PRODUKTY UBOCZNE Z PRZEROBU BURAKÓW CUKROWYCH JAKO SUBSTRATY DO BIOSYNTEZY KWASU CYTRYNOWEGO

Transkrypt

1 InŜynieria Rolnicza 4/2006 Waldemar Podgórski, ElŜbieta Gąsiorek, Władysław Leśniak Katedra Biotechnologii śywności Akademia Ekonomiczna we Wrocławiu PRODUKTY UBOCZNE Z PRZEROBU BURAKÓW CUKROWYCH JAKO SUBSTRATY DO BIOSYNTEZY KWASU CYTRYNOWEGO Streszczenie Zastosowanie metod hodowli wgłębnej i hodowli w podłoŝach stałych grzybów strzępkowych z gatunku Aspergillus niger pozwoliło na wykorzystanie produktów ubocznych powstających w produkcji cukru białego do biosyntezy kwasu cytrynowego. Ilość otrzymanego produktu przy zastosowaniu melasy buraczanej wyniosła 110 g/dm, a wysłodków buraczanych 173 g/kg. Dodatek melasy do wysłodków w ilości 20% pozwolił na dalszy wzrost ilości uzyskanego kwasu do 204 g/kg. Słowa kluczowe: produkty uboczne, wysłodki buraczane, melasa buraczana, biosynteza, kwas cytrynowy, Aspergillus niger Wprowadzenie Kwas cytrynowy stosowany jest w produkcji Ŝywności, napojów bezalkoholowych i alkoholowych, w przemyśle olejarskim, farmaceutycznym, metalurgicznym, chemicznym, kosmetycznym, tekstylnym, tytoniowym, tworzyw sztucznych i innych. W ostatnich latach obserwuje się zwiększoną dynamikę produkcji tego kwasu ze względu na zastosowanie cytrynianów w proszkach do prania i środkach czystości, jako zamienników uciąŝliwych dla środowiska fosforanów [Podgórski 2002]. Do produkcji kwasu cytrynowego najlepiej nadają się substraty o wysokim współczynniku czystości chemicznej, w których zawartość przyswajalnych źródeł węgla jest zbliŝona do 100%. Definiowany, limitowany substratowo skład podłoŝa sprzyja blokadzie przemian cyklu kwasów trójkarboksylowych na etapie syntezy kwasu cytrynowego poprzez inaktywację enzymów odpowiedzialnych za jego dalsze przemiany. Stosowanie czystych surowców do produkcji kwasu cytrynowego jest jednak mało ekonomiczne, dlatego ostatnio zwraca się uwagę na surowce tańsze, często produkty uboczne lub nawet odpadowe powstające w produkcji przemysłowej. Na uwagę zasługują między innymi odpady powstające w produkcji cukru [Gąsiorek $#&

2 JT_WX`Te CbWZÇef^\þ 8_ÑU\XgT : f\bex^þ JÄTWlfÄTj?XÉa\T^ 1999; Ikram-ul-Haq i in. 2002]. Szczególnie interesującą alternatywę dla drogiego cukru białego stanowi melasa i wysłodki buraczane. Melasa moŝe być przerabiana zarówno metodą hodowli powierzchniowej (SF) jaki i metodą wgłębną (SmF). Bardziej efektywna jest hodowla wgłębna, jednakŝe moŝe być ona stosowana wyłącznie do przerobu surowców płynnych lub rozpuszczalnych w wodzie. Zagospodarowanie odpadów stałych, w tym wysłodków buraczanych, wymaga natomiast wykorzystania hodowli drobnoustrojów w podłoŝach stałych (ang. solid-state (SSF)) [Gąsiorek 1999, Podgórski i in. 2004a; Podgórski i in. 2004b; Holker i in. 2004]. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie wyników badań nad zastosowaniem produktów odpadowych i ubocznych powstających w produkcji cukru z buraków cukrowych i porównanie ich z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu znacznie droŝszego produktu końcowego przerobu buraków, jakim jest cukier biały. Materiały i metody W badaniach stosowano: - cukier biały, - wysłodki buraczane o następującym składzie (%): woda 8-12, sucha substancja W skład suchej substancji wysłodków wchodziły: celuloza i hemicelulozy 34-38, pektyny 34-40, cukry 4-7, białka 6,5-8,0, tłuszcze 0,5-0,7, związki mineralne 3,5-4,5; - melasę buraczaną o składzie (%): sucha substancja 82,4, cukry ogółem 57,07, cukry redukujące 0,7, substancje niecukrowe 25,3, popiół 9,5, azot ogólny 1,8. Hodowle w podłoŝach stałych (SSF) prowadzono w poziomym reaktorze obrotowym Biosol (AE Wrocław), o pojemności całkowitej 7 dm 3. Hodowle wgłębne - prowadzono w reaktorach zbiornikowych z mieszadłem (STR) MicroFerm Fermenter MF114 (New Brunswick Scientific Co. Inc., New Brunswick, USA oraz Biomer 10 - (AE Wrocław), o pojemności całkowitej odpowiednio 14 i 7 dm 3. Kwas cytrynowy (C 6 H 8 O 7 H 2 O) oznaczano metodą HPLC oraz metodą miareczkową z zastosowaniem pirydyny i bezwodnika octowego. Aktywność endoglukanazową oznaczano przy uŝyciu 1% roztworu karboksymetylocelulozy (Sigma) w 0,05 M buforze octanowym o ph 4,8 jako substratu CM-celulazy. Aktywność egzoglukanazową oznaczano przy uŝyciu bibuły filtracyjnej Whatman nr 1 jako substratu dla FP-azy. Wyniki badań i ich omówienie Optymalny skład podłoŝa definiowanego dla biosyntezy kwasu cytrynowego jest stosunkowo prosty i zawiera rozpuszczone w wodzie wodociągowej (g/dm): cukier biały , NH 4 NO 3 2,0, KH 2 PO 4 0,2, MgSO 4 7H 2 O 0,2. Odczyn środowiska 2,6 2,8. Zastosowanie tak zdefiniowanego ilościowo podłoŝa do fermentacji kwasu cytrynowego metodą wgłębną pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności produktu (Y P/S ) na poziomie wyŝszym od 90% (tabela 1). $#'

