(21)Numer zgłoszenia: (87)Data i numer publikacji zgłoszenia. międzynarodowego: , WO94/10325, PCT Gazette nr 11/94

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21)Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (86) D ata i numer zgłoszenia międzynarodowego: (51)IntCl6: , PCT/FI93/00450 C12N 15/52 (87)Data i numer publikacji zgłoszenia C12P7/18 międzynarodowego: , WO94/10325, PCT Gazette nr 11/94 (54) Sposób wytwarzania ksylitolu i zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy (30) Pierw szeństw o : ,US,07/ (73) U praw niony z patentu: XYROFIN OY, Helsinki, FI (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 17/95 (72 ) T w ó rcy w y n a la zku : Anu M. Harkki, Espoo, FI Andrey N. Myasnikov, Kantvik, FI Juha H. A. Apajalahti, Helsinki, FI Ossi A. Pastinen, Kantvik, FI (45) O u d zie le n iu p atentu ogłoszono: WUP 02/00 (74) Pełnom ocnik: Ostrowska Elżbieta, POLSERVICE PL B1 (57)1. Sposób wytwarzania ksylitolu przez zrekombinowanego gospodarza p olegający na genetycznym m odyfikowaniu natywnego organizmu, prow a- dzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znam ienny tym, że (a) drobnoustrojowego gospodarza produkującego arabitol transformuje się DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC ) ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC ), (b) hoduje się zrekom binow anego gospodarza z etapu (a) wykorzystując jako źródło węgla D -heksozy takie jak. glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający ta k ą D-heksozę, lub D -arabitol, etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol, oraz (c) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (b) 9 Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujący jako źródło w ęgla D-heksozy takie jak glukoza, fruktoza, galaktoza, m annoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający takąd -heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, transformowany DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC ) i ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC 1119). 16. Sposób wytw arzania ksylitolu przez gospodarza drobnoustrojowego polegający na genetycznym modyfikowaniu natywnego organizmu, prowadzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znam ienny tym, że (a) hoduje się drobnoustrojow ego gospodarza transform owanego genem kodującym dehydrogenazę ksyhtolow ą (EC ); dehydrogenazę D-glukozo-6-fosforanow ą (EC ), 3-epimerazę D-rybulozo-5-fosforanową (EC ) i/lub D -rybulokinazę (2 7 i 47), wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza. lub ich mieszaniny, lub polim er lub oligomer zawierający taką D-heksozę lub D-arabitol etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol, oraz (b) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (a). 20 Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujący jako źródło węgla D-heksozy takie jak glukoza, fruktoza, galaktoza, m annoza, lub ich m ieszaniny, albo polim er lub oligomer zawierający takąd -heksozę, albo etanol łub glicerol, transform owany genem kodującym dehydrogenazę ksyhtolową (EC ) dehydrogenazę D-glu kozo-6-fosforanow ą (EC ), dehydrogenazę 6-fosfo-D-glukonianową EC ), D-rybulozo-5-fosforano-3-epim erazę (EC ), i/lub D-ry - bulokinazę (EC 2 7 I 47) FIG. 1

2 Sposób wytwarzania ksylitolu i zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania ksylitolu przez zrekombinowanego gospodarza polegający na genetycznym modyfikowaniu natywnego organizmu, prowadzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znam ienny tym, że: (a) drobnoustrojowego gospodarza produkującego arabitol transformuje się DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC ) i ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC ); (b) hoduje się zrekombinowanego gospodarza z etapu (a) wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (c) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (b). 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że arabitol stanowi związek pośredni w wymienionej drodze przemian. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że natywnego gospodarza stanowią drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że inaktywuje się aktywność D-ksylulokinazy (EC ) gospodarza. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że inaktywuje się aktywność transketolazy (EC ) gospodarza. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inaktywuje się aktywność transketolazy (EC ) i D-ksylulokinazy (EC ) gospodarza. 7. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że drożdże wybrane są z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i Torulospora hansenii, a grzyby wybrane są z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum commune. 8. Sposób według zastrz. 7, znam ienny tym, że jako drożdże stosuje się Zygosaccharomyces rouxii. 9. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujący jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, łub polimer lub oligomer zawierający ta k ą D-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, transformowany DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC ) i ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC ). 10. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 9, znam ienny tym, że aktywność D-ksylulokinazy (EC ) została zinaktywowana. 11. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 9, znam ienny tym, że aktywność transeketolazy (EC ) została zinaktywowana. 12. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 22, znam ienny tym, że aktywności D-ksylulokinazy (EC ) i transketolazy (EC ) zostały zinaktywowane. 13. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 9, albo 10, albo 11, albo 12, znam ienny tym, że natywnego gospodarza drobnoustrojowego stanowią drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol. 14. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 13, znam ienny tym, że drożdże wybrane są z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i Torulospora hansenii, a grzyby wybrane są z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum commune.

3 Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 14, znamienny tym, że drożdże stanowi Zygosaccharomyces rouxii. 16. Sposób wytwarzania ksylitolu przez gospodarza drobnoustrojowego polegający na genetycznym modyfikowaniu natywnego organizmu, prowadzeniu hodowli tego organizmu, oraz izolowaniu ksylitolu, znam ienny tym, że (a) hoduje się drobnoustrojowego gospodarza transformowanego genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC ); dehydrogenazę D-glukozo-6-fosforanową (EC ), 3-epimerazę D-rybulozo-5-fosforanową(EC ) i/lub D-rybulokinazę ( ), wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający tak ą D-heksozę lub D-arabitol etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (b) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (a). 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza z inaktywowaną aktywnością transketolazy (EC ). 18. Sposób według zastrz. 16, albo 17, znam ienny tym, że jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza z inaktywowaną aktywnością ksylulokinazy (EC ). 19. Sposób według zastrz. 17, albo 18, znam ienny tym, że jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza transformowanego genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy. 20. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystujący jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, albo polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, albo etanol lub glicerol, transformowany genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC ), dehydrogenazę D-glukozo-6-fosforanową (EC ), dehydrogenazę 6-fosfo-D-glukonianową EC ), D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazę (EC ), i/lub D-rybulokinazę (EC ). 21. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 20, znamienny tym, że aktywność transketolazy (EC ) została zinaktywowana. 22. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 20 albo 21, znam ienny tym, że aktywności D-ksylulokinazy (EC ) została zinaktywowana. 23. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy według zastrz. 20, albo 21, znamienny tym, że gospodarz jest transformowany genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy. * * * Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ksylitolu i zrekombinowanego gospodarza drobnoustrojowego. Ogólnie wynalazek dotyczy genetycznie zmodyfikowanych drobnoustrojów do wytwarzania użytecznych związków chemicznych (inżynierii metabolicznej), a w szczególności konstruowania szczepów drobnoustrojowych na drodze manipulacji genetycznej, tak że są one zdolne do przekształcania łatwo dostępnych źródeł węgla takich jak D-glukoza w cenniejszy produkt, np. ksylitol. Ksylitol jest związkiem chemicznym o poważnym znaczeniu jako specjalny środek słodzący. Jest on w przybliżeniu tak słodki jak sacharoza, nietoksyczny i nie jest rakotwórczy. Obecnie ksylitol wytwarza się w wyniku chemicznego uwodornienia D-ksylozy. D-ksylozę uzyskuje się z hydrolizatów różnych materiałów roślinnych, w których zawsze występuje ona w mieszaninie z innymi pentozami i heksozami. Oczyszczanie ksylozy, a także ksylitolu stanowi w związku z tym znaczny problem. Znanych jest szereg sposobów tego typu. Przykładowo wymienić można procesy ujawnione w opisach patentowych USA nr , , i Redukcję D-ksylozy do ksylitolu można również przeprowadzić na drodze mikrobiologicznej z wykorzystaniem szczepów naturalnych (M.F.S. Barbosa i inni, J. Industrial Microbiol. 3: (1988) lub szczepów uzyskanych metodami inżynierii genetycznej (J. Hallbom i inni,

4 Biotechnology 9: (1991)). Jednakże uzyskanie substratu, D-ksylozy w postaci odpowiedniej do przeprowadzenia fermentacji drożdżowej stanowi również poważny problem, gdyż tanie źródła ksylozy takie jak ług siarczynowy z produkcji pulpy i papieru, zaw ierają zanieczysz czenia, które inhibitują rozwój grzybów. Cennym alternatywnym sposobem wytwarzania ksylitolu byłoby wytwarzanie go na drodze fermentacji taniego i łatwo dostępnego substratu, takiego jak D-glukoza. Jednakże nie są znane drobnoustroje, które wytwarzają w znacznych ilościach ksylitol w czasie jednostopniowej fermentacji dowolnego znanego źródła węgla, innego niż D-ksyloza i D-ksyluloza, które są strukturalnie bardzo zbliżone do ksylitolu. Z drugiej strony wiele drobnoustrojów, zwłaszcza drożdży osmofilowych, np. Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha i Torulopsis candida, wytwarzają znaczne ilości bardzo zbliżonego pentytolu, D-arabitolu z D-glukozy (D.H. Lewis i D.C. Smith, New Phytol. 66: (1967)). Wykorzystując taką właściwość drożdży osmolitycznych H. Onishi i T. Suzuki opracowali sposób przekształcania D-glukozy w ksylitol na drodze trzech kolejnych fermentacji (Appl. Microbil. 18: (1969)). W procesie tym D-glukozę przekształca się najpierw w D-arabitol na drodze fermentacji ze szczepem drożdży osmolitycznych. Następnie D-arabitol utlenia się do D-ksylulozy w wyniku fermentacji z Acetobacter suboxydans. N a koniec D-ksylulo zę redukuje się do ksylitolu w trzeciej fermentacji z wykorzystaniem jednego z wielu szczepów drożdży zdolnych do redukowania D-ksylulozy do ksylitolu. Oczywistą wadą takiego sposobu jest to, że obejmuje on 3 różne etapy fermentacji, z których każdy trwa 2-5 dni; konieczne są ponadto dodatkowe etapy takie jak sterylizacja i usuwanie komórek, co zwiększa koszty procesu. Wydajność etapu fermentacji jest niska, a ilość produktów ubocznych jest znaczna. W związku z tym w dalszym ciągu istnieje zapotrzebowanie na sposoby opłacalnego wytwarzania ksylitolu przez układy mikrobiologiczne z łatwo dostępnych substratów. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ksylitolu przez zrekombinowanego gospodarza na drodze genetycznego modyfikowania natywnego organizmu, prowadzenia hodowli tego organizmu, oraz izolowania ksylitolu, polegający na tym, że: (a) drobnoustrojowego gospodarza produkującego arabitol transformuje się DNA kodującym dehydrogenazę D-arabitolu (EC ) i ewentualnie DNA kodującym dehydrogenazę ksylitolu (EC ); (b) hoduje się zrekombinowanego gospodarza z etapu (a) wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (c) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (b). Korzystnie arabitol stanowi związek pośredni w wymienionej drodze przemian. Również korzystnie, natywnego gospodarza stanowią drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol. W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku w gospodarzu inaktywuje się aktywność D-ksylulokinazy (EC ), i ewentualnie inaktywuje się aktywność transketolazy (EC ) gospodarza. Jeszcze bardziej korzystnie inaktywuje się aktywność transketolazy (EC ) i D-ksylulokinazy (EC ) gospodarza. Stosowane w sposobie według wynalazku drożdże wybrane są z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i Torulospora hansenii, a grzyby wybrane s ą z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum ]commune. Bardziej korzystnie jako drożdże stosuje się Zygosaccharomyces rouxii. Przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy charakteryzujący się tym, że jest zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, transformowany DNA, kodujący dehydrogenazę D-arabitolu (EC ) i ewentualnie DNA, kodujący dehydrogena-

