Anita Rywińska, Marta Utecht

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 14 (1) 2015, ISSN X (print) ISSN (on-line) DOSKONALENIE DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA DO BIOSYNTEZY ERYTRYTOLU ZA POMOCĄ MUTAGENIZACJI CHEMICZNEJ1 Anita Rywińska, Marta Utecht Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Streszczenie. W wyniku chemicznej mutagenizacji szczepu drożdży Yarrowia lipolytica Wratislavia K1 przy użyciu N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyny otrzymano 32 nowe szczepy. W testach płytkowych szczepy poddano selekcji w kierunku lepszego niż szczep wyjściowy wzrostu w niskim ph i przy wysokim stężeniu glicerolu oraz w kierunku słabszego wykorzystania erytrytolu jako źródła węgla. Wybrano 15 szczepów, których zdolność do produkcji erytrytolu zbadano w 7-dobowych hodowlach wytrząsanych. W podłożu zawierającym glicerol o czystości technicznej wszystkie szczepy produkowały erytrytol z wydajnością wyższą od szczepu wyjściowego, wynoszącą 0,22 0,25 g g -1. W hodowlach z glicerolem odpadowym wydajność produkcji erytrytolu wynosiła od 0,2 do 0,24 g g -1, natomiast w przypadku szczepu Wratislavia K1 0,25 g g -1. Podczas biosyntezy erytrytolu wszystkie szczepy tworzyły produkty uboczne mannitol i arabitol oraz kwas cytrynowy i α-ketoglutarowy, których udział w sumie tworzonych produktów wynosił od 41,8 do 32,8%. Analiza udziału produktów towarzyszących wskazała trzy szczepy: Wratislavia K1-b, Wratislavia K1-d i Wratislavia K1-g, potencjalnie przydatne do biosyntezy erytrytolu w hodowlach bioreaktorowych. Słowa kluczowe: Yarrowia lipolytica, glicerol, erytrytol, N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG) WSTĘP Erytrytol, występujący w nomenklaturze IUPAC jako (2R,3S)-butano-1,2,3,4-tetraol, jest alifatycznym, czterowęglowym alkoholem cukrowym należącym do grupy polioli [Cummings i Stephen 2007]. Nie wykazuje aktywności optycznej występuje wyłącznie w formie mezo, co związane jest z symetrycznością cząsteczki. Po raz pierwszy wyizolo- Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Anita Rywińska, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Wrocław, ul. J. Chełmońskiego 37/41, Anita.Rywinska@up.wroc.pl

2 18 A. Rywińska i M. Utecht wał go w 1852 roku Lamy z alg Apatococcus lobatus, a odkrytą wówczas substancję nazwał phycit [cyt. za O Donnell i Kearsley 2012]. Erytrytol od dawna funkcjonuje w diecie ludzkiej, powszechnie występuje w grzybach, niektórych owocach (gruszki, melony, winogrona, arbuzy, brzoskwinie) i w żywności fermentowanej (wino, sake, piwo, sosy sojowe, sery) [Moon i in. 2010, de Cock 1999, Shindou 1989]. W Stanach Zjednoczonych konsumpcja erytrytolu występującego naturalnie w żywności (głównie w serze i winie) na jednego mieszkańca jest szacowana na 80 mg na dzień lub około 1,3 mg na kg masy ciała na dzień [Bernt i in. 1996]. Oczyszczony za pomocą chromatografii jonowymiennej związek poddaje się krystalizacji, w wyniku której można uzyskać krystaliczny erytrytol o czystości przekraczającej 99,5% [O Brien-Nabors 2011]. Zarówno badania toksykologiczne na zwierzętach, jak i badania kliniczne jednoznacznie stwierdzają bezpieczeństwo spożywania erytrytolu [Moon i in. 2010]. Erytrytol jako jedyny poliol jest produkowany komercyjnie w procesie biotechnologicznym [O Donnell i Kearsley 2012]. Jego przemysłowa produkcja rozpoczęła się w roku 1990 w Japonii. Obecnie jest wytwarzany przez Bolak Corporation (Whasung, Kyungki-do, Korea), Cargill Food & Pharm Specialties (Blair, Nebraska, USA) i Mitsubishi Chemical Corporation (Tokyo, Japan) [Moon i in. 2010]. Źródłem węgla w procesie przemysłowym jest glukoza uzyskana w wyniku chemicznej lub enzymatycznej hydrolizy skrobi pszenicznej i kukurydzianej. Ze względów ekonomicznych używa się wyłącznie wyselekcjonowanych osmofilnych szczepów drożdży takich jak Torula sp. lub Moniliella pollinis [Jeya i in. 2009]. Nie zawsze wykorzystanie szczepów naturalnych (dzikich) zapewnia wystarczająco wysoką wydajność procesu produkcji. W celu zwiększenia aktywności metabolicznej szczepu prowadzi się prace nad optymalizacją warunków hodowli bądź modyfikacją genotypu. Dzięki modyfikacjom genetycznym ilość metabolitów wytwarzanych przez szczepy produkcyjne może przewyższać od kilku do kilkudziesięciu razy ich biomasę i od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy ich własne potrzeby. Metody biotechnologicznego doskonalenia szczepów mogą obejmować: selekcję fenotypową, hybrydyzację naturalną w procesach płciowych i paraseksualnych, hybrydyzację na drodze fuzji protoplastów, techniki inżynierii genetycznej oraz mutagenizację za pomocą promieniowania UV lub czynników chemicznych [Libudzisz i Kowal 2000]. Dostępna literatura dostarcza wielu przykładów z sukcesem przeprowadzonej mutagenizacji mikroorganizmów w celu poprawy ich właściwości produkcyjnych (tab. 1). Podobne badania były również prowadzone w celu zwiększenia produkcji erytrytolu [Lin i in. 2010]. Celem pracy było otrzymanie mutantów w szczepie drożdży Y. lipolytica Wratislavia K1 za pomocą mutagenizacji chemicznej przy wykorzystaniu N-metylo-N-nitro-N- -nitrozoguanidyny (MNNG) i ich selekcja pod kątem zwiększonej produkcji erytrytolu z glicerolu. MATERIAŁ I METODY Mikroorganizmy. Przedmiotem badań były 32 szczepy drożdży Yarrowia lipolytica uzyskane w wyniku mutagenizacji chemicznej szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1. Wszystkie badane w pracy szczepy przechowywano na skosach z podłożem YM (podłoże z ekstraktem drożdżowym i słodowym), w temperaturze 4 C, w kolekcji własnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Acta Sci. Pol.

3 Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica Tabela 1. Przykłady doskonalenia mikroorganizmów za pomocą promieniowania UV i mutagenizacji chemicznej Table 1. The examples of microorganisms improvement with the use of UV and chemical mutagenesis methods Mikroorganizm Microorganism Rhizopus oryzae Aspergillus sojae Aspergillus niger Rhodotorula acheniorum Kefir yeast Aspergillus oryzae Penicillium purpurogenum Aspergillus sp. Guehomyces pullulans Produkt Product Kwas fumarowy Fumaric acid Poligalakturonazy polygalacturonase Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa Glucose-6-phosphate dehydrogenase Β-karoten β-carotene Wydajność wzrostu w wysokiej temperaturze i przy wysokim stężeniu soli Cell yield at high temperatures and salt concentration Kwas glukonowy Gluconic acid Inulinaza Inulinase Enzymy pektynolityczne Pectinolytic enzymes β-galaktozydaza β-galactosidase Mutagen UV- MNNG UV- MNNG UV- MNNG UV, Ethymethanesurfonate (EMS), MNNG Poprawa wydajności Improvement of yield 21,1% 21.1% 2,4-krotna 2.4-fold 695,9% 695.9% 6,45-krotnie 6,45-fold MNNG 13% MNNG MNNG UV UV- MNNG MNNG 2,4-krotna 2.4-fold 2 3,5-krotna fold 5,8-krotna 5.8-fold 1,4-krotna 1.4-fold Źródło Source Fu i in. [2010] Fu et al. Heerd i in. [2014] Heerd et al. Liu i in. [2003] Liu et al. Nasrabadi i Razavi [2011] Nasrabadi and Razavi Petsas i in. [2002] Petsas et al. Raksha i in. [2012] Raksha et al. Sharma i in. [2005] Sharma et al. Sheykhinejad i in. [2008] Sheykhinejad et al. Xu i in. [2011] Xu et al. Procedura mutagenizacji. Procedurę mutagenizacji opracowano zgodnie z metodyką opisaną w pracy Tianwei i in. [2003]. Materiał komórkowy do procesu mutagenizacji pochodził ze zmywu z 48-godz. skosów. Biomasę standaryzowano w 1 M buforze fosforanowym (ph 6,0) do gęstości 10 7 kom cm -3, a następnie przenoszono do kolbek stożkowych o objętości 100 cm 3. Jako czynnik mutagenny stosowano N-metylo-N-nitro- -N-nitrozoguanidynę (MNNG) (rys. 1), a jej końcowe stężenie wynosiło: 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 0,7; 0,9; 1,5; 2,0 mg cm -3. Kolbki zawierające 10 cm 3 zawiesiny komórek wraz z czynnikiem mutagennym wytrząsano na wytrząsarce rotacyjnej przy 160 rpm, w 30 C przez 30 minut. Następnie do kolbek wprowadzono 90 cm 3 buforu fosforanowego i wykonano posiewy z kolejnych dziesiętnych rozcieńczeń na podłoże YM z glicerolem. Po 72 godz. inkubacji w 30 C policzono liczbę jednostek tworzących kolonie (j.t.k) w przeliczeniu na 1 ml zawiesiny drożdży i przedstawiono w formie krzywej przeżywalności (rys. 2). Właściwą mutagenizację przeprowadzono przy dawce MNNG równej 0,2 i 0,9 mg cm -3. Z hodowli płytkowych izolowano wszystkie kolonie, które oczyszczano do postaci czystej kultury i przechowywano na skosach YM w temperaturze 4 C. Biotechnologia 14 (1) 2015

