Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi

Transkrypt

1 Wrzesień 2010 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi Wersja 1 24 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR z oznaczeniem CE służący do przeprowadzania analizy jakościowej 29 mutacji somatycznych w onkogenie EGFR. Zestaw jest przeznaczony do stosowania z aparatem Rotor-Gene Q 5plex HRM. Do celów diagnostyki in vitro PL QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Wielka Brytania R PL Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Technologie badań i oznaczania próbek QIAGEN jest wiodącym dostawcą innowacyjnych technologii badań i oznaczania służących do izolowania i wykrywania zawartości dowolnych próbek biologicznych. Dzięki wysokiej jakości nasze zaawansowane produkty i usługi zapewniają pomyślne przeprowadzanie badań od próbek po wyniki. QIAGEN wyznacza standardy w następujących dziedzinach: Oczyszczanie DNA, RNA i białek Oznaczanie kwasów nukleinowych i białek Badania microrna oraz irna Automatyka technologii badań i oznaczania próbek Naszą misją jest umożliwienie naszym klientom osiągania doskonałych i przełomowych wyników badań. Więcej informacji można znaleźć na stronie

3 Zawartość Symbole 4 Transport i przechowywanie 5 Przeznaczenie 6 Ograniczenia w zakresie stosowania produktu 6 Kontrola jakości 7 Pomoc techniczna 7 Informacje dotyczące bezpieczeństwa 7 Wstęp 8 Zasada działania 8 Procedura 9 Sprzęt i odczynniki zapewniane przez użytkownika 10 Ważne informacje 11 Ogólne środki bezpieczeństwa 11 Format zestawu 11 Testy 12 Materiał próbek 12 Izolacja DNA 12 Kontrola 13 Ocena próbek 13 Analiza danych 14 Protokół 1: Ocena próbek 15 Protokół 2: Wykrywanie mutacji EGFR i analiza danych 28 Przewodnik rozwiązywania problemów 41 Załącznik A: Analiza danych z aparatu Rotor-Gene Q 43 Analiza kontroli bez matrycy (NTC) 43 Analiza próbek i kontrola pozytywna 45 Analiza próbek za pomocą aparatu Rotor-Gene Q 47 Załącznik B: Szczegóły mutacji 51 Literatura 53 Informacje dotyczące zamawiania 54 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010 3

4 Zawartość zestawu Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR (24) Nr katalogowy Liczba reakcji 24* Czerwony Fioletowy Pomarańczowy Różowy Zielony Żółty Szary Niebieski Mieszanina do reakcji kontrolnej Mieszanina reakcyjna T790M Mieszanina do reakcji delecji Mieszanina reakcyjna L858R Mieszanina reakcyjna L861Q Mieszanina reakcyjna G719X Mieszanina reakcyjna S768I Mieszanina do reakcji insercji Ctrl 2 x 600 µl T790M 600 µl Del 600 µl L858R 600 µl L861Q 600 µl G719X 600 µl S768I 600 µl Ins 600 µl Brązowy Kontrola pozytywna EGFR PC 300 µl Turkusowy Polimeraza DNA Taq Taq 140 µl Biały Woda wolna od nukleaz H 2 O 2 x 1,9 ml Instrukcja obsługi 1 Symbole <N> Zawiera ilość odczynników wystarczającą na przeprowadzenie <N> testów Termin przydatności Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro 4 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

5 Numer katalogowy Numer partii Numer materiału Składniki Zawartość Numer Zakres dopuszczalnych temperatur Oficjalny producent Zapoznać się z instrukcją obsługi Ważna informacja Transport i przechowywanie Zestaw therascreen EGFR PCR jest dostarczany na suchym lodzie i powinien być zamrożony w momencie odbioru przesyłki. Jeśli zestaw therascreen EGFR RGQ PCR nie był zamrożony w chwili odbioru, opakowanie zewnętrzne zostało otwarte podczas transportu, przesyłka nie zawiera listy zawartości opakowania, instrukcji użytkowania lub odczynników, należy skontaktować się z serwisem lub lokalnym dystrybutorem firmy QIAGEN (informacje znajdują się na tylnej okładce oraz na stronie Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR powinien zostać natychmiast po dostarczeniu umieszczony w zamrażarce o stałej temperaturze od 15 C do 25 C bez dostępu światła. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR należy chronić przed światłem słonecznym. Zestaw jest stabilny do chwili upływu terminu ważności podanego na etykiecie, jeśli jest przechowywany w zalecanych warunkach i w oryginalnym Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010 5

6 opakowaniu. Należy unikać rozmrażania i ponownego mrożenia zestawu. Zaleca się maksymalnie 7 cykli zamrażania/rozmrażania. Aby zapewnić optymalną aktywność i działanie, należy chronić cząsteczki Scorpions przed światłem, zapobiegając fotowybielaniu (podobnie jak w przypadku wszystkich cząstek znakowanych fluorescencyjnie). Przeznaczenie Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR służy do wykrywania 29 mutacji somatycznych w onkogenie EGFR oraz do oceny jakościowej statusu mutacji. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR jest przeznaczony do stosowania przez wyszkolony personel w warunkach laboratoryjnych z próbkami DNA pobranymi z utrwalonej formaliną, zanurzonej w parafinie tkanki niedrobnokomórkowego nowotworu płuc (NSCLC). Ograniczenia w zakresie stosowania produktu Wyniki uzyskane za pomocą tego urządzenia należy interpretować w kontekście wszystkich odpowiednich obserwacji klinicznych i laboratoryjnych; nie mogą one służyć jako jedyna podstawa diagnozy. Produkt może być obsługiwany wyłącznie przez personel przeszkolony w dziedzinie procedur diagnostyki in vitro oraz obsługi aparatu Rotor-Gene Q. Badania walidacji analitycznej zostały wykonane przy użyciu ludzkiego DNA pobranego z utrwalonych formaliną, zanurzonych w parafinie próbek guza nowotworowego. Walidacja produktu została przeprowadzona za pomocą produktów firmy QIAGEN przeznaczonych do oczyszczania DNA. Produkt jest przeznaczony do stosowania z amplifikatorem Rotor-Gene Q 5plex HRM do testów PCR w czasie rzeczywistym. W celu uzyskania optymalnych wyników należy ściśle przestrzegać wytycznych zawartych w dokumencie therascreen EGFR RGQ PCR Kit Instrukcja obsługi. Rozcieńczanie odczynników wbrew opisowi zawartemu w niniejszej instrukcji obsługi nie jest zalecane i skutkuje utratą wydajności. Ważne jest, aby dokonać oceny ilości i jakości materiału DNA przed rozpoczęciem analizy próbki przy użyciu zestawu therascreen EGFR RGQ PCR. Dodatkowa mieszanina reakcji kontrolnej (Ctrl) służy do określenia, czy wartość C T jest akceptowalna na potrzeby testu. Nie należy korzystać z odczytów absorbancji, ponieważ nie korelują one z wartościami C T w pofragmentowanych próbkach DNA. Należy zwrócić uwagę na daty ważności oraz informacje o warunkach przechowywania wydrukowane na pudełkach i etykietach wszystkich składników. Nie należy używać składników z przekroczoną datą ważności ani elementów niewłaściwie przechowywanych. 6 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

7 Kontrola jakości Zgodnie z poświadczonym certyfikatem ISO systemem zarządzania jakością firmy QIAGEN każda partia zestawów therascreen EGFR RGQ PCR przechodzi testy zgodności ze wstępnie określoną specyfikacją w celu zapewnienia spójnej jakości produktu. Pomoc techniczna Firma QIAGEN szczyci się wysoką jakością i dostępnością swojej pomocy technicznej. W naszych serwisach pracują doświadczeni naukowcy mający rozległą wiedzę praktyczną i teoretyczną w dziedzinie technologii badań i oznaczania próbek oraz stosowania produktów firmy QIAGEN. W przypadku pytań lub ogólnych problemów dotyczących zestawu therascreen EGFR RGQ PCR lub produktów firmy QIAGEN, prosimy o niezwłoczny kontakt z naszą firmą. Klienci firmy QIAGEN są kluczowym źródłem informacji o zaawansowanych lub specjalistycznych zastosowaniach naszych produktów. Informacje te pomogą innym naukowcom i badaczom prowadzącym projekty dla firmy QIAGEN. Z tego względu zachęcamy do kontaktowania się z naszą firmą w przypadku propozycji dotyczących działania produktu lub nowych zastosowań i technik. W celu uzyskania pomocy technicznej prosimy o kontakt z Centrum pomocy technicznej pod adresem lub telefon do jednego z serwisów lub lokalnych dystrybutorów firmy QIAGEN (informacje znajdują się na tylnej okładce oraz na stronie Informacje dotyczące bezpieczeństwa W czasie pracy ze środkami chemicznymi należy zawsze używać odpowiedniego fartucha laboratoryjnego, rękawiczek jednorazowych i okularów ochronnych. Wszystkie środki chemiczne oraz materiał biologiczny należy traktować jako potencjalnie niebezpieczne. Próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Próbki i odpady testowe należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami w zakresie bezpieczeństwa. Całodobowa informacja w nagłych sytuacjach Informacja medyczna w nagłych sytuacjach jest dostępna przez całą dobę w języku angielskim, francuskim i niemieckim pod następującym numerem telefonu: Centrum informacji toksykologicznej, Moguncja (Niemcy) Tel.: Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010 7

8 Wstęp Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR służy do wykrywania 29 mutacji w onkogenie EGFR za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) na aparacie Rotor-Gene Q. W oparciu o technologie Scorpions i ARMS zestaw therascreen EGFR RGQ PCR umożliwia wykrywanie poniższych mutacji w tle genomowego DNA typu dzikiego. 19 delecji w eksonie 19 (wykrywa obecność każdej z 19 delecji, ale ich nie rozróżnia) T790M L858R L861Q G719X (wykrywa obecność G719S, G719A i G719C, ale ich nie rozróżnia) S768I 3 insercje w eksonie 20 (wykrywa obecność każdego z 3 wstawień, ale ich nie rozróżnia) Zastosowane metody są wysoce selektywne i zależnie od całkowitej ilości obecnego DNA może wykryć niewielką zawartość procentową mutacji w tle genomowego DNA typu dzikiego. Taka selektywność i granice wykrywalności są lepsze niż w przypadku takich technologii, jak metoda sekwencjonowania z wykorzystaniem barwników ( dye terminator sequencing ). Zasada działania Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR do wykrywania mutacji w testach PCR w czasie rzeczywistym wykorzystuje dwie technologie ARMS i Scorpions. ARMS Swoista amplifikacja alleli lub mutacji jest dokonywana z wykorzystaniem technologii ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Polimeraza DNA Taq (Taq) jest skuteczna w rozróżnianiu dopasowania i niedopasowania nukleotydów przy końcu 3' primera PCR. Określone zmutowane sekwencje mogą być selektywnie amplifikowane, nawet w próbkach, w których większość sekwencji nie zawiera mutacji: kiedy primer jest w pełni dopasowany, amplifikacja zachodzi z pełną wydajnością; kiedy zasada przy końcu 3 nie jest dopasowana, zachodzi jedynie amplifikacja tła niskiego poziomu. 8 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

9 Scorpions Wykrywanie amplifikacji jest przeprowadzane z wykorzystaniem sond typu Scorpions. Scorpions to dwufunkcyjne cząsteczki zawierające primer PCR kowalencyjnie związany z sondą. Fluorochrom w takiej sondzie oddziałuje z wykorzystywanym w niej wygaszaczem, co zmniejsza fluorescencję. Podczas reakcji PCR, kiedy sonda wiąże się z amplikonem, fluorochrom i wygaszacz zostają rozdzielone. Prowadzi to do wzrostu poziomu fluorescencji w probówce reakcyjnej. Procedura Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR wymaga stosowania procedury dwuetapowej. Pierwszym etapem jest próba kontrolna służąca do oszacowania całkowitej ilości DNA w próbce. Drugim etapem jest próba mutacji służąca do określenia obecności lub braku zmutowanego DNA. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010 9

10 Sprzęt i odczynniki zapewniane przez użytkownika W czasie pracy ze środkami chemicznymi należy zawsze używać odpowiedniego fartucha laboratoryjnego, rękawiczek jednorazowych i okularów ochronnych. W celu uzyskania dodatkowych informacji należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) uzyskanymi od producentów poszczególnych produktów. Zestaw do izolacji DNA (patrz Izolacja DNA na stronie 12) Dedykowane pipety z regulacją przeznaczone do przygotowania mieszaniny do reakcji PCR* Pipety z regulacją przeznaczone do dozowania matrycy DNA*. Sterylne końcówki do pipet z filtrami Wirówka* do probówek reakcyjnych 2 ml Aparat Rotor-Gene Q 5plex HRM* z kanałami fluorescencyjnymi dla Cycling Green i Cycling Yellow Oprogramowanie Rotor-Gene Q, wersja Probówki w pasku z zatyczkami 0,1 ml do stosowania w wirówce 72-dołkowej (nr katalogowy lub ) Sterylne probówki do przygotowania mieszanin do PCR w mikrowirówce * Należy upewnić się, że wszystkie aparaty zostały sprawdzone i kalibrowane zgodnie z instrukcjami producenta. 10 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

11 Ważne informacje Ogólne środki bezpieczeństwa Użytkownik powinien zawsze zwracać uwagę na następujące kwestie: Używać sterylnych końcówek do pipet z filtrami, a pipety kalibrować zgodnie z instrukcjami producenta. Materiały pozytywne (próbki materiałów i pozytywne próbki kontrolne) przechowywać oddzielnie względem innych odczynników i dodawać je do mieszaniny reakcyjnej w osobnym miejscu. Przed rozpoczęciem testu rozmrozić składniki do temperatury pokojowej (15 25 C). Po rozmrożeniu wymieszać składniki (obracając 10-krotnie każdą probówkę) i krótko odwirować. Należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu reakcji PCR syntetycznym materiałem kontrolnym. Zaleca się używanie osobnych pipet do przygotowania mieszanin reakcyjnych i dodawania matrycy DNA. Przygotowywanie i rozdzielanie mieszanin reakcyjnych powinno być przeprowadzane w innym miejscu niż dodawanie matrycy. Nie otwierać probówek aparatu Rotor-Gene Q po zakończeniu reakcji PCR. Format zestawu W zestawie therascreen EGFR RGQ PCR znajduje się osiem testów: Jedna próba kontrolna (Ctrl) Siedem testów mutacji Wszystkie mieszaniny reakcyjne zawierają próbę kontrolną (kontrolę wewnętrzną) oznaczoną symbolem HEX. Pozwala to na kontrolę obecności inhibitorów, które mogą prowadzić do wyników fałszywie negatywnych. Odczynniki przeznaczone do stosowania z zestawem therascreen EGFR RGQ PCR zostały optymalnie rozcieńczone. Dalsze rozcieńczanie odczynników nie jest zalecane i może skutkować utratą wydajności. Nie zaleca się używania objętości reakcji mniejszej niż 25 µl, ponieważ zwiększa to ryzyko otrzymania wyników fałszywie negatywnych. Wszystkie odczynniki w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR zostały opracowane specjalnie do użycia z określonymi testami. Wszystkie odczynniki dostarczone w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR są przeznaczone wyłącznie do stosowania z odczynnikami z tego samego zestawu therascreen Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

12 EGFR RGQ PCR. Aby utrzymać optymalną wydajność zestawu, nie należy zamieniać odczynników. Należy używać wyłącznie polimerazy DNA Taq dostarczonej w zestawie. Nie należy zastępować jej polimerazą DNA Taq tego samego lub innego rodzaju z innych zestawów ani polimerazą DNA Taq innego producenta. Testy Próba kontrolna Próba kontrolna (Ctrl) oznaczona symbolem FAM służy do oszacowania całkowitej ilości DNA w próbce. Próba kontrolna amplifikuje region eksonu 2 genu EGFR. Primer oraz sonda zostały zaprojektowane tak, aby pominąć wszystkie znane polimorfizmy EGFR. Testy mutacji Każdy test mutacji oznaczony symbolem FAM zawiera jeden primer Scorpions oraz primery dla rozróżnienia pomiędzy DNA typu dzikiego a zmutowanym DNA wykrywanym przez test PCR w czasie rzeczywistym. Materiał próbek Wszystkie próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiał próbek musi być ludzkim DNA genomowym pobranym z utrwalonych formaliną i zanurzonych w parafinie próbek tkanki niedrobnokomórkowego nowotworu płuc. W celu zapewnienia odpowiedniej jakości próbek powinny one być transportowane zgodnie ze standardowymi metodami stosowanymi w patologii. Próbki nowotworów nie są jednorodne, a dane z tych próbek mogą nie odpowiadać danym z innych fragmentów tego samego nowotworu. Próbki nowotworu mogą zawierać również tkankę nienowotworową. W DNA z tkanek nienowotworowych nie jest spodziewana obecność mutacji genu EGFR wykrywanych przez zestaw therascreen EGFR RGQ PCR. Izolacja DNA Zalecamy korzystanie z zestawu do ekstrakcji DNA tkanek QIAamp DNA FFPE (QIAGEN, nr katalogowy 56404) w celu wykonania ekstrakcji ludzkiego DNA genomowego z utrwalonych formaliną i zanurzonych w parafinie próbek tkanki niedrobnokomórkowego nowotworu płuc. Oczyszczanie DNA należy wykonywać zgodnie z instrukcjami zawartymi w dokumencie QIAamp DNA 12 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

13 FFPE Tissue Kit Handbook (QIAamp DNA FFPE Tissue Instrukcja obsługi) z poniższymi zmianami: Skrawki uzyskane z tkanki zanurzonej w parafinie należy umieszczać na szkiełkach. Należy usunąć nadmiar parafiny z okolic tkanki, używając czystego, sterylnego skalpela. Należy zdrapać materiał z wycinka tkanki do probówek mikrowirówkowych, używając nowego czystego skalpela dla każdej próbki, która ma zostać pobrana. Trawienie proteinazą K należy przeprowadzać przez 1 godzinę. Oczyszczony genomowy DNA należy rozpuścić w 200 µl buforu ATE (dostarczonego w zestawie do ekstrakcji DNA z tkanek QIAamp DNA FFPE). Oczyszczony genomowy DNA przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C. Ocena DNA powinna być oparta o PCR i może różnić się od oceny ilościowej opartej na odczycie absorbancji. Dostarczana jest dodatkowa mieszanina do reakcji kontrolnej (Ctrl) pozwalająca na ocenę jakości i ilości DNA w próbkach przed zastosowaniem zestawu therascreen EGFR RGQ PCR. Wszystkie testy w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR pozwalają na uzyskanie krótkich produktów PCR. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR nie zadziała na silnie pofragmentowanym DNA. Kontrola Kontrola wewnętrzna Oprócz opisywanej reakcji testy zawierają kontrolę wewnętrzną (patrz Testy na stronie 12). Jeśli oba testy nie dały poprawnych wyników, dane należy automatycznie odrzucić, ponieważ możliwa jest obecność inhibitorów prowadzących do wyników fałszywie negatywnych. Rozcieńczenie próbki może zmniejszyć wpływ inhibitorów, ale spowoduje także rozcieńczenie DNA. Kontrole konieczne są w przypadku wszystkich testów eksperymentalnych. Ocena próbek Do oceny całkowitej ilości DNA w próbce należy użyć dodatkowej mieszaniny dla próby kontrolnej (Ctrl) dostarczanej w zestawie therascreen EGFR RGQ PCR. Próba kontrolna amplifikuje region eksonu 2 genu EGFR. Zaleca się, Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

14 aby próbki były przygotowywane wyłącznie z próbą kontrolną przy użyciu kontroli pozytywnej (PC) EGFR jako kontroli pozytywnej i wody (H 2 O) jako kontroli bez matrycy (NTC). Aby uzyskać optymalne wykorzystanie odczynników zestawu therascreen EGFR RGQ PCR, należy testować próbki partiami. Testowanie pojedynczych próbek powoduje zużycie większej ilości odczynników i zmniejszenie liczby próbek, które mogą zostać zbadane za pomocą jednego zestawu therascreen EGFR RGQ PCR. Analiza danych Testy Scorpions w czasie rzeczywistym wykorzystują szereg cykli PCR niezbędnych do wykrycia sygnału fluorescencji powyżej sygnału tła jako miarę ilości badanych cząsteczek na początku reakcji. Punkt, w którym sygnał powyżej fluorescencji tła zostaje wykryty, jest nazywany progiem cyklu (cycle threshold C T ). Wartości C T dla próbek są obliczane jako różnica pomiędzy C T testu mutacji a C T próby kontrolnej z tej samej próbki. Próbki są klasyfikowane jako zawierające mutację, jeśli wykazują wartość C T mniejszą niż wartość graniczną C T dla testu. Powyżej tej wartości próbka może zawierać mniej niż zawartość procentowa mutacji możliwa do wykrycia przez zestaw (poza progiem wykrycia testu) lub nie być zmutowana. Wartości C T mutacji 40 lub wyższe muszą być oznaczone jako negatywne lub poza zasięgiem wykrywania zestawu. W przypadku używania primerów ARMS możliwe jest niewydajne wiązanie primerów, powodujące bardzo późne C T tła pochodzące od DNA niezawierającego mutacji. Wszystkie wartości C T wyliczone na podstawie amplifikacji tła będą w takich warunkach większe od wartości granicznej C T i próbka zostanie sklasyfikowana jako niezawierająca mutacji. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR jest przeznaczony do stosowania z pięciokanałowym amplifikatorem QIAGEN Rotor-Gene Q do testów PCR w czasie rzeczywistym z wirówką 72-dołkową. 14 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

15 Protokół 1: Ocena próbek Protokół służy do oceny DNA całkowitej ilości DNA w próbkach. Ważne czynności do wykonania przed rozpoczęciem procedury Przed wykonaniem tej procedury należy zapoznać się z sekcją Ważne informacje na stronach Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się z aparatem Rotor- Gene Q. Patrz podręcznik użytkownika aparatu. Czynności do wykonania przed rozpoczęciem Przed rozpoczęciem odczynniki należy całkowicie rozmrozić, wymieszać (przez 10-krotne obrócenie) i krótko odwirować. Przed użyciem należy upewnić się, że polimeraza DNA Taq ma temperaturę pokojową (15 25 C). Krótko odwirować probówkę w celu zgromadzenia enzymu na dnie probówki. Procedura 1. Rozmrozić mieszaninę do reakcji kontrolnej (Ctrl) i kontrolę pozytywną EGFR (PC) do temperatury pokojowej (15 25 C). Po rozmrożeniu mieszaniny reakcji kontrolnej (Ctrl) i kontroli pozytywnej EGFR (PC) wymieszać je (obracając 10-krotnie każdą probówkę), aby uniknąć lokalnego gromadzenia się soli. 2. Przygotować wystarczającą ilość roztworów do reakcji dla próbek DNA (mieszanina reakcji kontrolnej (Ctrl) z polimerazą DNA Taq), jednej reakcji kontroli pozytywnej i jednej reakcji kontroli bez matrycy (NTC) zgodnie z objętościami podanymi w tabeli 1. Uwzględnić odczynniki dla 2 dodatkowych próbek. Roztwór do reakcji zawiera wszystkie składniki wymagane do reakcji PCR oprócz właściwej próbki. Nie wirować polimerazy DNA Taq, ponieważ może to prowadzić do inaktywacji enzymu. Przed użyciem upewnić się, że polimeraza DNA Taq ma temperaturę pokojową. Krótko odwirować probówkę w celu zgromadzenia całości enzymu na dnie probówki. Odmierzyć polimerazę DNA Taq za pomocą pipety, umieszczając końcówkę pipety pod powierzchnią cieczy, aby uniknąć pokrycia końcówki nadmiarem enzymu. Upewnić się, że reakcje zostały prawidłowo nastawione. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

