części określano skrótem vrna8. Cząsteczka ta, o długości 875 nukleotydów, koduje dwa białka, białko niestrukturalne (NS1, ang.

Transkrypt

1 STRESZCZENIE Grypa corocznie wywołuje epidemie i sporadycznie pandemie. Światowa Organizacja Zdrowia podaje, że każdego roku na grypę choruje 5-15% populacji ludzkiej, w tym u 3-5 milionów ludzi obserwuje się ciężki przebieg choroby, natomiast tysięcy umiera z powodu infekcji lub powikłań pogrypowych. Czynnikiem etiologicznym wywołującym chorobę jest wirus grypy należący do rodziny Orthomyxoviridae, rodzaju Influenzavirus. Wyróżnić można trzy typy wirusa A, B, C. Dodatkowo, typ A dzieli się na podtypy zgodnie z odmianą glikoprotein powierzchniowych (hemaglutyniny - H i neuraminidazy N) występujących w otoczce wirusa. Opisano 18 wariantów H i 9 wariantów N, a kombinacja tych dwóch glikoprotein stanowi nazwę podtypu, np. H1N1, H5N1, czy H7N2. Genom wirusa stanowi jednoniciowa ujemnie spolaryzowana cząsteczka RNA (vrna) podzielona na 8 segmentów, która łącznie koduje 11 białek niezbędnych w cyklu replikacyjnym wirusa. Genomowe RNA oddziałuje z nukleoproteiną i trzema podjednostkami polimerazy tworząc kompleks rybonukleoproteinowy (vrnp, ang. ribonucleoprotein complex). Kompleks vrnp pojedynczego segmentu stanowi niezależną jednostkę replikacyjną i transkrypcyjną. Informacje o strukturze drugorzędowej vrna są ograniczone i dotyczą głównie końców 5 i 3 cząsteczki vrna. Fragmenty te zbudowane są z odpowiednio 13 i 12 nukleotydów, które charakteryzują się wysoką zachowawczością sekwencyjną, zarówno wśród szczepów, jak i typów wirusa. Dodatkowo, wykazują one częściową, wzajemną komplementarność, w wyniku czego możliwe jest powstanie zamkniętej formy vrna. Terminalne rejony odgrywają również istotną funkcję podczas cyklu replikacyjnego wirusa. Są one rozpoznawane przez wirusową polimerazę i stanowią swoisty dla niej promotor. Ponadto, różne struktury drugorzędowe tego regionu, powstające w kolejnych etapach namnażania wirusa, mogą brać udział w regulacji procesów transkrypcji i replikacji. Pomimo braku informacji o strukturze drugorzędowej cząsteczek vrna postuluje się, że zawarte w niej motywy strukturalne są istotne podczas selektywnego pakowania vrnp do potomnego wirionu. Obiektem badań przedstawionych w niniejszej pracy było genomowe RNA segmentu 8 wirusa grypy szczepu A/VietNam/1203/2004 (H5N1), które w dalszej

2 części określano skrótem vrna8. Cząsteczka ta, o długości 875 nukleotydów, koduje dwa białka, białko niestrukturalne (NS1, ang. nonstructural protein) oraz białko eksportu jądrowego (NEP, ang. nuclear export protein), które powstaje w wyniku alternatywnego składania mrna NS1. Z uwagi na to, że vrnp pojedynczego segmentu tworzy niezależną jednostkę transkrypcyjną i replikacyjną, jak również z tego powodu, że vrna odgrywa istotną rolę w procesie tworzenia potomnego wirionu, może ona stanowić interesujący cel terapeutyczny. Badania rozpoczęto od mapowań chemicznych vrna8 metodą SHAPE oraz z zastosowaniem siarczanu dimetylu (DMS, ang. dimethyl sulfate). Po wprowadzaniu uzyskanych wyników do programu RNAstructure 5.3 wygenerowano strukturę drugorzędową nazwaną CM-vRNA8. Wirusowe RNA było wysoce ustrukturalizowane i zbudowane z czterech domen, z których domenę I stanowiły częściowo sparowane końce 3 i 5 tworzące motyw strukturalny panhandle opisany wcześniej w literaturze. W drugim etapie badań wykonano porównanie strukturalno sekwencyjne, w którym wykorzystano 8146 unikatowych sekwencji vrna8 wirusa grypy typu A znajdujących się w bazie danych NCBI. Analizy bioinformatyczne wykazały obecność konserwatywnych par zasad w sześciu rejonach vrna8: / , / , / , / , / oraz / Na podstawie uzyskanych wyników bioinformatycznych i eksperymentalnych został wygenerowany model struktury drugorzędowej CMC-vRNA8. Struktura drugorzędowa uległa przemodelowaniu w dwóch rejonach, w których wystąpiły zachowawcze fragmenty dwuniciowe (domena III, rejon oraz domena IV, rejon ). W badaniach struktury drugorzędowej vrna8 zastosowano również metodę hybrydyzacji RNA do sond oligonukleotydowych mikromacierzy izoenergetycznych. Wykorzystano 444 sondy komplementarne, krok po kroku, do badanego RNA. Sondami z biblioteki izoenergetycznej są 2 -O-metylowane pentamery i heksamery z modyfikacjami typu LNA oraz 2,6-diaminopurynorybozydem. Modyfikacje rybozy oraz reszty adenozyny zaprojektowano tak, aby energia swobodna dupleksów hybrydyzacyjnych tworzonych z docelowym RNA była bardziej korzystna i wyrównana (izoenergetyczna). Idea mapowania mikromacierzowego opiera się na obserwacji, że pofałdowane, badane RNA może związać się z sondą oligonukleotydową tylko w rejonie, który nie jest uwikłany w strukturę drugorzędową. Za pomocą