4 20 A. Rywińska i M. Utecht Rys. 1. N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna, MNNG Fig. 1. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG YM 20Gly; ph 3,5 YM 20Gly; ph 3,5 YM 200Gly YM 200Gly YNB 100ER YNB 100ER Rys. 2. Schemat testów płytkowych Fig. 2. Scheme of Petri dishes tests Substrat. W badaniach wykorzystano glicerol o czystości kosmetycznej (98%) oraz glicerol odpadowy z produkcji biodiesla, o zawartości 873 g. dm -3 glicerolu i 43 g. dm -3 NaCl (Wratislavia-BIO, Wrocław). Podłoża. Do testów płytkowych wykorzystano podłoża oznaczone jako: YM 20Gly i ph 3,5; YM 200Gly i YNB 100ER. Odczyn podłoża YM 20Gly i ph 3,5 przed sterylizacją ustalono na 3,5, a jego komponenty to (g dm -3 ): glicerol (98%) 20,0; ekstrakt drożdżowy 3,0; ekstrakt maltozowy 3,0; bactopepon 5,0; agar 20,0; woda destylowana do 1 dm 3. W podłożu YM 200Gly stężenie glicerolu (98%) wynosiło 200 g dm -3, a jego odczyn przed sterylizacją ustalono na 4,5. Podłoże YNB 100ER zawierało (g dm -3 ): YNB (gotowe wyjściowe podłoże azotowe, Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich) 0,67; erytrytol 100; agar 20,0; woda destylowana do 1 dm 3, ph 4,5. Podłoże produkcyjne do hodowli wstrząsanych zawierało (g dm -3 ): glicerol (98%) 100,0; (NH 4 ) 2 SO 4 2,5; MgSO 4 x 7H 2 O 1,0; KH 2 PO 4 0,22; ekstrakt drożdżowy 1,0; CaCO 3 2,5; woda destylowana do 1 dm 3. Podłoża sterylizowano w 121 C przez 20 minut. Warunki prowadzenia hodowli Testy płytkowe. Wykonano serie pasaży według schematu zamieszczonego na rysunku 1, w których materiałem ze skosów szczepiono podłoża stałe na płytkach Petriego: YM 20Gly i ph 3,5; YM 200Gly i YNB 100ER. W ostatnim etapie za pomocą sterylnej Acta Sci. Pol.

5 Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica igły wykonano punktowy posiew na świeże podłoża. Zaszczepione płytki inkubowano przez 72 godz. w temperaturze 30 C. Średnicę kolonii mierzono za pomocą suwmiarki. Hodowle produkcyjne wytrząsane. Hodowle szczepiono materiałem komórkowym pochodzącym ze skosów. Hodowle prowadzono na wytrząsarce rotacyjnej w temperaturze 29,5 C, przy 140 rpm, w 0,3 dm 3 kolbach stożkowych zawierających 0,03 dm 3 podłoża produkcyjnego, przez 7 dni. Próby do analiz pobierano po zakończeniu hodowli. Metody analityczne Biomasę oznaczano metodą wagową. Stężenie glicerolu, erytrytolu, mannitolu, arabitolu, kwasu cytrynowego oraz kwasu α-ketoglutarowego oznaczano metodą HPLC na kolumnie HyperRez XP carbohydrate H + (Dionex, UltiMate 3000 Series) połączonej z detektorami UV (λ = 210 nm) i RI (detektor refraktometryczny), w temperaturze 65 C, przy szybkości przepływu fazy ciekłej (25 mm kwasu trifluorooctowego; TFA) równej 0,6 cm 3 min-1. WYNIKI I OMÓWIENIE W pierwszym etapie badań szczep drożdży Y. lipolytica Wratislavia K1 poddano chemicznej mutagenizacji za pomocą pochodnej nitrozomocznika, mocnego mutagenu N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyny (MNNG) (rys. 1). W niniejszej pracy stężenie MNNG wynosiło od 0,01 do 2,0 mg cm -3. Uzyskane wyniki przedstawiono w formie krzywej przeżywalności (rys. 3). Już najniższa zastosowana dawka MNNG (0,01 mg cm -3 ) powodowała znaczny stopień redukcji populacji, o około 64%. MNNG jest mocnym mutagenem, który działa szczególnie efektywnie podczas procesu replikacji DNA. Wynikiem mutagenezy są mutacje punktowe związane z metylacją guaniny w pozycji O 6, mogące prowadzić do dwuniciowego uszkodzenia DNA, śmierci komórki lub kontrolowanego procesu mutagenezy w określonym regionie genomu [Niknahad i O`Brien 1995, Margison i in. 2002]. Przy dawkach NTG w zakresie od 0,1 do 0,7 mg cm -3 pozostawało od 11,8 do 16,9% żywych komórek. W zakresie stężenia MNNG od 0,9 do 2,0 mg cm -3 przeżywała podobna ilość komórek, około 5%. Tianwei i in. [2003] podobną procedurę mutagenizacji, przy dawkach MNNG w zakresie 0,05 0,9 mg cm -3, zastosowali do zwiększenia aktywności lipazy wytwarzanej przez szczep Candida sp Przy najniższym stężeniu MNNG przeżywalność komórek wynosiła 53%, natomiast przy najwyższym zaledwie 0,02%, co oznacza, że drożdże te były bardziej wrażliwe na działanie zastosowanego czynnika niż szczep badany w niniejszej pracy. Jednocześnie autorzy stwierdzili największy procent niepożądanych mutacji, 66,6%, przy stężeniu mutagenu 0,05 mg cm -3, natomiast najwięcej pożądanych mutacji, 85%, przy stosunkowo niskiej przeżywalności (0,05%), przy 0,5 mg cm -3. Ta sama dawka w badaniach własnych gwarantowała 8-krotnie wyższą przeżywalność. Mutagenizację z udziałem MNNG przeprowadzili również Finogenova i in. [2008] w celu ulepszenia zdolności drożdży Y. lipolytica do produkcji kwasu cytrynowego z glicerolu. W tych badaniach maksymalne stężenie MNNG wynosiło 0,1 mg cm -3. W zakresie stężenia tego związku od 0,05 do 0,1 mg cm -3 przeżywalność drożdży utrzymywała się na stałym poziomie wynoszącym około 25%. W badaniach własnych podobną przeżywalność, około 16%, uzyskano przy dawkach MNNG 0,1 0,2 mg cm -3. Biotechnologia 14 (1) 2015

6 22 A. Rywińska i M. Utecht W wyniku właściwej mutagenizacji, do której wybrano dawki MNNG 0,2 i 0,9 mg cm -3 dające przeżywalność komórek odpowiednio 16,9 i 5%, otrzymano 32 szczepy. Procent przeżywających komórek [%] Percentage of survived cells 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 36,2 32,1 16,9 16,4 14,1 11,8 5,0 4,7 4,5 0,01 0, MNNG [mg cm -3 ] Rys. 3. Krzywa przeżywalności szczepu Yarrowia lipolytica Wratislavia K1 po działaniu różnych dawek MNNG Fig. 3. Survival curve of Yarrowia lipolytica Wratislavia K1strain treated with different doses of MNNG Kolejnym etapem badań były testy płytkowe na podłożach: YM o ph 3,5 z 2% glicerolu (YM 20Gly i ph 3,5), YM z wysokim stężeniem glicerolu (200 g dm -3 ) (YM 200Gly) oraz na podłożu minimalnym YNB z erytrytolem jako źródłem węgla w stężeniu 100 g dm -3 (YNB 100ER). Wybór takich podłoży selekcyjnych został podyktowany dotychczasowymi wynikami badań, które wskazują, że kluczowymi czynnikami odpowiedzialnym za nadprodukcję erytrytolu z glicerolu przez drożdże Y. lipolytica są niskie ph oraz podwyższone ciśnienie osmotyczne środowiska hodowlanego [Rywińska i in. 2015, Tomaszewska i in. 2012]. Wcześniejsze badania wykazały również, że szczep Wratislavia K1 nie utylizuje erytrytolu jako źródła węgla, co okazało się niezwykle korzystne w procesach hodowlanych. Po wyczerpaniu podstawowego źródła węgla drożdże wykorzystują produkty uboczne, natomiast nie zużywają erytrytolu, co pozwala na znaczną poprawę selektywności procesu produkcji [Tomaszewska i in. 2014]. W wyniku mutagenizacji drożdży Monileilla sp. 440 przeprowadzonej za pomocą MNNG otrzymano 6 mutantów wykazujących wyższą produkcję erytrytolu od szczepu dzikiego. Interesujący jest fakt, że najbardziej efektywny producent asymilował inozytol i słabo erytrytol, natomiast szczep dziki nie asymilował inozytolu, za to dobrze wykorzystywał erytrytol jako źródło węgla [Lin i in. 2010]. Dlatego w niniejszej pracy celem testów płytkowych było wyselekcjonowanie szczepów zdolnych do wzrostu w niskim ph, przy wysokim stężeniu glicerolu oraz niewykorzystujących erytrytolu, czyli szczepów tworzących duże kolonie na podłożach YM oraz jak najmniejsze na podłożu YNB. Kontrolę stanowił szczep Wratislavia K1, który tworzył kolonie o średnicy 3,201, 4,13 i 1,38 mm, odpowiednio na podłożu: YM 200Gly, YM 20Gly i ph 3,5 oraz YNB 100ER. Średnice kolonii wraz z wynikami analiz statystycznych przedstawiono w tabelach 2 4. Nowo otrzymane szczepy dobrze rosły na podłożu z wysokim stężeniem glicerolu (tab. 2). Tylko dwa spośród nich tworzyły mniejsze kolonie od średnicy kolonii szczepu Wratislavia K1. Na podstawie sta- Acta Sci. Pol.

7 Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica tystycznego opracowania wyników wzrostu drożdży dży na tym podłożu otrzymano 3 grupy jednorodne. W trzeciej z nich występował szczep Wratislavia K1-a tworzący kolonie o największej średnicy, 7,39 mm. Na podłożu YM 20Gly i ph 3,5 aż ż 24 szczepy osiągnęły średnicę kolonii większą od szczepu wyjściowego Wratislavia K1 (tab. 3). Średnica kolonii pozostałych 8 szczepów wynosiła mniej niż 4,13 mm. Na podstawie analizy statystycznej otrzymano aż siedem grup jednorodnych. W siódmej grupie znalazł się szczep Wratislavia K1-e tworzący kolonie o największej średnicy, 5,10 mm. Na podłożu minimalnym z erytrytolem jako źródłem węgla (YNB-100ER) 18 szczepów wykazywało słabszy wzrost niż szczep wyjściowy, tworząc kolonie o średnicy mniejszej niż 1,38 mm (tab. 4). Na podstawie analizy statystycznej otrzymano osiem grup jednorodnych. Szczep Wratislavia K1-rr, który znalazł się ę w pierwszej grupie, nie wykazywał wzrostu na podłożu YNB z erytrytolem, natomiast kolonie o największej średnicy, 2 mm, zanotowano w przypadku szczepów Wratislavia K1-g i Wratislavia K1-gg. Na podstawie analizy statystycznej testów płytkowych do dalszych badań wybrano 15 szczepów (tab. 5). Wszystkie wybrane szczepy tworzyły większe kolonie niż szczep wyjściowy na podłożu z wysokim stężeniem glicerolu (YM 200Gly), jednak trzy spośród nich tworzyły mniejsze kolonie na podłożu kwaśnym (YM 20Gly i ph 3,5). Dwa szczepy wykazywały lepszy wzrost na podłożu z erytrytolem jako źródłem węgla niż szczep Wratislavia K1. W kolejnym etapie badań wyselekcjonowane szczepy testowano pod kątem produkcji erytrytolu w 7-dobowych hodowlach wytrząsanych w podłożu zawierającym glicerol o czystości technicznej (kosmetyczny) oraz w podłożu z glicerolem odpadowym, pochodzącym z produkcji biodiesla. Na rysunku 4 przedstawiono wydajność produkcji erytrytolu w przypadku wybranych szczepów. Badane szczepy produkowały erytrytol z glicerolu czystego z podobną wydajnością wynoszącą 0,22 0,25 g g -1. Interesujący jest natomiast fakt, że szczep wyjściowy w przypadku tego substratu produkował erytrytol z wydajnością niższą, 0,20 g g -1. Nieco bardziej zróżnicowane wartości tego parametru uzyskano w hodowlach, w których stosowano glicerol odpadowy. Uzyskane szczepy produkowały erytrytol z wydajnością w zakresie od 0,20 do 0,24 g g -1, podczas gdy szczep Wratislavia K1 z wydajnością równą 0,25 g g -1. Otrzymane wyniki, pomimo braku statystycznie istotnych różnic, mogą sugerować większą wrażliwość nowo otrzymanych szczepów na zanieczyszczenia obecne w substracie odpadowym, w porównaniu ze szczepem wyjściowym. Ponieważ nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy szczepami, o dalszym wyborze szczepów zdecydował udział produktów ubocznych tworzonych podczas biosyntezy erytrytolu (rys. 5). Duża ilość produktów towarzyszących może znacznie zwiększyć koszty uzyskania finalnego produktu. Wszystkie szczepy oprócz erytrytolu produkowały również mannitol, arabitol, kwas cytrynowy i kwas α-ketoglutarowy. Stężenie mannitolu wynosiło od 6,7 do 8,7 g dm -3, a arabitolu nie przekroczyło 3,9 g dm -3. Badane szczepy tworzyły nieco więcej kwasu cytrynowego niż α-ketoglutarowego, a stężenie tych kwasów nie przekroczyło odpowiednio 3,8 i 2,7 g dm -3. Udział erytrytolu w puli tworzonych produktów wynosił od 59,2% w przypadku szczepu Wratislavia K1-pp do 67,2% w szczepie Wratislavia K1-d. W hodowlach szczepu wyjściowego Wratislavia K1 udział erytrytolu był zdecydowanie wyższy w przypadku glicerolu odpadowego (68,2%) niż czystego substratu (57,9%). W efekcie analizy udziału innych polioli oraz kwasów organicznych za najlepsze uznano trzy szczepy Wratislavia K1-b, Wratislavia K1-d oraz Wratislavia K1-g. Biotechnologia 14 (1) 2015

8 24 A. Rywińska i M. Utecht Tabela 2. Analiza statystyczna średnicy kolonii segregantów szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1, uzyskanych w wyniku mutagenizacji chemicznej za pomocą MNNG rosnących na podłożu YM 200Gly Table 2. Statistical analysis of the diameter of colony surface of Y. lipolytica Wratislavia K1 segregants obtained through chemical mutagenesis using MNNG growing on YM 200Gly medium Lp. No. Szczep Strain Średnica kolonii na podłożu YM 200Gly [mm] Diameter of the colony on the medium YM 200Gly 1. Wratislavia K1-pp 2,89 2. Wratislavia K1-mm 3,00 3. Wratislavia K1 3,20 4. Wratislavia K1-dd 3,20 5 Wratislavia K1-nn 3,24 6. Wratislavia K1-o 3,26 7. Wratislavia K1-oo 3,31 8. Wratislavia K1-j 3,38 9. Wratislavia K1-ee 3, Wratislavia K1-aa 3, Wratislavia K1-hh 3, Wratislavia K1-ii 3, Wratislavia K1-k 3, Wratislavia K1-ss 3, Wratislavia K1-i 3, Wratislavia K1-h 3, Wratislavia K1-g 3, Wratislavia K1-e 3, Wratislavia K1-l 3, Wratislavia K1-m 3, Wratislavia K1-ll 3, Wratislavia K1-n 3, Wratislavia K1-rr 3, Wratislavia K1-kk 3, Wratislavia K1-gg 4, Wratislavia K1-cc 4, Wratislavia K1-bb 4, Wratislavia K1-d 4, Wratislavia K1-jj 4, Wratislavia K1-f 4, Wratislavia K1-c 4, Wratislavia K1-b 5, Wratislavia K1-a 7,39 Analiza wariancji test Duncana; α = 0,05 Variance analysis Duncan s test; α = 0.05 Grupy jednorodne Homogenous groups Acta Sci. Pol.

9 Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica Tabela 3. Analiza statystyczna średnicy kolonii segregantów szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1, uzyskanych w wyniku mutagenizacji chemicznej za pomocą MNNG rosnących na podłożu YM 20Gly i ph 3,5 Table 3. Statistical analysis of the diameter of colony surface of Y. lipolytica Wratislavia K1 se gregants, obtained through chemical mutagenesis using MNNG growing on YM 20Gly and ph 3,5 medium Lp. No. Szczep Strain Średnica kolonii na podłożu YM -20Gly i ph 3,5 [mm] Diameter of the colony on the medium YM -20Gly and ph 3,5 1. Wratislavia K1-ss 3,41 2. Wratislavia K1-i 3,66 3. Wratislavia K1-rr 3,67 4. Wratislavia K1-ii 3,69 5. Wratislavia K1-cc 3,84 6. Wratislavia K1-hh 3,84 7. Wratislavia K1-c 3,87 8. Wratislavia K1-ee 3,88 9. Wratislavia K1 3, Wratislavia K1-h 3, Wratislavia K1-ll 3, Wratislavia K1-kk 3, Wratislavia K1-k 3, Wratislavia K1-pp 3, Wratislavia K1-dd 4, Wratislavia K1-bb 4, Wratislavia K1-oo 4, Wratislavia K1-nn 4, Wratislavia K1-mm 4, Wratislavia K1-jj 4, Wratislavia K1-f 4, Wratislavia K1-j 4, Wratislavia K1-d 4, Wratislavia K1-g 4, Wratislavia K1-l 4, Wratislavia K1-m 4, Wratislavia K1-b 4, Wratislavia K1-gg 4, Wratislavia K1-n 4, Wratislavia K1-o 4, Wratislavia K1-aa 4, Wratislavia K1-a 4, Wratislavia K1-e 5,10 Analiza wariancji test Duncana; α = 0,05 Variance analysis Duncan s test; α = 0.05 Grupy jednorodne Homogenous groups Biotechnologia 14 (1) 2015

10 26 A. Rywińska i M. Utecht Tabela 4. Analiza statystyczna średnicy kolonii segregantów szczepu Y. lipolytica Wratislavia K1, uzyskanych w wyniku mutagenizacji chemicznej za pomocą MNNG rosnących na podłożu YNB 100ER Table 4. Statistical analysis of the diameter of colony surface of Y. lipolytica Wratislavia K1 segregants, obtained through chemical mutagenesis using MNNG growing on YNB 100ER medium Lp. No. Szczep Strain Średnica kolonii na podłożu YNB -100ER [mm] Diameter of the colony on the medium YNB -100ER 1. Wratislavia K1-rr 0,00 2. Wratislavia K1-bb 0,53 3. Wratislavia K1-a 0,65 4. Wratislavia K1-h 0,87 5. Wratislavia K1-pp 0,89 6. Wratislavia K1-n 0,90 7. Wratislavia K1-ss 0,94 8. Wratislavia K1-c 0,99 9. Wratislavia K1-ii 1, Wratislavia K1-mm 1, Wratislavia K1-nn 1, Wratislavia K1-ee 1, Wratislavia K1-e 1, Wratislavia K1-b 1, Wratislavia K1-j 1, Wratislavia K1-dd 1, Wratislavia K1-cc 1, Wratislavia K1-oo 1, Wratislavia K1-l 1, Wratislavia K1-i 1, Wratislavia K1 1, Wratislavia K1-kk 1, Wratislavia K1-k 1, Wratislavia K1-f 1, Wratislavia K1-o 1, Wratislavia K1-aa 1, Wratislavia K1-m 1, Wratislavia K1-d 1, Wratislavia K1-hh 1, Wratislavia K1-jj 1, Wratislavia K1-ll 1, Wratislavia K1-gg 1, Wratislavia K1-g 2,00 Analiza wariancji test Duncana; α = 0,05 Variance analysis Duncan s test; α = 0.05 Grupy jednorodne Homogenous groups Acta Sci. Pol.

11 Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica Tabela 5. Zestawienie wyników hodowli na podłożach selekcyjnych dla wybranych szczepów drożdży Table 5. The summary of the obtained cultures results on the selective media for strains selected Lp. No. Szczep Strain YM 200Gly Ø; Średnice kolonii [mm] Ø; Diameter of the colony YM 20Gly i ph 3,5 YM 20Gly and ph 3,5 YNB 100ER Wratislavia K1 3,20 3,87 1,38 1. Wratislavia K1-a 7,39 4,53 0,65 2. Wratislavia K1-b 5,10 4,35 1,13 3. Wratislavia K1-c 4,47 3,87 0,99 4. Wratislavia K1-d 4,30 4,23 1,44 5. Wratislavia K1-e 3,71 5,10 1,12 6. Wratislavia K1-g 3,69 4,27 2,00 7. Wratislavia K1-h 3,67 3,93 0,87 8. Wratislavia K1-j 3,37 4,23 1,21 9. Wratislavia K1-l 3,76 4,35 1, Wratislavia K1-n 3,90 4,36 0, Wratislavia K1-o 3,26 4,49 1, Wratislavia K1-bb 4,18 4,06 0, Wratislavia K1-pp 3,98 2,89 0, Wratislavia K1-rr 3,94 3,67 0, Wratislavia K1-ss 3,59 3,41 0,94 Glicerol 87,3% Glycerol Glicerol 98% Glycerol Wydajność produkcji erytrytolu [Y g g-1] Erythritol production yield Szczep Strain Rys. 4. Wydajność produkcji erytrytolu z glicerolu czystego i odpadowego przez szczepy drożdży Y. lipolytica uzyskane w wyniku mutagenizacji za pomocą MNNG Fig. 4. Yield of erythritol production from pure and crude glycerol by Y. lipolytica strains obtained through chemical mutagenesis using MNNG Biotechnologia 14 (1) 2015

12 28 A. Rywińska i M. Utecht Erytrytol Erythritol Mannitol Kwas cytrynowy Citric acid Kwas alfa-ketoglutarowy Alpha-ketoglutaric acid Arabitol Glicerol odpadowy Crude glycerol ss rr pp bb o n l j h g e d c b a Wratislavia K1 ss rr pp bb o n l j h g e d c b a Wratislavia K1 Glicerol czysty Pure glycerol 0% 20% 40% 60% 80% 100% Selektywność [%] Selelctivity Rys. 5. Procentowy udział produktów podczas biosyntezy erytrytolu z glicerolu czystego i odpadowego przez szczepy drożdży Y. lipolytica uzyskane w wyniku mutagenizacji za pomocą MNNG Fig. 5. Percentage share of products during erythritol biosynthesis from pure and crude glycerol by Y. lipolytica strains obtained through chemical mutagenesis using MNNG Acta Sci. Pol.

13 Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica PODSUMOWANIE W niniejszej pracy po razy pierwszy wykorzystano mutagenizację chemiczną za pomocą MNNG w celu poprawy zdolności drożdży Y. lipolytica do produkcji erytrytolu z glicerolu. W wyniku mutagenizacji przeprowadzonej w szczepie Wratislavia K1 uzyskano 32 nowe szczepy. Za pomocą testów płytkowych, w których oceniano zdolność do wzrostu w niskim ph, przy wysokim stężeniu glicerolu oraz zdolność do utylizacji erytrytolu, wyselekcjonowano 15 szczepów. Wybrane szczepy zbadano pod kątem produkcji erytrytolu z glicerolu o czystości technicznej i odpadowej w hodowlach wytrząsanych. Na podstawie oceny zarówno parametrów procesu biosyntezy erytrytolu, jak i selektywności tej produkcji wskazano 3 szczepy o poprawionych, w stosunku do szczepu wyjściowego, cechach produkcyjnych. Dalszy ciąg badań będzie obejmował charakterystykę procesu biosyntezy erytrytolu przez wskazane szczepy w hodowlach bioreaktorowych. Podziękowania. Badania realizowano w ramach projektu nr POIG /09; Biotechnologiczna konwersja glicerolu do polioli i kwasów dikarboksylowych oraz w ramach grantu N N Metabolizm glicerolu do erytrytolu w komórkach drożdży Yarrowia lipolytica. PIŚMIENNICTWO Bernt W., Borzelleca J., Flamm G., Munro I., Erythritol: a review of biological and toxicological studies. Reg. Toxic. Pharmacol., 24, 191. Cummings J.H., Stephen A.M., Carbohydrate terminology and classification. Eur. J. Clin. Nutr., 61, de Cock P., Erythritol: a novel noncaloric sweetener ingredient. Corti A (ed.): Low-Calorie Sweeteners: Present and Future. World Rev Nutr Diet. Basel, Karger. 85, Finogenova T.V., Puntus I.F., Kamzolova S.V., Lunina Yu.N., Monastyrskaya S.E., Morgunov I.G., Boronin A.M., Mutant Yarrowia lipolytica strains producing citric acid from glucose. Appl. Biochem. Microbiol., 44 (2), Fu Y.-Q., Xu Q., Li S., Chen Y., Huang H., Strain improvement of Rhizopus oryzae for overproduction of fumaric acid by reducing ethanol synthesis pathway. Korean J. Chem. Eng., 27 (1), Heerd D., Tari C. Fernández-Lahore M., Microbial strain improvement for enhanced polygalacturonase production by Aspergillus sojae. Appl. Microbiol. Biotechnol., 98, Libudzisz Z., Kowal K., 2000, Mikrobiologia techniczna, Wyd. Politechnika Łódź Lin S.J., Wen C.J., Wang P.M., Huang J.C., Wei C.L., Chang J.W., Chu W.S., High-level production of erythritol by mutants of osmophilic Moniliella sp. Proc. Biochem. 45 (6), Liu J.-Z., Zhang Q.-L., Weng L.-P., Ji L.-N., Screening and mutagenesis of Aspergillus niger for the improvement of glucose-6-phosphate dehydrogenase production. Appl. Biochem. Microbiol., 39, 5, Margison G., A new damage limitation exercise: ironing (Fe(II)) out minor DNA methylation lesions. DNA Repair Moon H.J., Jeya M., Kim I.W., Lee J.K., Biotechnological production of erythritol and its applications. Appl. Microbiol. and Biotechnol., 86, Nasrabadi M.,N., Razavi S.,H Optimization of β-carotene production by a mutant of the lactosepositive yeast Rhodotorula acheniorum from whey ultrafiltrate. Food Sci. Biotechnol. 20, 2, Biotechnologia 14 (1) 2015

