirus) - + Ludzki herpervirus Ludzki immunodeficiency virus Hepatitis A virus - + Hepatitis C virus - + Parvovirus B Wirus żółtej gorączki - + Ludzki T cell leukemia virus typ 1 i typ Coxsackie virus B3 - + Dengue virus Escherichia coli Zakres liniowy Zakres liniowy (pomiar analityczny) zestawu artus HBV RG PCR Kit był oznaczony za pomocą analizy serii rozcieńczeń standardu ilościowego HBV w zakresie od 1 x 10 8 IU/µl do 1 x 10-2 IU/µl. Serie rozcieńczeń były kalibrowane zgodnie z 1-szym międzynarodowym standardem WHO dotyczącym DNA HBV. Każde rozcieńczenie było oznaczane w powtórzeniach (n = 8 jeśli stężenie było 1 x 10 0 IU/µl, n = 16, jeśli stężenie było < 1 x 10 0 IU/µl) przy użyciu zestawu artus HBV RG PCR Kit i aparatu artus 3000 lub Rotor- Gene Liniowość zestawu artus HBV RG PCR Kit oznaczono dla zakresu stężeń: od 0,02 IU/µl do 1 x 10 8 IU/µl (zob. Rys. 11). 26 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

29 Pod warunkiem użycia do ekstrakcji DNA zestawu QIAamp DSP Virus Kit zestaw artus HBV RG PCR Kit wykazuje liniowość w zakresie od 1,1 IU/ml aż do 4 x 10 9 IU/ml. Zakres liniowy artus HBV RG PCR Kit Rys. 11: Kalkulacja zakresu liniowego. Linia prosta została określona przez liniową regresję log 10 z wyliczonych stężeń z log 10 stężeń nominalnych. Wyrównanie linii regresji zostało uwzględnione na rysunku Precyzja Dane o precyzji artus HBV RG PCR Kit pozwalają na określenie całkowitej zmienności oznaczenia. Całkowita zmienność składa się ze zmienności w obrębie oznaczeń (zmienność wielokrotnych wyników próbek o tym samym stężeniu wykonywanych w czasie jedengo eksperymentu), pomiędzy oznaczeniami (zmienność wielokrotych wyników badań wykonywanych przy użyciu różnych aparatów tego samego typu obsługiwanych przez różnych pracowników jednego laboratorium) oraz zmienności pomiędzyseryjnej (zmienność wielokrotych wyników oznaczeń wykonywanych przy użyciu różnych serii zestawów). Uzyskane dane wykorzystano do oznaczenia odchylenia standardowego, zmienności i współczynnika zmienności dla określonego patogenu i kontroli wewnętrznej PCR. artus HBV RG PCR Kit 03/

30 Dane dotyczące precyzji zestawu artus HBV RG PCR Kit były zbierane przy wykorzystaniu standardu ilościowego w najniższym stężeniu (QS 5; 10 IU/µl). Badania były wykonane w ośmiu powtórzeniach. Precyzja była wyliczana w oparciu o wartości Ct krzywych amplifikacji (Ct: threshold cycle, patrz Tabela 3). Dodatkowo dane dotyczące precyzji dla wyników ilościowych w jednostkach IU/µl były określane przy wykorzystaniu odpowiednich wartości Ct (patrz Tabela 4). W oparciu o te wyniki całkowity rozkład statystyczny dla każdej podanej próbki o wspomnianym stężeniu wynosi 1,29% dla Ct lub 8,99% dla stężenia, dla oznaczania kontroli wewnętrznej 1,87% dla Ct. Wartości te są oparte na sumie wszystkich pojedyńczych wartości oznaczonych zmiennych. Tabela 3: Precyzja danych na podstawie wartości Ct. Zmienność w obrębie oznaczeń: HBV RG/TM QS 5 Zmienność w obrębie oznaczeń: Kontrola wewnętrzna Pomiędzy oznaczeniami: HBV RG/TM QS 5 Pomiędzy oznaczeniami: Kontrola wewnętrzna Zmienność pomiędzyseryjna: HBV RG/TM QS 5 Zmienność pomiędzyseryjna: Kontrola wewnętrzna Ogólna zmienność: HBV RG/TM QS 5 Ogólna zmienność: Kontrola wewnętrzna Odchylenie standardowe Zmienność Współczynnik zmienności [%] 0,09 0,01 0,32 0,10 0,01 1,06 0,14 0,02 0,49 0,29 0,08 1,00 0,38 0,15 1,39 0,62 0,39 2,23 0,36 0,13 1,29 0,52 0,27 1,87 28 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

