Wybrane czynniki genetyczne warunkujące podatność na stwardnienie rozsiane i przebieg choroby

Transkrypt

1 Wybrane czynniki genetyczne warunkujące podatność na stwardnienie rozsiane i przebieg choroby Stwardnienie rozsiane (MS, ang. multiple sclerosis) jest przewlekłą chorobą ośrodkowego układu nerwowego, która charakteryzuje się obecnością rozsianych ognisk demielinizacji i aksonopatii w obrębie mózgu i rdzenia kręgowego 1. Szacuje się, że na świecie choruje na nią ponad 2,5 mln osób. W Polsce liczba osób chorych na MS wynosi ponad 40 tys. Stwardnienie rozsiane rozpoczyna się najczęściej u osób młodych, między 20-tym a 40- tym rokiem życia i dwa razy częściej dotyka kobiety niż mężczyzn, co jest cechą charakterystyczną wielu schorzeń autoimmunologicznych 2. Przebieg stwardnienia rozsianego jest bardzo zróżnicowany. Najczęściej, w około 85% przypadków, choroba rozpoczyna się naprzemiennie występującymi okresami rzutów i remisji (RR, ang. relapsing-remitting). Jedynie u 20% pacjentów z RR MS występuje łagodna postać choroby, w której po latach od wystąpienia pierwszych objawów stopień deficytu neurologicznego jest niewielki. Natomiast u większości z nich w ciągu 25 lat przybiera ona postać wtórnie postępującą (SP, ang. secondary progressive). Ponadto, w 10%- 15% przypadków wyróżnia się postać pierwotnie postępującą (PP, ang. primary progressive), charakteryzującą się stałym pogarszaniem niesprawności od początku choroby 3. Progresję choroby ocenia się m.in. na podstawie dziesięciopunktowych skal EDSS (ang. expanded disability status scale) 4 oraz MSSS (ang. multiple sclerosis status scale) 5. Ze względu na dużą częstość występowania, szczyt zachorowania we wczesnym wieku oraz wieloletni i progresywny przebieg, stwardnienie rozsiane stanowi istotny problem nie tylko medyczny, ale i społeczny. Dlatego też, badania przyczyniające się do wyjaśnienia, wciąż nie do końca poznanej, etiologii i patogenezy tej choroby wydają się być szczególnie ważne. Zgodnie z obecnym stanem wiedzy ryzyko zachorowania na stwardnienie rozsiane może być modulowane zarówno przez czynniki środowiskowe, jak i genetyczne. W latach 70- tych odkryto związek regionu 6p21, zawierającego geny HLA, z ryzykiem zachorowania na MS. Przez około trzy dekady region ten był jedynym, potwierdzonym czynnikiem warunkującym podatność na stwardnienie rozsiane. Dopiero wprowadzenie technik przeszukiwania genomu (GWAS, ang. genome wide association studies) pozwoliło na wytypowanie nowych genetycznych czynników ryzyka 6. Ponieważ polimorfizmy analizowane w GWAS są często jedynie markerami regionów, w których należy poszukiwać