5 zę ksylitolu (EC ). Korzystnie, w tak zrekombinowanym gospodarzu według wynalazku aktywność D-ksylulokinazy (EC ), oraz ewentualnie aktywność transketolazy (EC ) została zinaktywowana. Najbardziej korzystnie gospodarz drobnoustrojowy według wynalazku charakteryzuje się tym, że aktywności D-ksylulokinazy (EC ) i transketolazy (EC ) zostały zinaktywowane. Korzystnie zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy charakteryzuje się tym, że jako natywnego gospodarza drobnoustrojowego wykorzystuje się drożdże wytwarzające arabitol lub grzyb wytwarzający arabitol, a jeszcze bardziej korzystnie jest, gdy drożdże wybrane są z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i Torulospora hansenii, a grzyby wybrane są z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyllum commune. Najbardziej korzystnie, drożdże stanowi Zygosaccharomyces rouxii. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania ksylitolu przez gospodarza drobnoustrojowego na drodze genetycznego modyfikowania natywnego organizmu, prowadzenia hodowli tego organizmu, oraz izolowania ksylitolu, charakteryzujący się tym, że (a) hoduje się drobnoustrojowego gospodarza transformowanego genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC ); dyhydrogenezę D-glukozo-6-fosforanową (EC ), 3-epimerazę D-rybulozo-5-fosforanową (EC ) i/lub D-rybulokinazę ( ), wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, lub polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, lub D-arabitol, etanol lub glicerol, uzyskując jako produkt ksylitol; oraz (b) wydziela się ksylitol wytworzony w etapie (a). Korzystnie jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza z inaktywowaną aktywnością transketolazy (EC ), i ewentualnie z inaktywowaną aktywnością ksylulokinazy (EC ). Jeszcze bardziej korzystnie jako gospodarza drobnoustrojowego stosuje się gospodarza transformowanego genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy. Następnym przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy zdolny do produkcji ksylitolu wykorzystując jako źródło węgla D-heksozy takie jak: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza, lub ich mieszaniny, albo polimer lub oligomer zawierający taką D-heksozę, albo etanol lub glicerol, transformowany genem kodującym dehydrogenazę ksylitolową (EC ), dehydrogenazę D-glukozo-6-fosforanową (EC ), dehydrogenazę 6-fosfo-D-glukonianową (EC ), D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazę (EC ), i/lub D-rybulokinazę (EC ). W korzystnej odmianie wynalazku w zrekombinowanym gospodarzu drobnoustrojowym aktywność transketolazy (EC ) została zinaktywowana, lub ewentualnie aktywności D-ksylulokinazy (EC ) została zinaktywowana. Zrekombinowany gospodarz drobnoustrojowy korzystnie charakteryzuje się tym, że gospodarz ten jest transformowany genem kodującym niespecyficzną fosfatazę katalizującą defosforylację D-ksylulozofosforanu do D-ksylulozy. W związku z tym wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania ksylitolu, zgodnie z którym przygotowuje się nowy i nieznany szczep drobnoustrojowy, zmodyfikowany metodami inżynierii genetycznej wytwarzający taki ksylitol albo de novo lub w zwiększonych ilościach w porównaniu z rodzimym drobnoustrojem nie zmodyfikowanymi metodami inżynierii genetycznej. Nowa droga przemian metabolicznych zostaje wbudowana metodami inżynierii genetycznej do drobnoustroju, w wyniku czego następuje wytwarzanie de novo lub w zwiększonych ilościach ksylitolu przez taki drobnoustrój. Nowa droga modyfikuje drogę biosyntezy i/lub metabolizmu D-arabitolu poprzez wydłużenie występującej wcześniej drogi biosyntezy D-arabitolu o dodatkowe etapy wykorzystania D-arabitolu, poprzez wprowadzenie i nadekspresję genów kodujących dehydrogenazę D-arabi tolową wytwarzającą D-ksylulozę (EC ) i dehydrogenazę ksylitolową (EC ) do drobnoustroju wytwarzającego D-arabitol. Dzięki temu drobnoustrój wytwarza ksylitol w wyniku fermentacji źródeł węgla, które niemodyfikowany drobnoustrój wykorzystuje do biosyntezy D-arabitolu.

6 W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku aby zablokować drogę metaboliczną jest zużywana D-ksyloza w reakcji D-ksylokinazy i transketolazy inaktywuje się aktywność D-ksylulokinazy (EC ) gospodarza, lub też inaktywuje się aktywność transketolazy (EC ) gospodarza. Wynalazek dostarcza zatem sposób wytwarzania ksylitolu z wykorzystaniem nowych drobnoustrojów wspomnianych powyżej, przy czym zgodnie z tym sposobem wykorzystuje się powyższą zmodyfikowaną drogę biosyntezy D-arabitolu, która to droga została dodatkowo zmodyfikowana poprzez zdezaktywowanie w wyniku wywołanej chemicznie mutagenezy lub rozpadu genowego genu kodującego transketolazę (EC ) lub genu kodującego D-ksylulokinazę (EC ) w takich drobnoustrojach. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się drożdże wybrane z grupy obejmującej Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa i.torulaspora hansenii, a grzyby wybrane z grupy obejmującej Dendryphiella salina i Schizophyl lum commune. Szczególnie korzystnie jako drożdże stosuje się Zygosaccharomyces rouxii. Dostarczane przez wynalazek komórki gospodarza są zdolne do wytwarzania ksylitolu, gdy hodowane są na źródłach węgla innych niż D-ksyluloza lub D-ksyloza, oraz innych niż polimery lub oligomery albo ich mieszaniny. Źródła węgla wykorzystywane przez komórki gospodarze według wynalazku są tanie i łatwo dostępne. Drobnoustroje według wynalazku są również zdolne do wydzielania zsyntetyzowanego ksylitolu do hodowli. Cel ten osiąga się poprzez modyfikację metabolizmu pożądanego drobnoustroju, najczęściej występującego w przyrodzie drobnoustroju drożdżowego, w wyniku wprowadzenia i wywołania ekspresji pożądanych genów heterologicznych. Cel ten osiąga się również poprzez dalszą modyfikację metabolizmu takich pożądanych drobnoustrojów, tak aby wywołać nadekspresję i/lub zdezaktywować aktywność lub ekspresję pewnych genów homologicznych dla takich drobnoustrojów w stanie rodzimym. W korzystnym zmodyfikowanym zrekombinowanym gospodarzu drobnoustrojowym według wynalazku jest zinaktywowana aktywność D-ksylulokinazy (EC ), bądź też jest zinaktywowana aktywność transketolazy (EC ), lub też są zinaktywowane aktywności D-ksylulokinazy (EC ) oraz transketolazy (EC ). Na fig. 1 przedstawiono mapę restrykcyjną insertu w plazmidzie parl2. Jest to insert z lo cus chromosomowego Klebsiella terrigena Phpl, zawierający gen dehydrogenazy D-arabitolu K. terrigena. Otwarta ramka oznacza chromosomowy DNA K. terrigena. Strzałkami zaznaczono miejsce i kierunek genu dehydrogenazy D-arabitolowej (EC ) w tym DNA. Na fig. 2 przedstawiono konstrukcję pyard z padh i paah5. Na diagramach plazmidów linią pojedynczą (-) zaznaczono sekwencje bakteryjne; linią pofalowaną zaznaczono 2µM. DNA z S.cerevisiae; otwartą strzałką (=> ) zaznaczono promotor ADCI (gen ADCI kodujący dehydrogenazę alkoholową S. cerevisiae lub ADCI poprzednio oznaczany był jako ADHI); pustym rombem (0 ) zaznaczono terminator transkrypcyjny ADCI; blok prostokątny oznacza gen LEU2; a strzałką zakreskowaną zaznaczono gen dehydrogenazy D-arabitolowej. Na fig. 3 przedstawiono konstrukcję plazmidu pjdb(ax)-16. XYL2 oznacza gen dehydrogenazy ksylitolowej z Pichia stipitis. dald oznacza gen dehydrogenazy D-arabitolowej. ADCI oznacza obszar regulacji transkrypcyjnej (promotor) genu ADCI, poprzedzający sekwencję kodującą da 1D i połączony z nią funkcjonalnie. Symbole nie m ają tego samego znaczenia co na fig. 4. Na diagramach plazmidu liniąpojedynczą(-) zaznaczono sekwencje bakteryjne i 2 µm. DNA, gdy to zaznaczono; zamkniętą strzałką oznaczono promotor A D C1; zaciemnionym rombem ( ) zaznaczono terminator transkrypcyjny ADCI; blok prostokątny oznacza gen markera LEU2; strzałką zakreskowaną zaznaczono gen XYL2; a prostokąt zablokowany oznacza gen d al D. Na fig. 4 przedstawiono konstrukcję wektora wrzecionowego psrt(ax)-9 z E.coli-Z. Rouxii. Symbole mają to samo znaczenie co na fig. 3. Na fig. 5 przedstawiono mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu rdna T. candida. Na fig. 6 przedstawiono konstrukcję plazmidu ptc(ax) Na fig. 7 przedstawiono mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu rdna T. candida. Na fig. 7a przedstawiono konstrukcję plazmidu pcpu(ax).