3 CebWh^gl hubvmax!!! Tabela 1. Podstawowe parametry hodowlii wgłębnej Aspergillus niger w podło- Ŝach z cukrem białym, melasą buraczaną i hodowli w podłoŝach stałych na wysłodkach buraczanych Table 1. Basic parameters of submerged cultures of Aspergillus niger on substrates with white sugar, beet molasses, and cultivation in solid state substrates of beet pulp Metoda hodowli wgłębnej Metoda hodowli w podłoŝach stałych Określenie Oznaczenie J.m definiowane kompleksowe kompleksowe kompleksowe Intensywne natlenianie Intensywne natlenianie Sterowanie aktywnością oddechową - Dodatek melasy Substrat - - Cukier biały Melasa Melasa Wysłodki Wysłodki Szczep A.niger - - W78B W78B W78B S S Wsp. czyst. podłoŝa α % ~ <4 <4 ph początkowe - - 2, ,4 5,5 ph końcowe ,1 2,8 2,9 2,9 Cukier początk. S g/kg ,0 180 Cukier końcowy S k g/kg < Kwas cytrynowy P g/kg , (3,0) (2,1) (2,7) (3,2) (3,1) Biomasa X g/kg 11 13,9 14,5 28,7 25,6 Czas fermentacji t dni 6,2 9,0 6,8 6,0 6,0 Wydajność Y P/S % Produktywność Qp g/dm 3/ h 0,92 0,23 0,68 1,44 2,13 W nawiasach podano odchylenie standardowe od prezentowanych w tabeli wartości średnich Zamiana czystego substratu na melasę buraczaną spowodowała zmniejszenie wydajności kwasu cytrynowego z około 90 do 39%, czyli więcej niŝ o połowę. Przyczyną tego zjawiska była destrukcja kontrolnych właściwości definiowanego medium hodowlanego na skutek wprowadzenia z melasą buraczaną szeregu makro i mikroelementów, które sprzyjały raczej wzrostowi biomasy drobnoustrojów niŝ $#(