2 właściwych polimorfizmów funkcjonalnych, związanych z rozwojem i przebiegiem choroby, wyniki tych badań wymagają potwierdzenia i dalszej analizy w niezależnych populacjach 7, co między innymi było celem niniejszej pracy. W przedstawionym projekcie połączono bowiem dwie strategie identyfikacji genetycznych czynników ryzyka GWAS oraz badanie genów kandydatów. Przy wyborze genów kierowano się zarówno opublikowanymi wynikami badań przeszukiwania genomu, jak również wzięto pod uwagę potencjalny udział produktów białkowych w patogenezie stwardnienia rozsianego. Do zbadania wyselekcjonowano geny, kodujące cząsteczki zaangażowane m.in. w regulację procesu aktywacji limfocytów T i B: ALCAM, CD6; CD28, CTLA-4, CD80, CD86; CD40 i CD40L. Pierwszy etap projektu obejmował badanie 24 polimorfizmów wybranych na podstawie analizy in silico, w 8 powyższych genach kandydatach oraz analizę ich związku z podatnością i przebiegiem choroby. Przeanalizowano również interakcje pomiędzy wariantami polimorficznymi tych genów oraz ich wpływ na ryzyko i przebieg choroby. Ponadto przeprowadzono stratyfikację według najważniejszego czynnika genetycznego podatności na MS, jakim jest allel HLA-DRB1*15:01. Badanie to wykonano na grupie 336 osób chorych na stwardnienie rozsiane oraz grupie kontrolnej złożonej z 322 osób zdrowych. Na podstawie badań genetycznych wyselekcjonowano geny do badań funkcjonalnych. Były nimi: ALCAM, CD6, CD40 i CD40L. Dla tych genów porównano poziom ekspresji mrna u osób chorych i zdrowych. Przeanalizowano również korelację genotypu w badanych miejscach polimorficznych poszczególnych genów z poziomem ich ekspresji. Grupa osób chorych uczestniczących w drugim etapie badań składała się z 39 pacjentów z rzutoworemisyjną postacią choroby, natomiast grupę kontrolną stanowiło 40 zdrowych osób. ALCAM, CD6 Jednym z regionów wytypowanych w GWAS, jako potencjalnie związanym z podatnością na MS, był region 3q13, w którym zlokalizowany jest między innymi gen kodujący cząsteczkę ALCAM. Cząsteczka ta, oddziałując z receptorem CD6, reguluje proces aktywacji limfocytów T 8. Interakcje pomiędzy tymi cząsteczkami odgrywają również rolę w procesie transmigracji leukocytów przez barierę krew-mózg 9. W ramach niniejszej pracy

3 zbadano sześć polimorfizmów w genie ALCAM (rs c>t, rs a>g, rs579565g>a, rs c>t, rs g>t, rs g>a) oraz dwa w genie CD6 (rs c>g, rs g>a). Wyniki badań ujawniły, że osoby będące heterozygotami w miejscu polimorficznym rs c>t w genie ALCAM (nie zidentyfikowano rzadkich homozygot TT) miały ok. 1,7 razy wyższą podatność na MS, niższy stopień progresji choroby mierzony w skali MSSS oraz niższy wiek zachorowania w porównaniu z homozygotami CC. Również u osób posiadających allel A w miejscu polimorficznym rs579565g>a wiek zachorowania był niższy, ale efekty tych dwóch polimorfizmów nie były addytywne. Ponadto pokazano, że w badanej grupie, podobnie jak w innych populacjach europejskich, nosiciele HLA-DRB1*15:01 mieli prawie trzykrotnie wyższe ryzyko zachorowania na stwardnienie rozsiane w porównaniu z osobami nieposiadającymi tego allelu. Jednak u osób posiadających genotyp GT w miejscu polimorficznym rs g>t w genie ALCAM, jak również u heterozygot w miejscu polimorficznym rs g>a, nie zaobserwowano zwiększonego ryzyka związanego z obecnością allelu HLA-DRB1*15:01. Ze względu na niską częstość tych dwóch polimorfizmów w populacji kaukaskiej, w badanej grupie nie zidentyfikowano rzadkich homozygot. Badanie ekspresji genu ALCAM nie wykazało różnic w poziomie mrna między pacjentami i osobami zdrowymi. W pracy wykazano również, że SNP rs g>a w genie CD6 miał związek z podatnością na MS. Osoby posiadające genotyp AA (model recesywny) w tym miejscu polimorficznym miały niższe ryzyko zachorowania na stwardnienie rozsiane. Natomiast drugi z badanych polimorfizmów w genie CD6 rs c>g, mimo iż nie wpływał na predyspozycję do choroby, miał związek z jej progresją. Wyniki analizy pokazały, że osoby posiadające allel G w tym miejscu polimorficznym miały niższy stopień niepełnosprawności (mierzony w skali EDSS i MSSS) w porównaniu z osobami o genotypie CC. Ponadto analiza ekspresji genu CD6 ujawniła niższy poziom mrna tego genu u osób chorych na MS w porównaniu z osobami zdrowymi. CD28, CTLA-4, CD80, CD86 W niniejszej pracy zbadano geny kodujące cząsteczki CD28, CTLA-4, CD80 i CD86, które odgrywają kluczowa rolę w regulacji limfocytów T, a tym samym w utrzymywaniu tolerancji immunologicznej na własne antygeny. Zbadano dwa SNP w genie CD28

