Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Transkrypt

1 Vol. 6/2007 Nr 2(19) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Wpływ polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 na ekspresję jego produktu na powierzchni limfocytów T u dzieci z chorobą Hashimoto The Influence of CTLA-4 Gene Polymorphism at Position 49 of Exon 1 on the Surface Expression of its Product on T cells in Children with Hashimoto Thyroiditis 1 Anna Kucharska, 2 Elżbieta Górska, 1 Alicja Wiśniewska, 2 Maria Wąsik, 1 Barbara Rymkiewicz-Kluczyńska 1 Katedra i Klinika Pediatrii i Endokrynologii AM w Warszawie 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego AM w Warszawie Adres do korespondencji: dr med. Anna M. Kucharska, Klinika Pediatrii i Endokrynologii AM w Warszawie, Warszawa, ul. Marszałkowska 24, amakucharska@tlen.pl, endokrynologia@litewska.edu.pl Słowa kluczowe: choroba Hashimoto, CTLA-4, polimorfizm genu, limfocyty, dzieci Key words: Hashimoto disease, CTLA-4, gene polymorphism, T cells, children STRESZCZENIE/ABSTRACT Polimorfizm genu CTLA-4 jest uznany za jeden z istotnych poza HLA czynników ryzyka chorób autoimmunologicznych, w tym chorób tarczycy. Według niektórych autorów polimorfizm A/G w pozycji 49 eksonu 1 powoduje osłabienie funkcji CTLA-4 w regulacji aktywacji limfocytów T. Celem pracy była ocena zależności genotypu w locus 49 eksonu 1 genu CTLA-4 i ekspresji powierzchniowej CTLA-4 na limfocytach T u dzieci z chorobą Hashimoto i w grupie kontrolnej. Materiał: Zbadano 88 dzieci: 43 z chorobą Hashimoto oraz 45 zdrowych kontroli dobranych etnicznie i według płci. Obecność polimorfizmu oceniano za pomocą SSCP i RLFP z użyciem enzymu restrykcyjnego BbvI. Ekspresję CTLA-4 oceniano przy pomocy cytometrii przepływowej aparatem Coulter EPICS XL. Analizę statystyczną przeprowadzono z użyciem testu T-studenta. Wyniki: U dzieci z chorobą Hashimoto homozygoty G/G występowały istotnie statystycznie częściej niż w grupie kontrolnej (odpowiednio 30% i 12%). Częstość występowania homozygot A/A i heterozygot nie różniła się istotnie w obu grupach. Ekspresja powierzchniowa CTLA-4 była istotnie statystycznie niższa u dzieci z chorobą Hashimoto niż w grupie kontrolnej i dotyczyło to zarówno homozygot G/G, jak i A/A. Nie stwierdzono natomiast istotnej statystycznie różnicy w ekspresji u homozygot A/A w porównaniu z homozygotami G/G w grupie dzieci z chorobą Hashimoto jak również w grupie kontrolnej. Wniosek: Nasze wyniki sugerują, że niższa powierzchniowa ekspresja CTLA-4 na limfocytach T u chorych z chorobą Hashimoto nie jest zależna od genotypu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4. 9

2 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 6/2007;2(19):9-14 CTLA-4 gene polymorphism is one of the strongest candidates of autoimmune thyroid diseases susceptibility locus except the HLA. Some studies show that CTLA-4 exon 1 polymorphism affects the function of the CTLA-4 gene products. The aim of the study was to investigate the surface expression of CTLA-4 on peripheral T cells in homozygotes A/A and G/G at position 49 of exon 1 of CTLA-4 gene among children diagnosed with Hashimoto thyroiditis and in healthy controls. Material: blood samples were obtained from 88 children: 43 with Hashimoto thyroiditis and 45 without any autoimmune diseases or thyroid disease. Hashimoto thyroiditis was diagnosed on the basis of the presence of thyroglobulin and thyroid peroxidase antibodies and a typical picture of the thyroid ultrasound. Methods: CTLA-4 exon 1 polymorphism was defined by SSCP analysis and confirmed with FRLP using BbvI enzyme. The T cell subsets were analysed with three-colour flow cytometry by Coulter EPICS XL cytometer. Statistical analysis was performed using Students test. Results: Among children with Hashimoto thyroiditis, there were more individuals with G/G alleles than in the control group (30% and 12% respectively). The comparison of CTLA-4 expression between homozygotes G/G and individuals with A/A alleles in children with Hashimoto disease showed no statistically significant difference. The same results were found in the control group. Statistically significant lower CTLA-4 expression was found in children with Hashimoto disease than in controls, both in G/G homozygotes and in A/A homozygotes (p< 0,05). Conclusions: our data suggest that the low surface expression of CTLA-4 on T cells in children with Hashimoto thyroiditis does not depend on the genotype at position 49 in exon 1 of CTLA-4 gene. Wstep Polimorfizm genu CTLA-4 jest uznawany za jeden z najbardziej istotnych poza HLA genetycznych czynników ryzyka chorób autoimmunologicznych, w tym autoimmunologicznych chorób tarczycy. Gen CTLA-4 jest atrakcyjnym kandydatem do roli genu podatności na choroby autoimmunologiczne, ponieważ regulacja odpowiedzi immunologicznej na szlaku CTLA4/CD28/B7 jest jednym z kluczowych mechanizmów utrzymywania stanu autotolerancji. Potwierdzają to doświadczenia na populacji myszy pozbawionych CTLA-4, które rozwijają ciężki autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny [1, 2]. W wielu niezależnych próbach wykazano sprzężenie w rejonie locus genu CTLA-4 z zespołami autoimmunologicznymi: chorobą Gravesa-Basedowa [3, 4, 5, 6, 7], chorobą Hashimoto [7, 8], cukrzycą typu I [6, 8, 9]. W rejonie genu CTLA-4 opisano trzy polimorficzne markery pozostające w sprzężeniu z autoimmunologicznymi chorobami tarczycy: 1. w pozycji -318 w rejonie promotora genu CTLA-4, polegający na zamianie cytozyny na tyminę [10], 2. w pozycji 49 eksonu 1, polegający na zamianie adeniny na guaninę, co prowadzi do zastąpienia threoniny przez alaninę w kodonie 17 wiodącego peptydu CTLA-4 [9], 3. w rejonie 3 UTR (UTR rejon nieulegający transkrypcji) eksonu 4, polimorfizm powtórzeń par zasad: (AT)n [11]. Stwierdzenie sprzężenia danego loci z chorobą nie jest dowodem jego rzeczywistego znaczenia czynnościowego. Dopiero wykazanie, że obecność polimorfizmu zmienia funkcję produktu genu, prowadząc do rozwoju choroby, jest dowodem jego udziału w patogenezie. Spośród wymienionych trzech polimorfizmów znaczenie czynnościowe wykazano najlepiej w przypadku polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 (A/G 49). Czynność CTLA-4 polega na hamowaniu aktywacji limfocytu T, a jego działanie regulacyjne zależy głównie od ekspresji białka na powierzchni komórki. CTLA-4 hamuje odpowiedź limfocytu T w dwóch mechanizmach. Pierwszy jest realizowany poprzez przekazanie negatywnego sygnału z CTLA-4 w odpowiedzi na aktywację receptora limfocytu T i jest zależny od cytoplazmatycznego fragmentu CTLA-4 zakotwiczonego w błonie komórkowej limfocytu T [12, 13]. Drugi mechanizm polega na kompetycji między CTLA-4 i CD28 na powierzchni komórki o wiązanie z B7. Jest on zależny od poziomu powierzchniowej ekspresji CTLA-4. Związanie B7 przez CTLA-4 prowadzi do zakończenia odpowiedzi poprzez ograniczenie sygnału z CD28, anergię limfocytów T oraz apoptozę limfocytów T autoreaktywnych. Jeżeli założymy, że obecność polimorfizmu A/G 49 ma wpływ na funkcję regulacyjną CTLA-4, to można się spodziewać, że homozygoty posiadające rzadkie allele G/G powinny wykazywać słabszą powierzchniową ekspresję CTLA-4 na limfocytach T. Celem pracy była ocena zależności genotypu w locus 49 eksonu 1 genu CTLA-4 i ekspresji powierzchniowej CTLA-4 na limfocytach T u dzieci z chorobą Hashimoto i w grupie kontrolnej. 10

3 Kucharska A. i inni Wpływ polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 na ekspresję jego produktu... Materiał i metody Zbadano 88 dzieci: 43 dzieci z chorobą Hashimoto oraz 45 zdrowych kontroli dobranych etnicznie i według płci. Kryterium rozpoznania choroby Hashimoto była obecność przeciwciał przeciwko tyreoglobulinie i peroksydazie tarczycowej w surowicach chorych oraz charakterystyczny obraz ultrasonograficzny tarczycy. Dzieci z grupy kontrolnej miały prawidłową czynność tarczycy, nie miały przeciwciał przeciwtarczycowych ani chorób o podłożu autoimmunologicznym. Metody laboratoryjne Genomowe DNA izolowano z krwi żylnej przy użyciu zestawów Genomic Midi AX (ASA Biotechnology). Polimorfizm genu CTLA-4 w pozycji 49 eksonu 1 badano metodą SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) oraz równolegle każdą próbkę badano metodą RFLP (Restriction Fragment-Lenght Polymorphism). Metodą PCR amplifikowano fragment genu CTLA-4 z użyciem oligonukleotydów: forward 5 GCTCTACTTCCTGAAGACCT-3 oraz reverse 5 -AGTCTCACTCACCTTTGCAG-3, według opisu sekwencji ludzkiego cdna dla CTLA-4 podanego przez Harper i Balzano [11]. Stosowano następujące warunki reakcji: denaturacja przez 10 minut w temp. 950C, następnie 35 cykli przez 45 sekund w temp. 940C; przyłączenie starterów: 45 sekund w temp. 580C; wydłużanie: 45 sekund w temp. 720C; wydłużanie końcowe: 10 minut w temp. 720C. Meoda SSCP: Do 2 μl produktu PCR dodawano równoważną objętość formamidu i denaturowano 5 minut w temp. 950C. Następnie próbkę schładzano w łaźni lodowej (40C) i poddawano elektroforezie w 7,5% żelu poliakrylamidowym przez 20 minut przy 400 ma, 40 W, 150 V, w temp. 40C. Do elektroforezy używano aparatu Fast-System (Biosystem). Elektroforegramy barwiono solami srebra. Metoda RFLP: 15 μl produktu reakcji PCR dodawano do 10 μl mieszaniny zawierającej 1x Nebuffer 2 oraz 1,5 μl enzymu restrykcyjnego Bbv I (Biolabs, New England). Próbkę po nawarstwieniu olejem mineralnym inkubowano przez 24 godziny w temp. 370C. Następnie poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym (60 minut, 500 ma, 40 W, 120 V) w temp. pokojowej. Elektroforegram barwiono bromkiem etydyny celem wizualizacji. Metoda RFLP: 15 μl produktu reakcji PCR dodawano do 10 μl mieszaniny zawierającej 1x Nebuffer 2 oraz 1,5 μl enzymu restrykcyjnego Bbv I (Biolabs, New England). Próbkę po nawarstwieniu olejem mineralnym inkubowano przez 24 godziny w temp. 37ºC. Następnie poddawano elektroforezie na 2% żelu agarozowym (60 minut, 500 ma, 40 W, 120 V) w temp. pokojowej. Elektroforegram barwiono bromkiem etydyny celem wizualizacji. Oznaczanie ekspresji antygenów na limfocytach krwi obwodowej Ocenę fenotypu limfocytów przeprowadzono przy użyciu cytometru przepływowego firmy Beckman Coulter EPICS XL 4C, wykorzystując oprogramowanie EPICS XL/XL-MCL, wersja 2,0. Analizę przeprowadzano przy użyciu kombinacji przeciwciał monoklonalnych firmy Immunotech Beckman Coulter Company, France: CD4 FITC/ CD28PC5/ CD152PE oraz CD8FITC/ CD28PC5/ CD152PE. W doświadczeniu stosowano odpowiednio potrójną izotypową kontrolę IgG. Heparynizowaną krew rozcieńczano trzykrotnie 0,9% jałowym roztworem chlorku sodu, nawarstwiano na odczynnik Histopaque firmy SIGMA Diagnostics. Inc. (ST.Louis, MO USA), następnie wirowano przez 30 minut przy 400 x g. Wyizolowane komórki przepłukiwano trzykrotnie jałowym roztworem 0,9% NaCl i zawieszano w PBS (BIOMED). Do 100 μl wyizolowanych limfocytów o stężeniu 5mln/mL PBS dodawano 10 μl odpowiednich przeciwciał monoklonalnych, następnie próbki inkubowano w temp. pokojowej, w ciemności przez 30 minut. Po inkubacji próbki utrwalano oraz lizowano zestawem odczynników firmowych Uti-Lyse firmy Dako Cytomation, USA. Tak przygotowane próbki poddawano analizie w cytometrze przepływowym. Wyniki podano, opisując ich wartości średnie oraz odchylenia standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu T-studenta oraz testów istotności określających różnice między wskaźnikami struktury dla rozkładu normalnego z użyciem programu Statistica 5. Za istotne statystycznie przyjęto p<0,05. Dla badania uzyskano akceptację Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Warszawie. Wyniki W grupie dzieci z chorobą Hashimoto homozygoty G/G występowały istotnie statystycznie czę- 11

4 Praca oryginalna ściej niż w grupie kontrolnej (tab. I). Ekspresję badanych antygenów CD na powierzchni limfocytów T analizowano przy pomocy testu T-studenta w następujących układach: Grupa I: Homozygoty A/A w grupie pacjentów z chorobą Hashimoto w stosunku do homozygot A/A w grupie kontrolnej. Grupa II: Homozygoty G/G z chorobą Hashimoto w porównaniu do homozygot G/G w grupie kontrolnej. Grupa III: Homozygoty G/G w grupie Hashimoto w porównaniu do homozygot A/A w grupie kontrolnej. Grupa IV: Homozygoty A/A w grupie Hashimoto w porównaniu do homozygot G/G w grupie kontrolnej. Grupa V: Homozygoty A/A do homozygot G/G w grupie z chorobą Hashimoto. Grupa VI: Homozygoty A/A do homozygot G/G w grupie kontrolnej. Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w ekspresji CTLA-4 u homozygot A/A w porównaniu Endokrynol. Ped., 6/2007;2(19):9-14 do homozygot G/G w obrębie tej samej grupy: zarówno w grupie dzieci z chorobą Hashimoto, jak i w grupie kontrolnej. Stwierdzono natomiast statystycznie istotną różnicę pomiędzy dziećmi chorymi i zdrową grupą kontrolną, niezależnie od genotypu. Ekspresja powierzchniowa CTLA-4 na limfocytach krwi obwodowej była istotnie statystycznie niższa u dzieci z chorobą Hashimoto niż w grupie kontrolnej. Różnica ta była istotna zarówno przy porównywaniu samych homozygot rzadkich G/G w obu grupach, jak i samych homozygot częstych A/A. Homozygoty rzadkie G/G z chorobą Hashimoto miały istotnie mniej limfocytów z ekspresją powierzchniową CTLA-4 niż częste homozygoty A/A z grupy kontrolnej. Homozygoty częste A/A w grupie dzieci z chorobą Hashimoto miały istotnie statystycznie niższą ekspresję CTLA-4 zarówno na limfocytach CD4, jak i CD8 w porównaniu do homozygot rzad- Tabela I. Częstość występowania poszczególnych rodzajów genotypów w pozycji 49 genu CTLA-4 w badanych grupach Table I. The frequency of particular genotypes at position 49 CTLA-4 gene in the examined groups Grupa z chorobą Hashimoto [n=43] Grupa kontrolna [n=45] *różnica istotna statystycznie Homozygoty A/A [%] Homozygoty G/G [%] Heterozygoty A/G [%] 27,9 30,2* 41,8 26,6 12,3* 60,0 Tabela II. Porównanie ekspresji antygenów na powierzchni limfocytów T u pacjentów i kontroli w zależności od genotypu w pozycji 49 genu CTLA-4 (test T-studenta). Table II. The comparison of T cell antigen expression in patients and controls depending on the genotype at position 49 of CTLA-4 gene (T-student test). CD4/28 CD4/152 CD8/28 CD8/152 CD4 CD8 CD152 Grupa I NS p=0,004 NS NS NS NS p=0,002 Grupa II NS p=0,02 NS p=0,02 NS NS p=0,005 Grupa III NS p=0,01 NS NS NS NS p=0,008 Grupa IV NS p=0,01 NS p=0,005 NS NS p=0,002 Grupa V NS NS NS NS NS NS NS Grupa VI NS NS NS NS NS NS NS Grupa I: porównanie ekspresji u homozygot A/A w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot A/A w grupie kontrolnej Grupa II: porównanie ekspresji u homozygot G/G w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot G/G w grupie kontrolnej Grupa III: porównanie ekspresji u homozygot G/G w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot A/A w grupie kontrolnej Grupa IV: porównanie ekspresji u homozygot A/A w grupie Hashimoto do ekspresji u homozygot G/G w grupie kontrolnej Grupa V: porównanie ekspresji u homozygot A/A do ekspresji u homozygot G/G w grupie z chorobą Hashimoto Grupa VI: porównanie ekspresji u homozygot A/A do ekspresji u homozygot G/G w grupie kontrolnej NS różnica nieistotna statystycznie 12

5 Kucharska A. i inni Wpływ polimorfizmu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4 na ekspresję jego produktu... kich G/G w grupie kontrolnej. Różnice te dotyczyły subpopulacji limfocytów T CD4+, a w przypadku grupy II i IV także limfocytów CD8+. (tab. II). Dyskusja Sprzężenie polimorfizmu A/G 49 z autoimmunologicznymi chorobami tarczycy sugeruje, że jego obecność ma wpływ na czynność białka CTLA-4. Teoretycznie wpływ ten może być realizowany na kilka sposobów: przez zmniejszoną ekspresję CTLA-4 na powierzchni limfocytów, poprzez zmniejszenie powinowactwa do ligandu lub też przez produkcję nieprawidłowego białka pozbawionego właściwej mu funkcji. Homozygoty rzadkie G/G (Ala/Ala) powinny teoretycznie wykazywać słabszą funkcję CTLA-4 hamującą pobudzenie limfocytów w porównaniu do homozygot częstych A/A (thr/thr). Taką koncepcję potwierdzają wyniki badań Kouki, który wykazał, że G 49 allele jest związana z osłabieniem kontroli proliferacji limfocytów T [14]. Badania Maurer 2002 sugerują także, że powierzchniowa ekspresja CTLA-4 i jej wewnątrzkomórkowa dystrybucja koreluje z genotypem w pozycji 49. Homozygoty G/G mają zmniejszoną powierzchniową ekspresję CTLA-4, podczas gdy aktywowane limfocyty T u homozygot A/A wykazują inny model dystrybucji wewnątrzkomórkowej CTLA-4 niż homozygoty G/G [15]. Zależność między genotypem w pozycji 49 a poziomem ekspresji CTLA-4 potwierdził w swoich badania takze Ligers [16]. Homozygoty AA wykazywały wyższą ekspresję powierzchniową CTLA-4 po aktywacji, a także większą zawartość mrna dla CTLA-4 w niestymulowanych komórkach. Nasz eksperyment analizował ekspresję powierzchniową CTLA-4 na limfocytach krwi obwodowej w warunkach podstawowych, to znaczy bez stymulacji komórek. Porównywano procentowy udział limfocytów T z ekspresją powierzchniową CTLA-4 u dzieci z chorobą Hashimoto i u dzieci zdrowych. W naszym badaniu udział limfocytów T z ekspresją powierzchniową CTLA-4 we krwi obwodowej był istotnie statystycznie niższy u dzieci z chorobą Hashimoto niż w grupie kontrolnej niezależnie od rodzaju genotypu w badanym loci. Wynik ten potwierdzono zarówno u homozygot rzadkich G/G, jak i u homozygot częstych A/A, co sugeruje, że ekspresja CTLA-4 nie była zależna od obecności polimorfizmu, natomiast miała związek z chorobą Hashimoto. Fakt, że w obrębie tej samej grupy pacjentów nie stwierdzono istotnej statystycznie wyższej ekspresji CTLA-4 u homozygot częstych A/A w porównaniu do homozygot rzadkich G/G także zaprzecza założeniu, że ekspresja jest determinowana przez genotyp w pozycji 49 genu CTLA-4. Homozygoty częste A/A w grupie dzieci z chorobą Hashimoto, które teoretycznie powinny mieć prawidłową ekspresję CTLA-4, miały ją istotnie statystycznie mniejszą niż homozygoty rzadkie G/G w grupie kontrolnej, zarówno na limfocytach CD4, jak i CD8. Według naszych wyników dzieci z chorobą Hashimoto mają istotnie mniejszą ekspresję CTLA-4 na limfocytach T we krwi obwodowej, ale zjawisko to nie jest prostą konsekwencją obecności niekorzystnych alleli G w analizowanym w badaniu loci. Wniosek Nasze wyniki sugerują, że niższa powierzchniowa ekspresja CTLA-4 na limfocytach T u chorych z chorobą Hashimoto nie jest zależna od genotypu w pozycji 49 eksonu 1 genu CTLA-4. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Tivol E.A., Borriello F., Schwieitzer A.N., Lynch W.P. et al.: Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4. Immunity, 1995:3, [2] Waterhouse P., Penninger J.M., Timms E., Wakcham A. et al.: Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA-4. Science, 1995:270, [3] Yanagawa T., Hidaka Y., Giumaraes V., Soliman M., DeGroot L.J.: CTLA-4 gene polymorphism associated with Graves disease in a Caucasian population. JCEM 1995:80, [4] Yanagawa T., Taniyama M., Enomoto S., Gomi K. et al.: CTLA-4 gene polymorphism confers susceptibility to Graves disease in Japanese. Thyroid. 1997: [5] Yung E., Cheng P.S., Fok T.F., Wong G.W.: CTLA-4 gene A-G polymorphism and childhood Graves disease. Clinical Endocrinology. (Oxf) 2002:56(5),

6 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 6/2007;2(19):9-14 [6] Donner H., Rau H., Walfish P.G., Braun J., Siegmunt T., Finke R., Herwig J., Usadel K.H., Badenhoop K.: CTLA4 alanine-17 confers genetic susceptibility to Graves disease and to type 1 diabetes mellitus. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1997: [7] Awata T., Kurihara S., Iitaka M. et al.: Association of CTLA-4 gene A/G polymorphism (IDDM12 locus) with acute- onset and insulin-depleted IDDM as well as autoimmune thyroid disease (Graves, disease and Hashimoto s thyroiditis) in the Japanese population. Diabetes. 1998:47, [8] Donner H., Braun J., Seidl Ch. et al.: Codon 17 Polymorphism of the Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 Gene in Hashimoto s Thyroiditis and Addison s Disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1997:82 (12), [9] Nistico L., Buzzetti R., Pritchard L.E. et al.: The CTLA-4 gene region of chromosome 2q33 is linked to, and associated with type I diabetes. Human Molecular Genetics. 1996:5, [10] Deichmann K., Heinzmann A., Bruggennolte E. et al.: An Mse I RFLP in the human CTLA-4 promoter. Biochemical and Biophysical Researche Communications. 1996:225, [11] Harper K., Balzano C., Rouvier E. et al.: CTLA-4 and CD28 activated lymphocyte molecules are closely related in both mouse and human as to sequence, message expression, gene structure and chromosomal location. Journal of Immunology, 1991: 147, [12] Lee K.M., Chuang E., Griffin M. et al.: Molecular basis of T cell inactivation by CTLA-4. Science. 1998:282, [13] Carreno M., Bennet F., Chau T.A., Ling V. et al.: CTLA-4 (CD152) can inhibit T cell activation by two different mechanisms depending on its level of cell surface expression. The Journal of Immunology. 2000:165, [14] Kouki T., Sawai Y. Gardine C.A. et al.: CTLA-4 Gene Polymorphism at Position 49 in Exon 1 Reduces the Inhibitory Function of CTLA-4 and contributes to the Pathogenesis of Graves Disease. The Journal of Immunology, 2000:165, [15] Maurer M., Loserth S., Kolb-Maurer A. et al.: A polymorphism in the human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA4) gene (exon 1+49) alters T cell activation. Immunogenetics. 2002:54, 1-8. [16] Ligers A., Teleshova N., Masterman T. et al.: CTLA-4 gene expression is influenced by promoter and exon 1 polymorphism. The Genes and Immunity, 2001:2,