3 modyfikowanych sond można określić dostępne rejony jednoniciowe w RNA, a więc uzyskać informacje o jego strukturze i jednocześnie miejscach silnie wiążących oligonukleotydy. Wyniki uzyskane tym sposobem wykazują dużą zgodność z modelem struktury drugorzędowej CMC-vRNA8, co potwierdza prawidłowość jego wymodelowania. W celu weryfikacji modelu struktury drugorzędowej CMC-vRNA8 przeprowadzono także analizy bioinformatyczne. Przy pomocy programu RNAstructure oszacowano prawdopodobieństwo występowania określonych par zasad oraz niesparowanych nukleotydów. Największy stopień prawdopodobieństwa obserwowano w domenie IV. Wprowadzenie ograniczeń w postaci zachowawczych par zasad z analizy sekwencyjno strukturalnej spowodowało także zwiększenie prawdopodobieństwa poszczególnych par zasad i niesparowanych nukleotydów w domenie III. Na podstawie analizy 8146 unikatowych sekwencji vrna8 pochodzących z bazy danych przeprowadzono kolejną analizę bioinformatyczną weryfikującą strukturę CMC-vRNA8. Uzyskano wysoki procent występowania par zasad zaproponowanych w CMC-vRNA8 (średnio 87,4%) wśród wszystkich sekwencji vrna segmentu 8 wirusa grypy typu A. Było ono wyższe o 0,4% w porównaniu z CM-vRNA8. Cząsteczkę vrna8 poddano również ograniczonym cięciom w obecności rodnika hydroksylowego. Metoda ta wnosiła informację o trzeciorzędowym pofałdowaniu vrna8. Analiza wykazała, że w vrna8 dla wolnego rodnika dostępna była większość nukleotydów w regionach: , , , oraz Natomiast niedostępna była większość nukleotydów w regionach: , , , , i W modelu struktury vrna8 w rejonie występował motyw strukturalny typu spinki do włosów. Wykazano, że struktury takie mogą być wydajnym substratem dla enzymów z rodziny ADAR, które katalizują deaminację hydrolityczną adenozyny, w wyniku której powstaje inozyna. Analiza bioinformatyczna sekwencji tego rejonu wykazała, że 31 adenozyn z udziałem ADAR może ulegać deaminacji do inozyny. W zaproponowanej strukturze CMC-vRNA8 występowały rejony jednoniciowe nie wykazujące reaktywności podczas mapowania chemicznego. Analiza tych rejonów wykazała sześć regionów potencjalnie zaangażowanych w oddziaływania trzeciorzędowe: / lub / , / , / lub / ,426 oraz /

4 W celu udokładnienia uzyskanej struktury drugorzędowej vrna8 zaprojektowano 4 krótsze, modelowe cząsteczki: mini-vrna8, M1-RNA, M2-RNA i M3-RNA. Cząsteczka mini-vrna8 zbudowana z 376 nukleotydów i zawierała 182 nukleotydy z końca 5 vrna8 oraz 188 z końca 3. Postuluje się, że w rejonach do nukleotydów w obu terminalnych regionach vrna mogą występować sygnały pakowania cząsteczki do wirionu potomnego. M1-RNA (fragment domeny III, rejon ) oraz M2-RNA (fragment domeny IV, rejon ) zawierały motywy helikalne zbudowane z zachowawczych par zasad. Natomiast cząsteczka M3-RNA stanowiła fragment domeny IV obejmujący rejon W modelu CMC-vRNA8 rejon ten tworzył strukturę typu spinki do włosów i zawierał miejsca wiązania sond mikromacierzowych. Dodatkowo, w regionie tym znaleziono sekwencję komplementarną do vrna czterech innych segmentów. Modelowe cząsteczki RNA poddano mapowaniu chemicznemu, jak również określono miejsca dostępne dla wiązania oligonukleotydów z użyciem mikromacierzy izoenergetycznych. W wygenerowanej strukturze drugorzędowej mini-vrna8 zaobserwowano identyczne lub podobne motywy strukturalne do tych występujących w pełnej długości vrna8. Zaproponowana struktura drugorzędowa modelowych cząsteczek (M1-RNA, M2-RNA, M3-RNA) potwierdziła duże prawdopodobieństwo odpowiednich motywów strukturalnych w vrna pełnego segmentu 8. Dzięki obecności tych samych elementów struktury drugorzędowej domen vrna8 na 5 i 3 końcu, cząsteczka mini-vrna8 mogłaby stanowić trzon wydajnego, nowego DI-RNA (ang. Defecting Interfering RNA). Wykazano, że zmutowane cząsteczki vrna z delecją lub insercją w środkowej części sekwencji mają zdolność do replikacji i włączania do potomnych wirionów. DI-RNA stworzone na bazie minivrna8 mogłoby służyć do wprowadzania genów reporterowych do komórki podczas badań związanych z wirusem grypy. Jednakże jej funkcjonalność należałoby potwierdzić w testach na liniach komórkowych. Wskazywałoby to na istotną rolę elementów struktury drugorzędowej zachowanych w mini-vrna8. Sugeruje się, że, tak jak w przypadku innych wirusów, struktura drugorzędowa vrna ma istotne znaczenie podczas cyklu replikacyjnego, a jej ważne elementy strukturalne muszą być zachowane mimo ewolucyjnej zmienności wirusa grypy. W związku z tym, zaprojektowano 14 oligonukleotydów antysensowych (ASO) kierując się zaproponowaną strukturą drugorzędową vrna8 [szczep

5 A/VietNam/1203/2004 (H5N1)], mapowaniem mikromacierzowym oraz regionami komplementarnymi pomiędzy vrna poszczególnych segmentów. Mikromacierze izoenergetyczne dostarczając informacji na temat rejonów jednoniciowych w cząsteczce, tym samym wskazały również dostępne miejsca dla wiązania oligonukleotydów antysensowych. Miejsca te dodatkowo były potwierdzone poprzez hydrolizę RNA z użyciem RNazy H. Informacja ta była istotna podczas projektowania oligonukleotydów antysensowych, jako potencjalnych inhibitorów cyklu replikacyjnego wirusa grypy. Jako miejsca wiązania sond oligonukleotydowych (środek wiązania w sekwencji vrna8) określono następujące nukleotydy: 17, 68, 69, 117, 141, 142, 163, , 250, 253, 254, 275, 389, 390, 405, , 436, 534, 535, 537, 538, , oraz 854. W vrna8 wykazano obecność rejonów komplementarnych do vrna pozostałych siedmiu segmentów wirusa grypy, korzystając z programu BLAST. Wykazano, że rejon posiada fragmenty komplementarne do vrna czterech innych segmentów (segmentu 1, 3, 4 oraz 5). Występowały również trzy rejony ( , , ) komplementarne do vrna trzech segmentów (odpowiednio: segmentu 3, 5, 6, segmentu 3, 4, 5 oraz segmentu 3, 4, 6). Natomiast aż 11 fragmentów posiadało wspólną część komplementarną do dwóch innych segmentów: (vrna1 i vrna7); (vrna1 i vrna5); (vrna5 i vrna7); , , oraz (vrna4 i vrna7); (vrna3 i vrna5); , (vrna3 i vrna7) oraz (vrna4 i vrna6). Przypuszcza się, że regiony te mogą być odpowiedzialne za oddziaływania pomiędzy segmentami. Z tego powodu podczas projektowania ASO szczególną uwagę zwracano również na te rejony wirusowego RNA. Aktywność zaprojektowanych oligonukleotydów antysensowych badano na linii komórkowej MDCK infekowanej wirusem grypy szczepu A/California/04/2009 (H1N1). Wykorzystywany w badaniach wirus w 2009 roku wywołał pandemię. Szczep ten wybrano ze względu na możliwość przeprowadzenia badań z wykorzystaniem naturalnego wirusa w laboratorium prof. Luisa Martinez-Sobrido (Wydział Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet w Rochester, USA). Dodatkową zaletą jest model mysi do badań nad tym wirusem istniejący w tym samym laboratorium. Wszystkie ASO, z wyjątkiem oligomeru ASO 276-8C, które składały się z 2 -O-metylowanych oligonukleotydów wykazywały znaczącą inhibicję cyklu replikacyjnego wirusa w komórkach MDCK. Szczególnie wysoką aktywność wykazał

6 oligonukleotyd antysensowy 168-8U, który zmniejszał namnażanie wirusa do poziomu 3%. Zaobserwowano również, że oligomer G528-8U promował namnażanie wirusa w komórkach MDCK, zwiększając ilość wirusa do poziomu 189% w stosunku do kontroli. Zjawisko to wymaga jednak dodatkowych badań, w celu jego wyjaśniania. Efekt wywoływany przez G528-8U mógłby być wykorzystany w wydajnym namnażaniu szczepów laboratoryjnych przy produkcji szczepionek i w celach naukowych. Uzyskane wyniki inhibicji cyklu replikacyjnego wirusa wskazują na znaczenie funkcjonalne struktury drugorzędowej vrna8. Zastosowana strategia, której punktem wyjścia jest model struktury drugorzędowej, może być podstawą projektowania efektywnych inhibitorowych oligonukleotydów nakierowanych na RNA wirusa grypy.