4 (rs , rs t>c) oraz po trzy polimorfizmy w genach CTLA-4 (rs c>t, rs231775a>g, rs g>t), CD80 (rs6641t>g, rs t>a, rs t>c) i CD86 (rs t>g, rs g>a, rs g>c). Wykazano, że allel G w miejscu polimorficznym rs231775a>g w genie CTLA-4 zwiększał ryzyko zachorowania na MS, ale tylko u osób nieposiadających HLA-DRB1*15:01. Zaobserwowano również, że polimorfizm rs t>g w genie CD86 miał związek z ryzykiem zachorowania. Osoby posiadające allel G w tym miejscu polimorficznym charakteryzowały się wyższą podatnością na MS w porównaniu z osobami o genotypie TT. Z kolei mniejsze ryzyko zachorowania wykazywały osoby posiadające allel A w miejscu polimorficznym rs t>a genu CD80. Ponadto, wykazano interakcję pomiędzy polimorfizmami w genach: CD28 (rs t>c), CD80 (rs6641t>g) i CD86 (rs g>c) wpływającą na wiek zachorowania na stwardnienie rozsiane. CD40, CD40L Z uwagi na kluczową rolę oddziaływań CD40-CD40L zarówno w humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej oraz wyniki badań przeszukiwania genomu, do zbadania w ramach projektu doktorskiego wybrano również geny CD40 i CD40L. Analiza ujawniła, że spośród pięciu badanych polimorfizmów (trzech w genie CD40 - rs752118c>t, rs c>t i rs c>g i dwóch w CD40L rs t>c i rs a>g) tylko polimorfizm rs c>t w genie CD40 miał związek z ryzykiem zachorowania na MS oraz przebiegiem choroby. Osoby posiadające allel T w tym miejscu polimorficznym miały wyższą podatność na MS oraz wyższy wiek zachorowania, a także dłużej pozostawały w fazie rzutowo-remisyjnej choroby. Badania wykazały także wpływ tego polimorfizmu na poziom ekspresji mrna genu CD40. Osoby posiadające genotyp CT lub TT w miejscu polimorficznym rs c>t (predysponujący do MS) miały niższy poziom mrna genu CD40 w porównaniu z homozygotami CC. Badania ujawniły również, że w grupie kontrolnej kobiety miały wyższy poziom ekspresji CD40L w porównaniu z mężczyznami. Ponadto kobiety chore na MS miały niższy poziom mrna CD40L niż kobiety zdrowe. Analiza korelacji poziomów ekspresji CD40 i CD40L ujawniła, że w grupie kontrolnej, osoby posiadające wyższy poziom mrna CD40, wykazywały również wyższą ekspresję CD40L. Takiej zależności nie zaobserwowano w grupie chorych na MS.

