Izolacja drobnoustrojów z gleby potencjalnych producentów związków biologicznie aktywnych. Opracowanie: dr inż. Roland Wakieć

Transkrypt

1 Izolacja drobnoustrojów z gleby potencjalnych producentów związków biologicznie aktywnych. Opracowanie: dr inż. Roland Wakieć Wprowadzenie. Technologie, w których stosowane są mikroorganizmy wymagają używania szczepów o określonych właściwościach metabolicznych. Źródłem poznanych i opisanych szczepów drobnoustrojów mogących znaleźć zastosowanie w procesach biotechnologicznych mogą być organizmy przechowywane w kolekcjach placówek naukowych, firm biotechnologicznych a także (a może nawet przede wszystkim) w dużych kolekcjach centralnych, takich jak najbardziej znana amerykańska kolekcja American Type Culture Collection (ATCC, czy też jej polski odpowiednik: Polska Kolekcja Mikroorganizmów (PCM, Według danych literaturowych ocenia się, że poznanych jest dotychczas 12% gatunków bakterii oraz jedynie 5% występujących w naturze szczepów grzybowych. Stwarza to duże pole do działania dla mikrobiologów poszukujących nowych organizmów o różnorakich właściwościach biotechnologicznych. Niewyczerpanym wręcz rezerwuarem szczepów jest środowisko naturalne ze szczególnym uwzględnieniem gleby. Organizmy zasiedlające glebę tworzą złożony zespół o bardzo dużej liczebności zwany edafonem. W skład edafonu oprócz mikroorganizmów wchodzą jednokomórkowce roślinne i zwierzęce, rośliny naczyniowe oraz bezkręgowce bytujące w przypowierzchniowej warstwie gleby. Edafon może stanowić od 1 do nawet 10% suchej masy substancji organicznej gleby. Wśród mikroorganizmów glebowych możemy wyróżnić: wirusy (reprodukujące się w komórkach roślin, zwierząt i człowieka oraz bakteriofagi), grzyby oraz bakterie (w tym promieniowce), które stanowią podstawową masę mikroorganizmów glebowych. W jednym gramie gleby uprawnej występuje komórek bakterii, konidiów promieniowców, zarodników grzybów. Mikroorganizmy glebowe dzięki swym różnorodnym właściwościom biochemicznym są niezbędnym gwarantem ciągłości przemiany materii w przyrodzie. Drobnoustroje rozmnażają się i przetwarzają materię organiczną, tworząc biomasę własnych komórek oraz nagromadzają substraty niezbędne do uzupełniania zasobów próchnicy a także rozkładają i mineralizują związki organiczne, przez co włączają w ponowny obieg pierwiastki nieodzowne w produkcji roślinnej, opartej na asymilacji CO 2 z atmosfery. Występujące w glebie bakterie właściwe, promieniowce oraz grzyby zdolne są do biosyntezy antybiotyków, witamin, kwasów organicznych, przeprowadzania reakcji rozkładu ksenobiotyków, białek, 1

2 wielocukrów, lipidów czy biotransformacji związków steroidowych lub antybiotyków. Bytując w tym samym środowisku jakim jest gleba, drobnoustroje odziaływują wzajemnie na siebie. Możliwych jest kilka form współżycia drobnoustrojów glebowych: symbioza (bakterie nitryfikacyjne), pasożytnictwo (fagi bakteryjne), drapieżnictwo, komensalizm oraz antagonizm ze szczególnym uwzględnieniem dwóch jego odmian: mikolizy i antybiozy. Mikoliza polega na litycznym oddziaływaniu bakterii i promieniowców na grzyby przy pomocy enzymów np. celulazy i proteazy (produkowanych np. przez Pseudomonas i Bacillus). Antybioza z kolei polega na wydzielaniu przez drobnoustroje antybiotyków jako produktów ubocznych procesów metabolicznych. Głównym źródłem antybiotyków są promieniowce; o wiele mniej antybiotyków wytwarzają inne bakterie. Bardzo ważne dla lecznictwa antybiotyki produkują grzyby strzępkowe. Szacunkową liczbę antybiotyków produkowanych przez daną grupę drobnoustrojów wraz z najważniejszymi przykładami przedstawia poniższa tabela. grupa drobnoustrojów gatunek liczba antybiotyków antybiotyk Promieniowce > 6000 Streptomyces aureofaciens tetracykliny Micromonospora purpurea gentamycyny Saccharopolyspora erythrea erytromycyna Streptomyces griseus streptomycyna Streptomyces orientalis wankomycyna Streptomyces nodosus amfoterycyna Inne bakterie > 1000 Bacillus brevis gramicydyna Grzyby > 2000 Cephalosporium cefalosporyna C acremonium Penicillium chrysogenum penicylina G i V Penicillium grisefulvum gryzeofulwina Tolypocladium niveum cyclosporyna Tabela 1. Szacunkowa liczba antybiotyków wytwarzanych przez wybrane grupy drobnoustrojów wraz z najważniejszymi przykładami. W celu pozyskania nowych drobnoustrojów ze środowiska opracowano specjalne programy i metody skriningowe. Skrining czyli przesiewanie drobnoustrojów lub produktów ich metabolizmu definiowany jest jako kompleksowe postępowanie, obejmujące zespół selektywnych zabiegów mających na celu wykrycie i izolowanie spośród dużej liczby możliwych, tylko tych drobnoustrojów (lub ich metabolitów), które są celem badań, oraz wstępną ocenę ich przydatności. W celu dokonania oceny przydatności organizmów do 2

3 procesów biotechnologicznych, w tym do produkcji antybiotyków bądź innych substancji aktywnych biologicznie, należy je namnożyć i testować w postaci czystych kultur. Podstawową metodą izolacji czystych kultur jest rozcieńczenie populacji organizmów w roztworze fizjologicznym chlorku sodu bądź odpowiednim podłożu. Następnie wykonuje się posiew rozcieńczonych zawiesin na płytki Petriego z podłożem stałym odpowiednio dobranym, stymulującym wzrost poszukiwanych przez nas organizmów. Jeżeli na pojedyncze płytce wyrasta kilka lub kilkanaście kolonii, istnieje bardzo duże prawdopodobieństwo, że wyrosły one z pojedynczych komórek i możemy w ten sposób uzyskać czystą kulturę danego organizmu. Stosunkowo łatwo jest wyizolować drobnoustroje dominujące w populacji zasiedlającej dane środowisko, znacznie trudniej wyizolować jest mniej liczne gatunki rzadkie. Odpowiednie dobranie podłoża oraz warunków hodowli pomaga w izolacji czystych kultur odpowiednich, wybranych organizmów, dlatego stanowi szczególny przedmiot zainteresowania biotechnologii. Stymulację wzrostu pożądanych mikroorganizmów uzyskać można poprzez wspomniany już wcześniej dobór składu chemicznego pożywki: zastosowanie selektywnych inhibitorów (np. antybiotyków), ale również poprzez dobór odpowiedniego ph, temperatury oraz natlenienie. poszukiwany organizm promieniowce bakterie (w tym promieniowce) grzyby czynniki selekcyjne dodatek do pożywki nowobiocyny, penicyliny G i cykloheksymidu dodatek do pożywki propionianu sodowego dodatek do pożywki nystatyny lub cykloheksimidu alkalizacja środowiska, np. przez zmieszanie próbki gleby z kredą i inkubację przez około 7-9 dób dodatek do pożywki streptomycyny lub tetracykliny organizmy których wzrost zostaje zahamowany bakterie i grzyby zahamowanie wzrostu większości mikroorganizmów poza promieniowcami grzyby grzyby bakterie bakterie, promieniowce, grzyby dodatek penicyliny lub D-cykloseryny eliminacja bakterii Gram + bakterie przetrwalnikujące dodatek polimyksyn eliminacja bakterii Gram minutowe ogrzanie próbki do temp C wszystkie inne Tabela 2. Wybrane czynniki selekcyjne, stymulujące wzrost określonych organizmów. Gdy brak jest kryteriów wstępnej oceny organizmów podczas poszukiwania szczepów przydatnych do procesów biotechnologicznych, wówczas losowo wybrane kolonie wyrosłe na płytkach Petriego poddaje się badaniom na próbach fermentacyjnych. Jest to niestety sposób 3