16 Tabela 1. Przygotowanie mieszaniny do PCR dla reakcji kontrolnej Mieszanina do PCR Mieszanina do Test reakcji kontrolnej (Ctrl)* Polimeraza DNA Taq* Próba kontrolna 19,5 µl 0,5 µl * Przygotowując roztwór do reakcji, należy uwzględnić ilość dla 2 dodatkowych próbek. 3. Mieszać roztwór do reakcji PCR przez delikatne pipetowanie. Natychmiast dodać 20 µl mieszaniny do PCR do każdej probówki aparatu Rotor-Gene. 4. Natychmiast dodać 5 µl próbki, kontroli pozytywnej EGFR (PC) lub wody wolnej od nukleaz (H 2 O) (na potrzeby reakcji kontroli bez matrycy NTC) do każdej probówki aparatu Rotor-Gene. 5. Zamknąć probówki PCR i umieścić je w odpowiednich pozycjach na podstawce Rotor-Disc. Jeśli wirówka nie jest równomiernie załadowana, zrównoważyć ją dodatkowymi pustymi próbówkami aparatu Rotor-Gene Q. Po przeniesieniu próbek do wirówki zalecamy sprawdzić, czy we wszystkich probówkach znajdują się jednakowe objętości cieczy. 6. Natychmiast umieścić podstawkę Rotor-Disc w aparacie Rotor- Gene Q. Upewnić się, że pierścień blokujący (akcesorium aparatu Rotor-Gene Q) jest umieszczony na wirówce, uniemożliwiając przypadkowe otwarcie probówek podczas wirowania. 7. W celu dokonania oceny próbek należy utworzyć profil temperatury zgodnie z poniższą procedurą. Ustawianie ogólnych parametrów testów Rysunki 1, 2, 3 Początkowa aktywacja enzymu hot-start Rysunki 4, 5 Amplifikacja DNA Rysunki 6, 7, 8, 9 Regulacja kanałów fluorescencyjnych Rysunki 10, 11, 12, 13 Uruchamianie wirowania Rysunek 14 Wszystkie specyfikacje dotyczą oprogramowania Rotor-Gene Q w wersji Dodatkowe informacje na temat programowania aparatów Rotor- Gene Q znajdują się w podręczniku użytkownika aparatu. Na ilustracjach 16 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

17 odpowiednie ustawienia zakreślono czarnymi ramkami. Podane ilustracje dotyczą aparatów Rotor-Gene Q. 8. Kliknąć dwukrotnie ikonę oprogramowania aparatu Rotor-Gene Q w wersji na pulpicie komputera podłączonego do aparatu Rotor- Gene Q. Wybrać kartę Advanced (Zaawansowane) w wyświetlonym oknie dialogowym New Run (Nowe wirowanie). 9. Aby utworzyć nowy szablon, wybrać opcję Empty Run (Puste wirowanie), a następnie kliknąć opcję New (Nowe), aby otworzyć okno New Run Wizard (Kreator nowego wirowania). 10. Wybrać typ wirówki, zaznaczając opcję 72-Well Rotor (Wirówka 72-dołkowa). Sprawdzić, czy założono pierścień blokujący. Zaznaczyć opcję Locking Ring Attached (Założono pierścień blokujący) i kliknąć przycisk Next (Dalej) (Rysunek 1) Rysunek 1. Okno dialogowe New Run Wizard (Kreator nowego wirowania). 11. Wprowadzić nazwę operatora, wybrać wartość objętości reakcji 25 µl i wpisać uwagi dodatkowe. Kliknąć przycisk Next (Dalej) (Rysunek 2). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

18 1 3 2 Rysunek 2. Ustawianie ogólnych parametrów testów. 12. Kliknąć przycisk Edit Profile (Edytuj profil) w następnym oknie dialogowym New Run Wizard (Kreator nowego wirowania) (Rysunek 3) i zaprogramować profil temperatury zgodnie z informacjami podanymi w poniższych czynnościach. 4 1 Rysunek 3. Edycja profilu. 18 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

19 13. Kliknąć przycisk Insert after (Wstaw po) i wybrać opcję New Hold at Temperature (Nowe wstrzymanie temperatury) (Rysunek 4). Kliknąć pozycję 60, aby zmienić temperaturę na 95 C. 1 2 Rysunek 4. Początkowy etap inkubacji przy 95 C. 14. Kliknąć opcję 60 C i zmienić opcję Hold Temperature (Wstrzymanie temperatury) na 95 C, a następnie kliknąć obszar 1, aby zmienić opcję Hold Time (Czas wstrzymania) na 15 minut. Kliknąć przycisk Insert after (Wstaw po) i wybrać opcję New Cycling (Nowy cykl) (Rysunek 5) Rysunek 5. Początkowy etap inkubacji przy 95 C. 15. Ustawić liczbę cykli na 40, klikając odpowiednią liczbę. Wybrać opcję 95 C for 20 seconds (95 C przez 20 sekund). Ustawić czas na 30 secs (30 sekund) (Rysunek 6). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

20 1 3 2 Rysunek 6. Etap cykli przy 95 C. 16. Zaznaczyć opcję 60 C for 20 secs (60 C przez 20 sekund). Ustawić czas na 60 sekund. Kliknąć przycisk Not Acquiring (Brak rejestracji) (Rysunek 7). 2 1 Rysunek 7. Etap cykli przy 60 C. 20 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

21 17. Na panelu Available Channels (Dostępne kanały) wybrać kanały Yellow (Żółty) i Green (Zielony) do rejestracji, zaznaczając je, a następnie klikając przycisk > w celu ich przeniesienia do panelu Acquiring Channels (Rejestrowane kanały) (Rysunek 8). 1 2 Rysunek 8. Rejestrowanie dla etapu cykli przy 60 C. 18. Zaznaczyć opcję 72 C for 20 secs (72 C przez 20 sekund) i usunąć tę sekcję, a następnie kliknąć przycisk OK (Rysunek 9). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

22 2 1 Rysunek 9. Usunięcie etapu przedłużenia. 19. Kliknąć przycisk Gain Optimisation (Optymalizacja wzmocnienia) (Rysunek 10). 3 1 Rysunek 10. Optymalizacja wzmocnienia. 22 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

23 20. Kliknąć przycisk Optimise Acquiring (Optymalizuj rejestrowanie), a następnie kliknąć przycisk OK dla kanałów: zielonego i żółtego (Rysunki 11 i 12). 1 2 Rysunek 11. Optymalizacja automatycznego wzmocnienia dla kanału zielonego. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

24 1 Rysunek 12. Optymalizacja automatycznego wzmocnienia dla kanału żółtego. 21. Zaznaczyć pole Perform Optimisation before 1st Acquisition (Wykonaj optymalizację przed pierwszą rejestracją), a następnie kliknąć przycisk Close (Zamknij), aby powrócić do ekranu kreatora (Rysunek 13). 24 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

25 1 2 Rysunek 13. Wybór kanałów: zielonego i żółtego. 22. Kliknąć przycisk Next (Dalej), aby zapisać szablon, wybrać opcję Save Template (Zapisz szablon), a następnie zapisać szablon w folderze szablonów. 23. Sprawdzić podsumowanie, a następnie kliknąć przycisk Start Run (Uruchom wirowanie), aby zapisać plik testu i uruchomić test (Rysunek 14). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

26 1 Rysunek 14. Uruchamianie wirowania. 24. Po uruchomieniu wirowania zostanie wyświetlone nowe okno, w którym można wprowadzić nazwy próbek lub kliknąć przycisk Finish (Zakończ) i wprowadzić je później. 25. Zapisać wszystkie dane w odpowiednim folderze. 26. Po zakończeniu wirowania przeanalizować dane. 27. Ocenić wartości C T dla reakcji kontrolnej bez matrycy (NTC), aby upewnić się, że nie wystąpiło zanieczyszczenie dające pozytywny wynik amplifikacji w kanale FAM (C T niższe niż 40) lub nieprawidłowy wynik kontroli wewnętrznej w kanale HEX (brak C T ) wskazujący na problem z ustawieniami. Kontrola pozytywna EGFR (PC) musi dać wynik próby kontrolnej C T (kanał FAM) w zakresie 26,26 30,95. Więcej informacji na temat analizy danych zawiera Załącznik A. Danych próbki nie należy brać pod uwagę, jeśli wyniki dowolnego z dwóch testów są nieprawidłowe. C T próby kontrolnej 30,69 37: zalecana ostrożność przy interpretacji, ponieważ bardzo niskie stężenia mutacji mogą nie zostać wykryte. C T próby kontrolnej 37 40: w takich próbkach obecnych jest tylko kilka kopii DNA, które można poddać procesowi amplifikacji, a mutacje zostaną prawdopodobnie wykryte tylko wtedy, gdy większość kopii jest zmutowana. Należy pamiętać, że jeśli próbka daje opóźniony próg C T próby kontrolnej, należy porównać wartość C T kontroli wewnętrznej próbki z kontrolą wewnętrzną NTC. Jeśli kontrola wewnętrzna próbki jest opóźniona lub 26 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

27 negatywna w porównaniu z NTC, może to świadczyć o obecności inhibitora. Możliwe jest zmniejszenie wpływu inhibitorów przez rozcieńczenie próbki, chociaż spowoduje to także rozcieńczenie DNA. Rozcieńczenie próbki: C T kontrolne o wartości <23 spowoduje przeładowanie testów mutacji. Próbki dające C T kontrolne <23 należy rozcieńczyć. Aby zobaczyć każdą mutację na niskim poziomie, stężone próbki należy rozcieńczyć tak, aby były >23 i <30,69, zakładając, że rozcieńczenie o połowę zwiększa C T o 1. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

28 Protokół 2: Wykrywanie mutacji EGFR i analiza danych Protokół służy do wykrywania mutacji EGFR i analizy danych. Ważne czynności do wykonania przed rozpoczęciem procedury Przed wykonaniem tej procedury należy zapoznać się z sekcją Ważne informacje na stronach Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się z aparatem Rotor- Gene Q. Patrz podręcznik użytkownika aparatu. W celu wydajnego wykorzystania zestawu therascreen EGFR RGQ PCR próbki powinny być pogrupowane w partiach po 7 (w celu wypełnienia wirówki 72-dołkowej). Testowanie mniejszych partii spowoduje zmniejszenie liczby próbek, które można przebadać za pomocą jednego zestawu therascreen EGFR RGQ PCR. Aby uniknąć odchyleń związanych z różnicami w przebiegu testów, dla każdej próbki DNA próby kontrolne i testy mutacji powinny być analizowane w tej samej reakcji PCR. Czynności do wykonania przed rozpoczęciem Przed rozpoczęciem odczynniki należy całkowicie rozmrozić, wymieszać (przez 10-krotne obrócenie) i krótko odwirować. Przed użyciem należy upewnić się, że polimeraza DNA Taq ma temperaturę pokojową (15 25 C). Krótko odwirować probówkę w celu zgromadzenia enzymu na dnie probówki. Procedura 1. Rozmrozić mieszaninę reakcyjną i kontrolę pozytywną EGFR (PC) do temperatury pokojowej (15 25 C). Po rozmrożeniu mieszaniny reakcyjnej i kontroli pozytywnej EGFR (PC) wymieszać je (obracając 10-krotnie każdą probówkę), aby uniknąć lokalnego gromadzenia się soli. 2. Przygotować wystarczającą ilość roztworów do reakcji dla próbek DNA (mieszanina reakcji kontrolnej (Ctrl) z polimerazą DNA Taq), jednej reakcji kontroli pozytywnej i jednej reakcji kontroli bez matrycy (NTC) zgodnie z objętościami podanymi w tabeli 2. Uwzględnić odczynniki dla 2 dodatkowych próbek. Roztwór do reakcji zawiera wszystkie składniki wymagane do reakcji PCR oprócz właściwej próbki. Nie wirować polimerazy DNA Taq, ponieważ może to prowadzić do inaktywacji enzymu. 28 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

29 Przed użyciem upewnić się, że polimeraza DNA Taq ma temperaturę pokojową. Krótko odwirować probówkę w celu zgromadzenia całości enzymu na dnie probówki. Odmierzyć polimerazę DNA Taq za pomocą pipety, umieszczając końcówkę pipety pod powierzchnią cieczy, aby uniknąć pokrycia końcówki nadmiarem enzymu. Upewnić się, że reakcje zostały prawidłowo nastawione. Tabela 2. Przygotowanie mieszaniny do PCR dla reakcji kontrolnej Mieszanina do PCR Mieszanina do Test reakcji kontrolnej (Ctrl)* Polimeraza DNA Taq* Próba kontrolna 19,5 µl 0,5 µl Test mutacji 19,5 µl 0,5 µl * Przygotowując roztwór do reakcji, należy uwzględnić ilość dla 2 dodatkowych próbek. 3. Mieszać roztwór do reakcji PCR przez delikatne pipetowanie. Natychmiast dodać 20 µl mieszaniny do PCR do każdej probówki aparatu Rotor-Gene. 4. Natychmiast dodać 5 µl próbki, kontroli pozytywnej EGFR (PC) lub wody wolnej od nukleaz (H 2 O) (na potrzeby reakcji kontroli bez matrycy NTC) do każdej probówki aparatu Rotor-Gene. Każda próbka DNA musi być testowana zarówno z kontrolą jak i wszystkimi testami mutacji. Układ testów przedstawiono w tabeli 3. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

30 Tabela 3. Układ roztworów kontrolnych (Ctrl) i testów mutacji Kontrola Numer próbki PC NTC Ctrl T790M Delecje L858R L861Q G719X S768I Ins Zamknąć probówki aparatu Rotor-Gene Q i umieścić je w odpowiednich pozycjach na podstawce Rotor-Disc. Jeśli wirówka nie jest równomiernie załadowana, należy zrównoważyć ją dodatkowymi pustymi próbówkami aparatu Rotor-Gene Q. 6. Natychmiast umieścić podstawkę Rotor-Disc w aparacie Rotor- Gene Q. Upewnić się, że pierścień blokujący (akcesorium aparatu Rotor-Gene Q) jest umieszczony na wirówce, uniemożliwiając przypadkowe otwarcie probówek podczas wirowania. 7. W celu dokonania oceny próbek należy utworzyć profil temperatury zgodnie z poniższą procedurą. Ustawianie ogólnych parametrów testów Rysunki 15, 16, 17 Początkowa aktywacja enzymu hot-start Rysunek 18 Amplifikacja DNA Rysunek 19 Regulacja kanałów fluorescencyjnych Rysunki 20, 21 Uruchamianie wirowania Rysunek 22 Wszystkie specyfikacje dotyczą oprogramowania Rotor-Gene Q w wersji Dodatkowe informacje na temat programowania aparatów Rotor Gene znajdują się w podręczniku użytkownika aparatu. Na ilustracjach odpowiednie ustawienia zakreślono czarnymi ramkami. Podane ilustracje dotyczą aparatów Rotor Gene Q. 30 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

31 8. Kliknąć dwukrotnie ikonę oprogramowania aparatu Rotor-Gene Q w wersji na pulpicie komputera podłączonego do aparatu Rotor- Gene Q. Wybrać kartę Advanced (Zaawansowane) w wyświetlonym oknie dialogowym New Run (Nowe wirowanie). 9. Aby utworzyć nowy szablon, wybrać opcję Empty Run (Puste wirowanie), a następnie kliknąć opcję New (Nowe), aby otworzyć okno New Run Wizard (Kreator nowego wirowania). 10. Wybrać typ wirówki, zaznaczając opcję 72-Well Rotor (Wirówka 72- dołkowa). Sprawdzić, czy założono pierścień blokujący. Zaznaczyć opcję Locking Ring Attached (Założono pierścień blokujący) i kliknąć przycisk Next (Dalej) (Rysunek 15) Rysunek 15. Okno dialogowe New Run Wizard (Kreator nowego wirowania). 11. Wprowadzić nazwę operatora, wybrać wartość objętości reakcji 25 µl i wpisać uwagi dodatkowe. Kliknąć przycisk Next (Dalej) (Rysunek 16). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

32 1 3 2 Rysunek 16. Ustawianie ogólnych parametrów testów. 12. Kliknąć przycisk Edit Profile (Edytuj profil) w następnym oknie dialogowym New Run Wizard (Kreator nowego wirowania) (Rysunek 17) i zaprogramować profil temperatury zgodnie z informacjami podanymi w poniższych czynnościach. 4 1 Rysunek 17. Edycja profilu. 32 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

33 13. Kliknąć przycisk Insert after (Wstaw po) i wybrać opcję New Hold at Temperature (Nowe wstrzymanie temperatury) (Rysunek 18). Kliknąć pozycję 60, aby zmienić temperaturę na 95 C. 1 2 Rysunek 18. Początkowy etap inkubacji przy 95 C. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

34 14. Kliknąć opcję 60 C i zmienić opcję Hold Temperature (Wstrzymanie temperatury) na 95 C, a następnie kliknąć obszar 1, aby zmienić opcję Hold Time (Czas wstrzymania) na 15 minut. Kliknąć przycisk Insert after (Wstaw po) i wybrać opcję New Cycling (Nowy cykl) (Rysunek 19) Rysunek 19. Początkowy etap inkubacji przy 95 C. 15. Ustawić liczbę cykli na 40, klikając odpowiednią liczbę. Zaznaczyć opcję 95 C for 20 secs (95 C przez 20 sekund). Ustawić czas na 30 secs (30 sekund) (Rysunek 20) Rysunek 20. Etap cykli przy 95 C. 34 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

35 16. Zaznaczyć opcję 60 C for 20 secs (60 C przez 20 sekund). Ustawić czas na 60 seconds (60 sekund). Kliknąć przycisk Not Acquiring (Brak rejestracji) (Rysunek 21). 2 1 Rysunek 21. Etap cykli przy 60 C. 17. Na panelu Available Channels (Dostępne kanały) wybrać kanały Yellow (Żółty) i Green (Zielony) do rejestracji, zaznaczając je, a następnie klikając przycisk > w celu ich przeniesienia do panelu Acquiring Channels (Rejestrowane kanały) (Rysunek 22). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

36 1 2 Rysunek 22. Rejestrowanie dla etapu cykli przy 60 C. 18. Zaznaczyć opcję 72 C for 20 secs (72 C przez 20 sekund) i usunąć tę sekcję, a następnie kliknąć przycisk OK (Rysunek 23). 2 1 Rysunek 23. Usunięcie etapu przedłużenia. 19. Kliknąć przycisk Gain Optimisation (Optymalizacja wzmocnienia) (Rysunek 24) Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

37 1 Rysunek 24. Optymalizacja wzmocnienia. 20. Kliknąć przycisk Optimise Acquiring (Optymalizuj rejestrowanie), a następnie kliknąć przycisk OK dla kanałów: zielonego i żółtego (Rysunki 25 i 26). 1 2 Rysunek 25. Optymalizacja automatycznego wzmocnienia dla kanału zielonego. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

38 1 Rysunek 26. Optymalizacja automatycznego wzmocnienia dla kanału żółtego. 21. Zaznaczyć pole Perform Optimisation before 1st Acquisition (Wykonaj optymalizację przed pierwszą rejestracją), a następnie kliknąć przycisk Close (Zamknij), aby powrócić do ekranu kreatora (Rysunek 27). 38 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

39 1 2 Rysunek 27. Wybór kanałów: zielonego i żółtego. 22. Kliknąć przycisk Next (Dalej), aby zapisać szablon, wybrać opcję Save Template (Zapisz szablon), a następnie zapisać szablon w folderze szablonów. 23. Sprawdzić podsumowanie, a następnie kliknąć przycisk Start Run (Uruchom wirowanie), aby zapisać plik testu i uruchomić test (Rysunek 28). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

40 1 Rysunek 28. Uruchamianie wirowania. 24. Po uruchomieniu wirowania zostanie wyświetlone nowe okno, w którym można wprowadzić nazwy próbek lub kliknąć przycisk Finish (Zakończ) i wprowadzić je później. 25. Zapisać wszystkie dane w odpowiednim folderze. 26. Po zakończeniu wirowania przeanalizować dane. Więcej informacji na temat analizy danych zawiera Załącznik A. 40 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

41 Przewodnik rozwiązywania problemów Przewodnik może przydać się w przypadku wystąpienia ewentualnych problemów. Aby uzyskać więcej informacji, należy także zapoznać się ze stroną często zadawanych pytań w witrynie naszego Centrum pomocy technicznej pod adresem Naukowcy w działu serwisu firmy QIAGEN chętnie odpowiedzą na pytania dotyczące danych i protokołów opisanych w niniejszej instrukcji obsługi, a także technologii badań i oznaczania próbek (informacje kontaktowe znajdują się na tylnej okładce oraz na stronie Komentarze i propozycje Brak sygnału kontroli pozytywnej EGFR (PC) w kanale fluorescencyjnym Cycling Green a) Wybrany kanał fluorescencyjny dla analizy danych PCR jest niezgodny z protokołem b) Nieprawidłowo zaprogramowany profil temperatury aparatu Rotor-Gene c) Nieprawidłowa konfiguracja reakcji PCR d) Warunki przechowywania co najmniej jednego składnika są niezgodne z instrukcjami podanymi w sekcji Transport i przechowywanie (strona 5) e) Minął termin ważności zestawu therascreen EGFR RGQ PCR Na potrzeby analizy danych wybrać kanał fluorescencyjny Cycling Green w przypadku analizy EGFR PCR oraz kanał fluorescencyjny Cycling Yellow w przypadku kontroli wewnętrznej PCR. Porównać profil temperatury z protokołem. Sprawdzić etapy procedury według schematu odmierzania pipetą i w razie potrzeby powtórzyć reakcję PCR. Sprawdzić warunki przechowywania i termin ważności (na etykiecie zestawu) odczynników i w razie potrzeby zastosować nowy zestaw. Sprawdzić warunki przechowywania i termin ważności (na etykiecie zestawu) odczynników i w razie potrzeby zastosować nowy zestaw. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

42 Komentarze i propozycje Sygnały z kontrolą negatywną w kanale fluorescencyjnym Cycling Green analitycznej reakcji PCR a) Podczas przygotowywania reakcji PCR nastąpiło zanieczyszczenie Powtórzyć reakcję PCR z nowymi odczynnikami w powtórzeniach. Jeśli to możliwe, zamknąć probówki PCR bezpośrednio po dodaniu próbki do testów. Upewnić się, że przestrzeń robocza oraz aparaty są regularnie odkażane. b) Zanieczyszczenie podczas procesu ekstrakcji Powtórzyć ekstrakcję i reakcję PCR próbki do zbadania przy użyciu nowych odczynników. Upewnić się, że przestrzeń robocza oraz aparaty są regularnie odkażane. 42 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

43 Załącznik A: Analiza danych z aparatu Rotor-Gene Q Należy sprawdzić wykresy wszystkich reakcji z aparatu Rotor-Gene Q. Czasami wzrost siły sygnału fluorescencyjnego można zaobserwować w kontroli bez matrycy (NTC) i próbkach ujemnych. W takim przypadku po uzyskaniu wartości C T użytkownik powinien odróżnić zdarzenie rzeczywistego wzmocnienia mogące świadczyć o zanieczyszczeniu kontroli bez matrycy (NTC) i rzeczywistym wzmocnieniu od liniowego wzrostu fluorescencji, który może być spowodowany artefaktem. Analiza kontroli bez matrycy (NTC) Na rysunkach 29 i 30 przedstawiono dwa przykłady zachowania kontroli NTC wraz z instrukcjami odczytu tego rodzaju wykresu. Na nieliniowym wykresie na rysunku 29 występuje rzeczywiste wzmocnienie spowodowane zanieczyszczeniem próbki. Taki wynik należy odrzucić, a próbki przetestować ponownie. Na rysunku 30 widać liniowe wzmocnienie kontroli NTC. W takim przypadku należy rozpatrzyć fluorescencję nieprzetworzoną: odpowiedni wykres fluorescencji nieprzetworzonej przedstawia rysunek 31, na którym widoczny jest liniowy wzrost fluorescencji zamiast zdarzenia wzmocnienia rzeczywistego. Dane z tego wykresu mogą posłużyć jako wyniki testu, będąc dowodem przejścia kontroli pozytywnej i kontroli wewnętrznej. Dla porównania z rysunkiem 31, rysunek 32 przedstawia dane fluorescencji nieprzetworzonej ze zdarzeniem wzmocnienia rzeczywistego. W takim przypadku dane należy odrzucić, a próbki przetestować ponownie, ponieważ świadczy to o obecności zanieczyszczenia. Wzmocnienie przedstawiające zanieczyszczeni e w probówce z kontrolą bez matrycy (NTC) Rysunek 29. Zanieczyszczenie w kontroli NTC testu na analizowanym wykresie. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

44 Liniowy wzrost fluorescencji w dołku kontroli NTC Rysunek 30. Przykład liniowego wzrostu fluorescencji w dołku kontroli NTC. Liniowe wzmocnienie w dołku kontroli NTC dla danych fluorescencji nieprzetworzonej Rysunek 31. Fluorescencja nieprzetworzona z Rysunku Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

45 Zanieczyszczenie w dołku kontroli NTC dla danych fluorescencji nieprzetworzonej. W pozostałych dołkach zanieczyszczenie nie występuje. Rysunek 32. Dane fluorescencji nieprzetworzonej przedstawiające dołek kontroli NTC ze zdarzeniem wzmocnienia rzeczywistego. Analiza próbek i kontrola pozytywna Na rysunkach 33 i 34 przedstawiono dwa przykłady wzmocnienia w reakcjach próbek wraz z instrukcjami odczytu tego rodzaju wykresu. Na rysunku 33 widoczne jest wzmocnienie rzeczywiste w dołku próbki na analizowanym wykresie. Jeśli wykres tego typu przyjmuje postać esowatej krzywej wzmocnienia, oznacza to wzmocnienie rzeczywiste, a dane z tego wykresu mogą posłużyć jako wyniki testu, będąc dowodem przejścia kontroli pozytywnej i kontroli wewnętrznej. Rysunek 34 przedstawia wzmocnienie liniowe w reakcji próbki. W takim przypadku należy rozpatrzyć dane fluorescencji nieprzetworzonej: odpowiedni wykres fluorescencji nieprzetworzonej przedstawia rysunek 35, na którym widoczny jest liniowy wzrost z rysunku 33 odpowiadający liniowemu wzrostowi fluorescencji nieprzetworzonej. Dane z tych wykresów mogą posłużyć jako wyniki testu pod warunkiem, że przeszły kontrolę pozytywną i wewnętrzną. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

46 Wykresy przedstawiając e wzmocnienie rzeczywiste Rysunek 33. Wzmocnienie rzeczywiste w dołku próbki na analizowanym wykresie. Wykresy przedstawiające wzmocnienie rzeczywiste Liniowy wzrost fluorescencji w dołkach 2 próbek Rysunek 34. Przykład liniowego wzrostu fluorescencji w dołkach dwóch próbek. 46 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

47 Wzmocnienie rzeczywiste w dołkach próbek dla danych fluorescencji nieprzetworzonej Wzmocnienie liniowe w dołkach próbek dla danych fluorescencji nieprzetworzonej Rysunek 35. Fluorescencja nieprzetworzona z Rysunku 34. Analiza próbek za pomocą aparatu Rotor-Gene Q Otworzyć odpowiedni plik za pomocą oprogramowania Rotor-Gene Q (2.0.2). Oznakować próbki. Na stronie kanału nieprzetworzonego dla każdego detektora/kanału kliknąć pozycję Options (Opcje) i wprowadzić wartość w polu Crop start cycles (Usuń cykle startowe). Na stronie z opcją Remove data before cycle (Usuń dane przed cyklem) wprowadzić wartość 15 i kliknąć przycisk OK. Kliknąć przycisk Analyse (Analizuj). Na stronie analizy kliknąć opcję Cycling A (from 15), Yellow (Cykl A (od 15), żółty), aby zaznaczyć kanał HEX. Powinna zostać wyróżniona probówka dynamiczna. Kliknąć pozycje Slope correct (Korekcja nachylenia) i Linear scale (Skala liniowa). Ustawić wartość progową 0,02 i sprawdzić wartości C T. Na stronie analizy kliknąć opcję Cycling A (from 15), Green (Cykl A (od 15), zielony), aby zaznaczyć kanał FAM. Powinna zostać wyróżniona probówka dynamiczna. Kliknąć pozycje Slope correct (Korekcja nachylenia) i Linear scale (Skala liniowa). Ustawić wartość progową 0,075 i sprawdzić wartości C T. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

48 Analiza próbek: kontrola bez matrycy NTC i kontrola wewnętrzna 1. Ocenić wartości C T kontroli NTC, aby upewnić się nie występują żadne zanieczyszczenia powodujące dodatnie wzmocnienie sygnału FAM (C T mniejsze od 40). Opis znajduje się na stronach W dołkach kontroli NTC sygnał HEX z próby kontrolnej (kontroli wewnętrznej) musi dać wynik pozytywny we wszystkich 8 dołkach (C T 37). Jeśli występuje wzmocnienie dodatnie w kanale FAM oraz wzmocnienie >37 w sygnale HEX, należy odrzucić wynik próbki. 2. Dla pozostałych dołków sprawdzić, czy dają one sygnał HEX z kontroli wewnętrznej. Istnieją 3 możliwe przypadki: 2a. Jeśli próba kontrolna (kontrola wewnętrzna) daje wynik pozytywny, należy kontynuować analizę. 2b. Jeśli kontrola wewnętrzna dała nieprawidłowy wynik, ale reakcja FAM przebiegła pomyślnie, należy kontynuować analizę, ponieważ reakcja FAM ma status ważniejszy niż reakcja kontroli wewnętrznej. 2c. Jeśli nie powiodły się reakcje FAM i kontroli wewnętrznej, nie należy brać danych pod uwagę, ponieważ możliwa jest obecność inhibitorów prowadzących do wyników fałszywie negatywnych. Rozcieńczenie próbki może zmniejszyć wpływ inhibitorów, ale spowoduje także rozcieńczenie DNA. 3. Wartość C T kontroli musi wynosić ponad 23, aby uniknąć przeładowania testu. Analiza próbek: kontrola pozytywna 1. Obliczyć wartość ΔC T, jak opisano poniżej, upewniając się, że wartości C T mutacji i kontroli pochodzą z tej samej próbki: [C T mutacji] [C T kontroli] = ΔC T 2. Wartości kontroli pozytywnej EGFR (PC) ΔC T powinny zawierać się w zakresach wartości podanych w tabeli Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

49 Tabela 4. Oczekiwane wartości ΔC T kontroli pozytywnej (PC) w oprogramowaniu Rotor-Gene Q (2.0.2) Wartość kontroli pozytywnej Test (PC) ΔC T T790M od 2,88 do 3,01 Delecje od 6,71 do 4,16 L858R od 2,41 do 0,90 L861Q od 4,61 do 1,48 G719X od 2,89 do 1,03 S768I od 3,37 do 2,31 Insercje od 2,93 do 1,28 Analiza próbek: próbki pacjentów 1. Obliczyć wartość ΔC T, jak opisano poniżej, upewniając się, że wartości C T mutacji i kontroli pochodzą z tej samej próbki. Opis znajduje się na stronach [C T mutacji] [C T kontroli] = ΔC T 2. Porównać wartość ΔC T dla próbki z punktem granicznym dla danego testu (Tabela 5), upewniając się, że zastosowano właściwy punkt graniczny dla każdego testu. Punkt graniczny jest punktem powyżej którego sygnał dodatni może wynikać z sygnału tła primera ARMS DNA typu dzikiego. Jeśli wartość ΔC T próbki jest większa niż wartość punktu granicznego, próbka jest określana jako negatywna lub poniżej progu wykrywalności zestawu. Jeśli wartość próbki jest mniejsza niż punkt graniczny, próbka jest klasyfikowana jako pozytywna w zakresie wykrycia mutacji przez test. Opis znajduje się na stronach Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

50 Tabela 5. Wartości graniczne oprogramowania Rotor-Gene Q (2.0.2) Test Wartość graniczna ΔC T T790M 6,38 Delecje 9,06 L858R 8,58 L861Q 9,26 G719X 9,31 S768I 9,26 Insercje 7,91 50 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

51 Załącznik B: Szczegóły mutacji Numery identyfikacyjne COSMIC pochodzą z Katalogu mutacji somatycznych w nowotworach ( Tabela 6. Lista mutacji i numerów identyfikacyjnych COSMIC Mutacja Ekson Podstawowa zmiana Nr identyfikacyjny COSMIC T790M C>T 6240 L858R T>G 6224 L861Q T>A 6213 S768I G>T 6241 G719A G>C 6239 G719S G>A 6252 G719C G>T 6253 Insercje 20 Delecje _2308ins _2320insCAC _2311insGGT _2249del _2252>AAT (kompleks) _2253del _2251del _2254del _2255>T (kompleks) _2250del _2255del _2248>GC (kompleks) _2252>GCA (kompleks) _2247del Część dalsza tabeli na następnej stronie. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

52 Tabela 5. Lista mutacji i numerów identyfikacyjnych COSMIC (cd.) Mutacja Ekson Podstawowa zmiana Nr identyfikacyjny COSMIC 2239_2253del Delecje _2256del _2248TTAAGAGAAG>C (kompleks) 2239_2258>CA (kompleks) _2251del _2257del _2254del _2251>C (kompleks) Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

53 Literatura Firma QIAGEN udostępnia obszerną, aktualną bazę danych online publikacji naukowych, w których stosowane są produkty QIAGEN. Zaawansowane opcje wyszukiwania umożliwiają znajdowanie potrzebnych artykułów według słów kluczowych lub zastosowań, obszarów badań, tytułów itp. W celu uzyskania listy pozycji literaturowych należy odwiedzić witrynę bazy online firmy QIAGEN pod adresem lub skontaktować się z działem serwisu lub lokalnym dystrybutorem firmy QIAGEN. Cytowane odniesienia do literatury 1. Paez, J.G. et. al. (2004) EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304, Lynch, T.J. et. al. (2004) Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 350, Pao, W. (2005) Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. PloS Medicine 2, Newton, C.R. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res Whitcombe, D., Theaker J., Guy, S.P., Brown, T., Little, S. (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17, Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

54 Informacje dotyczące zamawiania Produkt Zawartość Nr katalogowy therascreen EGFR RGQ PCR Kit (24) Aparat Rotor-Gene Q i akcesoria Rotor-Gene Q, 5plex HRM Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Do 24 reakcji: 1 próba kontrolna, 7 testów mutacji, kontrola pozytywna, polimeraza DNA Taq Aparat do PCR w czasie rzeczywistym z analizatorem HRM, 5-kanałowy (zielony, żółty, pomarańczowy, czerwony, purpurowy) z kanałem HRM, laptop, oprogramowanie, akcesoria, 1 rok gwarancji naprawy obejmującej części i robociznę Aluminiowy blok do ręcznego nastawiania reakcji w probówkach w układzie 72 x 0,1 ml z jednokanałową pipetą 250 pasków 4 probówek z zatyczkami na 1000 reakcji 10 x 250 pasków 4 probówek z zatyczkami na reakcji Na żądanie Aktualne informacje licencyjne oraz wyłączenia odpowiedzialności dla poszczególnych produktów znajdują się w odpowiedniej instrukcji obsługi lub podręczniku użytkownika zestawu QIAGEN. Instrukcje obsługi lub podręczniki użytkownika zestawu QIAGEN są dostępne w witrynie Można je także zamówić w serwisie lub u lokalnego dystrybutora firmy QIAGEN. 54 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

55 Ta strona została celowo pozostawiona pusta Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/

56 Ta strona została celowo pozostawiona pusta 56 Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR Instrukcja obsługi 09/2010

57 Zakup tego produktu umożliwia nabywcy stosowanie go na potrzeby usług diagnostycznych in vitro świadczonych dla pacjentów. Niniejszym nie udziela się ogólnych patentów ani licencji innych niż prawa do użycia wynikające z zakupu produktu. Znaki towarowe: QIAGEN, QIAamp Scorpions, therascreen (QIAGEN Group); ARMS (AstraZeneca Limited); FAM, HEX (Life Technologies, Inc.); Rotor-Gene, Rotor-Disc (Corbett Research Pty Ltd). Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR to zestaw diagnostyczny z oznaczeniem CE zgodnym z dyrektywą Unii Europejskiej dotyczącą diagnostycznych urządzeń medycznych in vitro 98/79/WE. Produkt niedostępny w niektórych krajach. Umowa ograniczonej licencji Korzystanie z tego produktu oznacza zgodę nabywcy lub użytkownika zestawu therascreen EGFR RGQ PCR na następujące warunki: 1. Zestaw therascreen EGFR RGQ PCR może być stosowany zgodnie z dokumentem therascreen EGFR RGQ PCR Kit Instrukcja obsługi, wyłącznie z elementami znajdującymi się w tym zestawie. Firma QIAGEN nie udziela żadnej licencji w zakresie praw własności intelektualnych do użytkowania niniejszego zestawu z elementami nienależącymi do zestawu, z wyjątkiem elementów opisanych w dokumencie therascreen EGFR RGQ PCR Kit Instrukcja obsługi oraz dodatkowych protokołów dostępnych na stronie 2. Z wyjątkiem wyraźnie określonych licencji, firma QIAGEN nie gwarantuje, że niniejszy zestaw i/lub jego użytkowanie nie narusza praw osób trzecich. 3. Zestaw oraz jego elementy są przeznaczone do jednorazowego użytku. Nie są one przeznaczone do ponownego użycia, regeneracji ani odsprzedaży. 4. Z wyjątkiem wyraźnie określonych licencji firma QIAGEN nie udziela innych licencji wyraźnych ani dorozumianych. 5. Nabywca i użytkownik zestawu zobowiązuje się nie podejmować kroków ani nie zezwalać innym osobom na podejmowanie kroków mogących doprowadzić do opisanych wyżej czynności zabronionych lub je umożliwić. Firma QIAGEN może wnosić roszczenia wynikające z niniejszej Umowy ograniczonej licencji do dowolnego sądu i będzie rościć prawa do zwrotu wszelkich kosztów postępowań i kosztów sądowych, w tym wynagrodzeń prawników, związanych z egzekwowaniem postanowień Umowy ograniczonej licencji lub praw własności intelektualnej w zakresie zestawu i/lub jego elementów. Aktualne warunki licencyjne znajdują się w witrynie QIAGEN. Wszelkie prawa zastrzeżone.

58 Australia Orders Fax Technical Austria Orders Fax Technical Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) PL Sample & Assay Technologies