4 JT_WX`Te CbWZÇef^\þ 8_ÑU\XgT : f\bex^þ JÄTWlfÄTj?XÉa\T^ nadprodukcji kwasu cytrynowego. Istotne znaczenie w kształtowaniu niŝszej wydajności fermentacji miał takŝe brak moŝliwości obniŝenia odczynu podłoŝa ze względu na znaczną buforowość stosowanego surowca. W wyniku szeregu doświadczeń stwierdzono, Ŝe skutecznym czynnikiem regulującym intensywność nadprodukcji kwasu cytrynowego w podłoŝach melasowych moŝe być limitowanie dostępu tlenu pełniącego rolę substratu ograniczającego wzrost biomasy i blokadę przemian cyklu Krebsa na etapie dalszych przemian cytrynianu 1 [Podgórski 2002]. Stwierdzono, Ŝe wysokie natlenianie podłoŝa z melasą buraczaną obniŝa zarówno aktywność kwasotwórczą grzybni w fazie akumulacji kwasu cytrynowego, jak i wydajność całego procesu, przyczyniając się, w warunkach wysokiego ph, do intensyfikacji syntezy kwasu glukonowego, którego stęŝenie w podłoŝu moŝe być zbliŝone do ilości kwasu cytrynowego. Parametrami kontrolnymi intensywności natleniania hodowli, skutecznie regulującymi efektywność fermentacji, mogą być parametry metaboliczne Aspergillus niger mierzone w sposób ciągły w postaci objętościowej szybkości przyswajania tlenu (QO 2 ) i wydzielania dwutlenku węgla (QCO 2 ), odzwierciedlające aktywność oddechową hodowanego szczepu [Podgórski 2004]. W fazie akumulacji produktu (od 72 h) utrzymywano stęŝenie tlenu rozpuszczonego na niskim poziomie, około 10% stanu nasycenia, co korzystnie ograniczało intensywność oddychania A. niger. W efekcie, duŝa szybkość asymilacji tlenu (QO 2 ) przy stosunkowo małej szybkości wydzielania dwutlenku węgla (QCO 2 ) hamowała rozwój biomasy i sprzyjała wzrostowi szybkości biosyntezy kwasu cytrynowego. W rezultacie przeprowadzonych badań uzyskano wzrost stęŝenia kwasu cytrynowego z około 50 do ponad 110 g/dm 3 (tabela 1). Maksymalna produktywność fermentacji kształtowała się na poziomie 1,5 g/dm 3 /h, natomiast wartość średnia tego parametru dla całego procesu wyniosła 0,7 g/dm 3 /h. W wyniku fermentacji uzyskano wydajność produktu (Y P/S ) na poziomie 90%, czyli zbliŝoną do wydajności otrzymywanych w podłoŝach z cukrem białym, przy nieco niŝszej produktywności procesu. Melasa, ze względu na swoją postać, mogła być przerabiana metodą hodowli wgłębnej, natomiast wysłodki buraczane wymagały zastosowania hodowli w podłoŝach stałych. Głównym źródłem węgla i energii w wysłodkach buraczanych nie jest łatwo przyswajalna przez mikroorganizmy sacharoza, jak to ma miejsce w przypadku stosowania cukru białego lub melasy buraczanej, lecz celuloza, hemicelulozy, pektyny i tłuszcze, czyli substraty, których utylizacja wymaga znacznie bardziej rozwiniętego aparatu enzymatycznego drobnoustrojów. W wyniku przeprowadzonych badań okazało się, Ŝe szybkość rozkładu celulozy do cukrów prostych nie stanowi czynnika limitującego efektywność biosyntezy kwasu 1 W podłoŝach definiowanych rolę substratów ograniczających normalny rozwój a.niger pełni azot i fosfor. $#)

5 CebWh^gl hubvmax!!! cytrynowego. Co więcej, zastosowanie hodowli w podłoŝach stałych pozwoliło na uzyskanie znacznie wyŝszych ilości produktu, nie tylko w stosunku do fermentacji wgłębnej podłoŝy melasowych, ale równieŝ w odniesieniu do podłoŝy definiowanych z cukrem białym (tabela 1, rys. 1) CM-aza S, P [g/kg] P SR Aktywność enzymów [IU/g] 50 FP-aza SR stęŝenie substancji redukujących, P stęŝenie produktu, t czas, CM-aza stęŝenie enzymu CM-azy, FP-aza stęŝenie enzymu FP-azy SR concentration of reducing substances, P product concentration, t time, CM-ase concentration of the CM-ase enzyme, FP-ase concentration of FP-ase t [h] Rys. 1. Fig. 1. Kształtowanie się wybranych wartości parametrów hodowli Aspergillus niger w podłoŝach stałych na wysłodkach buraczanych Selected parameter values of Aspergillus niger cultivation on solid substrates of beet pulp Dalszą poprawę efektywności procesu biosyntezy uzyskano poprzez dodanie do wysłodków melasy w ilości 20%. Ilość otrzymanego kwasu cytrynowego była w tym przypadku najwyŝsza i wyniosła 204 g/kg (tabela 1). Z analizy danych Tabeli 1 wynika jednak, Ŝe hodowla w podłoŝach stałych charakteryzuje się niŝszymi wartościami otrzymywanych wydajności w stosunku do hodowli wgłębnej. Nie jest to jednak cecha metody, a raczej efekt róŝnicy w rodzaju stosowanych substratów. Przyczyną niŝszych wydajności uzyskiwanych z uŝyciem wysłodków jest przede wszystkim gorsza przyswajalność produktów hydrolizy polisacharydów (głównie celulozy), będących podstawowym źródłem węgla, w stosunku do łatwo przyswajalnej przez pleśnie sacharozy zawartej w cukrze białym i melasie. $#*

6 JT_WX`Te CbWZÇef^\þ 8_ÑU\XgT : f\bex^þ JÄTWlfÄTj?XÉa\T^ Hodowla mikroorganizmów w podłoŝach stałych stwarza szansę na ekonomiczną bioutylizację szeregu innych odpadów przemysłu rolno-spoŝywczego. Odpady te mogłyby być zastosowane do bioprodukcji białek, enzymów, kwasów organicznych, dodatków do Ŝywności, biopestycydów, grzybów, barwników, gumy ksantanowej, hormonów itd. [Soccol i Vandenberghe 2003; Podgórski i in. 2004]. Wnioski 1. Zastosowanie melasy buraczanej i optymalizacja jej przerobu metodą fermentacji wgłęnej, polegająca na regulacji dostępu tlenu do komórek drobnoustrojów, pozwoliła na otrzymanie stęŝenia kwasu cytrynowego w ilości 110 g/dm Wysłodki buraczane przerabiane metodą hodowli w podłoŝach stałych umoŝliwiają uzyskanie stęŝenia produktu w ilości 170 g/kg 1, a wiec na poziomie znacznie przewyŝszającym rezultaty uzyskane nie tylko na melasie ale równieŝ w odniesieniu do podłoŝy definiowanych z cukrem białym. 3. Najlepsze rezultaty fermentacji uzyskano wzbogacając wysłodki buraczane w 20% dodatek melasy. Pozwoliło to na wzrost ilości otrzymanego produktu do 204 g/kg Przeprowadzone badania wykazały wysoką przydatność produktów ubocznych przerobu buraków cukrowych (melasy buraczanej i wysłodków) do produkcji wysokowartościowego metabolitu syntezy mikrobiologicznej, jakim jest kwas cytrynowy, stwarzając szanse na ich wartościowsze niŝ dotychczas zastosowanie (pasza dla zwierząt lub substrat do produkcji etanolu). Bibliografia Gąsiorek E., Badania nad biosyntezą kwasu cytrynowego metodą hodowli w podłoŝu stałym (solid state). Praca doktorska. AE Wrocław. Holker U., Hofer M., Lenz J Biotechnological advantages of laboratory-scale solid-state fermentation with fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol., 64 (2) Ikram-ul-Haq., Sikander A., Qadeer M.A., Javed I Citric acid fermentation by mutant strain of Aspergillus niger GCMC-7using molasses based medium. Electronic Journal of Biotechnology [online], 5(2). Podgórski W Kształtowanie aktywności oddechowej i kwasotwórczej Aspergillus niger podczas produkcji kwasu cytrynowego w podłoŝach z melasą trzcinową. (Modeling of respiratory and acidogenic activity of Aspergillus niger $#+

7 CebWh^gl hubvmax!!! during citric acid production in cane molasses media). Prace Nauk Monografie i opracowania nr 144, Wydawnictwo Akademii Ekonomicznej, Wrocław. Podgórski W Monitorowanie aktywności metabolicznej A. niger w procesie sterowania biotransformacją glukozy do kwasu glukonowego w systemie on-line. Biotechnologia, 1 (64) Podgórski W., Gąsiorek E. Leśniak W. 2004a. Using of organic wastes from sugar factory as raw materials for organic acids production. 31th International Conference of Chemical Engineering, SSCHE Tatranské Matliare. 074, s Podgórski W., Gąsiorek E., Leśniak W., Gadomski K. 2004b. Bioutilization and biotransformation of wastes and byproducts from food industry into organic acids. Acta Sci. Pol. Biotechnologia, 3 (1-2) Soccol C. R., Vandenberghe L.P.S Overview of applied solid-state fermentation in Brazil. Biochem. Eng. J., 13 (2-3) USING BYPRODUCTS AND ORGANIC WASTES FROM SUGAR BEET PROCESSING AS RAW MATERIALS FOR BIOLOGICAL CITRIC ACID PRODUCTION Summary Using two methods of fermentation: submerged and solid state for cultivation of Aspergillus niger allowed utilizing byproducts originated in white sugar production for citric acid biosynthesis. The amount of product obtained from beet molasses and sugar beet pulp amounted to 110 g/dm 3, and 173 g/kg 1 respectively. Enrichment of sugar beet pulp with 20% of molasses increased citric acid concentration up to 204 g/kg 1. Key words: byproducts, beet pulp, beet molasses, biosynthesis, citric acid, Aspergillus niger $#,