7 Na fig. 8 przedstawiono klonowanie ZWF1 i genu gnd. Na fig. 8a przedstawiono konstrukcję plazmidu PAAH(gnd). Na fig. 9 przedstawiono konstrukcję plazmidu psrt(zg). Na fig. 10 przedstawiono hodowlę szczepu Z. rouxii ATCC [psrt(ax)-09] w fermentatorze. Na fig. U przedstawiono hodowlę mutanta pochodzącego ze szczepu Z.rouxii ATCC [psrt(ax)-09] w fermentatorze. I. Definicje W poniższym opisie powszechnie używa się szereg terminów wykorzystywanych w technologii zrekombinowanego DNA. Aby zapewnić klarowne i jednoznaczne zrozumienie opisu i zastrzeżeń, w tym również zakres tych terminów, poniżej podano odpowiednie definicje. Źródło węgla inne niż ksyloza lub ksyluloza. W użytym znaczeniu określenie źródło węgla inne niż ksyloza lub ksyluloza oznacza substrat węglowy do wytwarzania ksylitolu inny niż D-ksyloza i D-ksyluloza, ich polimery lub oligomery albo ich mieszaniny (takie jak ksylan i hemiceluloza). Źródło węgla korzystnie podtrzymuje wzrost genetycznie zmodyfikowanych metodami inżynierii genetycznej drobnoustrojowych komórek gospodarzy według wynalazku, oraz fermentację w gospodarzach drożdżowych. Wiele tanich i łatwo dostępnych związków można zastosować jako źródło węgla do wytwarzania ksylitolu w drobnoustrojowych komórkach gospodarzach według wynalazku, w tym D-glukozę i różne syropy zawierające D-glukozę oraz mieszaniny D-glukozy z innymi cukrami. Określenie to obejmuje również inne cukry przyswajane przez gospodarzy według wynalazku translacji z uwagi na obecność translacyjnych kodonów stopu w sekwencji anty sensownego RNA. Określenie komplementarny DNA lub gen cdna obejmuje zrekombinowane geny syntetyzowane np. w wyniku odwrotnej transkrypcji mrna, w związku z czym nie zawierają one zakłócających sekwencji (intronów). Klony genowe z genomowego DNA będą zazwyczaj zawierać introny. Nośnik klonowania. Plazmidowy lub fagowy DNA albo inna sekwencja DNA zdolna do przenoszenia informacji genetycznej, w szczególności DNA, w komórce gospodarzu. Nośnik klonowania często charakteryzuje się tym, że zawiera jedno lub niewielką liczbę miejsc rozpoznawania przez endonukleazę, w których takie sekwencje DNA mogą być rozcinane w ustalony sposób bez utraty zasadniczej funkcji biologicznej nośnika i do których można włączać wymagane DNA w tym celu, aby wywołać jego klonowanie w komórce gospodarzu. Nośnik klonowania może ponadto zawierać marker przydatny do wykorzystania przy identyfikacji komórek transformowanych nośnikiem klonowania, oraz źródła replikacji, które umożliwiają utrzymanie i rep likację nośnika w jednym lub więcej gospodarzach prokariotycznych lub eukariotycznych. Markery dotyczą np. oporności na tetracyklinę lub oporności na ampicylinę. Określenie wektor używa się czasami zamiast nośnika klonowania. Plazmid jest nośnikiem klonowania, zazwyczaj kołowego DNA, który utrzymywany jest i ulega autonomicznie replikacji w co najmniej jednej komórce gospodarzu. Nośnik ekspresji. Nośnik lub wektor zbliżony do nośnika klonowania, ale który podtrzymuje ekspresję genu, w którym został on sklonowany, po przetransformowaniu do gospodarza. Klonowany gen zazwyczaj umieszcza się pod kontrolą (to znaczy w połączeniu funkcjonalnym) pewnych sekwencji kontrolnych takich jak sekwencje promotorowe, które m ogą być dostarczane przez nośnik lub przez zrekombinowaną konstrukcję klonowanego genu. Sekwencje kontrolujące ekspresję będą zmieniać się w zależności od tego czy wektor przeznaczony do tego, by wytwarzać w wyniku ekspresji gen połączony funkcjonalnie w gospodarzu prokariotycznym czy w eukariotycznym, a ponadto mogą zawierać elementy transkrypcyjne takie jak elementy wzmacniacza ( w górę od sekwencji aktywacji) oraz sekwencje zakończania i/lub miejsca inicjowania i zakończania translacji. Gospodarz. Gospodarzem jest komórka, prokariotyczna lub eukariotyczna, która wykorzystywana jest jako odbiorca lub nośnik zrekombinowanego materiału.

8 Gospodarz według wynalazku. Gospodarz według wynalazku jest gospodarzem drobnoustrojowym, który z natury nie wytwarza w znacznych ilościach ksylitolu w czasie fermentacji, ze znanych źródeł węgla innych niż D-ksyloza i D-ksyluloza, ich polimery lub oligomery lub mieszaniny, ale został zmodyfikowany metodami inżynierii genetycznej, aby mógł go wytwarzać, zgodnie ze sposobami według wynalazku. Znaczna ilość oznacza ilość umożliwiającą wydzielanie ksylitolu w postaci czystej lub ilość, którą można łatwo zmierzyć technikami analitycznymi zazwyczaj wykorzystywanymi w analizie węglowodanów w drobnoustrojowym bulionie fermentacyjnym. Dehydrogenaza arabitolowa. Znane są dwa typy dehydrogenaz D-arabitolowych: wytwarzająca D-ksylulozę (EC ) oraz wytwarzająca D-rybozę. Dehydrogenazy wytwarzające D-rybozę znaleziono w dzikich drożdżach i grzybach. Dehydrogenazy arabitolowe wytwarzające D-ksylulozę zostały znalezione jedynie w bakteriach. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie wzmianki i odsyłacze w opisie dotyczące dehydrogenazy arabitolowej odnoszą się do dehydrogenazy arabitolowej wytwarzającej D-ksylulozę. Gałąź utleniająca drogi pentoza-fosforan. Określenie gałąź utleniająca drogi pentoza-fosforan obejmuje tą część bocznika pentoza-fosforan, która katalizuje reakcje utleniania, takie jak reakcje katalizowane przez dehydrogenazę 6-fosforanu D-glukozy (EC ) i/lub dehydrogenazę 6-fosfo-D-glukonianu (EC ), w których wykorzystywane są substraty heksozowe i powstają fosforany pentoz. Nie utleniająca część drogi pentoza-fosforan (która również katalizuje bezpośrednie powstawanie rybozy z D-glukozy) charakteryzuje się nieutleniającymi izomeryzacjami takimi jak reakcje katalizowane przez izomerazę 5-fosforanu rybozy, D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazę i transaldolazę. Patrz Biological Chemistry, R.H. Mahler i i E. H. Cordes, Harper & Row, wydawcy, New York, 1966, str Pochodne funkcyjne. Funkcyjną pochodną białka lub kwasu nukleinowego jest cząsteczka stanowiąca chemiczną lub biochemiczną pochodną otrzymaną z tego białka lub kwasu nukleinowego, która zachowuje biologiczną aktywność (funkcyjną lub strukturalną), którą charakteryzuje się rodzime białko lub kwas nukleinowy. Określenie funkcyjna pochodna obejmuje również fragmenty, warianty, analogi lub pochodne chemiczne cząsteczki, które zachowują pożądaną aktywność cząsteczki rodzimej. W opisie cząsteczkę określa się jako chemiczną pochodną innej cząsteczki, gdy zawiera ona dodatkowe grupy chemiczne nie stanowiące normalnie części cząsteczki. Grupy takie mogą zwiększać rozpuszczalność, absorpcję, okres biologicznego półtrwania cząsteczki itp. Grupy mogą zmniejszać toksyczność cząsteczki, eliminować lub osłabiać niepożądane działanie uboczne cząsteczki itp. Grupy zdolne do wywierania takich efektów opisane są w Remington s Pharmaceutical Sciences (1980). Procedury sprzęgania takich grup z cząsteczką są dobrze znane. Fragment. Fragment cząsteczki takiej jak białko lub kwas nukleinowy oznacza część rodzimej genetycznej sekwencji aminokwasów lub nukleotydów, a zwłaszcza funkcyjne pochodne według wynalazku. Wariant lub analog. Wariant lub analog białka lub kwasu nukleinowego oznacza cząsteczkę zasadniczo podobną strukturalnie lub pod względem aktywności biologicznej do cząsteczki rodzimej, taką jak cząsteczka kodowana przez allel funkcyjny. II. Konstrukcja dróg przemian metabolicznych dla biosyntezy ksylitolu Według wynalazku przeprowadza się taką manipulację dróg przemian metabolicznych drobnoustrojowego gospodarza, aby osłabić lub wyeliminować wykorzystanie węgla w innych celach niż wytwarzanie ksylitolu. Wszyscy tacy gospodarze wytwarzają ksylitol w jednym etapie fermentacji. W jednym wykonaniu gospodarze według wynalazku mogą wykazywać aktywność dehydrogenazy ksylitolowej (EC ) w stopniu wystarczającym do wytwarzania ksylitolu. Jednakże, jak to opisano poniżej, w tych gospodarzach, w których pożądana jest nadprodukcja dehydrogenazy ksylitolowej, zrekombinowane geny kodujące dehydrogenazę ksylitolową mogą być transformowane do komórek gospodarzy. W praktycznej realizacji wynalazku gospodarze według wynalazku charakteryzują się zdolnością do syntetyzowania ksylitolu ze strukturalnie niezbyt podobnych źródeł węgla takich

9 jak D-glukoza, a nie po prostu z D-ksylozy i/lub D-ksylulozy. Gospodarze według wynalazku są również zdolni do wydalania zsyntetyzowanego ksylitolu do ośrodka. W szczególności w przykładowych i korzystnych wykonaniach gospodarze według wynalazku charakteryzują się występowaniem jednej z dwóch dróg przemian. Po pierwsze występowaniem drogi przemiany, w której arabitol stanowi związek pośredni przy wytwarzaniu ksylitolu, a po drugie występowaniem drogi przemiany, w której do wytwarzania ksylitolu wykorzystuje się 5-fosforan ksylulozy w wyniku reakcji odfosforylowania i redukcji. W związku z tym gospodarze według wynalazku charakteryzuj a się co najmniej jedną z następujących modyfikacji genetycznych: (1) wykonane zostało klonowanie genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej wytwarzającej D-ksylulozę (EC ), dzięki czemu uzyskuje się konwersję D-arabitolu do D-ksylulozy (cecha drogi przemiany I); i/lub (2) natywny gen gospodarza kodujący aktywność transketolazową został zdezaktywowany (cecha drogi przemiany II). Dodatkowo wykonać można szereg innych modyfikacji gospodarza, tak aby zwiększyć jego zdolność do wytwarzania ksylitolu. Tak np. gospodarzy opisanych w (1) i (2) można dodatkowo zmodyfikować tak, że: (3) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy ksylitolowej (EC ); (3) natywny gen gospodarza kodujący D-ksylulokinazę (EC ) został zdezaktywowany; (4) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy (EC ); (4) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianowej (EC ); oraz (5) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność D-rybulozo -5-fosforano-3-epimerazy (EC ). W korzystnym wykonaniu gospodarze według wynalazku wykazują więcej niż jed n ą z wyżej podanych modyfikacji genetycznych. Tak np. w korzystnym wykonaniu według wynalazku węgiel przechodzi z D-arabitolu bezpośrednio do (to znaczy w jednym etapie) D-ksylulozy i z D-ksylulozy bezpośrednio do ksylitolu. W związku z tym w takim wykonaniu gospodarz według wynalazku został tak zmodyfikowany, że zostało w nim wykonane klonowanie genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej wytwarzającej D-ksylulozę oraz gen kodujący dehydrogenazę ksylitolową (EC ). Należy podkreślić, że jakkolwiek w wielu rozwiązaniach D-arabitol jest wewnętrznie syntetyzowany z innych źródeł węgla przez gospodarzy według wynalazku, to może on być również dodany z zewnątrz bezpośrednio do pożywki. W innym korzystnym wykonaniu droga biosyntezy ksylitolu nie obejmuje arabitolu jako związku pośredniego. Następuje raczej przechodzenie węgla z 5-fosforanu D-ksylulozy do D-ksylulozy i dalej do ksylitolu. Gdy D-glukozę stosuje się jako źródło węgla, węgiel może przechodzić przez część utleniającą drogi przemiany pentoza-fosforan, z D-glukozy poprzez 6-fosforan D-glukozy i 6-fosfo-D-glukonian do 5-fosforanu D-rybulozy. Fosforan D-rybulozy może następnie ulegać epimeryzacji do 5-fosforany D-ksylulozy, odfosforylowaniu do D-ksylulozy i redukcji do ksylitolu. W związku z tym gospodarz według wynalazku stosowany w takim wykonaniu powinien stanowić gospodarz, w którym: (a1) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosforanu D-glukozy (EC ) lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub (a2) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy 6-fosfo-D-glukonianowej (EC ) lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub

10 (a3) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazy lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub (a4) przeprowadzone zostało klonowanie w gospodarzu genu kodującego białko wykazujące aktywność dehydrogenazy ksylitolowej (EC ) lub gen natywny gospodarza ulega nadekspresji; i/lub (b) natywny gen transketolazy został zdezaktywowany; i/lub (c) natywny gen gospodarza kodujący aktywność ksylulokinazy (EC ) został zdezaktywowany. Etap odfosforylowania (konwersja fosforanu D-ksylulozy do D-ksylulozy) jest jednym etapem katalizowanym przez enzym, który nie został scharakteryzowany w postaci czystej. Jednakże wykazano, że aktywność enzymatyczna odpowiedzialna za podobny etap (konwersja 5-fosforany D-rybulozy do D-rybulozy) w natywnej drodze wytwarzania D-arabitolu przez drożdże osmofilowe jest niespecyficzna i zdolna jest również do katalizowania odfosforylowania 5-fosforany D-ksylulozy (J.M.Ingram i W. A. Wood, J. Bacteriol. 89: (1965)). Mutacja transketolazy i nadekspresja dwóch dehydrogenaz utleniającej drogi przemiany pentoza-fosforan służy dwóm celom. Po pierwsze mogą one zwiększyć wydajność drogi przemiany I zwiększając ilość 5-fosforanu rybulozy w komórce i w konsekwencji wytwarzanie arabitolu i ksylitolu. Po drugie w wyniku tej samej kombinacji modyfikacji może wystąpić nadmierne nagromadzenie się 5-fosforany ksylulozy, niezbędne do zajścia drogi przemiany II. Z tego względu sposoby z wykorzystaniem występującej w przyrodzie drogi przemiany prowadzącej do powstawania D-arabitolu z różnych źródeł węgla i przedłużenie tej drogi o dwie reakcje w celu przekształcenia D-arabitolu w ksylitol nie stanowią jedynej możliwej drogi przemiany objętej zakresem wynalazku. Skonstruować można inne drogi przemiany prowadzące do ksylitolu jako końcowego produktu metabolicznego, nie obejmujące D-arabitolu jako związku pośredniego. I tak drogę przemiany do ksylitolu z 5-fosforanu D-rybulozy można zrealizować na drodze więcej niż jednego łańcucha reakcji. 5-fosforan D-rybulozy może zostać wydajnie przekształcony w 5-fosforan D-ksylulozy przez D-rybulozo-5-fosforano-3-epimerazę, a jeśli dalszej konwersji 5-fosforany D-ksylulozy zapobiegnie się w wyniku mutacji w genie transketolazy, to nagromadzony 5-fosforan D-ksylulozy może zostać odfosforylowany przez tą samą niespecyficzną fosfatazę co 5-fosforan D-rybulozy (J.M. Ingram i inni, J. Bacteriol. 89: (1965)) oraz zredukowany do ksylitolu przez dehydrogenazę ksylitolową. Realizacja takiej drogi przemiany może dodatkowo wymagać dezaktywacji genu D-ksylulokinazy, aby zminimalizować straty energii spowodowane jałową pętlą 5-fosforan D-ksylulozy > D-ksyluloza -> 5-fosforan D-ksylulozy. Dodatkowa zmiana genetyczna - wprowadzenie i (nad)ekspresja genu D-rybuloki nazy (EC ) może zminimalizować równoczesne wytwarzanie D-arabitolu przez takie szczepy wiążąc D-rybulozę wytworzoną przez niespecyficzną fosfatazę. D-rybuloza może zostać z powrotem przekształcona w fosforan D-rybulozy, a następnie w 5-fosforan D-ksylulozy. III. Konstrukcja gospodarzy według wynalazku Metoda wytwarzania metodami inżynierii genetycznej gospodarzy według wynalazku jest ułatwiona w wyniku wydzielania i częściowego sekwencjonowania czystego białka kodującego interesujący enzym lub klonowania sekwencji genetycznych zdolnych do kodowania takiego białka z wykorzystaniem technologii łańcuchowych reakcji polimerazowych; oraz w wyniku ekspresji takich sekwencji genetycznych. W użytym znaczeniu określenie sekwencje genetyczne odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego (korzystnie DNA). Sekwencje genetyczne zdolne do kodowania białka pochodzą z różnych źródeł. Do źródeł tych należy genomowy DNA, cdna, syntetyczny DNA i ich kombinacje. Korzystnym źródłem genomowego DNA jest genomowa biblioteka drożdży. Korzystnym źródłem cdna jest biblioteka cdna wytworzona z mrna drożdży hodowanych w warunkach znanych z tego, że indukują ekspresję pożądanego mrna lub białka.

11 cdna według wynalazku nie obejmuje występujących w naturze intronów, jeśli cdna został wytworzony z wykorzystaniem dojrzałego mrna jako matrycy. Genomowy DNA według wynalazku może, lecz nie musi obejmować występujące w naturze introny. Ponadto uzyskać można taki genomowy DNA zasocjowany z obszarem 5' promotora sekwencji genomowych i/lub z obszarem 3' terminacji transkrypcyjnej. Ponadto uzyskać można taki genomowy DNA w asocjacji z sekwencjami genetycznymi, które kodują nietranslatowany obszar 5' mrna i/lub z sekwencjami genetycznymi, które kodują nietranslatowany obszar 3'. W takim stopniu, aby komórka gospodarz mogła rozpoznawać transkrypcyjne i/lub translacyjne sygnały regulatorowe związane z ekspresją mrna i białka, nietranslatowane obszary 5' i/lub 3' obszary natywnego genu i/lub nietranslatowane obszary 5' i/lub 3' mrna można zachować i wykorzystać w regulacji transkrypcyjnej i translacyjnej. Genomowy DNA można wydzielić z komórki dowolnego gospodarza, zwłaszcza z gospodarza drożdżowego, a następnie oczyścić go, dobrze znanymi sposobami (patrz np. Guide to Molecular Cloning Techiques, S.L. Berger i inni, red., Academic Press (1987)). Korzystnie stosowany preparat mrna będzie wzbogacony w mrna kodujący pożądane białko, w sposób naturalny, w wyniku wydzielenia z komórek wytwarzających duże ilości białka, albo in vitro, technikami powszechnie stosowanymi do wzbogacania preparatów mrna w specyficzne sekwencje, takimi jak wirowanie z gradientem sacharozy, albo też obydwoma technikami. W przypadku klonowania w wektorze takie odpowiednie preparaty DNA (genomowego DNA lub cdna) przypadkowo rozciera się lub rozszczepia enzymatycznie i liguje się z odpowiednimi wektorami uzyskując bibliotekę zrekombinowanego genu (genomową lub cdna). Sekwencję DNA kodującą pożądane białko lub jej funkcyjne pochodne wstawić można do wektora DNA znanymi technikami obejmującymi tworzenie końcówek z tępymi końcami i ze skośnymi końcami do ligowania, trawienie enzymem restrykcyjnym w celu uzyskania odpowiednich końcówek, odpowiednie wypełnianie lepkich końców, obróbkę fosfatazą alkaliczną w celu uniknięcia niepożądanych połączeń oraz ligowanie z odpowiednimi ligazami. Techniki takich manipulacji opisane sąprzez T. Maniatisa (T. Maniatis i inni, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, II wyd., 1988) i są dobrze znane. Biblioteki zawierające sekwencje kodujące pożądany gen można poddać selekcjonowaniu i sekwencję pożądanego genu zidentyfikować dowolnym sposobem specyficznie wybierającym sekwencję kodującą taki gen lub białko, takim jak np. a) hybrydyzacja z odpowiedniąsondą(sondami) kwasu nukleinowego, które zawierają sekwencję specyficzną względem DNA tego białka, B) analiza translacyjna wybrana na podstawie hybrydyzacji, w której przeprowadza się translację in vitro natywnego mrna hybrydyzującego z danym klonem, po czym dokładniej charakteryzuje się produkty translacji, albo c) w przypadku gdy klonowane sekwencje genetyczne są same zdolne do ekspresji mrna, przeprowadza się immunoprecypirację produktu translacji białka wytworzonego przez gospodarza zawierającego klon. Sondy oligonukleotydowe specyficzne względem określonego białka, które można wykorzystać do identyfikacji klonów tego białka można zaprojektować na podstawie znajomości sekwencji kwasów nukleinowych w DNA kodującym takie białko lub białko pokrewne. Alternatywnie wyhodować można przeciwciała przeciw oczyszczonym formom białka i zastosować je do identyfikacji obecności unikatowych determinantów białkowych w transformantach, które wytwarzają w wyniku ekspresji pożądane klonowane białko. Sekwencję reszt aminokwasów w peptydzie określa się stosując ich powszechnie wykorzystywane trzyliterowe oznaczenia lub ich oznaczenia jednoliterowe. Zestawienie takich trzyliterowych i jednoliterowych oznaczeń można znaleźć w podręcznikach takich jak Biochemistry, A. Lehninger, Worth Publishers, New York NY, (1970). Gdy sekwencję aminokwasów przedstawia się poziomo, to o ile nie zaznaczono tego inaczej, koniec aminowy znajduje się na lewym końcu, a koniec karboksylowy znajduje się na prawym końcu. Podobnie, o ile nie zaznaczono inaczej, w sekwencji kwasów nukleinowych koniec 5' znajduje się z lewej strony. Z uwagi na to, że kod genetyczny jest wieloznaczny, więcej niż jeden kodon można wykorzystać do kodowania określonego aminokwasu (J.D. Watson, w: Molecular Biology od the Gene, 3 wyd., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA(1977), str ). Fragmenty peptydu

