BIOTECHNOLOGIA OGÓLNA

Transkrypt

1 BIOTECHNOLOGIA OGÓLNA 1. Wprowadzenie do biotechnologii. Rys historyczny. Zakres i znaczenie nowoczesnej biotechnologii. Opracowanie procesu biotechnologicznego. 7. Produkcja biomasy. Białko mikrobiologiczne Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych. Pozyskiwanie drobnoustrojów. Ulepszanie szczepów na drodze mutagenizacji. Metody selekcji szczepów. Podstawy hybrydyzacji drobnoustrojów. Technologia rekombinacji DNA. Przechowywanie szczepów Biotechnologia w przemyśle spożywczym. Produkcja probiotyków. Produkcja kwasu mlekowego. Nadprodukcja wybranych produktów metabolizmu. Biosynteza i nadprodukcja aminokwasów. Produkcja kwasów organicznych. Fermentacja etanolowa Warunki prowadzenia bioprocesów. Sposoby prowadzenia procesów mikrobiologicznych. Biokatalizatory. Bioreaktory. Charakterystyka drobnoustrojów przemysłowych. Wymagania pokarmowe. Degradacja związków wielkocząsteczkowych. Centralne przemiany metaboliczne. Wzrost drobnoustrojów przemysłowych Biotechnologia w przemyśle farmaceutycznym. Biotechnologia antybiotyków. Produkcja szczepionek. Insulina. Leki nowej generacji. Procesy biotransformacji. Biotransformacja związków steroidowych. Biotransformacja antybiotyków. Bioługowanie metali. Literatura 1

2 Przy wyborze mikroorganizmu dla danego procesu technologicznego uwzględniane są następujące kryteria: 1. Charakterystyka odżywiania mikroorganizmu. Często wymagane jest aby w procesie technologicznym mogły być stosowane tanie media. W niektórych przypadkach substrat jest z góry określony (np. metanol, serwatka). 2. Optimum temperatury. Wykorzystanie mikroorganizmów, dla których optymalna temperatura jest wyższa niż 40 C redukuje koszty chłodzenia w aparatach przemysłowych. Im wyższa dopuszczalna temperatura wewnątrz reaktora, tym większa różnica temperatur między medium i czynnikiem chłodzącym, co umożliwia zmniejszenie ilości czynnika chłodzącego.* Ponadto prowadzenie hodowli drobnoustrojów w podwyższonych temperaturach zmniejsza ryzyko zakażenia organizmami szkodliwymi. 3. Zdolność mikroorganizmu do wzrostu w aparaturze przemysłowej, odporność na typ procesu i stosowane materiały. 4. Stabilność cech drobnoustrojów i odporność na manipulacje genetyczne. 5. Produkcyjność, tzn. zdolność przetwarzania substratu w produkt z wysoką wydajnością, liczona w jednostce czasu. 6. Łatwość wydzielenia produktu z medium pofermentacyjnego. 7. Brak toksycznych produktów metabolizmu. Ponadto, należy uwzględniać takie cechy mikroorganizmów, które ułatwiają prowadzenie procesów technologicznych. Należą do nich: 1. odporność na infekcje, 2. własności niepieniące mediów hodowlanych, 3. odporność na niektóre składniki substratu pochodzenia naturalnego, 4. odporność na niskie stężenie rozpuszczonego tlenu (dla mikroorganizmów aerobowych). 2

3 Pozyskanie drobnoustrojów ze środowiska Wyróżniamy cztery zasadnicze etapy: 1.Wybór miejsca i pobranie próbek 2.Wstępna obróbka próbek 3.Namnażanie drobnoustrojów i selekcja czystych kultur 4.Testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do wytwarzania określonych produktów W celu zwiększenia koncentracji interesujących nas mikroorganizmów stosuje się: 1.Oddziaływanie na środowisko przed pobraniem próby 2.Wprowadzenie do środowiska wabików 3.Wstępną obróbkę fizyczną lub mechaniczną próby 4.Hodowlę wzbogacającą 3

4 Izolacja szczepów przemysłowych W Polsce istnieje wiele kolekcji czystych kultur, o różnym zakresie i wielkości. Do najważniejszych z punktu widzenia technologii biochemicznej, należą: kolekcja Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno- Spożywczego w Warszawie, kolekcja Wydziału Chemii i Technologii Żywności Politechniki Łódzkiej oraz kolekcja Akademii Techniczno-Ekonomicznej we Wrocławiu. Te trzy kolekcje są zarejestrowane w Światowej Federacji Kolekcji Kultur (WFCC). 4

5 5

6 Podstawową metodą izolacji czystych kultur jest metoda rozcieńczenia ich populacji: w roztworze NaCl w roztworze Ringera w odpowiednim podłożu Inne metody izolacji: środki chemiczne detergenty środki fizyczne flotacja, filtracja, sedymentacja, wirowanie 6

7 metoda posiewu powierzchniowego 7

8 posiew redukcyjny 8

9 Drobnoustroje pozyskane ze środowiska naturalnego prowadzą procesy biosyntezy lub biotransformacji z wydajnością nie wystarczającą zazwyczaj do opracowania ekonomicznego procesu technologicznego Zwiększenie aktywności metabolicznej i podwyższenie wydajności danego szczepu jest możliwe tylko w granicach określonych genotypem. Metody ulepszania drobnoustrojów KLASYCZNE: 1. Mutacja 2. Selekcja 3. Adaptacja 4. Hybrydyzacja naturalna 5. Fuzja protoplastów NOWOCZESNE: 1. Technologia rekombinacji DNA 9

10 Mutacja nagłe, skokowe zmiany materiału genetycznego, możliwe dziedziczenie mutant osobnik o zmienionym genotypie mutageneza proces prowadzący do jego powstania Mutacje za względu na charakter powstania mutacje spontaniczne ( ) indukowane (czynniki mutagenne) 10

11 Mutacje za względu na wielkość zmian zachodzących z DNA 11

12 Mutacje za względu na powstałą zmianę mutacje substytucja insercja delecja tranzycja transwersja 12

13 G Delecja A G G T A A C A G T C A T A G T A T A C A G G T A A C A T C A T A G T A T A C 13

14 Insercja A G G G T A A C A G T C A T A G T A T A C A G G T A A C A G G T C A T A G T A T A C 14

15 Substytucja - tranzycja A C G T G C A T G C T A A C A G T C A T A A T A T A C A T T G T C A G T A T T A T A T G A C G T G C T A G C A G C C A C A G T A T A C A T T G T C A G T A T T A T A T G 15

16 Substytucja - transwersja A C G T G C A T T G T A A C A G T C A T A A T A T A C A T T G T C A G T A T T A T A T G A C G T G C T A T C A G C C A G A G T A T A C A T T G T C A G T A T T A T A T G 16

17 Czynniki mutagenne czynniki biologiczne czynniki chemiczne czynniki fizyczne 17

18 18

19 Zalety promieniowania UV 19

20 Fotoreaktywacja 28

21 Naprawa DNA 29

22 Etapy procesu mutagenizacji 1. Penetracja mutagenu do komórki 2. Jego oddziaływanie na DNA, w wyniku czego zachodzą niestabilne zmiany pierwotne 3. Naprawa uszkodzeń pierwotnych z możliwością zajścia trwałych zmian wtórnych w strukturze DNA 4. Stabilizacja mutacji, powodująca utrzymywanie się uszkodzeń DNA w kolejnych pokoleniach komórek 5. Zmiany biochemiczne w komórce i fenotypowe ujawnienie się mutacji 30

23 Kierunki i zmiany genotypu w wyniku mutagenezy 31

24 32

25 Metoda penicylinowa 36

26 Hybrydyzacja Hybrydyzacja naturalna Hybrydyzacja somatyczna 1. Fuzja protoplastów komórki całkowicie pozbawione ściany komórkowej 2. Fuzja sferoplastów komórki częściowo pozbawione ściany komórkowej 37

27 Hybrydyzacja naturalna przekazanie informacji genetycznej z komórek dawcy do komórek biorcy w wyniku fizycznego kontaktu obu komórek polega na wymianie homologicznych fragmentów DNA między chromosomami dawcy i biorcy w wyniku rozdzielenia materiału genetycznego w komórkach potomnych otrzymuje się hybrydy o zmienionym genotypie warunkiem koniecznym jest bliskie pokrewieństwo filogenetyczne organizmów naturalna hybrydyzacja zachodzi bardzo rzadko!!! Podstawowa przeszkoda: ściana komórkowa ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej 38

28 Fuzja protoplastów (1972 r.) polega na połączeniu dwóch komórek różnych szczepów mikroorganizmów, całkowicie lub częściowo pozbawionych ściany komórkowej duża częstotliwość rekombinacji (10-20% komórek) rekombinacja pomiędzy szczepami o tym samym typie płciowym rekombinacja międzygatunkowa możliwość wymiany dużych fragmentów DNA każda z hybrydyzujących komórek może pełnić rolę dawcy i biorcy możliwość fuzji protoplastów z liposomami zawierającymi obcy materiał genetyczny 39

29 Przygotowanie protoplastów enzymatyczna hydroliza ściany komórkowej bakterie G+ i promieniowce - lizozym grzyby sok żołądkowy ślimaka Helix pomatia wymaga środowiska hipertonicznego 0,8-1,2M sorbitol 0,6M KCl stosowanie czynników zwiększających efektywność procesu 30% glikol polietylenowy jony wapnia 40

30 41

31 Fuzja protoplastów Najczęściej stosowana metoda do dalszego ulepszania szczepów pochodzących z różnych linii mutacyjnych zwiększenie wydajności produkcji zmiana wymagań pokarmowych ograniczenie wytwarzania produktów ubocznych zwiększenie szybkości wzrostu zmiana przyswajalności różnych substratów zwiększenie oporności na substancje toksyczne zwiększenie oporności na bakteriofagi 42

32 Koniugacja proces transferu genów polegający na bezpośrednim przekazywaniu DNA z komórek dawcy do komórek biorcy wskutek ich bezpośredniego kontaktu za pośrednictwem pilusów (mostków cytoplazmatycznych) Transformacja przekazywanie cech genetycznych komórkom biorcy, z pominięciem łączenia w pary, poprzez DNA uwolniony do środowiska z komórek dawcy. Transdukcja proces wprowadzenia nowego genu do komórki poprzez tzw. fagi łagodne 43

33 Schemat trzech głównych mechanizmów wymiany informacji genetycznej między bakteriami. Dany gen jest przenoszony z komórki dawcy do biorcy przez: a) transformację wyizolowanego DNA; b) transdukcję za pośrednictwem wektora bakteriofaga; c) koniugację, czyli rekombinację płciową polegającą na połączeniu dwóch komórek bakteryjnych 44

34 Koniugacja 45

35 Transformacja 46

36 Transformacja 47

37 Transdukcja 48

38 Zarys technologii rekombinacji DNA 49

39 Zamrażanie drobnoustrojów Czynniki ochronne: zawierające białka: mleko, bulion, żelatyna, serwatka zawierające sacharydy: glukoza, sacharoza, laktoza zawierające aminokwasy: kwas asparaginowy, kwas glutaminowy substancje polimerowe: hydroksyetyloskrobia (HES) alkohole polihydroksylowe: glicerol, mannitol, sorbitol, glikol polietylenowy inne: dimetylosulfotlenek (DMSO) 57

40 Suszenie sublimacyjne Rys. 1. Wykres fazowy wody z punktem potrójnym: P woda destylowana (T = 0,01 C; P = 610 Pa ), P' rzeczywisty roztwór wodny 58

41 Suszenie sublimacyjne 59

42 Szybkość liofilizacji zależy od: grubości warstwy materiału (suchego i zamrożonego) przewodnictwa cieplnego materiału (suchego - małe - często ogranicza szybkość sublimacji, zamrożonego - duże) temperatury warstwy wysuszonej (uwarunkowana termostabilnością materiału (zwykle C) temperatury frontu sublimacji (najlepiej jak największa, zwykle od -15 do -45 C) temperatury kondensatora (najlepiej jak najmniejsza, ale ekonomiczna) sposobu zamrożenia surowca ciśnienia podczas liofilizacji (0,1-2 mm Hg) 60

43 Zalety procesu: wilgoć usuwana w niskich temperaturach wyklucza inaktywację termiczną produktu zachowana jest struktura materiału suszonego praktycznie wyeliminowane jest usuwanie lotnych składników suszonego materiału, lub naruszenie jego składu chemicznego ułatwiona możliwość otrzymywania sterylnego produktu Wady procesu: złożona aparatura i jej oprzyrządowanie długi czas trwania procesu wysokie zapotrzebowanie na energię 61