5 Podsumowując, wykazano, że Ryzyko zachorowania na stwardnienie rozsiane może być modulowane przez warianty polimorficzne w genach ALCAM, CD6, CD80, CD86 i CD40. Podatność na MS oraz przebieg choroby mogą być również warunkowane przez interakcje międzygenowe: CTLA-4 i HLA-DRB1*15:01, ALCAM i HLA- DRB1*15:01 oraz CD28, CD80 i CD86. Polimorfizmy w genach ALCAM, CD28, CD80, CD86 i CD40 związane są z wiekiem zachorowania MS. Warianty polimorficzne w genach ALCAM i CD6 wpływają na stopień niepełnosprawności chorych, natomiast polimorfizm w genie CD40, może modyfikować postęp choroby poprzez wpływanie na długość trwania fazy RR. Czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju stwardnienia rozsianego u osobników obu płci wydaje się być obniżony poziom mrna genu CD6, natomiast u kobiet do rozwoju MS może przyczyniać się również obniżona ekspresja genu CD40L. Poziom ekspresji mrna genu CD40 zależy od genotypu w miejscu polimorficznym rs c>t. Wyniki przedstawionych badań dotyczących genu ALCAM zostały opublikowane w Journal of Neuroimmunology 10 i było to pierwsze w literaturze doniesienie wskazujące na udział tego genu w warunkowaniu podatności na stwardnienie rozsiane i jego znaczenie w przebiegu choroby. Kontynuacja badań nad genami ALCAM oraz CD6 w kontekście MS doprowadziła do opublikowania kolejnej pracy w Journal of Neuroimmunology 11, w której po raz pierwszy w populacji polskiej opisano związek genu CD6 z ryzykiem i progresją tej choroby. Niniejszy projekt jest pierwszym, w którym zbadano związek genów CD40 i CD40L oraz związek ich wzajemnych interakcji z podatnością i przebiegiem stwardnienia rozsianego w populacji polskiej. Wyniki tych badań, opublikowane w Human Immunology 12, potwierdziły, wykazany w innych populacjach, związek polimorfizmu genu CD40 (rs ) z ryzykiem MS oraz po raz pierwszy ujawniły wpływ tego polimorfizmu na przebieg choroby. Ponadto, do chwili obecnej stosunkowo nieliczne prace podejmują temat związku genów CD28, CD80 i CD86 z podatnością na MS oraz z progresją tej choroby. Natomiast

6 dane dotyczące polimorfizmów w genie CTLA-4 nie są spójne. Wyniki moich badań, wykazujące związek genów CD80 i CD86 z podatnością na stwardnienie rozsiane, przyczyniają się do poszerzenia wiedzy na temat genetycznego podłoża stwardnienia rozsianego. Uzyskane wyniki wskazują również na istotny udział wzajemnych interakcji między genami w warunkowaniu podatności (CTLA-4 i HLA-DRB1*15:01, ALCAM i HLA- DRB1*15:01), a także przebiegu choroby (CD28, CD80 i CD86).

7 1. Pender MP and Greer JM. Immunology of multiple sclerosis. Current allergy and asthma reports. 2007; 7: Sawcer S, Franklin RJ and Ban M. Multiple sclerosis genetics. Lancet neurology. 2014; 13: Inglese M. Multiple sclerosis: new insights and trends. AJNR American journal of neuroradiology. 2006; 27: Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurology. 1983; 33: Roxburgh RH, Seaman SR, Masterman T, et al. Multiple Sclerosis Severity Score: using disability and disease duration to rate disease severity. Neurology. 2005; 64: International Multiple Sclerosis Genetics C, Bush WS, Sawcer SJ, et al. Evidence for polygenic susceptibility to multiple sclerosis--the shape of things to come. American journal of human genetics. 2010; 86: Baranzini SE. Revealing the genetic basis of multiple sclerosis: are we there yet? Current opinion in genetics & development. 2011; 21: Pinto M and Carmo AM. CD6 as a therapeutic target in autoimmune diseases: successes and challenges. BioDrugs : clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy. 2013; 27: Cayrol R, Wosik K, Berard JL, et al. Activated leukocyte cell adhesion molecule promotes leukocyte trafficking into the central nervous system. Nature immunology. 2008; 9: Wagner M, Wisniewski A, Bilinska M, et al. ALCAM--novel multiple sclerosis locus interfering with HLA-DRB1*1501. Journal of neuroimmunology. 2013; 258: Wagner M, Bilinska M, Pokryszko-Dragan A, et al. ALCAM and CD6 - multiple sclerosis risk factors. Journal of neuroimmunology Wagner M, Wisniewski A, Bilinska M, et al. Investigation of gene-gene interactions between CD40 and CD40L in Polish multiple sclerosis patients. Human immunology. 2014; 75: