UTYLIZACJA ODPADÓW TŁUSZCZOWYCH Z UDZIAŁEM WYBRANYCH SZCZEPÓW 1 GEOTRICHUM CANDIDUM

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 5(1-2) 2006, UTYLIZACJA ODPADÓW TŁUSZCZOWYCH Z UDZIAŁEM WYBRANYCH SZCZEPÓW 1 GEOTRICHUM CANDIDUM Anita Rywińska, Danuta Witkowska Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Streszczenie. W pracy przebadano osiem szczepów droŝdŝy Geotrichum candidum pod względem moŝliwości syntezy lipaz w hodowlach wstrząsanych w podłoŝu zawierającym jako źródło węgla szlam produkt odpadowy prz emysłu tłuszczowego. Do hodowli wprowadzano zamiennie 1%, 2% i 3% szlamu oraz porównawczo 1% dodatek glukozy lub 1% oleju rzepakowego. Aktywność lipaz oceniano wobec oliwy z oliwek (JL O ) i trimaślanu glicerolu (JL T ) stosowanych jako substraty. Wśród badanych szczepów wykazano zróŝnicowanie w poziomie aktywności zarówno zewnątrz-, jak i wewnątrzkomórkowych lipaz w zaleŝności od stęŝenia szlamu, rodzaju substratu w testach enzymatycznych i czasu hodowli. Enzymy badanych szczepów wykazywały większą specyficzność w stosunku do oliwy z oliwek niŝ do trimaślanu glicerolu. W większości badanych szczepów maksymalna produkcja lipaz występowała juŝ w 3 dobie hodowli. Niski poziom syntezy lipaz w podłoŝu z glukozą, a wyŝszy w obecności szlamu i oleju rzepakowego wskazuje na indukowany lipidami charakter ich biosyntezy. Najefektywniejsze do biosyntezy enzymów okazało się podłoŝe zawierające 1% dodatek szlamu, a szczep G. candidum X5 wyróŝniał się najwyŝszą aktywnością zewnątrzkomórkowych lipaz (195 JL ZO ml -1 ). Słowa kluczowe: Geotrichum candidum, lipazy, źródło węgla, szlam olejowy WSTĘP Rozwijający się przemysł rolno-spoŝywczy dostarcza duŝych ilości produktów ubocznych i odpadów. Ich zagospodarowanie stanowi powaŝny problem gospodarczy i ekologiczny. Niektóre z tych odpadów moŝna przetworzyć, stosując określone preparaty enzymatyczne lub bezpośrednio mikroorganizmy. Badania te wiąŝą się nie tylko z moŝliwością poŝytecznego wykorzystania produktów odpadowych pochodzących z róŝnych przemysłów, np. do produkcji biomasy, enzymów czy kwasów organicznych, ale i znacznym obniŝeniem kosztów takich procesów. Adres do korespondencji Corresponding author: Anita Rywińska, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności, Uniwersytet Przyrodniczy, ul. C.K. Norwida 25, Wrocław, aryw@ozi ar.wroc.pl

2 28 A. Rywińska, D. Witkowska DuŜym obciąŝeniem dla środowiska naturalnego są odpady pochodzące z przemysłu tłuszczowego. W zakładach tłuszczowych po myciu urządzeń rafinacyjnych, jak równieŝ po operacjach technologicznych zbierają się tłuszcze odpadowe, w tym porafinacyjne kwasy tłuszczowe, szlamy olejowe, olej autoklawowy, które zawierają nienasycone kwasy tłuszczowe. Wykorzystano juŝ olej palmowy, rzepakowy i olej z orzeszków ziemnych jako poŝywkę dla Saccharomycopsis lipolityca, droŝdŝe Candida utilis do utylizacji porafinacyjnych kwasów tłuszczowych i tłuszczu kanałowego, takŝe grzyby Aspergillus oryzae do utylizacji ścieków po ekstrakcji oleju palmowego [Bednarski i in. 2003]. DuŜym zainteresowaniem wielu ośrodków naukowych, ze względu na bardzo rozbudowany aparat enzymatyczny, cieszą się droŝdŝe Geotrichum candidum [Baillargeon 1990]. Znane są równieŝ próby wykorzystania tego gatunku do utylizacji odpadów tłuszczowych, takich jak łój bydlęcy i drobiowy czy neutralizacji związków fenolowych skaŝających glebę [Białasiewicz 1997]. Celem prezentowanej pracy była ocena moŝliwości wykorzystania szlamu produktu odpadowego przemysłu tłuszczowego, jako źródła węgla do biosyntezy lipaz wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych ośmiu szczepów droŝdŝy Geotrichum candidum. MATERIAŁY I METODY Mikroorganizmy. Przedmiotem badań było 8 szczepów Geotrichum candidum (tab. 1). Szczepy przechowywano na skosach YM w temperaturze 4 C i przeszczepiano raz w roku. PodłoŜa. Zastosowano podłoŝe mineralne o składzie: Bactopepton 5%, MgSO 4 7H 2 O 0,1%, NaNO 3 0,1%, ph 6,0 [Baillargeon, Sonnet 1991]. Jako źródło węgla stosowano: szlam (produkt odpadowy przemysłu tłuszczowego) w stęŝeniu 1%, 2% i 3% oraz porównawczo glukozę lub olej rzepakowy w stęŝeniu 1%. PoŜywkę sterylizowano w temperaturze 121 C przez 20 minut. Warunki prowadzenia hodowli. Hodowle prowadzono w 250 ml kolbach Erlenmayera zawierających 50 ml podłoŝa na wytrząsarce rotacyjnej typu Elpan przy 170 rpm, przez 7 dni, w temperaturze 30 o C. Hodowle szczepiono inokulum o gęstości 10 7 kom ml -1 (standaryzacja z uŝyciem komory Thoma) uzyskanym ze zmywu ze skosu 0,1% roztworem Tween-u 80. Próby do analiz (5 ml) pobierano po 3, 5 i 7 dniach hodowli i wirowano na wirówce typu MPW 30 (6500 x g przez 10 min). Metody analityczne. W supernatancie i biomasie oznaczano aktywność lipolityczną zewnątrz- (JL Z ) i wewnątrzkomórkową (JL W ), wobec substratów: syntetycznego trimaślanu glicerolu tributyryny (JL ZT, JL WT ) i oliwy z oliwek (JL ZO, JL WO ) według metodyki opisanej w pracy Rywińskiej i in. [2005] oraz białko metodą Lowry'ego [1951]. Aktywność lipolityczną wyraŝono w ilości µmoli 0,05 M NaOH potrzebnych do zobojętnienia kwasów tłuszczowych uwolnionych w wyniku działania na substrat lipaz zawartych w 1 ml płynu pohodowlanego w ciągu 1 godziny. Acta Sci. Pol.

3 Utylizacja odpadów tłuszczowych Tabela 1. Stosowane szczepy Geotrichum candidum Table 1. Strains of Geotrichum candidum used Nazwa szczepu Name of strains Symbol Symbol Źródło Source Geotrichum candidum KB 6 X6 Ser Brie Cheese Brie, Geotrichum candidum KB 5 X5 Ser Brie Cheese Brie, Geotrichum candidum Sc 12 Sc 12 Ser Cammembert Cheese Cammembert, Geotrichum candidum PH 1 PH Pióra Feathers, Geotrichum candidum 1 O1 Kolekcja własna KBiMś AR Laboratory collection Geotrichum candidum MSK 311 MSK Słód, Malt Geotrichum candidum SS 47 D 2 D2 Słód Malt Geotrichum candidum SS 32 B 1 B1 Słód Malt OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW W prezentowanej pracy przebadano osiem szczepów droŝdŝy Geotrichum candidum (tab. 1) pod względem moŝliwości syntezy enzymów lipolitycznych w podłoŝu zawierającym róŝne ilości szlamu (1%, 2% i 3%) produktu odpadowego przemysłu tłuszczowego. Porównawczo przeprowadzono procesy w podłoŝu zawierającym 1% glukozy lub 1% oleju rzepakowego. NajwyŜsze wartości aktywności zewnątrzkomórkowych lipaz odnotowano w podło- Ŝu z olejem, najniŝsze w podłoŝu z glukozą, co świadczy o indukowanym lipidami charakterze biosyntezy lipaz (tab. 2). Wzrastające stęŝenie szlamu okazało się nie sprzyjać produkcji zewnątrzkomórkowych lipaz przez badane droŝdŝe, poniewaŝ zdecydowanie najwięcej enzymów lipolitycznych komórki produkowały w podłoŝu zawierającym 1% tego źródła węgla (rys. 1). Szczególnie wyróŝniały się szczepy X5 (195 JL ZO ml -1 ), X6 (155 JL ZO ml -1 ) oraz PH (150 JL ZO ml -1 ) i D2 (135 JL ZO ml -1 ). W podłoŝu zawierającym 2% szlamu tylko szczep MSK uzyskał aktywność na poziomie 155 JL ZO ml -1. W poŝywce z największą ilością szlamu (tj. 3%) cztery szczepy osiągnęły wartości aktywności w przedziale JL ZO ml -1, w przypadku pozostałych droŝdŝy aktywności były znacznie niŝsze. NiŜsze wartości aktywności przy coraz wyŝszym stęŝeniu źródła węgla mogą być spowodowane tym, Ŝe szlam ze względu na swoje właściwości fizyczne, tj. duŝą lepkość i gęstość, moŝe utrudniać wzrost komórek droŝdŝy oraz biosyntezę enzymów lipolitycznych. Prawdopodobnie wyŝsze stęŝenie tłuszczu powoduje znaczne oblepienie komórek droŝdŝowych utrudniając im dostęp do pozostałych składników pokarmowych i do rozpuszczonego tlenu. Podobne obserwacje przeprowadzili Rymowicz i in. [1997] w przypadku hodowli niektórych szczepów droŝdŝy Yarrowia lipolytica w podłoŝach zawierających porafinacyjne kwasy tłuszczowe. Komórki dwóch spośród pięciu badanych szczepów były całkowicie oblepione tłuszczem, co uniemoŝliwiło jakikolwiek przyrost biomasy. Biotechnologia 5(1-2) 2006

4

5

6 32 A. Rywińska, D. Witkowska W badaniach własnych (rys. 1) generalnie najwyŝsze wartości aktywności zewnątrzkomórkowych lipaz (wobec oliwy z oliwek i tributyryny) odnotowano w 3 dniu, z wyjątkiem hodowli ze szlamem w stęŝeniu 2%, gdzie maksymalne wartości uzyskano w 5 dniu, a nawet, w przypadku szczepów O1 i PH, w 7 dniu. W podłoŝu zawierającym 1% szlamu aktywności na początku procesu hodowlanego były wyŝsze nawet o 50% od tych uzyskiwanych w 5 dobie. NajwyŜsze aktywności w 3 dniu hodowli autorzy obserwowali juŝ wcześniej [Rywińska i in. 2005]. Przyczyny spadku aktywności w kolejnych dniach trwania hodowli mogą być bardzo róŝne. Corzoi Revah [1999] wykazali, ŜeobniŜająca się aktywność moŝe być spowodowana wyczerpywaniem się substratu oraz wzrastającym ph hodowli. Z kolei doświadczenia Zarevøcka i in. [2005] ukazują spadek aktywności jako wynik rosnącej aktywności enzymów proteolitycznych produkowanych w tym samym czasie co enzymy lipolityczne. Hassanien i in. [1985] twierdzą, Ŝe spadek aktywności moŝe być spowodowany inhibicyjnym oddziaływaniem powstających produktów. W prezentowanej pracy aktywność lipolityczna oceniana była wobec dwóch substratów, tj. oliwy z oliwek (JL O ) i trimaślanu glicerolu tributyryny (JL T ). Zdecydowanie wyŝsze wartości aktywności otrzymano dla substratu oliwy z oliwek. Wobec tributyryny wysoką aktywnością wyróŝniały się tylko szczepy X6, X5 oraz D2 rosnące w podłoŝu z 1% szlamu (rys. 1D). Pomimo Ŝe aktywność ta była niŝsza, od 3,7% do 17,9%, od oznaczanej wobec oliwy, moŝna wysnuć wniosek, Ŝe droŝdŝe te posiadają wyŝsze uzdolnienia do syntezy lipaz w omawianych warunkach. W przypadku pozostałych szczepów i wariantów hodowlanych (rys. 1E, F) wartość aktywności zewnątrzkomórkowych lipaz oznaczanych wobec tributyryny nie przekraczała 50 JL T. Wyniki te świadczą o wyŝszej preferencji lipaz droŝdŝy G. candidum do hydrolizy wiązań estrowych tworzonych przez długołańcuchowe kwasy tłuszczowe niŝ przez krótkołańcuchowe kwasy masłowe obecne w tributyrynie. W podłoŝu zawierającym 1% oleju rzepakowego (tab. 2) wartości aktywności zewnątrzkomórkowych lipaz, oznaczanych zwłaszcza wobec oliwy z oliwek, były wyŝsze niŝ w podłoŝu ze szlamem (rys. 1A). Biorąc jednak pod uwagę fakt, Ŝe do badań stosowano czysty olej oraz mocno zanieczyszczony szlam, róŝnice w wartościach uzyskanych aktywności były stosunkowo nieduŝe. NajwyŜszą aktywność, 265 JL ZO ml -1, uzyskał szczep X5 w 5 dniu hodowli, a cztery inne szczepy (PH, O1, MSK i D2) osiągnęły aktywności w przedziale JL ZO ml -1 (tab. 2). Warto zwrócić uwagę na fakt, iŝ w poŝywce z olejem rzepakowym, inaczej niŝ w podłoŝu ze szlamem, w większości przypadków aktywność wzrastała wraz z czasem procesu. NajwyŜsze wartości osiągane były w 5 lub 8 dniu, co moŝe sugerować, iŝ nie nastąpiło jeszcze całkowite wyczerpanie substratu. Aktywności oznaczane wobec tributyryny (tab. 2) były zbliŝone do otrzymanych w podłoŝu ze szlamem (rys. 1D). Maksymalna wartość aktywności otrzymanej w podłoŝu z 1% glukozy wynosiła zaledwie 80 JL ZO ml -1 (szczep MSK) (tab. 2), co jednoznacznie potwierdza tezę o indukującym wpływie tłuszczu na biosyntezę enzymów lipolitycznych przez badane szczepy droŝdŝy G. candidum. Podobne spostrzeŝenia inni autorzy odnotowali juŝ wcześniej [Adamczak i Bednarski 1996, Jacobsen 1989, Ginalska i in. 2004]. Generalnie jednak aktywności droŝdŝy G. candidum w niniejszej pracy są niŝsze od uzyskanych przez innych badaczy, którzy jako źródło węgla stosowali róŝne oleje, triacyloglicerole czy kwasy tłuszczowe [Ginalska i in. 2004]. Znacznie niŝsze aktywności lipolityczne, dla tych samych szczepów ale w hodowlach prowadzonych ze zmielonym słodem i jęczmieniem, uzyskali Piegza i in. [2005]. Acta Sci. Pol.

7

8 34 A. Rywińska, D. Witkowska Badania własne wykazały, Ŝe najwyŝsze wartości aktywności lipolitycznej przeliczonych na miligram białka uzyskano w podłoŝu z 2% szlamu i to zarówno w przypadku oliwy (rys. 2B), jak i tributyryny (rys. 2E). Natomiast bez względu na ilość zastosowanego szlamu, w większości przypadków, aktywność wewnątrzkomórkowych lipaz w hodowlach wstrząsanych wykazywała wyŝsze wartości od aktywności właściwej zewnątrzkomórkowej. Przyczyną takiej sytuacji jest zapewne duŝa zawartość róŝnych białek w płynie pohodowlanym, których ilość rosła wraz ze wzrostem stęŝenia szlamu (dane nieprezentowane). Wysoką aktywnością enzymów związanych z komórką wyróŝniały się szczepy: X6 (36,4 JL WO mg -1 ), 3-11 (35,8 JL WO mg -1 ) (rys. 2B) oraz D2 (49,7 JL WO mg -1 ) (rys. 2C). Warto równieŝ zwrócić uwagę, Ŝe najwyŝsze wartości aktywności, w podłoŝu z 1% i 2% szlamu przypadały w 5 dniu hodowli, a tylko w podłoŝu z 3% szlamu w 3 dniu. W hodowlach z olejem lub glukozą (tab. 3, tab. 4) równieŝ bardzo wyraźnie zaznaczała się wyŝszość wartości aktywności wewnątrzkomórkowych nad zewnątrzkomórkowymi i równieŝ bez względu na rodzaj substratu. Wśród testowanych droŝdŝy w podłoŝu z glukozą wyróŝniał się szczep X6, który uzyskał w 5 dniu aktywność na poziomie 13,01 JL WO mg -1 oraz 3-11, którego aktywność w 3 dniu wynosiła 12,0 JL WO mg -1. NajwyŜsze aktywności w podłoŝu z olejem rzepakowym odnotowano w 5 dobie dla szczepów X5 (8,46 JL WO mg -1 ) i 3-11 (6,53 JL WO mg -1 ). W odniesieniu do aktywności oznaczanych wobec tributyryny (tab. 4) naleŝy wymienić szczepy Sc12 oraz D2, które w 3 dobie procesu z glukozą uzyskały aktywności odpowiednio 10,59 JL WT mg -1 oraz 13,33 JL WT mg -1. Natomiast w podłoŝu z olejem rzepakowym aktywność wewnątrzkomórkowych lipaz nie przekraczała wartości 4,082 JL WT mg -1 dla szczepu MSK w 5 dobie. RównieŜ Rywińska i in. [2005] w swoich wcześniejszych badaniach wykazali wyŝsze wartości aktywności lipaz związanych z komórką niŝ zewnątrzkomórkowych i to oznaczanej zarówno wobec oliwy z oliwek, jak i tributyryny, tłumacząc uzyskane wyniki częściowo konstytutywnym charakterem biosyntezy wewnątrzkomórkowych lipaz. PODSUMOWANIE Biosynteza lipaz, przez badane szczepy G. candidum, najintensywniej przebiegała w podłoŝu z olejem, najsłabiej w podłoŝu z glukozą, co świadczy o indukowanym lipidami charakterze biosyntezy tych enzymów. W przypadku szlamu najwyŝsze aktywności zewnątrzkomórkowych lipaz odnotowano przy 1% stęŝeniu tego źródła węgla. Uzyskane w tych warunkach wartości aktywności były nieznacznie tylko niŝsze od otrzymanych w podłoŝu z olejem, co świadczy o tym, Ŝe szlam moŝe być z powodzeniem wykorzystywany do biosyntezy enzymów lipolitycznych. Acta Sci. Pol.

9

10

11 Utylizacja odpadów tłuszczowych PIŚMIENNICTWO Adamczak M., Bednarski W., Some factors affecting lipase production by yeasts and filamentous fungi. Biotech. Lett., 18, 10, Baillargeon M.W., Purification and specifity of lipases from Geotrichum candidum, Lipids, Vol. 25, No 12, Baillargeon M.W., Sonnet P.E., Selective lipid hydrolysis by Geotrichum candidum NRRL Y-553 lipase. Biotechnology Letters, Vol 13, No 12, Bednarski W., Reps A., Biotechnologia Ŝywności, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne. Białasiewicz D., Wpływ obniŝenia temperatury na aktywność enzymów hydrolitycznych Geotrichum candidum. Przemysł spoŝywczy, 11, Corzo G., Revah S., Production and characteristics of the lipase from Yarrowia lipolytica 681. Bioresource Technology, 70, Ginalska G., Bancerz R., Kowalska T., A thermostable lipase produced by a newly isolated Geotrichum-like strain, R59. J. Ind. Microbiol Biotechnol, 31, Hassanien F.R., Shehata M.I., Ragab M., A study on Geotrichum candidum lipase stability. Die Nahrung 29, 3, Jacobsen T., Jensen B., Olsen J., Allermann K., Extracellular and cell-bound lipase activity in relation to growth of Geotrichum candidum. Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, Piegza M., Witkowska D., Stempniewicz R., Rywińska A., Geotrichum hydrolytic activity in milled malt and barley medium. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Vol 8. Rymowicz W., Rafałowicz D., Wojtatowicz M., Musiał I., Dobór szczepów i składu podłoŝa do produkcji biomasy Yarrowia lipolytica na substratach tłuszczowych. Biotechnologia, 3, 38, Rywińska A., Piegza M., Witkowska D., Produkcja lipaz przez wybrane szczepy Geotrichum candidum w zaleŝności od źródła węgla w poŝywce. Acta Scientiarum Polonorum, Biotechnologia, 4, 1-2, Zarevúcka M., Kejík Z., Šaman D., Wimmer Z., Demnerová K., Enantioselective properties of induced lipases from Geotrichum. Enzyme and Microbial Technology, 37, UTILIZATION OF OIL INDUSTRY WASTES BY DIFFERENT GEOTRICHUM CANDIDUM STRAINS Abstract. In this paper eight strains of Geotrichum candidum were examined for their ability to produce lipases in mineral medium containing different concentration of residues oil waste product from fatty industry, as a carbone source. Residue oil was used in 1%, 2%, 3% concentration. Mineral medium with addition of 1% of glucose or 1% rapeseed oil was used for comparison. Activities of lipases were tested against olive oil (JL O ) and glycerol tributyrate (JL T ) used as substrates. All tested strains differed in intra- and extracellular lipase activity, depending on the concentration of oil residue as well as incubation time and the substrate type used in enzymatic analysis. Generally, enzymes of tested strains showed higher specifity to olive oil, then to glycerol tributyrate. The highest production of lipases appeared as early as the 3-th day of incubation. Higher level of lipases in presence of residue oil or rapeseed oil in Biotechnologia 5(1-2) 2006

12 38 A. Rywińska, D. Witkowska comparison with control medium (containing 1% glucose as carbon source) indicates inductive character of their biosynthesis. Culture medium containing 1% of residue oil appeared to be the most effective for enzyme synthesis and G. candidum X5 strain showed the highest extracellular activity (195 JL O ml -1 ) in given conditions. Key words: Geotrichum candidum, lipases, carbon source, residue oil Zaakceptowano do druku Accepted for print: Acta Sci. Pol.