12 analizuje się w celu zidentyfikowania sekwencji aminokwasów, które mogą być kodowane przez oligonukleotydy o najniższym stopniu wieloznaczności. Korzystnie towarzyszy temu identyfikacja sekwencji, które zawierają aminokwasy kodowane tylko przez jeden kodon. Jakkolwiek przypadkowo sekwencja aminokwasów może być kodowana tylko przez pojedynczą sekwencję oligonukleotydową, to często sekwencja aminokwasów może być kodowana przez dowolną z zestawu podobnych oligonukleotydów. Ważne jest jednak to, że jakkolwiek wszystkie elementy takiego zestawu zawierają sekwencję oligonukleotydową, które sązdolne do kodowania tego samego fragmentu peptydu i w związku z tym potencjalnie zawierają taką samą sekwencję oligonukleotydową jak gen, który koduje fragment peptydu, to jednak tylko jeden element w zestawie zawiera sekwencję nukleotydów identyczną z sekwencją genu kodującą egzon. Ponieważ element ten znajduje się w tym zestawie i jest zdolny do hybrydyzacji z DNA nawet w obecności innych elementów zestawu, można zastosować niefrakcjonowany zestaw oligonukleotydów w taki sam sposób, jak stosuje się jeden oligonukleotyd, do klonowania genu kodującego peptyd. Wykorzystując kod genetyczny zidentyfikować można jeden lub więcej oligonukleotydów na podstawie sekwencji aminokwasów, przy czym każdy z nich może być zdolny do kodowania pożądanego białka. Prawdopodobieństwo, że określony oligonukleotyd będzie rzeczywiście zawierał odpowiednią sekwencję kodującą białko, można oszacować biorąc pod uwagę zależności nienormalnego parowania zasad oraz częstotliwość, z jaką określony kodon jest rzeczywiście wykorzystywany (do kodowania określonego aminokwasu) w komórkach eukariotycznych. Wykorzystując zasady wykorzystywania kodonów identyfikuje się pojedynczą sekwencję oligonukleotydową lub zestaw sekwencji oligonukleotydowych, który zawiera teoretycznie najbardziej prawdopodobną sekwencję niezdolną do kodowania sekwencji białkowych. Odpowiedni oligonukleotyd lub zestaw oligonukleotydów zdolny do kodowania fragmentu pewnego genu (albo komplementarny z takim oligonukleotydem lub zestawem oligonukleotydów) można zsyntetyzować powszechnie znanymi sposobami (patrz np. Synthesis and Application of DNAandRNA, S.A. Narang,red., 1987, Academic Press, San Diego, CA) i zastosować jako sondę do identyfikacji i wydzielania klonu takiego genu, z wykorzystaniem znanych technik. Sposoby hybrydyzacji kwasu nukleinowego i identyfikacji klonu opisane sąprzez T. Maniatisa i innych w Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982) oraz przez B.D. Hamesa i innych w Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)). Te elementy opisanej powyżej biblioteki genów, których zdolność do takiej hybrydyzacji została potwierdzona, analizuje się następnie w celu ustalenia długości i charakteru zawartych w nich sekwencji kodujących. Aby ułatwić wykrywanie pożądanej sekwencji kodującej DNA opisaną powyżej sondę DNA znakuje się możliwą do wykrycia grupą. Taką wykrywalną grupę może stanowić dowolny materiał o wykrywalnych właściwościach fizycznych lub chemicznych. Materiały takie są dobrze znane w technikach hybrydyzacji kwasów nukleinowych, tak że zasadniczo większość znaczników stosowanych w takich metodach zastosować można w sposobie według wynalazku. Szczególnie przydatne są znaczniki radioaktywne takie jak 32P, 3H, 14C, 35S,,125I itp. Zastosować można dowolny znacznik radioaktywny dający wymagany sygnał i wykazujący odpowiedni okres półtrwania. Jeśli oligonukleotyd jest jednoniciowy, to można go znaczyć radioaktywnie wykorzystując reakcję kinazy. Jako sondy hybrydyzacji kwasów nukleinowych przydatne mogą być również polinukleotydy znaczone nieradioaktywnym markerem takim jak biotyna, enzym lub grupa fluorescencyjna. W związku z tym ustalenie częściowej sekwencji białka umożliwia identyfikację teoretycznie najbardziej prawdopodobnej sekwencji DNA lub zestawu takich sekwencji, zdolnych do kodowania takiego peptydu. Konstruując oligonukleotyd komplementarny z taką teoretyczną sekwencją (lub konstruując zestaw oligonukleotydów komplementarnych z takim zestawem najbardziej prawdopodobnych oligonukleotydów) uzyskuje się cząsteczkę DNA (lub zestaw cząsteczek DNA), zdolnych do działania jako sonda (sondy) do identyfikacji i wydzielania klonów zawierających gen.

13 W alternatywnym sposobie klonowania genu wytwarza się bibliotekę stosując wektor ekspresji w wyniku klonowania DNA lub, jeszcze korzystniej, cdna uzyskanego z komórki zdolnej do ekspresji białka, w wektorze ekspresji. Bibliotekę selekcjonuje się następnie w celu wyodrębnienia elementów wytwarzających w wyniku ekspresji pożądane białko, np. selekcjonując bibliotekę za pomocą przeciwciał białka. Powyższymi sposobami można w związku z tym zidentyfikować sekwencje genetyczne zdolne do kodowania białka albo biologicznie czynnych lub antygenowych fragmentów tego białka. W celu dokładniejszego scharakteryzowania takich sekwencji genetycznych oraz w celu wytworzenia zrekombinowanego białka pożądane jest wykonanie ekspresji białek, które kodują te sekwencje. Ekspresja taka identyfikuje te klony, które wytwarzają w wyniku ekspresji białka wykazujące charakterystykę białka pożądanego. Do takich charakterystyk może należeć między innymi zdolność do specyficznego wiązania przeciwciała, zdolność do inicjowania wytwarzania przeciwciała, które jest zdolne do wiązania się z natywnym, niezrekombinowanym białkiem, zdolność do nadawania aktywności enzymatycznej komórce, będącej właściwością białka, oraz zdolność do nadawania nieenzymatycznego (ale specyficznego) działania komórce biorczej. Sekwencję DNA można skrócić znanymi sposobami w celu wydzielenia pożądanego genu z obszaru chromosomowego, który zawiera więcej informacji, niż to jest konieczne przy zastosowaniu tego genu w gospodarzach według wynalazku. Tak np. wykorzystać można trawienie restrykcyjne w celu rozszczepienia sekwencji o pełnej długości w wymaganym miejscu. Alternatywnie lub dodatkowo zastosować można nukleazy, które odszczepiają od końca 3' cząsteczki DNA, w celu strawienia pewnej sekwencji i uzyskania skróconej formy, przy czym sekwencję o wymaganej długości identyfikuje się i oczyszcza metodami elektroforezy żelowej i sekwencjonowania DNA. Do takich nukleaz należy np. egzonukleaza III i Bal 31. Inne nukleazy są dobrze znane. W praktycznej realizacji wynalazku jako model zastosowano drożdże osmofilowe Z. rouxii. Z. rouxii można zastosować przy wytwarzaniu środków spożywczych, gdyż są one tradycyjnie stosowane w Japonii do wytwarzania sosu sojowego. Drożdże zostały np. opisane w publikacji The Yeast, A Taxonomic Study, Kreger-van Rijn (red.), Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1984, w której drożdże te opisano na stronach Inne drożdże wytwarzające D-arabitol, takie jak Candida polymorpha, Torulopsis candida, Candida tropicalis, Pichia farinosa, Torulospora hansenii itp., a także grzyby wytwarzające D-arabitol, takie jak Dendryp hiella salina lub Schizophyllum commune, można także zastosować jako organizmy - gospodarze w sposobie według wynalazku. Wiadomo, że enzymy utleniające D-arabitol do D-ksylulozy (C ) występują w bakteriach, a nie występują w drożdżach i grzybach. W związku z tym Klebsiella terrigena stanowi korzystne źródło genu dehydrogenazy D-arabitolowej (wytwarzającej D-ksylulozę), gdyż jest to niepatogeniczna bakteria glebowa, wykazująca wysoką pobudzaną aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej. Szczep Klebsiella terrigena Phpl zastosowany w przykładach uzyskano do K. Haahteli, Uniwersytet w Helsinkach. Wydzielanie szczepu opisali Haahtela i inni, App. Env. M i- crobiol. 45: (1983). Klonowanie genu dehydrogenazy D-arabitolowej można dogodnie przeprowadzić konstruując bibliotekę genomową chromosomowego DNA K. terrigena w odpowiednim wektorze, np. w dobrze znanym i dostępnym w skali technicznej plazmidzie puc19. Bibliotekę tę transformuje się do jednego z wielu szczepów E. coli, zdolnych do wykorzystywania D-ksylulozy, ale nie D-arabitolu jako jedynego źródła węgla. Przykład odpowiedniego szczepu stanowi szczep E. coli SCSI dostępny ze Stratagene. Transformanty posiewa się następnie na pożywce zawierającej D-arabitol jako jedyne źródło węgla i wydziela się klony zdolne do rozwoju na takiej pożywce. Obszar kodujący dehydrogenazy D-arabitolowej K. terrigena można dogodnie wydzielić w postaci fragmentu 1,38 kb Bc1l-Clal i wykonać fuzję z sekwencjami odpowiedniego promotora i transkrypcyjnego terminatora. Promotor i terminator transkrypcyjny Saccharomyces cerevisiae ADCI stanowią przykłady transkrypcyjnych elementów regulatorowych przydatnych w realizacji wynalazku, gdy drożdże Z. rouxii stosuje się jako organizm - gospodarza. Sekwencje ADCI dostępne są z GenBank.

14 Jakkolwiek większość D-ksylulozy i grzybów zawiera gen dehydrogenazy ksylitolowej (EC ), nadekspresja tego genu będzie zazwyczaj konieczna przy realizacji wynalazku. Klonowanie genu XYL2 Pichia stipitis kodującego dehydrogenazę ksylitolową (EC ) można dogodnie przeprowadzić zgodnie z technologią łańcuchowych reakcji polimerazowych, wykorzystując opublikowaną informację dotyczącą sekwencji nukleotydowej genu XYL2 (K tte r i inni, Curr. Genet. 18: (1990)). Gen można wprowadzić do innego gatunku drożdży bez jakiejkolwiek modyfikacji wykonując ekspresję pod kontrolą jego własnego promotora, albo też promotor można wymienić na inny silny promotor drożdżowy. Wykonać można konstrukcje genetycznie stabilnych transformantów z układami wektorowymi lub z układami transformującymi, integrując w ten sposób pożądany DNA w chromosomie gospodarza. Taka integracja może wystąpić de novo w komórce, albo może przebiegać z udziałem transformacji wektorem, który funkcyjnie sam wbudowuje się do chromosomu gospodarza, takim jak fag, wektory retrowirusowe, transpozony lub inne elementy DNA, które ułatwiają integrację sekwencji DNA w chromosomach. Geny kodujące dehydrogenazę D-arabitolową i dehydrogenazę ksylitolową (EC ). pod kontrolą odpowiednich promotorów można połączyć w jednej konstrukcji plazmidowej i wprowadzić do komórek gospodarza - organizmów wytwarzających D-arabinozę w wyniku transformacji. Charakter wektora plazmidowego będzie zależeć od organizmów gospodarzy. I tak w korzystnym wykonaniu wynalazku w przypadku Z. rouxii stosuje się wektory zawierające DNA utajonego plazmidu psrl (K. Ushio i inni, J. Ferment. Technol. 66: (1988)). W przypadku innych gatunków drożdży lub grzybów, dla których nie są znane plazmidy ulęgające autonomicznie replikacji, wykorzystać można integrację genów dehydrogenazy ksylitolowej (EC ) i dehydrogenazy D-arabitolowej w chromosomie gospodarza. Skierowanie integracji do rybosomowego locus DNA (DNA kodującego rybosomowe RNA) gospodarza stanowi korzystny sposób przeprowadzenia integracji o dużej liczbie kopii, a wysoki poziom ekspresji dwóch genów dehydrogenazowych tak skierowanych można uzyskać zapewniając w wystarczającej ilości sekwencje zrekombinowanego DNA na zrekombinowanym konstrukcie, tak aby sterować integrację w to właśnie locus. Genetyczne markery wykorzystywane do transformacji drobnoustrojów wytwarzających D-arabitol stanowią korzystnie markery dominatowe z wprowadzoną opornością na różne antybiotyki takie jak gentamycyna lub fleomycyna, na metale ciężkie takie jak miedź itp. Wybieralny gen markera można albo bezpośrednio połączyć z sekwencjądna genu ulegającego ekspresji lub wprowadzić do tej samej komórki na drodze współtransformacji. Poza wprowadzeniem genów dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej (EC ) wykonać można inne modyfikacje genetyczne konstruując nowe szczepy wytwarzające ksylitol. I tak wykonać można nadekspresję genów kodujących enzymy utleniającej drogi przemiany pentoza-fosforan, aby zwiększyć szybkość syntezy 5-fosforanu D-rybulozy, prekursora D-arabitolu. Ponadto zdezaktywować można gen kodujący transketolazę - enzym katalizujący katabolizm 5-fosforanów pentuloz lub 5-fosforanów pentoz, wykorzystując konwencjonalne techniki mutagenezy lub rozbijania genu, co prowadzi do zwiększenia nagromadzenia się fosforanów cukrów o 5 atomach węgla. Dezaktywacja genu D-ksylulokinazy może spowodować wzrost wydajności ksylitolu w wyniku wyeliminowania strat D-ksylulozy na skutek fosforylowania. Kombinację mutacji dezaktywującej transketolazę i nadekspresji 5-epimerazy D-rybulozowej zastosować można w celu stworzenia odmiennego rodzaju drogi wytwarzania ksylitolu, w której D-arabitol nie jest wykorzystywany jako związek pośredni. Do przeprowadzenia ekspresji pożądanego białka i/lub jego aktywnych pochodnych konieczne są sygnały transkrypcyjne i translacyjne rozpoznawane przez odpowiedniego gospodarza. Klonowane sekwencje kodujące uzyskane sposobami opisanymi powyżej, korzystnie w formie dwuniciowej, można połączyć funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi transkrypcyjną ekspresję w wektorze ekspresji, a następnie wprowadzić do komórki gospodarza, prokariotycznego lub eukariotycznego, uzyskując zrekombinowane białko lub jego funkcyjną pochodną. W zależności od tego, którą nić połączy się funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi ekspresję transkrypcyjną, można także osiągnąć ekspresję antysensownego RNA lub jego funkcyjnej pochodnej.

15 W wyniku ekspresji białka w różnych gospodarzach powstać mogą różne portranslacyjne modyfikacje, które m ogą zmienić właściwości białka. Korzystnie wynalazek obejmuje ekspresję białka lub jego funkcyjnej pochodnej w komórkach eukariotycznych, a zwłaszcza w drożdżach. Cząsteczkę kwasu nukleinowego takiego jak DNA, określa się za zdolnądo ekspresji polipeptydu, gdy zawiera ona sekwencje kontrolujące ekspresję, które obejm ują transkrypcyjną informację regulatorową, przy czym sekwencje te są funkcjonalnie połączone z sekwencją nukleotydową, która koduje polipeptyd. Połączenie funkcjonalne stanowi połączenie, w którym sekwencja połączona jest z jedną lub więcej sekwencjami regulatorowymi w taki sposób, aby ekspresja sekwencji przebiegała pod wpływem lub kontrolą sekwencji regulatorowej. Dwie sekwencje DNA (takie jak sekwencja kodująca i sekwencja obszaru promotora połączona z końcem 5' sekwencji kodującej) określa się jako połączone funkcjonalnie, jeśli w wyniku indukcji działania promotora następuje transkrypcja mrna kodującego pożądane białko oraz jeśli charakter połączenia między dwoma sekwencjami DNA (1) nie wpływa na ramkę odczytu sekwencji kodującej, 92) nie zakłóca zdolności regulatorowych sekwencji ekspresyjnych do kierowania ekspresją białka, antysensownego mrna lub (3) nie zakłócają zdolności matrycy DNA do transkrypcji. W związku z tym obszar promotora powinien być funkcjonalnie połączony z sekwencją DNA jeśli promotor ma być zdolny do skutecznej transkrypcji tej sekwencji DNA. Dokładny charakter obszarów regulatorowych niezbędnych do osiągnięcia ekspresji genu może zmieniać się w zależności od gatunków lub typów komórek, z tym że zazwyczaj zawierają one jako niezbędne, 5' nie-transkrybujące i 5' nie-translatujące (nie-kodujące) sekwencje odgrywające rolę odpowiednio w transkrypcji i translacji, takie jak ramka TATA, sekwencja przykrywająca, sekwencja CAAT itp. W szczególności takie kantrolne sekwencje 5' nie transkrybujące będą zawierać obszar obejmujący promotor transkrypcyjnego regulowania funkcjonalnie połączonego genu. Takie transkrypcyjne sekwencje kontrolne mogą również zależnie od potrzeb obejmować sekwencje wzmacniacza lub sekwencje aktywatora w górę. Ekspresja białka w gospodarzach eukariotycznych takich jak drożdże wymaga stosowania obszarów regulatorowych działających w takich gospodarzach, a korzystnie drożdżowych układów regulatorowych. Zastosować można wiele różnych transkrypcyjnych i translacyjnych sekwencji regulatorowych, zależnie od charakteru gospodarza. Korzystnie takie sygnały regulatorowe są zasocjowane w stanie natywnym z określonym genem zapewniającym wysoki poziom ekspresji w komórce gospodarzu. W przypadku eukariotów gdy transkrypcja nie jest połączona z translacją, takie obszary kontrolne może, lecz nie musi, zapewniać kodon inicjatorowy metioniny (AUG), w zależności od tego czy klonowana sekwencja zawiera metioninę. Obszary takie będą zazwyczaj zawierać obszar promotora wystarczający do skierowania zaincjowania syntezy RNA w komórce gospodarzu. Korzystne s ą promotory z genów drożdży kodujących produkt mrna zdolny do translacji, a w szczególności zastosować można silne promotory, pod warunkiem, że działają one jako promotory również w komórce gospodarzu. Do korzystnych silnych promotorów należy promotor genu GALI, promotory genu glikolitycznego takiego jak gen fosfoglicerokinazy (PGK) lub promotor konstytutywnej dehydrogenazy alkoholowej (ADC1) (G.Ammerer, Meth. Enzymol. 101C: (1983); Aho, FEBS Lett. 291: (1991)). Jak to jest powszechnie znane, translacja eukariotycznego mrna inicjowana jest przy kodonie kodującym pierwszą metioninę. Z tego względu korzystnie jest zapewnić, aby połączenie między promotorem eukariotycznym i sekw encją DNA kodującą pożądane białko lub jej funkcyjną pochodną nie zawierało jakichkolwiek zakłócających kodonów, które sązdolne do kodowania metioniny. Obecność takich kodonów wynika albo z powstawania białka fuzyjnego (gdy kodon AUG znajduje się w tej samej ramce odczytu co sekwencja DNA kodująca białko) albo z mutacji przesuwającej ramkę (gdy kodon AUG nie znajduje się w tej samej ramce odczytu co sekwencja kodująca białko). Dobrać można takie sygnały regulatorowe inicjowania transkrypcyjnego, które umożliwiają tłumienie lub aktywację, tak że można będzie modulować ekspresję funkcjonalnie połączonych

16 genów. Interesujące są sygnały regulatorowe wrażliwe na temperaturę, tak że zmieniając temperaturę można będzie tłumić lub inicjować ekspresję, albo są podatne na regulację chemiczną, np. tworząc metabolit. Sygnały translacyjne nie są konieczne, gdy pożądana jest ekspresja antysen sownych sekwencji RNA. W razie potrzeby opisanymi powyżej technikami klonowania uzyskać można nie-transkrynowane i/lub nie-translatowane obszary 3' względem sekwencji kodującej pożądane białko. Obszar 3'-nie-transkrybowany może zostać zachowany z uwagi na jego elementy regulatorowej sekwencji zakończania transkrypcyjnego; obszar 3'-nie-tranlatowany może zostać zachowany z uwagi na jego elementy regulatorowej sekwencji zakończania translacyjnego, albo z uwagi na te elementy, które kierują poliadenylowaniem w komórkach eukariotycznych. Gdy natywne sygnały sekwencji kontrolnych ekspresji nie działają w sposób zadowalający w komórce gospodarza, to sekwencje działające w komórce gospodarza można zamienić. Wektory według wynalazku m ogą ponadto zawierać inne funkcjonalnie połączone elementy regulatorowe takie jak elementy DNA, które nadają oporność na antybiotyki, albo źródła replikacji do utrzymywania wektora w jednej lub więcej komórkach gospodarza. W innym korzystnym wykonaniu, zwłaszcza w przypadku Z. rouxii, wprowadzoną sekwencję wbudowuje się do wektora plazmidowego zdolnego do autonomicznej replikacji w gospodarzu - biorcy. W tym celu wykorzystać można dowolny z wielu wektorów. Do istotnych czynników uwzględnianych przy doborze konkretnego wektora plazmidowego lub wirusowego należą: łatwość z jaką komórki biorcze, które zawierają wektor, można rozpoznawać i odróżniać od tych komórek biorczych, które nie zawierająwektora; liczba wymaganych kopii wektora w konkretnym gospodarzu; oraz to, czy pożądana jest możliwość wymiany wektora między komórkami gospodarzami różnych gatunków. Korzystne plazmidy drożdżowe zależą od gospodarza. W przypadku Z. rouxii korzystnie stosuje wektory oparte na natywnych utajonych plazmidach psrl (E. Toh i inni, J. Bacteriol. 151: (1982)), psb1, psb2, psb3 lub psb4 (E. Toh i inni, J. Gen. Microbiol. 130: (1984). Plazmid psrt303d (A. Jeampipatkul i inni, Mol. Gen. Genet. 206: (1987)) stanowi przykład użytecznego wektora plazmidowego dla drożdży Zygosaccharomyces. Po wytworzeniu wektora lub sekwencji DNA zawierającej konstrukcję (konstrukcje) w celu wykonania ekspresji, konstrukcję (konstrukcje) DNA wprowadza się do odpowiedniej komórki gospodarza dowolnym z wielu różnych sposobów takich jak transformacja. Po wprowadzeniu wektora komórki biorcze hoduje się w selektywnej pożywce zapewniającej selekcję z uwagi na wzrost komórek zawierających wektor. W wyniku ekspresji jednej lub więcej klonowanych sekwencji genów powstaje pożądane białko, albo też fragment tego białka. Ekspresja taka może zachodzić w sposób ciągły w transformowanych komórkach, albo też w sposób kontrolowany, np. w wyniku zainicjowania ekspresji. W celu skonstruowania gospodarzy według wynalazku, którzy zostali zmienieni w taki sposób, że nie może już w nich zachodzić ekspresja pewnego produktu genowego, przeprowadzić można miejscowo ukierunkowaną mutagenezę z wykorzystaniem znanych technik, takich jak rozbicie genu (R.S. Rothstein, Meth. Enzymol. 101C: (1983)). IV Wytwarzanie ksylitolu Gdy zrekombinowane drożdże wytwarzające arabitol, korzystnie drożdże osmofilowe, zastosuje się jako gospodarzy według wynalazku, mogą one rozwijać się na pożywce o wysokim ciśnieniu osmotycznym, np. na pożywce zawierającej 10-60% D-glukozy, a korzystnie 25% D-glukozy. ( Normalna pożywka zazwyczaj zawiera zaledwie 2-3% glukozy. Pożywka o wysokim ciśnieniu osmotycznym wywołuje wytwarzanie D-arabitolu w dzikich szczepach drożdży osmofilowych takich jak Z. rouxii. Pożywkę hodowlaną dla zrekombinowanych i kontrolnych (dzikich) szczepów analizuje się znanymi sposobami, w różnych odstępach czasu hodowli, w celu oznaczenia zawartości ksylitolu. W warunkach hodowli nie zoptymalizowanych pod względem maksymalnej wydajności D-arabitolu szczep Z. rouxii ATCC13356 [psrt (AX)-9] wytwarza i wydziela do pożywki zarówno ksylitol jak i D-arabitol. Tylko D-arabitol wykrywany jest

17 w hodowli szczepu kontrolnego. Wydajność ksylitolu w pierwszych próbach [patrz tabela 4 w przykładzie 4] po 48 godzinach hodowli wynosiła około 7,7 g/litr. Ksylitol można wyodrębniać z pożywki dla gospodarza według wynalazku i oczyszczać dowolnym ze znanych sposobów. Tak np. w patencie USA nr , który wprowadza się jako źródło literaturowe, opisano chromatograficzne wydzielanie ksylitolu z hodowli drożdżowych. W związku z tym po etapie fermentacji ksylitol można wyodrębniać z hodowli i oczyszczać z wykorzystaniem etapów chromatografii opisanych w patencie USA nr , przeprowadzając następnie krystalizację. Przykłady Przykład 1. Klonowanie bakteryjnego genu dehydrogenazy D-arabitolowej Klebsiella terrigena Phpl (otrzymane od K. Haahteli, Uniwersytet w Helsinkach, patrz Haahtelaiinni, Appl. Env. Microbiol. 45: (1983)) hodowano w 1 litrze pożywki L B (1%tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl) przez noc w 30 C. Komórki bakteryjne (około 5 g) odwirowano, przemyto raz TE (10 mm tris-hcl, 1 mm EDTA, ph 7,5) i ponownie zawieszono w TE zawierającym 1 % dodecylosiarczanu sodowego i 200 µg/ml proteinazy K. Zawiesinę inkubowano w 37 C przez 30 minut, po czym wyekstrahowano raj równą objętością fenolu i dwa razy chloroformem. Dodano 3 M octan sodowy (1/10 objętości) i etanol (3 objętości), po czym wytrącone kwasy nukleinowe odwirowano i ponownie rozpuszczono w 5 ml TE. RNA usunięto w wyniku wirowania roztworu w 25 ml 1 M NaCl przez noc z szybkością obrotów/minutę w wirówce Beckman Ti50.2. Uzyskany w ten sposób chromosomowy DNA K. terrigena zawierał fragmenty o przeciętnej wielkości par zasad (bp). DNA strawiono następnie endonukle azą restrykcyjną Sau3A w buforze dostawcy (Boehringera) przy stosunku enzym:dna 5U/mg, aż do zmniejszenia średniej wielkości fragmentu DNA do około 5-10 kb (ocenianej na podstawie elektroforezy na żelu agarozowym). Produkt trawienia frakcjonowano metodą elektroforezy na bloku 0,6% żelu agarozowego o wymiarach 20 x 10 x 0,6 cm w buforze TBE (0,09 M tris-kwas borowy, 1 mm EDTA, ph 8,3) przy 5 V/cm przez noc, po czym wycięto otwór w bloku agarozowym w miejscu odpowiadającym fragmentowi o wielkości około 5 kb, w otwór wstawiono kawałek membrany do dializy i elektroforezę kontynuowano tak długo, aż zasadniczo wszystkie fragmenty DNA o wielkości ponad 5 kb zostaną zaadsorbowane na membranie. Plazmidowy DNA z puc19 (otrzymany z Pharmacia) strawiono endonukleazą restrykcyjną BamHI i bakteryjną fosfatazą alkaliczną stosując bufor i warunki reakcji podane przez producenta. Liniow ą po stać puc19 oczyszczono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu wykorzystując metodę elektroelucji membranowej opisaną powyżej, a następnie zligowano z frakcją 5-15 kb chromosomowego DNA Klebsiella terrigena. Mieszaninę z ligowania zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli SCSI (otrzymanych ze Stratagene) do uzyskania oporności na ampicylinę. W doświadczeniu tym uzyskano około zrekombinowanych klonów. Uśrednione komórki z płytek do transformowania posiano na płytkach z minimalną pożywką zawierającą D-arabitol (1%) jako jedyne źródło węgla. Po 2 dniach inkubowania w 37 C uzyskano szereg kolonii. Plazmidowy DNA wydzielono z dwóch (najszybciej rozwijających się) klonów zastosowano do powtórnego transformowania szczepu HB101 E. coli, niezdolnego do katabolizowania D-arabitolu, ale zdolnego do wykorzystywania D-ksylulozy. Stwierdzono, że wszystkie transformanty wykazują dodatnią próbę wykorzystania D-arabitolu na płytkach McConkeya agarowo-d-arabitolowych (otrzymanych z Difco), podczas gdy klony kontrolne (ten sam szczep transformowany puc19) dały wynik negatywny. Analiza restrykcyjna wykazała, że dwa wydzielone klony zawierają identyczne plazmidy. Jeden z dwóch wydzielonych plazmidów (nazwany parl2) wykorzystano do dalszej analizy. Mapę restrykcyjną klonowanego fragmentu DNA z K. terrigena o 9,5 kb (około) w parl2 zawierającym gen dehydrogenazy D-arabitolowej przedstawiono na fig. 1. Przykład 2. Ekspresja genu bakteryjnej dehydrogenazy D-arabitolowej w drożdżach Z wyjściowego klonu DNA K. terrigena o 9,5 kb, zawierającego gen dehydrogenazy D-arabitolowej fragment Sacl-HindIII o około 1,8 kb subklonowano z wykorzystaniem zwykłych technik rekombinacji DNA stwierdzając, że zawiera on gen dehydrogenazy D-arabitolowej.

18 Plazmid zawierający ten fragment DNA w wektorze puc19 (padh, gdzie ADH oznacza dehydrogenazę D-arabitolową) wydzielono ze szczepu E. coli JM 110, strawiono endonukleazami restrykcyjnymi Bcll i ClaI, po czym fragment DNA o 1,38 kb wydzielono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym. Ten fragment DNA potraktowano fragmentem DNA-poli merazy I Klenowa w obecności wszystkich czterech trifosforanów dezoksynukleotydów i zligowano z drożdżowym wektorem ekspresji paah5 (Ammerer, Meth. Enzymol. 101: (1983)) rozciętym za pom ocą HindIII i zadanym fragmentem Klenowa (fig. 2). Uzyskany plazmid ekspresji, pyard, jest wektorem wrzecionowym E. coli-saccharomyces cerevisiae, zawierającym replikację i gen oporności na ampicylinę pochodzenia bakteryjnego (E. coli), replikację od 2 µm DNA pochodzenia drożdżowego (S. cerevisiae) oraz gen LEU2 do selekcjonowania w drożdżach pochodzenia drożdżowego (S. cerevisiae). Kaseta ekspresji zawiera promotor drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej I (ADC) oraz flankujący terminator transkrypcji (ADCI) funkcjonalnie połączony z genem dehydrogenazy D-arabitolowej K. terrigena. Szczep Saccharomyces cerevisiae GRF18 (MATα, leu-2-3,112, his3-1 1,15) oraz S. cerevi siae DBY746 (ATCC 44773; MATα, leu2-3,112, his3-al, ura3-52 trpl-289) zastosowano jako gospodarze do transformowania opisanym powyżej wektorem ekspresji dehydrogenazy D-arabitolowej pyard, uzyskując takie same wyniki. Transformację przeprowadzono standardową procedurąz chlorkiem litu (Ito i inni, J. Bacteriol. 153: (1983)), stosując marker LEU2 pyard do selekcji transformantów. Transformanty hodowano na ciekłej pożywce w minimalnym ośrodku: 0,67% drożdżowych zasad azotowych ( Difco ), 2% D-glukozy, 100 mg/litr histy dyny i tryptofanu, w 30 C przez noc z wytrząsaniem. Komórki odwirowano, zawieszono w minimalnej objętości 0,1 M fosforanu sodowego buforowanego do ph 6,8, zawierającego 1 mm NAD+ i rozbito 0,5 mm kuleczkami szklanymi w aparacie typu młyna perełkowego Bead beater ( Biospec products ) przez 6 minut z chłodzeniem lodem. Aktywność dehydrogenazy D-arabitolowej oznaczono w sposób opisany powyżej. W doświadczeniach tych zastosowano ekstrakt komórek K. terrigena hodowanych na D-arabitolu zastosowano jako dodatni materiał kontrolny, a DBY746 transformowany paah5 jako ujemny materiał kontrolny. Wyniki podane w tabeli 2 wykazują, że gen dehydrogenazy D-arabitolowej wydzielony z K. terrigena ulega skutecznie ekspresji w drożdżach. Szczep drobnoustrojowy Tabela 2 Aktywność dehydrogenazy D-arabitolowe (jednostki przyjęte arbitralnie) K. terrigena Phpl 3,5 DBY746 [pyard] 1,0 DBY746 [paah5] 0,00 Przykład 3. Konstrukcja wektorów drożdżowych do nadekspresji genów dehydrogenazy ksylitolowej i dehydrogenazy D-arabitolowej Znaną sekwencję nukleotydową genu XYL2 drożdży (Pichia stipitis), kodującego dehydrogenazę ksylitolową [Kötter i inni, Curr. Genet. 18: (1990)] zastosowano do zsyntety zowania oligonukleotydów do klonowania tego genu metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej. Dwa oligonukleotydy: CGAATTCTAGACCACCCTAAGTCGTCCC (5'-oligonukleotyd) [SEQ ID No. 1] i TTCAAGAATTCAAGAAACTCACGTGATGC (3'-oligonukleotyd) [SEQ ID No. 2] przeznaczono do wprowadzenia dogodnych miejsc restrykcyjnych Xbal i EcoRI na końce 5'- i 3'- produktu PCR. 5'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycji 1-24 XYL2, a 3'-oligonukleotyd przyłącza się w pozycji , zgodnie z numeracjąużytą przez Köttera i innych, Curr. Genet. 18: (1990). Pichia stipitis CBS6054 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, PO Box 273,3740 AG Baam, Holandia) hodowano przez noc na pożywce YEPD (1 % ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% D-glukozy), po czym komórki odwirowano, przemyto raz 1 M roztwó-

19 rem sorbitolu zawierającym 1 mm EDTA, ph 7,5, ponownie zawieszono w tym samym roztworze i strawiono środkiem Lysicate (Sigma). Trawienie kontrolowano śledząc gęstość optyczną przy 600 nm przy rozcieńczeniu 1:1000 zawiesiny komórek w 1% SDS. Trawienie zakończono, gdy wielkość ta spadła do około 1/7 wielkości wyjściowej. Zawiesinę sferoplastów przemyto następnie 4 razy 1 M roztworem sorbitolu. Sferoplasty poddano lizie w 1% SDS i zadano 200 µg/ml proteinazy K w 37 C na 30 minut. Po jednokrotnej ekstrakcji fenolem i dwukrotnej chloroformem kwasy nukleinowe strącono etanolem i ponownie rozpuszczono w niewielkiej ilości buforu TE. Integralność chromosomowego DNA sprawdzono przeprowadzając elektroforezę na żelu agarozowym. Średnia wielkość fragmentu DNA przekraczała 50 kb. PCR przeprowadzono stosując polimerazę Tag DNA (Boehringer) w buforze dostawcy. Zastosowano cykl termiczny: 93 C - 30 s, 55 C - 30 s i 72 C - 60 s. Produkt PCR wyekstrahowano chloroformem, wytrącono etanolem i strawiono EcoRI i Xbal w standardowych warunkach. Po oczyszczaniu na żelu agarozowym fragment DNA klonowano do puc18 rozciętego Xbal i EcoRI (plazmid puc(xyl2)). Przeprowadzona następnie analiza restrykcyjna potwierdziła, że mapa restrykcyjna klonowanego fragmentu odpowiada sekwencji nukleotydów genu XYL2 P. stipitis. Plazmidy drożdżowe do nadekspesji dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej skonstruowano w sposób przedstawiony na fig. 3 i 4. W celu zmienienia flankujących miejsc restrykcyjnych kasety ekspresji dehydrogenazy D-arabitolowej w plazmidzie pyard całą kasetę wycięto stosując trawienie BamHI przeprowadzono klonowanie do puc18 strawionego za pomocą BamHI. Uzyskany plazmid puc(yard) strawiono za pomocą Sali i EcoRI, po czym sam fragment DNA o 2 kb wydzielono metodą preparaty wnej elektroforezy na żelu agarozowym. Fragment ten zligowano z fragmentem Hindlll-EcoRI DNA o 1,6 kb wydzielonym z plazmidu puc(xyl2) i fragmentem wektora wrzecionowego E. coli-drożdżowego pjdb207 o 6.6 kb (J.D. Beggs, Nature 275: (1978)) strawionego za pom ocą HindIII i SalI. Plazmid pjdb(ax)-16 wydzielono po transformacji E. coli powyższą mieszaniną ligacyjną. Plazmid ten jest zdolny do replikacji zarówno w E. coli jak i w Saccharomyces cerevisiae. W S. cerevisiae nadzoruje on wysoki poziom syntezy zarówno dehydrogenazy D-arabitolowej jak i dehydrogenazy ksylitolowej. Plazmid psrt(ax)-9 zsyntetyzowano w wyniku ligowania fragmentu Sali o 4.7 kb z plazmidu pjdb(ax)-9 i liniowej formy plazmidu psrt303d (Jeampipatkul i inni, Mol. Gen. Genet. 206: (1987)) uzyskaną w wyniku częściowej hydrolizy za pomocą Sali. Przykład 4. Konstrukcja szczepów drożdży wydzielających ksylitol Przeprowadzono transformowanie Zygosaccharomyces rouxii ATCC plazmidem psrt(ax)-9 nieznacznie zmieniając uprzednio opisaną metodę (K. Ushio i inni, J. Ferment. Technol. 66: (1988)). W skrócie Z. rouxii hodowano przez noc na pożywce YEPD (uzyskując hodowlę o gęstości optycznej 3-5 przy 600 nm), po czym komórki zabrano stosując wirowanie z małą prędkością, przemyto dwukrotnie 1M roztworem sorbitolu z 1mM EDTA, ph 7,5, ponownie zawieszono tym samym roztworze o objętości równej 1/5 wyjściowej objętości hodowli, zawierającym 1% 2-merkaptoetanolu i przeprowadzono trawienie w temperaturze pokojowej za pomocą środka lysicate (Sigma). Przebieg trawienia śledzono pobierając odpowiednią próbkę zawiesiny komórek, którą rozcieńczano 1% roztworem SDS i mierzono gęstość optyczną rozcieńczonej próbki przy 600 nm. Gdy wielkość ta spadła do 1/7 wielkości wyjściowej, trawienie kończono chłodząc zawiesinę w lodzie, po czym przemywano ją (10 minut wirowania w 0 C z szybkością 1000 obrotów/minutę) roztworem sorbitolu ją aż do pozbycia się wykrywalnego zapachu merkaptoetanolu. Sferoplasty przemyto jeden raz zimnym 0,3 M roztworem chlorku wapniowego w 1M sorbitolu i ponownie zawieszono w tym samym roztworze o objętości równej 1/4 wyjściowej objętości hodowli. Próbki po 200 tej zawiesiny i (ig plazmidowego DNA wymieszano i inkubowano w 0 C przez 40 minut. Do zawiesiny sferoplastów dodano 0,8 ml schłodzonego w lodzie 50% roztworu PEG-6000, zawierającego 0,3 M chlorek wapnia i inkubację w obniżonej temperaturze kontynuowano przez 1 godzinę. Sferoplasty zatężono stosując wirowanie z szybkością4000 obrotów/minutę przez 10 minut w laboratoryjnej wirówce, zawieszono w 2 ml YEPD zawierającego 1 M sorbitol i pozostawiono do regeneracji na

20 noc w temperaturze pokojowej. Zregenerowane komórki posiano na płytkach YEPD zawierających µg/ml gentamycyny i inkubowano w 30 C przez 4-6 dni. Transformanty hodowano w ciekłej pożywce YEPD, po czym ekstrakty komórkowe uzyskane w sposób opisany w przypadku S. cerevisiae (przykład 2) i oznaczono aktywności dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej. Wyniki tych pomiarów porównano z podobnymi pomiarami wykonanymi dla innych organizmów w tabeli 3. Wykazują one, że obydwa geny skutecznie wykonują ekspresję w Z. rouxii. Komórki Z. rouxii ATCC transformowane psrt(ax)-9 hodowano przez 2 dni w 50 ml YEPD zawierającej 50 µg/ml gentamycyny, po czym zebrano je i zastosowano do zaszczepienia 1000 ml YEPD zawierającej 25% wag. D-glukozy i 50 [µg/ml gentamycyny. Hodowlę prowadzono w 100 ml kolbie na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów/minutę) w 30 C. W innym doświadczeniu (doświadczenie 2) zastosowano tą samą pożywkę bez ekstraktu drożdżowego (pożywka niskofosforanowa). Zawartość ksylitolu w bulionie pożywkowym oznaczano standardowymi metodami HPLC i chromatografii gazowej. Wyniki podano w tabeli 4. Nie wykryto ksylitolu w ośrodku hodowli nietransformowanych Z. rouxii hodowanych na tej samej pożywce (bez gentamycyny). Tabela 3 Aktywności dehydrogenazy D-arabitolowej i dehydrogenazy ksylitolowej w różnych organizmach i szczepach Organizm i szczep Plazmid (*) Dehydrogenaza D-arabitolowa (IU/mg białka) Dehydrogenaza ksylitolowa (IU/mg białka) Klebsiella terrigena Phpl - 0,48 NW (**) S. cerevisiae DBY746-0,00 <0,01 S. cerevisiae DBY746 pjdb(yard) 3,0 <0,01 S. cerevisiae DBY746 pjdb(ax)-16 1,9 1,2 Z. rouxii ATCC ,00 <0,02 Z. rouxii ATCC psrt(ax)-9 1,3 0,7 (*) Plazmidy wytwarzają w wyniku ekspresji następujące enzymy: pjdb(yard) - dehydrogenaza D-arabitolowa pjdb(ax)-16 - dehydrogenaza D-arabitolowa i dehydrogenaza ksylitolowa psrt(ax)-9 - dehydrogenaza D-arabitolowa i dehydrogenaza ksylitolowa (**) NO- nie oznaczano Tabela 4 Wytwarzanie ksylitolu przez Z. rouxii ATCC zawierające plazmid psrt(ax)-9 (g/litr) Czas hodowli Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 (godziny) ośrodek z ekstraktem drożdżowym ośrodek bez ekstraktu drożdżowego 0 0,0 0,0 48 7,7 0, ,5 6,1 W podobny sposób skonstruować można szczepy wytwarzające ksylitol z innych źródeł węgla. Tak np. Candida tropicalis są zdolne do przekształcania n-alkanów w D-arabitol (K. Hattori i T. Suzuki, Ąrgic. Biol. Chem. 38: (1974) z dobrą wydajnością. Fragment Sali o 4,7 kb z plazmidu pjdb(ax)-9 można wstawić do plazmidu pcu1 (L. Haas i inni, J. Bacteriol. 172: (1990)) i zastosować do transformowania szczepu S. topicalis SU-2 (ura3). Tą samą kasetę ekspresji można również transformować w prototropowym szczepie C. tropicalis na wektorze plazmidu zawierającym dominujący selektywny marker.