31 Tabela 4: Precyzja danych na podstawie oznaczeń ilościowych (IU/µl). Zmienność w obrębie oznaczeń: HBV RG/TM QS 5 Pomiędzy oznaczeniami: HBV RG/TM QS 5 Zmienność pomiędzyseryjna: HBV RG/TM QS 5 Ogólna zmienność: HBV RG/TM QS 5 Odchylenie standardowe Zmienność Współczynnik zmienności [%] 0,93 0,87 9,28 0,79 0,63 7,92 1,03 1,05 10,21 0,90 0,81 8, Bezbłędność Weryfikacja bezbłędności pozwala na oznaczenie całkowitego wskaźnika błędu zestawu artus HBV RG PCR Kit. Do każdej ze 100 HBV-negatywnych próbek osocza dodano kontroli DNA HBV w takiej ilości, aby uzyskać stężenie 0,05 IU/µl eluowanej objętości (tj. około 3-krotna wartość stężenia limitu analitycznej czułości). Po wykonaniu ekstrakcji za pomocą QIAamp DSP Virus Kit (patrz 8.2 Izolacja DNA) próbki te były analizowane przy użyciu zestawu artus HBV RG PCR Kit. Dla wszystkich próbek całkowity wskaźnik błędu wynosił 0%. Dodatkowo oszacowano stabilność kontroli wewnętrznej poprzez oczyszczanie i analizę 100 próbek osocza HBV-negatywnego. Całkowity wskaźnik błędu wyniósł 0%. Nie zaobserwowano inhibicji. Tak więc bezbłędność zestawu artus HBV RG PCR Kit wynosi 99 % Odtwarzalność Dla oceny odtwarzalności wymagane jest regularne określanie sprawności zestawu artus HBV RG PCR Kit oraz wydajności w porównaniu z innymi zestawami. Dane te są możliwe do uzyskania poprzez uczestnictwo w ustalonych programach testowych. artus HBV RG PCR Kit 03/

32 11.7 Ocena diagnostyczna W badaniach wykonanych w dwóch niezależnych laboratoriach porównywano kombinację zestawu artus HBV RG PCR Kit oraz aparatu artus 3000 lub Rotor-Gene 3000 z zestawem COBAS TaqMan HBV Assay. Dla tych potrzeb przetestowano 287 próbek pobranych zarówno przed, jak i po rozpoczęciu badań. Oznaczenia próbek zestawami COBAS TaqMan HBV Assay wykonano zgodnie z instrukcją producenta. DNA do badań przy użyciu zestawu artus HBV RG PCR Kit było izolowane za pomocą QIAamp DSP Virus. W porównaniu z wynikami uzyskanymi na aparacie COBAS TaqMan jako referencyjnymi, dla wszystkich próbek testowanych zestawem artus HBV RG PCR Kit czułość diagnostyczna wyniosła 100%, a specyficzność diagnostyczna 97%. Wyniki podano w tabeli 5. Powtórna analiza trzech różnych próbek poprzez dodatkowe testy potwierdziła rezultaty artus, a więc można przupuszczać, że ta rozbieżność wynika z wyższej wrażliwości artus HBV RG PCR Kit. Tabela 5: Wyniki porównawczych badań walidacyjnych. High Pure/COBAS TaqMan HBV Test + - Total artus HBV RG PCR Kit artus HBV RG PCR Kit 03/2007

33 Korelację dla wyników ilościowych, dla obu badanych systemów analizowano metodą regresji liniowej. Następnie logarytmowane wyniki dla obu zestawów wykreślono w postaci rozproszenia jednych względem drugich (patrz Rys. 12). Rys. 12: Porównanie COBAS TaqMan z oczyszczaniem High Pure względem artus HBV RG PCR Kit z oczyszczaniem DSP. 12. Ograniczenia w stosowaniu testu Wszystkie odczynniki mogą być użyte wyłącznie do diagnostyki in vitro. Produkt może być użyty tylko przez personel specjalnie poinstruowany i przeszkolony w stosowaniu procedur in vitro zgodnie z normą EN 375. Wymagane jest postępowanie zgodnie z instrukcją dołączoną do testu. Należy zwrócić uwagę na daty przydatności do użycia wydrukowane na opakowaniu i na naklejkach na poszczególnych składnikach zestawu. Nie należy używać składników po upływie terminu ważności. artus HBV RG PCR Kit 03/

34 13. Informacja bezpieczeństwa W celu uzyskania informacji na temat bezpieczeństwa zestawu artus HBV RG PCR Kit należy zapoznać się z odpowiednimi danymi (MSDS). MSDS jest dostępny online na stronie internetowej w formacie PDF Kontrola jakości W związku z tym, że firma QIAGEN posiada system zarządzania jakością ISO 9001 oraz certyfikat ISO 13485, każda seria odczynników w zestawach artus HBV RG PCR Kit jest testowana pod kątem zgodności ze specyfikacją, w celu zapewnienia jakości produktu. Ponadto, każda seria jest aprobowana przez Instytut Paula Ehrlich a (PEI). 15. Referencje Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): artus HBV RG PCR Kit 03/2007

35 16. Objaśnienie symboli Użyć przed Numer Serii Producent Numer Katalogowy Numer materiału Podręcznik Medyczne urządzenie diagnostyczne in vitro <N> Zawiera wystarczające dla testów <N> Ograniczenie zakresu temperatury Standard ilościowy Kontrola wewnętrzna artus HBV RG PCR Kit 03/

36 34 artus HBV RG PCR Kit 03/2007

37 Austria QIAGEN Vertriebs GmbH Löwengasse 47/ Wien Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Canada QIAGEN Inc Argentia Road Unit 7 Mississauga Ontario L5N 8L2 Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) France QIAGEN S.A. 3 avenue du Canada LP COURTABOEUF CEDEX Orders Fax Technical Germany QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse Hilden Orders Fax Technical Italy QIAGEN S.p.A. Via Grosio, 10/ Milano Orders Fax Technical Japan QIAGEN K.K. Forefront Tower II 13-1, Kachidoki 3 Chome Chuo-ku, Tokyo Telephone Fax Technical Switzerland QIAGEN AG Garstligweg Hombrechtikon Orders Fax Technical USA QIAGEN Inc Turnberry Lane Valencia CA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) PL Sample & Assay Technologies