14 30 A. Rywińska i M. Utecht Niknahad H.I., O`Brien P.J., Cytotoxicity induced by N-methyl-N`-nitro-Nnitrosoguanidine may involve S-nitrosyl glutathione and nitric oxide. Xenobiotica 25, O Brien-Nabors L., Alternative Sweeteners, fourth edition. CRC Press, O Donnell K., Kearsley M., Sweeteners and sugar alternatives in food technology, second edition. Wiley-Blackwell, Petsas I., Psarianos K., Bekatorou A., Koutinas A.A., Banat I.M., Marchant R., Improvement of Kefir yeast by mutation with N-methyl-N-nitrosoguanidine. Biotechnol. Lett. 24, Raksha S., Srinivasan S., Prasant G., Prabu R., Over-expression of gluconic acid in Aspergillus oryzae RP-21 mutants generated by a random mutagenesis approach. 3 Biotech. 2, Rywińska A., Marcinkiewicz M., Cibis E., Rymowicz W., Optimization of medium composition for erythritol production from glycerol by Yarrowia lipolytica using response surface methodology. Prep. Biochem. Biotechnol. 45, 6, Sharma A.D., Gill P.K., Bhullar S.S., Singh P Improvement in inulinase production by simultaneous action of physical and chemical mutagenesis in Penicillium purpurogenum. World J. Microbiol. Biotechnol., 21, Sheykhinejad A., Heydarian M., Hormozi F., Strain improvement of Aspergillus sp. for pectinolytic enzymes production. Abstracts / J. Biotechnol. 136S, S290 S344. Shindou T., Sasaki Y., Eguchi T., Euguchi T., Hagiwara K., Ichikawa T., Identification of erythritol by HPLC and GC-MS and quantitative measurement in pulps of various fruits. J. Agric. Food Chem., 37 (6), Tianwei T., Mu Z., Bingwu W., Chunhua Y., Li D., Screening of high lipase producing Candida sp. and production of lipase by fermentation. Proc. Biochem., 39, Tomaszewska L., Rywińska A., Gładkowski W., Production of erythritol and mannitol by Yarrowia lipolytica yeast in media containing glycerol. J. Ind.Microbiol Biotechnol. 39 (9), Tomaszewska L., Rywińska A., Rymowicz W., High selectivity of erythritol production from glycerol by Yarrowia lipolytica. Biomass Bioenerg., 64, Xu J.-L., Zhao J., Wang L.-F., Sun H.-Y., Song Ch.-L., Chi Z.-M., Enhanced β-galactosidase production from whey powder by a mutant of the psychrotolerant yeast Guehomyces pullulans 17 1 for hydrolysis of lactose. Appl. Biochem. Biotechnol., 166, Acta Sci. Pol.

15 Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica IMPROVEMENT OF YARROWIA LIPOLYTICA YEAST FOR ERYTHRITOL BIOSYNTHESIS USING CHEMICAL MUTAGENESIS Abstract. Thirty-two strains were obtained in Wratislavia K1 strain of Yarrowia lipolytica through chemical mutagenesis using N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine. In Petri-dishes test strains were examined towards better growth in conditions of low ph and high concentration of glycerol and towards poorer use of erythritol as carbon source in comparison to parental strain. Fifteen strains were selected and tested for their ability to produce erytrhtiol in 7-days shake-flasks experiment. In the medium containing pure glycerol all the strains under investigation produced erythritol with the yield of g g -1, hence higher than parental strain. The yield of erythritol production from crude glycerol by mutant strains was in the range of g g -1, and 0.25 g g -1 by Wratislavia K1. During erythritol biosynthesis all the examined strains formed by-products mannitol, arabitol, citric and α-ketoglutaric acids and their share in the total products ranged from 41.8 to 32.8%. Analysis of by-products indicated three strains, Wratislavia K1-b, Wratislavia K1-d i Wratislavia K1-g, as potentially useful for erythritol biosynthesis in bioreactor cultures. Key words: Yarrowia lipolytica, glycerol, erythritol, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) Zaakceptowano do druku Accepted for print: Do cytowania For citation: Rywińska A., Utecht M., Doskonalenie drożdży Yarrowia lipolytica do biosyntezy erytrytolu za pomocą mutagenizacji chemicznej, Acta Sci. Pol. Biotechnol., 14 (1), Biotechnologia 14 (1) 2015