4 mało efektywny i bardzo pracochłonny, wymagający dużej liczby pożywek. Możliwa jest jednak wstępna ocena aktywności kolonii wyrastających na danym podłożu za pomocą metod opartych na wykorzystaniu zjawiska dyfuzji pozakomórkowych produktów metabolizmu w podłożu agarowym i określaniu wielkości powstających stref ich przenikania ujawnianych za pomocą drobnoustrojów testowych. Znanych jest kilka rodzajów tego typu testów: metoda podwójnej hodowli na płytkach Petriego (2 warstwy podłoża stałego pierwsza na której wyrosły kolonie poszukiwanych producentów antybiotyków, druga zawierająca szczep testowy, wokół kolonii wytwarzających antybiotyk można zaobserwować zahamowanie wzrostu szczepu testowego), metoda krążków agarowych (polegająca na przeniesieniu wyciętych krążków agarowych wraz koloniami poszukiwanych producentów antybiotyków na płytkę agarową z wysianym szczepem testowym i obserwowanie stref zahamowania wokół kolonii produkujących substancje aktywne biologicznie) i trzecia (praktycznie najprostsza) naniesienie ezą zawiesiny komórek potencjalnych producentów antybiotyków w pożywce płynnej jako prostej linii w poprzek płytki Petriego z wysianym na podłożu agarowym szczepem testowym. Po wstępnej ocenie przydatności uzyskanych szczepów można przejść do prób fermentacyjnych i dalszych etapów oceny aktywności związku produkowanego przez wyizolowany szczep. Sterylizacja pożywek z wykorzystaniem autoklawu. Autoklaw to hermetycznie zamknięty kocioł stalowy o podwójnych ścianach i dnie, w którym uzyskuje się wysokie ciśnienie. Jest zaopatrzony w manometr, termometr, zawór bezpieczeństwa i elektryczny system grzewczy. Czynnikiem jałowiącym w autoklawie jest przegrzana nasycona para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. W aparacie gotująca się woda doprowadza do nadciśnienia parę wodną, która ulega nasyceniu po zupełnym wyparciu powietrza. Manometr znajdujący się w obudowie wskazuje wzrost ciśnienia po zamknięciu zaworu odpowietrzającego. Pomiędzy ciśnieniem a temperaturą wewnątrz autoklawu, a także pomiędzy temperaturą a efektem sterylizacji istnieją ścisłe zależności. Im wyższe jest ciśnienie wewnątrz kotła tym wyższe są temperatury, a im wyższe temperatury tym krótszy okres sterylizacji. Podłoża i produkty nie zawierające składników wrażliwych na wysokie temperatury sterylizuje się w autoklawie w temp. 121 C przez min lub w temperaturze 117 C przez minut. 4

5 1. Gałka zaworu bezpieczeństwa, 2. Manometr komory sterylizacyjnej, 3. Manometr kotła, 4. Zawór trójdrożny manometru, 5. Termometr wskazujący temperaturę w komorze, 6. Rączka zamka pokrywy, 7. Dźwignia zaworu sterującego, 8. Zawór doprowadzający parę do kotła, 9. Dźwignia zaworu selekcyjnego, 10. Wskaźnik poziomu wody w komorze, 11. Zawór odpowietrzający komorę, 12.Zawór odprowadzający kondensat z komory sterylizacyjnej Schemat 1. Budowa autoklawu. Cel ćwiczenia. Izolacja z gleby czystych hodowli promieniowców wytwarzających substancje o działaniu antagonistycznym do wybranych szczepów testowych (bakterie Gram +, Gram, bądź grzyby). Zapoznanie się z technikami przygotowywania i sterylizacji pożywek płynnych oraz stałych a także z testami aktywności biologicznej. Wykonanie ćwiczenia. 1. Sporządzić wyciąg z gleby: odważyć 2 gramy ziemi, przenieść do kolby o pojemności 100 ml zawierającej 20ml 0,85 % roztworu NaCl (należy wykonać samodzielnie -objętość około 100ml). Do zawiesiny można dodać niewielką objętość ( 0,5-1ml ) czynnika emulgującego Tween 80. Roztwór ekstrahować, wytrząsając przez minut w wytrząsarce przy stosunkowo wysokich obrotach. 2. Wykonać szereg rozcieńczeń otrzymanego wyciągu z gleby według poniższego schematu. 5

6 Schemat 2. Rozcieńczenia wyciągu z gleby 3. Przygotować stałe podłoża agarowe (każdego po 60 ml), poddać sterylizacji w autoklawie i wylać po 4 płytki Petriego z każdym z przygotowanych podłóż. Podłoże agarowe Streptomyces Medium (Fluka) (2% agar; Streptomyces Medium 84g/litr) Uwaga! Przygotować 80 ml podłoża i wylać dodatkowo 2 skosy. Podłoże agarowe Streptomyces Medium (Fluka) z dodatkiem propionianu sodu (jak wyżej plus 2% propionian sodu) Podłoże MYA (2% agar, 1% glukoza, 0,4% Yeast Extract, 0,5% Malt Extarct, 0,5% BactoPeptone) Podłoże Sabourauda (YEPG) (2% agar, 2% glukoza, 1% BactoPrptone, 1% Yeast Extract) 4. Przygotować płynne podłoże Streptomyces Medium (250ml) według opisu na opakowaniu (poddać sterylizacji w autoklawie). 5. Wysiać po 100 μl czterech najwyższych rozcieńczeń wyciągu z gleby na przygotowane płytki Petriego. Po wysianiu płytki inkubować w C przez 7 dób. (koniec pierwszych zajęć) 6. Po 7 dniowej inkubacji wykonać archiwizację otrzymanych wyników (zdjęcia, rysunki), wybrać płytki, z których możliwe jest uzyskanie czystych kultur, wyselekcjonować kolonie do dalszej pracy, sporządzić przeżyciowe preparaty mikroskopowe. 6

7 7. Zaszczepić wybranymi koloniami (promieniowców) przygotowane pożywki płynne i inkubować je przez kolejne 7 dni w temperaturze 28 0 C z intensywnym wytrząsaniem. 8. Przygotować na następne zajęcia 4 płytki Petriego ze stałą pożywką YEPG oraz 8 płytek ze stałą pożywką TSA (2% agar, 1,2% Triptic Soy Broth) (koniec drugich zajęć) 9. Ocenić wygląd hodowli po 7 dniach inkubacji, sporządzić przeżyciowy preparat mikroskopowy. Zanotować spostrzeżenia. 10. Wykonać badanie właściwości antagonistycznych wybranych promieniowców glebowych w stosunku do testowych drobnoustrojów: bakterii Gram + i Gram oraz patogenu grzybowego (odpowiednio: Bacillus subtilis, Escherichia coli i Candida albicans). Zastosować 2 metody: W płytki YEPG wetrzeć przy pomocy głaszczki po 50 μl inoculum C. albicans, w 4 płytki TSA wetrzeć inoculum B. subtilis a w kolejne 4 płytki E. coli. Płytki opisać. Nabrać sterylnie jedno oczko ezy, płynnej hodowli promieniowca i nanieść na każdą z płytek z drobnoustrojami testowymi, wykonując ezą prostą linię będącą średnicą płytki. Powtórzyć dla każdej z posiadanych hodowli (dla każdej z trzech hodowli promieniowców wykonać 3 płytki, po jednej z C. albicans, B. Subtilis i E. coli). pierwsza metoda Pobrać po 1ml hodowli każdego z izolowanych mikroorganizmów, przenieść do jałowych probówek eppendroffa i wirować w wirówce przy prędkości obrotów/min przez 15 minut. Każdym z uzyskanych supernatantów nasączyć 3 jałowe krążki bibułowe i umieścić po jednym na płytkach Petriego z każdym z drobnoustrojów testowych. Pamiętać o opisaniu na spodniej stronie płytek Petriego którym supernatantem został nasączony dany krążek! metoda druga Płytki z drobnoustrojami testowymi inkubować przez 24 godziny w 37 0 C w przypadku B. subtilis i E. coli oraz przez 48 godzin w 30 0 C w przypadku C. albicans. Zachować w lodówce hodowle izolowanych organizmów. Po upływie wyznaczonego czasu inkubacji odczytać wynik i zanotować rezultaty, sporządzić odpowiednią dokumentację. (koniec trzecich zajęć ostatnich) 7

8 Sprawozdanie. Sprawozdanie powinno zawierać dokumentację zdjęciową/rysunkową wszystkich etapów izolacji. Omówienie cech uzyskanych kolonii, takich jak: kształt, kolor, sposób wzrostu na podłożu agarowym, liczebność. Wszystkie obserwacje powinny zostać skomentowane, podobnie jak wybór kolonii do dalszej pracy a także wyniki badań właściwości antagonistycznych. Na podstawie wyników badań właściwości antagonistycznych można się również pokusić o spekulacje dotyczące przynależności produkowanych związków do danych grup antybiotyków. Instrukcję sporządzono na podstawie/literatura uzupełniająca: 1. Biotechnologia i chemia antybiotyków, A. Chmiel, S. Grudziński Wydawnictwo Naukowe PWN, Biotechnologia mikrobiologiczna ćwiczenia i pracownie specjalistyczne, J. Długosinski, Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Podstawy mikrobiologii w ochronie środowiska. B. Kołwzan, W. Adamiak, K. Grabas, A. Pawełczyk, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej,