Badania nad funkcją kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego móżdżku myszy z wykorzystaniem zwierząt transgenicznych

Transkrypt

1

2 Śląska Akademia Medyczna w Katowicach Jarosław-Jerzy Barski Badania nad funkcją kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego móżdżku myszy z wykorzystaniem zwierząt transgenicznych Rozprawa habilitacyjna Katowice 2004

3 Rodzicom

4 Składam podziękowania Panu prof. Hansowi Thoenenowi za umożliwienie mi podjęcia badań których wynikiem jest przedstawiona praca. Serdecznie dziękuję Panu prof. Michaelowi Meyerowi za zainteresowanie mnie tematem podjętym w pracy i fachową pomoc podczas jej wykonywania. Pragnę również podziękować mojej małżonce Ewie Barskiej za pomoc w pracach laboratoryjnych oraz Pani prof. Joannie Lewin-Kowalik i Pani dr Agnieszce Larysz-Brysz za cenne uwagi redakcyjne.

5 Praca została wykonana w Zakładzie Neurobiochemii Instytutu Neurobiologii Maxa Plancka w Martinsried/Niemcy Jaroslaw Barski Digitally signed by Jaroslaw Barski DN: CN = Jaroslaw Barski, C = PL, O = UZ, OU = WNB Reason: I am the author of this document Date: :59:18 +02'00'

6 Jarosław-Jerzy Barski Spis treści 1 Wstęp Funkcje jonów Ca 2+ w komórce nerwowej Funkcje móżdżku Mechanizm powstawania hamowania długotrwałego LTD Objawy zaburzenia funkcji móżdżku Metody badań uszkodzeń móżdżku stosowane w modelu zwierzęcym Białko pcp Rodzina białek EF-hand Charakterystyka buforów wapniowych obecnych w komórkach Purkinjego Kalbindyna D-28k Parwalbumina System Cre/loxP Założenia i cel pracy Materiał i metody Klonowanie DNA Przygotowanie komórek pnia Zwierzęta eksperymentalne Ekstrakcja DNA i analiza metodą Southern blot Analiza ekspresjii metodą RT-PCR Analiza ekspresjii metodą Western blot Analiza immunohistochemiczna Barwienie β-galaktozydazy metodą lacz Test otwartego pola Test na bieżni z przeszkodami Test na równoważni Badanie odruchów wzrokowych Eksperymenty elektrofizjologiczne i analiza LTD Pomiary wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca Omówienie wyników Modyfikacja genu kalbindyny przy pomocy sekwencji loxp linia Calbtm Konstrukcja wektora Calbtm I

7 Spis treści Przygotowanie komórek pnia Ocena ekspresji kalbindyny Analiza behawioralna i testy sprawnościowe Wprowadzenie ekspresji rekombinazy Cre do komórek Purkinjego linia L7Cre Konstrukcja wektora L7Cre Przygotowanie komórek pnia Ocena ekspresji rekombinazy Cre Analiza behawioralna i testy sprawnościowe Wyłączenie ekspresji kalbindyny w komórkach Purkinjego linia L7 x Calbtm Krzyżówka linii Calbtm.2 i L7Cre-2 analiza genetyczna Ocena rekombinacji allelu Calb tm.2 w komórkach Purkinjego Testy behawioralne i sprawnościowe Ocena zachowania eksploracyjnego test otwartego pola Analiza koordynacji ruchowej Odruchy wzrokowe Hamowanie długotrwałe (LTD) Wahania stężeń wapnia Ca 2+ pod wpływem stymulacji synaptycznej Dyskusja Wnioski Streszczenie Summary Bibliografia...94 II

8 Jarosław-Jerzy Barski 1 Wstęp 1.1 Funkcje jonów Ca 2+ w komórce nerwowej Jony wapniowe Ca 2+ pełnią kluczową rolę w metabolizmie wszystkich typów komórek (ryc.1). Pośredniczą w wymianie informacji pomiędzy wnętrzem komórki i przestrzenią międzykomórkową. Regulują procesy metaboliczne zachodzące w obrębie cytoplazmy, gdzie są nośnikiem informacji pomiędzy organellami komórkowymi, oraz biorą udział w sterowaniu ekspresją genów w odpowiedzi na bodźce dochodzące do komórki. W ten sposób mają wpływ na wszystkie podstawowe witalne funkcje komórki, poczynając od jej narodzin, poprzez proliferację i różnicowanie, a na procesach starzenia się i śmierci kończąc. Ryc.1 Procesy komórkowe zależne od udziału jonów wapniowych Szczególnie ważna rola przypada jonom wapniowym w komórkach pobudliwych, do których należą przede wszystkim komórki nerwowe. Jony Ca 2+ należą do podstawowych czynników integrujących układ nerwowy jako całość, uczestnicząc w przewodnictwie synaptycznym, a co za tym idzie są istotnym elementem regulacyjnym w procesie uczenia i zapamiętywania. System przekaźnikowy wykorzystujący jony Ca 2+ rejestruje zmiany ich stężenia [Ca 2+ ] i w obrębie cytoplazmy. Ponieważ absolutne różnice [Ca 2+ ] i są bardzo niewielkie, rejestrowanie ich i wykorzystanie przez mechanizmy wewnątrzkomórkowe możliwe jest jedynie w przypadku, gdy stosunek sygnału do tła, [Ca 2+ ] i : [Ca 2+ ] i(r) (gdzie [Ca 2+ ] i(r) = spoczynkowe stężenie wolnego Ca 2+ ), jest wysoki. Sytuacja taka możliwa jest wyłącznie wtedy, kiedy [Ca 2+ ] i(r) utrzymywane jest na bardzo niskim poziomie - około 100nM. System, który pozwala na względnie stałe utrzymywanie takich 1

9 Wstęp relacji, musi spełniać kilka warunków wyjściowych: musi posiadać znaczną pojemność, gdyż gwałtowny napływ jonów Ca 2+ może spowodować nawet 100-krotny wzrost ich stężenia, musi bardzo szybko reagować na zmiany stężenia jonów wapniowych - wahania [Ca 2+ ] i odpowiedzialne za wydzielanie neurotransmiterów trwają około 1ms - oraz w razie konieczności musi utrzymać podwyższone wartości [Ca 2+ ] i nawet przez wiele sekund, np. w przypadku hiperpolaryzacji spowodowanej serią potencjałów czynnościowych. Należy jednak przy tym pamiętać, iż nadmierne stężenie jonów Ca 2+ w cytoplazmie jest toksyczne dla komórki i może doprowadzić do jej śmierci, w związku z czym muszą istnieć bardzo sprawne mechanizmy usuwające szkodliwy nadmiar jonów wapnia z cytoplazmy. W procesie przenoszenia informacji za pomocą jonów wapniowych możemy wyróżnić cztery etapy funkcjonalne (ryc.2): bodziec prowadzący do uruchomienia sygnalizacji wapniowej, napływ Ca 2+ do cytoplazmy, aż do uzyskania aktywnego stężenia wapnia, procesy wapniozależne, odpływ Ca 2+ z cytoplazmy. Ryc.2 Schemat przedstawiający poszczególne etapy sygnalizacji wapniowej. Oznaczenia barwne odpowiadają kolorom użytym na rycinie 3 Jony wapnia uczestniczące w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej mogą pochodzić z przestrzeni międzykomórkowej lub z wewnętrznych zbiorników wapnia (ryc.3). 2

10 Jarosław-Jerzy Barski Ryc.3 Obieg jonów Ca 2+ w komórce nerwowej z uwzględnieniem wapniozależnych procesów komórkowych. Kolorem niebieskim oznaczono procesy odpowiedzialne za aktywację sygnalizacji wapniowej. Kolorem zielonym oznaczono procesy związane ze wzrostem stężenia jonów Ca 2+. Kolorem czerwonym oznaczono procesy odpowiedzialne za usuwanie jonów wapniowych z cytoplazmy. ACI/III cyklaza adenylowa I lub III, AMPA receptor α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksalopropionowy, ATP adenozyno trójfosforan, cadpr cykliczny adenozyno dwufosforan rybozy, camp cykliczny adenozyno monofosforan, CAMKII Ca 2+ /kalmodulino zależna kinaza białkowa II, CAM-CN kalmodulina-kalcyneuryna, Ins(1,4,5)P3 inozytolo-1,4,5-trifosforan, InsP3R receptor inozytolo-1,4,5-trifosforanowy, L, N, PQ, - kanały dla jonów Ca 2+, LTD hamowanie długotrwałe, LTP wzmocnienie długotrwałe, mglur metabotropowy receptor glutaminergiczny, NMDA receptor N-metylo-D-asparginianowy, PMCA pompa wapniowa błony plazmatycznej, PTP kanał PTP, RYRI receptor ryanodynowy, SERCA pompa wapniowa retikulum sarkoplazmatycznego. Jony Ca 2+ pochodzące z zewnątrz napływają do cytoplazmy poprzez kanały obecne w błonie komórkowej, które możemy podzielić ze względu na sposób ich aktywacji na trzy grupy: kanały bramkowane napięciem reagujące na zmiany potencjału elektrycznego błony cytoplazmatycznej. Do tej grupy należą kanały typu L, N, P/Q, R i T zaangażowane między innymi w uwalnianie transmiterów z zakończeń synaptycznych oraz doprowadzające jony wapnia regulujące aktywacje genów, 3

11 Wstęp kanały bramkowane chemicznie związane funkcjonalnie z receptorami reagującymi na transmitery. W tej grupie znajdują się receptory NMDA (Nmetylo-D-asparaginianowe), nieobecne w komórkach Purkinjego dojrzałych gryzoni [157] oraz receptory AMPA (α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4- izoksalopropionowe) biorące udział w procesach pamięci i uczenia poprzez regulację długotrwałego wzmocnienia - LTP (ang. long-term potentiation) i długotrwałego hamowania - LTD (ang. long-time depression), kanały bramkowane pojemnością zależne od stanu wypełnienia wewnątrzkomórkowych zbiorników Ca 2+, uruchamiające napływ Ca 2+ do wnętrza komórki poprzez nieznany bliżej mechanizm. Wewnętrznym zbiornikiem jonów wapniowych wykorzystywanych w sygnalizacji jest retikulum endoplazmatyczne. Wypływ jonów Ca 2+ z tego zbiornika kontrolowany jest przez rożne kanały błonowe, przy czym najlepiej poznanymi są kanały zależne od receptorów inozytolo-1,4,5-trifosforanowych (InsP 3 R) [156] oraz ryanodynowych (RYR), których obecność stwierdzono we wszystkich przedziałach wewnątrzkomórkowych komórek Purkinjego, za wyjątkiem kolców dendrytycznych [112, 212]. Dokładna funkcja tych drugich nie została dotychczas ostatecznie wyjaśniona [105, 121]. Do uwalniania jonów wapnia z retikulum endoplazmatycznego dochodzi w procesie zwanym uwalnianiem Ca 2+ indukowanym Ca 2+ CICR (ang. Ca 2+ -induced Ca 2+ release) [121, 176, 208]. Jony wapniowe po spełnieniu swej funkcji przekaźnikowej są natychmiast usuwane z cytoplazmy przy pomocy pomp wapniowych i wymienników jonowych. Rozmieszczone w błonie plazmatycznej pompy wapniowe PMCA (ang. plasma membrane Ca 2+ ATPase) [49, 70, 77, 184] oraz wymienniki Na + /Ca 2+ usuwają nadmiar wapnia na zewnątrz komórki [22, 114], natomiast pompy wapniowe retikulum sarko-endoplazmatycznego SERCA (ang. sarco-endoplasmatic reticulum Ca 2+ ATPase) wpompowują jony Ca 2+ do rezerwuarów wewnątrzkomórkowych [11, 64]. Strukturami zaangażowanym w usuwanie wapnia z cytoplazmy są również mitochondria [64]. Pobierają one intensywnie jony wapniowe podczas ich napływu do cytoplazmy, a następnie uwalniają je wolno podczas odbudowywania spoczynkowego poziomu wapnia. Pobór wapnia przez mitochondrium odgrywa istotną rolę w regulacji amplitudy wahań [Ca 2+ ] i oraz ich przestrzenno-czasowej dystrybucji w cytoplazmie. Transport jonów wapniowych do wnętrza mitochondrium zależny jest od usuwania z 4

12 Jarosław-Jerzy Barski jego wnętrza protonów, co z kolei tworzy gradient elektrochemiczny umożliwiający syntezę ATP. Ten sam gradient napędza transport Ca 2+ do wnętrza mitochondrium na zasadzie uniportu o niskim powinowactwie do jonów wapnia, którego półmaksymalna aktywacja następuje przy [Ca 2+ ] i około 15µM. Stąd też intensywność akumulacji jonów wapniowych przez mitochondria zależy od lokalnego ich stężenia, które jest wysokie w bliskim sąsiedztwie otwartych kanałów wapniowych takich jak np. receptory InsP 3 czy RYR. Zjawisko to sugeruje istnienie wzajemnej zależności funkcjonalnej pomiędzy mitochondriami i retikulum endoplazmatycznym, w której to retikulum dostarcza Ca 2+ pobierane przez mitochondria, natomiast mitochondria regulują proces wydzielania jonów wapniowych z retikulum endoplazmatycznego. Mitochondria są w stanie zakumulować znaczne ilości jonów wapniowych, lecz posiadają jednocześnie mechanizmy enzymatyczne zapobiegające nagromadzeniu nadmiernej ich ilości. Kiedy stężenie jonów osiągnie poziom spoczynkowy, mitochondrialny wymiennik Na + /Ca 2+ wypompowuje zgromadzone jony wapniowe do cytoplazmy, skąd są one odprowadzane przez retikulum endoplazmatyczne lub usuwane do przestrzeni międzykomórkowej. Nagromadzenie nadmiernej ilości jonów wapniowych wewnątrz mitochondrium prowadzi również do uruchomienia mechanizmu zbliżonego do CICR i wydalania jonów Ca 2+ do cytoplazmy poprzez kanały PTP (ang. permeability transition pore) [74, 148]. 1.2 Funkcje móżdżku W wyniku szczegółowych badań prowadzonych od wielu lat poznano i opisano podstawowe funkcje, jakie spełnia móżdżek w obrębie ośrodkowego układu nerwowego. Do podstawowych zadań tej struktury należy: utrzymanie równowagi ciała, kontrola precyzji i płynności ruchów dowolnych i mimowolnych, dystrybucja siły skurczów mięśni i koordynacja ruchowa. Do dziś jednak trwa dyskusja na temat, w jaki sposób móżdżek realizuje wymienione powyżej funkcje. Rozwój metod eksperymentalnych pozwalających na bardziej dogłębne badanie układu nerwowego doprowadził do odkrycia nowych aspektów funkcjonowania móżdżku, a co za tym idzie do powstania nowych teorii opisujących zasadę działania tej struktury [22, 24, 29, 43, 46, 83, 124, 133, 156, 194]. Podstawą do dyskusji nad zasadami działania móżdżku stała się teoria, którą w latach 70-tych stworzyli niezależnie 5

13 Wstęp od siebie David Marr i James Albus. Wysunęli oni mianowicie hipotezę, iż pętle neuronalne istniejące w korze móżdżku mogą być wykorzystywane podczas uczenia się funkcji motorycznych. Uczeni ci stworzyli modele matematyczne zakładające, iż impulsy dochodzące do komórek Purkinjego za pośrednictwem włókien pnących modyfikują odpowiedź tych neuronów na informacje docierające z innych obszarów mózgowia za pośrednictwem włókien kiciastych [5, 129]. Modyfikacja ta ma charakter hamujący i może utrzymywać się przez dłuższy czas, stąd została nazwana hamowaniem długotrwałym (ang. LTD long-time depression). 1.3 Mechanizm powstawania hamowania długotrwałego LTD Hamowanie długotrwałe realizowane jest poprzez modyfikację połączeń synaptycznych komórek Purkinjego. Modyfikacja ta prowadzi do zablokowania odpowiedzi neuronu postsynaptycznego (komórka Purkinjego) na neurotransmiter (glutaminian) dostarczany do przestrzeni synaptycznej przez neuron presynaptyczny (komórka ziarnista). Na poziomie molekularnym do wywołania LTD w komórkach Purkinjego potrzebne są trzy zasadnicze elementy (ryc.4): napływ jonów Ca 2+, aktywacja glutaminergicznych receptorów jonotropowych AMPA, aktywacja glutaminergicznych receptorów metabotropowych mglur. 6

14 Jarosław-Jerzy Barski Ryc.4 Schemat powstawania hamowania długotrwałego. AA kwas arachidonowy, AMPA receptor α-amino-3- hydroksy-5-metylo-4-izoksalopropionowy, DAG dwuacyloglicerol, G białko z grupy G, InsP3 inozytolo-1,4,5- trifosforan, mglur metabotropowy receptor glutaminergiczny, P grupa fosforanowa, PAF czynnik aktywujący płytki, PIP2 fosfatydyloinozytolo-4,5-bifosforan, PKC kinaza białkowa C, PLA2 fosfolipaza A2, PLC fosfolipaza C, PTK kinaza białkowa tyrozynowa, VGCC kanał wapniowy bramkowany napięciem. W warunkach fizjologicznych za wzrost stężenia jonów wapniowych odpowiedzialne są włókna pnące, natomiast aktywacja receptorów AMPA i mglur należy do włókien równoległych. Eksperymenty badające szczegółowo przebieg procesów prowadzących do LTD pokazały, iż w procesie tym może uczestniczyć wiele przekaźników pośrednich [78, 87, 88, 89], których aktywacja prowadzi do wzrostu stężenia jonów wapniowych w wyniku ich gwałtownego wydzielania z 7

15 Wstęp wewnątrzkomórkowych zbiorników Ca 2+ (CICR), a następnie do fosforylacji receptorów AMPA. W następstwie tych procesów dochodzi do długotrwałego hamowania aktywności receptorów AMPA, które jak wskazują ostatnie badania, odbywa się poprzez ich internalizację [131]. Rola włókien pnących polegałaby na dostarczaniu błędnego sygnału, który w momencie nałożenia się na podobny błędny sygnał pochodzący od włókien równoległych, powodowałby wygaszenie tego drugiego. Zgodnie z tą teorią włókna pnące pełniłyby funkcję komparatora, czyli jednostki funkcjonalnej rejestrującej różnice pomiędzy informacją sensoryczną oczekiwaną a rzeczywistą. W miarę wykonywania kolejnych podobnych i błędnych ruchów nieadekwatna informacja sensoryczna powinna być wygaszana, co w efekcie prowadziłoby do nauczenia się prawidłowej funkcji motorycznej [87]. 1.4 Objawy zaburzenia funkcji móżdżku Objawy zaburzenia pracy móżdżku u ludzi możemy podzielić zgodnie z klasyczną klasyfikacją Holmsa [81] na trzy grupy: hipotonia, czyli spadek napięcia mięśniowego, ataksja rozumiana jako zaburzenie koordynacji ruchowej przy wykonywaniu ruchów dowolnych, drżenie towarzyszące wykonywaniu ruchów, widoczne szczególnie w ich fazie końcowej. Pierwszy z objawów wiąże się z obniżeniem napięcia mięśniowego i zmniejszeniem siły skurczów. Przy pomocy tego zjawiska można wytłumaczyć występowanie tzw. odruchów wahadłowych. W przypadku badania odruchu kolanowego u pacjentów z uszkodzeniami móżdżku, po uderzeniu młotkiem neurologicznym powrót kończyny do pozycji wyjściowej poprzedzony jest kilkoma oscylacjami podudzia. Do charakterystycznych objawów ataksji pochodzenia móżdżkowego możemy zaliczyć różnorodne zaburzenia w wykonywaniu ruchów dowolnych. Typowymi przykładami takich zaburzeń są dysmetria, charakteryzująca się zaburzeniem orientacji przestrzennej wykonywanych ruchów, oraz dyskineza polegająca na stosowaniu siły skurczów nieadekwatnej do sytuacji. 8

16 Jarosław-Jerzy Barski Do typowych objawów związanych z zaburzeniami w funkcjonowaniu móżdżku należy również tremor kinetyczny zwany też drżeniem zamiarowym. Widoczny jest on szczególnie w fazie hamowania ruchu, kiedy dochodzi do aktywacji mięśni antagonistycznych. 1.5 Metody badań uszkodzeń móżdżku stosowane w modelu zwierzęcym Celem zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw wymienionych dysfunkcji motorycznych prowadzi się badania na zwierzętach, głównie na myszach, wykazujących zaburzenia koordynacji ruchowej przy jednoczesnych zdefiniowanych zmianach patologicznych w obrębie móżdżku. Od wielu już lat modelem eksperymentalnym w tych badaniach są linie myszy posiadających spontanicznie występujące mutacje genetyczne prowadzące do uszkodzenia lub/oraz atrofii dwóch głównych populacji komórkowych kory móżdżku czyli komórek Purkinjego i komórek ziarnistych [73]. W celach eksperymentalnych wywołuje się również zdefiniowane uszkodzenia móżdżku: chirurgicznie poprzez stereotaktyczne uszkodzenie kory móżdżku lub jej dróg aferentnych czy eferentnych [23, 99, 140, 163, 172], chemicznie poprzez stereoktaktyczne wprowadzanie substancji neurotoksycznych do wybranych obszarów móżdżku [8, 33], genetycznie poprzez celowe mutacje genowe prowadzące do wyłączenia ekspresji białek lub też ich nadekspresji w populacjach neuronalnych obecnych w móżdżku, w tym przede wszystkim w komórkach Purkinjego [13, 14, 15, 16, 60, 209]. Wprowadzane uszkodzenia powodują nieprawidłowości funkcji móżdżku o różnym natężeniu (nieraz bardzo subtelnych), widoczne przede wszystkim jako zaburzenia szeroko pojętej koordynacji ruchowej ataksje. Natężenie i zakres wprowadzonych uszkodzeń można analizować, poddając zwierzęta eksperymentalne testom behawioralnym i sprawnościowym. Do typowego zestawu eksperymentalnego możemy tu zaliczyć: test otwartego pola (ang. open field) [32], labirynt wodny Morrisa [141], test na bieżni obrotowej Rotarod [92], test na bieżni z przeszkodami oraz test na równoważni [96]. W skład metod badawczych stosowanych w zwierzęcych modelach uszkodzenia móżdżku wchodzą również bardziej skomplikowane metodycznie testy badające odruch optokinetyczny i przedsionkowo-wzrokowy [49, 102, 185, 197]. Odruch optokinetyczny (OKR ang. optokinetic reflex) polega na dostosowaniu ruchów gałek 9

17 Wstęp ocznych do poruszającego w się w polu widzenia obrazu, natomiast odruch przedsionkowo-wzrokowy (VOR ang. vestibulo-ocular reflex) adaptuje ustawienie gałek ocznych do ruchów głowy. Komórki Purkinjego kory móżdżku należą do kluczowych elementów uczestniczących w regulacji obu tych odruchów (ryc.5). Ryc.5 Schemat pętli neuronalnych uczestniczących w odruchu optokinetycznym i przedsionkowowzrokowym. JM/JP kompleks jąder móżdżku i jąder przedsionkowych, JS jądra śródmózgowia, JSPM jądro siatkowate pokrywy mostu, K komórka koszyczkowata, P komórka Purkinjego, WK włókna kiciaste, WP włókna pnące, Z komórka ziarnista. Neurony uczestniczące w regulacji VOR tworzą otwartą pętlę neuronalną zwaną łukiem Lorente de Nó. W skład jej wchodzą: neurony zwoju przedsionkowego, otrzymujące informację z przedsionka, drugorzędowe neurony przedsionkowe oraz neurony okoruchowe unerwiające mięśnie gałki ocznej. Koordynacja OKR odbywa się 10

18 Jarosław-Jerzy Barski za pomocą zamkniętej pętli neuronalnej utworzonej przez komórki zwojowe siatkówki, jądra śródmózgowia, część przedsionkową móżdżku oraz kompleks jąder móżdżku i jąder przedsionkowych. Komórki ziarniste i koszyczkowate części przedsionkowej móżdżku otrzymują również impulsację przedsionkową, optokinetyczną oraz okoruchową za pomocą włókien kiciastych. Komórki Purkinjego tej części móżdżku kontrolują VOR i OKR poprzez połączenia z kompleksem jąder móżdżkowych i przedsionkowych. 1.6 Białko pcp-2 Tkankowo specyficzne eksperymenty transgeniczne w komórkach Purkinjego móżdżku stały się możliwe wraz z odkryciem białka L7 zwanego zgodnie z oficjalną nomenklaturą: pcp-2 (ang. Purkinje cell protein, patrz: Mouse Genome Informatics Białko to opisane po raz pierwszy w 1988 roku przez dwie niezależne grupy badawcze [148, 149] charakteryzuje się bardzo specyficzną ekspresją i syntetyzowane jest jedynie w neuronach dwubiegunowych siatkówki oraz komórkach Purkinjego móżdżku [19, 150]. Gen kodujący to białko zlokalizowany jest na chromosomie 8 [34, 64] i zbudowany jest z 4 opisanych dotąd eksonów zajmujących około 4% całej sekwencji o długości 8kb [151, 198]. W trakcie badań własnych stwierdziłem obecność dodatkowego krótkiego eksonu, znajdującego się pomiędzy eksonami 3 i 4 [Barski et al., artykuł w przygotowaniu]. Lokus genu pcp-2 koduje mrna będące źródłem białka o ciężarze cząsteczkowym 16kD [149]. Translacja rozpoczyna się od kodonu ATG obecnego w eksonie 2 i obejmuje ekson 3 oraz część eksonu 4. Pcp-2 zawiera region o sekwencji zbliżonej do czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego oraz domenę GRP (ang. G protein regulatory motif) odpowiedzialną za interakcję pcp-2 z białkami G [125, 146]. Eksperymenty biochemiczne wykazały, iż pcp- 2 moduluje uwalnianie GDP z białek G i oraz G o. Ekspresja tego białka w komórkach Purkinjego myszy rozpoczyna się podczas pierwszych dwóch tygodni po urodzeniu, a jego obecność można wykazać poprzez barwienie immunohistochemiczne, Western blot, hybrydyzację RNA in situ oraz Northern blotting [148, 149]. Oznacza to, iż pcp-2 występuje w komórkach Purkinjego w stosunkowo dużych ilościach, co sugerowałoby znaczącą rolę tego białka dla tej populacji neuronów. Linie myszy z wyłączonym genem dla pcp-2 zostały stworzone niezależnie w dwóch laboratoriach [138, 199]. Jednak 11

19 Wstęp wbrew oczekiwaniom, nie stwierdzono u tych myszy żadnych zmian fenotypowych, zarówno pod względem morfologicznym, jak i behawioralnym. Należy jednak dodać, iż badania te były prowadzone zanim poznano funkcję pcp-2 jako modulatora uwalniania GDP, tak więc odpowiednie eksperymenty badające ten aspekt funkcjonalny ujawniłyby może nieodkryte dotychczas odstępstwa od fenotypu dzikiego. Pomimo, iż funkcja pcp-2 pozostaje nadal niewyjaśniona, sekwencje nukleotydów kodujące to białko były wielokrotnie stosowane w badaniach nad funkcją móżdżku, umożliwiając wprowadzanie ekspresji genów heterologicznych do komórek Purkinjego [9, 13, 26, 27, 28, 41, 48, 56, 57, 58, 86, 101, 150, 181, 182, 183, 210, 211]. 1.7 Rodzina białek EF-hand W przetworzeniu sygnału wapniowego na odpowiedź komórkową uczestniczą białka wiążące jony Ca 2+, przy czym zaangażowane są one z jednej strony w bezpośrednią indukcję wapniozależnych procesów komórkowych (sensory wapnia), z drugiej natomiast w buforowanie poziomu wapnia na obszarze cytoplazmy (bufory wapnia). Na szczególną uwagę zasługuje grupa białek należących do tzw. rodziny EFhand. Wspólną cechą strukturalną tej rodziny jest obecność domen wiążących jony wapnia, zwanych EF-hand [12, 97, 159]. Nazwa ta pochodzi od ich charakterystycznej budowy przypominającej kształtem dłoń, opisanej po raz pierwszy przez Kretsingera [108]. Domenę EF-hand tworzą dwie α-helisy oraz pętla zbudowana z 12 aminokwasów, które wiążą jon Ca 2+. Wniknięcie jonu wapnia do domeny prowadzi do jego związania oraz zmiany konformacji EF-hand (ryc.6). 12

20 Jarosław-Jerzy Barski Ryc.6 Schematyczne przedstawienie budowy domeny EF-hand oraz zmiany jej konformacji po związaniu jonu Ca 2+. Jony wapnia są wiązane ze stałą dysocjacji około 1µM w obecności milimolarnego, fizjologicznego stężenia jonów magnezu, które mogą być wymiennie wiązane przez domenę EF-hand na drodze kompetycji. Prototypem białka z rodziny EF-hand jest kalmodulina, rozpowszechniona praktycznie w całym świecie roślinnym i zwierzęcym. Kalmodulina posiada cztery domeny EF-hand i jest mediatorem wielu wapniozależnych procesów komórkowych. W grupie białek buforujących stężenie jonów wapniowych w cytoplazmie, do najlepiej poznanych należą: kalretynina, parwalbumina i kalbindyna. Zainteresowanie tymi białkami spowodowane zostało ich specyficzną lokalizacją ograniczoną do niektórych tylko populacji komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) [11, 35, 178]. Jeżeli porównamy ekspresję tych trzech białek w mózgowiu myszy (ryc.7), dostrzeżemy od razu wyraźne różnice w rozmieszczeniu tych trzech buforów wapniowych. Szczegółowa analiza immunohistologiczna wykazała, iż obszary wyznakowane przeciwciałami specyficznymi dla każdego z tych białek, pokrywają się ze sobą w bardzo nieznacznym stopniu. 13

21 Wstęp Ryc.7 Immunohistologiczna lokalizacja buforów wapniowych w mózgowiu myszy. a. kalbindyna D-28k, b. parwalbumina, c. kalretynina. H hipokamp, K kora mózgu, M móżdżek, MO most, OD oliwka dolna, OW opuszka węchowa, P prążkowie, PW podwzgórze, W wzgórze, WP wzgórek przedni, WT wzgórek tylny. 14

22 Jarosław-Jerzy Barski Charakterystyka buforów wapniowych obecnych w komórkach Purkinjego Jeżeli przyjrzymy się lokalizacji kalretyniny, parwalbuminy i kalbindyny w korze móżdżku zobaczymy, iż komórki Purkinjego pozbawione są zupełnie kalretyniny, natomiast zawierają parwalbuminę i kalbindynę. Kalretynina obecna jest na terenie warstwy ziarnistej, gdzie występuje we wszystkich komórkach ziarnistych [167, 176], jednobiegunowych komórkach koszyczkowatych [51, 52, 65] oraz komórkach Lugaro [50, 170] (ryc.8 e,f). W warstwie drobinowej kalretyninę zawierają wyłącznie aksony komórek ziarnistych, czyli włókna równoległe [170, 176]. Ryc.8 Lokalizacja białkowych buforów wapniowych w móżdżku myszy. a+b. kalbindyna D-28k, c+d parwalbumina, e+f. kalretynina. KM kora móżdżku, JM jądra móżdżku, WD warstwa drobinowa, WKP warstwa komórek Purkinjego, WZ warstwa ziarnista. Prostokątem zaznaczono obszar przedstawiony przy silniejszym powiększeniu. a+c+e bar = 500 µm, b+d+f bar = 50 µm Kalbindyna D-28k 15

23 Wstęp Kalbindyna D-28k jest produktem genu Calb1 zlokalizowanego u myszy na chromosomie 4 (szczegółowe informacje patrz.: Ensembl Genome Browser, oraz National Center for Biotechnology Information, NCBI, sekwencje: SEG D25367S oraz D25352 do D25357). Analiza sekwencji kodujących kalbindynę D-28k wykazała obecność 11 eksonów oraz sekwencji regulujących ekspresję tego białka, tworzących region promotorowy zajmujący około 3,5 kb [158, 190]. Efektem ekspresji tego genu jest białko o masie cząsteczkowej 28kD, posiadające sześć domen EF-hand, z których cztery wiążą jony Ca 2+, natomiast dwie z nich nie posiadają tej zdolności ze względu na zmieniony skład aminokwasowy [39] (ryc.9). Ryc.9 Schemat ilustrujący organizację domen EF-hand wchodzących w skład kalbindyny D-28k. Kolorem czerwonym oznaczono domeny zdolne do wiązania jonów Ca2+, natomiast kolorem niebieskim domeny nieaktywne. Szczegółowe badania nad kinetyką wiązania jonów Ca 2+ przez kalbindynę ujawniły, iż białko to zawiera domeny EF-hand o zróżnicowanych parametrach kinetycznych, co wiąże się z ich różnym powinowactwem do jonów wapnia [144]. Domeny o wyższym powinowactwie są domenami wolnymi, a ich stała k +, opisująca szybkość wiązania jonów wapnia, waha się w zakresie 1,1-1,3 x 10 7 M -1 s -1. Domeny o niższym powinowactwie są około osiem razy szybsze przy k + Ca2+ = 7,7-8,7 x 10 7 M -1 s -1. Przedstawione parametry kinetyczne pozwalają określić kalbindynę jako bufor szybki, zdolny do wiązania jonów wapniowych w pierwszej fazie ich napływu do komórki. Parametry te wynikają również z faktu, iż kalbindyna wykazuje bardzo niskie powinowactwo do jonów magnezu, czym różni się zasadniczo od parwalbuminy, również obecnej w komórkach Purkinjego [76, 117]. Kalbindynę oczyszczono po raz pierwszy z jelita kurzego [192], a następnie zlokalizowano ją w nerce, gdzie uczestniczy w transporcie jonów wapniowych [59]. Dalsze badania nad występowaniem kalbindyny ujawniły jej rozpowszechnioną ekspresję w układzie nerwowym wielu gatunków zwierząt, i to zarówno bezkręgowców, jak i kręgowców [35, 166]. W układzie nerwowym dorosłych ssaków kalbindyna 16

24 Jarosław-Jerzy Barski zlokalizowana jest w komórkach nerwowych o długich aksonach, występujących głównie we wzgórzu, prążkowiu i istocie czarnej oraz w neuronach o krótkich aksonach takich jak interneurony rdzenia kręgowego, kory mózgu, hipokampa czy komórki ziarniste zakrętu zębatego [11, 12, 35, 67, 90, 178]. Ekspresja kalbindyny pojawia się również przejściowo w określonych stadiach rozwoju embrionalnego [7]. U zwierząt dorosłych poziom ekspresji tego białka utrzymuje się na mniej więcej stałym poziomie, wykazując tendencję spadkową wraz z wiekiem [120]. Na terenie kory móżdżku występowanie kalbindyny ograniczone jest tylko i wyłącznie do komórek Purkinjego, w których rozmieszczona jest ona równomiernie na terenie całej cytoplazmy wypełniając ich dendryty oraz aksony, a jej stężenie, w zależności od metody pomiaru, oceniane jest na µM, co stanowi około 15% całkowitej masy białka (ryc.8 a,b). Badania w warunkach nadekspresji kalbindyny lub po jej wprowadzeniu do różnych typów komórek wykazały, iż białko to posiada zdolność buforowania jonów Ca 2+ i modulacji funkcji kanałów wapniowych, przez co uczestniczy w regulacji wewnątrzkomórkowej homeostazy wapniowej [6, 37, 136]. W ten sposób kalbindyna może wpływać na wapniozależną sygnalizację komórek pobudliwych, jakimi są neurony, i tym samym wpływać na ich fizjologiczne funkcje. Zjawisko to zostało opisane między innymi na przykładzie neuronów należących do jądra nadwzrokowego podwzgórza, które pod wpływem kalbindyny mogą zmieniać rodzaj aktywności elektrycznej z pulsacyjnej na ciągłą [118]. Neurony jądra nadwzrokowego podwzgórza zaangażowane są w regulację wydzielania wazopresyny i oksytocyny. Wydzielaniu pierwszego z hormonów towarzyszą potencjały czynnościowe generowane w sposób pulsacyjny, natomiast wydzielaniu drugiego z nich towarzyszy impulsacja ciągła [79]. Kolejnym krokiem w badaniach nad funkcją kalbindyny było stworzenie ogólnych mutantów, czyli myszy pozbawionych tego białka w całym organizmie [2]. Myszy te nie wykazywały żadnych zaburzeń rozwojowych czy morfologicznych w obrębie ośrodkowego układu nerwowego. Obserwacja zachowania tych zwierząt w standardowych warunkach hodowlanych nie pozwalała dostrzec żadnych anomalii behawioralnych, natomiast specyficzne testy sprawdzające koordynację ruchową podczas wymuszonej adaptacji do nowych warunków środowiskowych, wykazała znaczne upośledzenie sprawności motorycznej [2]. Analiza aktywności elektrycznej komórek Purkinjego będącej odpowiedzią na stymulację włókien pnących czy równoległych, nie wykazała żadnych 17

25 Wstęp zaburzeń spowodowanych brakiem kalbindyny w tych neuronach. Zaobserwowano natomiast wyraźne zmiany w przebiegu wywoływanych stymulacją synaptyczną wahań stężenia jonów Ca 2+ w dendrytach komórek Purkinjego [2]. Stymulacja komórek Purkinjego pojedynczym impulsem poprzez włókna równoległe czy pnące powoduje gwałtowny wzrost stężenia jonów wapniowych, a następnie jego wolniejszy, dwufazowy spadek, zawierający komponentę szybką i wolną. Amplituda komponenty szybkiej była czterokrotnie wyższa u zwierząt pozbawionych kalbindyny (Cb-/-) niż u zwierząt kontrolnych (Cb+/+). Amplituda komponenty wolnej oraz spoczynkowe stężenie jonów wapniowych pozostawało bez zmian. Na podstawie wyników tych badań powstała hipoteza robocza, iż kalbindyna D-28k jest szybkim buforem jonów wapniowych uczestniczącym w regulacji wahań stężenia jonów Ca 2+. Większość danych eksperymentalnych na temat kalbindyny pochodzi jednak z eksperymentów prowadzonych na neuronach hipokampa. Kalbindyna jest tu obecna w komórkach ziarnistych zakrętu zębatego i neuronach piramidowych pola CA1, brak jej natomiast na terenie pola CA3. Stwarza to wygodną sytuację do badań nad jej funkcją postsynaptyczną przy połączeniach neuronów piramidowych CA3 i CA1 oraz presynaptyczną w przypadku połączeń pomiędzy neuronami ziarnistymi zakrętu i piramidowymi pola CA3. Jedne z wcześniejszych badań prowadzonych na hodowanych neuronach hipokampa w warunkach nadekspresji kalbindyny wykazały zmniejszone wzmocnienie synaptyczne w tych neuronach [38], co było zgodne z założeniem, iż w obecności kalbindyny szybciej spada stężenie wolnego wapnia Ca 2+ w komórce. Stąd też obniżone torowanie w komórkach hipokampa pozbawionych kalbindyny było wynikiem nieoczekiwanym [100]. Niezgodność tę można by wytłumaczyć różnymi populacjami neuronalnymi analizowanymi w obu tych eksperymentach. Jednak bardziej eleganckim rozwiązaniem są wyniki nowszych badań, które wykazały, iż obecność szybkiego buforu jonów Ca 2+ po stronie presynaptycznej może prowadzić do zwiększonego torowania zależnego od częstotliwości pseudotorowania [173]. W eksperymencie tym, prowadzonym na neuronach kory szczura, zastosowano chelatory jonów wapniowych BABTA i EGTA, którymi wypełniano neurony. W przypadku iniekcji przy pomocy BABTA, po zastosowaniu pierwszego bodźca następowało częściowe wysycenie tego chelatora jonami Ca 2+, czego efektem było zmniejszone buforowanie tych jonów po zastosowaniu drugiego bodźca, a tym samym wzrost stężenia Ca 2+. Efekt ten był jednak 18

26 Jarosław-Jerzy Barski widoczny jedynie w przypadku BABTA, który jest szybkim buforem jonów wapniowych. Nie obserwowano go jednak po zastosowaniu EGTA, będącego buforem wolnym. Jak już nadmieniłem wcześniej, kalbindyna posiada dwie szybkie domeny wiążące jony wapniowe, co upodabnia jej właściwości buforujące do chelatora BABTA. Stąd też niskie lub średnie stężenie kalbindyny (lub BABTA) zwiększa torowanie, natomiast jej nieobecność (myszy-mutanty pozbawione kalbindyny Cb-/-) lub bardzo wysokie stężenie (nadekspresja kalbindyny) zmniejsza torowanie. Celem dokładniejszego poznania tego procesu w neuronach hipokampa, stworzona została linie myszy transgenicznych, u których ekspresja kalbindyny została zredukowana przy pomocy ekspresji antysensownej [139]. U myszy tych mierzono torowanie po zastosowaniu impulsu parzystego w kolateralach Schaffera, gdzie po stronie presynaptycznej znajduje się bardzo niewiele kalbindyny [93] i zgodnie z wynikami uzyskanymi u zwierząt Cb-/- [100] torowanie wykazywało wartości niezmienione. Zwierzęta z antysensowną ekspresją kalbindyny badano również pod względem długotrwałej plastyczności neuronów hipokampa i związanej z nią pamięci [93, 100]. Otrzymane wyniki wykazały zaburzenia wzmocnienia synaptycznego (LTP ang. long term potentiation) oraz trudności przy wykonywaniu przez zwierzęta testów behawioralnych sprawdzających orientację przestrzenną. Badania dotyczące roli kalbindyny w komórkach nerwowych sugerują również jej możliwy udział w zapobieganiu neurodegeneracji, lecz funkcja ta nie została ostatecznie potwierdzona [3, 69, 80, 100, 208]. Wysoki poziom ekspresji kalbindyny D-28k w jądrze nadskrzyżowaniowym (nucleus suprachiasmaticus - SCN) spowodował zainteresowanie naukowców ewentualną rolą kalbindyny w funkcjonowaniu tzw. zegara biologicznego, dostosowującego aktywność fizjologiczną zwierząt i człowieka do cyklów okołodobowych. Przeprowadzone eksperymenty wykazały korelację pomiędzy fazami cyklu okołodobowego a ekspresją kalbindyny oraz sugerują możliwość regulacji aktywności neuronów SCN poprzez to białko [77, 91, 114, 115, 180]. Interesujące wyniki otrzymano również podczas eksperymentów badających ewentualną funkcję, jaką mogłaby pełnić kalbindyna jako sensor wapniowy. Hipotezę taką wspierają wyniki analizy fizykochemicznych właściwości kalbindyny oraz pierwsze dane odnośnie możliwych przekaźników uczestniczących w sygnalizacji inicjowanej przez zmiany konformacyjne kalbindyny [17, 18]. 19

27 Wstęp Parwalbumina Oprócz kalbindyny komórki Purkinjego zawierają parwalbuminę, przy czym występuje ona również w innych elementach neuronalnych kory móżdżku, a mianowicie w GABA-ergicznych interneuronach warstwy drobinowej, czyli w komórkach gwiaździstych i komórkach koszyczkowatych, które unerwiają komórki Purkinjego, a same otrzymują impulsację z włókien równoległych i pnących [35, 106] (ryc.8 c,d). Parwalbumina jest białkiem cytoplazmatycznym o masie cząsteczkowej 12kD i wypełnia całe wnętrze komórek Purkinjego, a jej stężenie ocenia się na µM [106, 161]. Posiada ona trzy domeny EF-hand, w tym dwie aktywne, przy czym ich silne powinowactwo do jonów magnezu powoduje, iż parwalbumina w warunkach fizjologicznych wysycona jest tymi jonami, co zasadniczo zmienia jej kinetykę wiązania jonów Ca 2+. Stała dysocjacji dla Ca 2+ przy panującym w neuronach stężeniu Mg + [82, 113, 117, 188] wynosi pomiędzy nM, co obniża wartość k + do około 6 x 10 6 M -1 s -1 i czyni parwalbuminę wolnym buforem jonów wapniowych w porównaniu z kalbindyną. 1.8 System Cre/loxP Mutacje tkankowo specyficzne należą do kluczowych metod biologii molekularnej. Pozwalają one na wyłączenie lub zmianę funkcji badanego białka w zdefiniowanej populacji komórkowej, co z jednej strony umożliwia zawężenie badań do wybranego, interesującego nas obszaru, z drugiej natomiast strony pozwala na uniknięcie problemów powstających przy tworzeniu mutantów ogólnych. Zdarza się mianowicie często, iż wyłączenie funkcji genu dla białka uczestniczącego w kluczowych procesach komórkowych prowadzi do fenotypu letalnego, co może w znacznym stopniu utrudnić, lub wręcz uniemożliwić, analizę zwierząt homozygotycznych. System Cre/loxP jest dotychczas najlepiej poznanym i najczęściej stosowanym przy generowaniu mutacji zdefiniowanych tkankowo [14, 109, 162, 164, 207]. Wykorzystuje on zjawisko rekombinacji genowej występującej u bakteriofaga P1, opisane w 1981 roku przez Sternberga i Hamiltona [187]. Opisany przez tych autorów system rekombinacji wykorzystuje dwa elementy (ryc.10): sekwencje loxp (ang. loxp sites), które są krótkimi sygnałowymi sekwencjami DNA, 20

28 Jarosław-Jerzy Barski rekombinazę Cre. Ryc.10 Zasada działania systemu rekombinacji Cre/loxP. a. Skład nukleotydowy sekwencji loxp, strzałką zaznaczono fragment odpowiedzialny za orientację sekwencji loxp. b. Efekt rekombinacji w zależności od wzajemnej orientacji sekwencji loxp. Pojedyncza sekwencja loxp zbudowana jest z 34 par nukleotydów, które kodują trzy elementy funkcjonalne, a mianowicie rdzeń odpowiedzialny za orientację sekwencji loxp w łańcuchu DNA oraz dwie marginalne sekwencje będące sygnałami rozpoznawczymi dla recombinazy Cre (ryc.10a). Rekombinaza Cre jest białkiem enzymatycznym, które po rozpoznaniu sekwencji loxp obecnych w łańcuchu DNA rekombinuje sekwencje nukleotydów zawarte między nimi. Efekt rekombinacji zależny jest od wzajemnej orientacji sekwencji loxp (ryc.10b). Sekwencje loxp skierowane w tę samą stronę powodują wycięcie zawartego pomiędzy nimi fragmentu DNA, przy czym w zrekombinowanym fragmencie pozostaje jedna, kompletna sekwencja loxp. Wprowadzenie sekwencji loxp skierowanych wzajemnie do siebie powoduje odwrócenie fragmentu DNA zawartego pomiędzy nimi. Chcąc stworzyć linię myszy posiadających w swoim genomie mutację o zdefiniowanym zakresie występowania, musimy stworzyć dwie wyjściowe linie myszy. W pierwszej z nich sekwencję nukleotydów, którą chcemy zrekombinować, modyfikujemy poprzez wprowadzenie sekwencji loxp na jej końcach 3 oraz 5. Wprowadzenie sekwencji loxp do badanego genu jest zabiegiem stosunkowo prostym, możliwym praktycznie w przypadku dowolnej, znanej sekwencji DNA i polega na zastąpieniu macierzystej sekwencji poprzez sekwencję zmodyfikowaną w drodze rekombinacji homologicznej. Najistotniejszym aspektem modyfikacji DNA przy pomocy 21

29 Wstęp sekwencji loxp jest ryzyko zaburzenia ekspresji białka kodowanego przez zmodyfikowany odcinek DNA. Dlatego też przed dalszymi eksperymentami należy przeprowadzić analizę jakościową oraz ilościową białka syntetyzowanego na podstawie informacji zawartej w zmodyfikowanym fragmencie genu, porównując otrzymane wyniki z danymi pochodzącymi od osobników genetycznie niezmienionych. Do genomu drugiej linii myszy wprowadzamy sekwencję DNA kodującą rekombinazę Cre, przy czym jej ekspresja jest sterowana przez elementy regulacyjne należące do genu o znanym schemacie aktywności tkankowej. Najpoważniejszym ograniczeniem tej części systemu Cre/loxP jest niewielka liczba genów o ekspresji zawężonej do wyraźnie zdefiniowanych populacji komórkowych. Dodatkowym utrudnieniem jest fakt, iż zasadniczo nie możemy wprowadzić do genomu sekwencji kodujących rekombinazę Cre poprzez rekombinację homologiczną. Zabieg taki spowodowałby zastąpienie ekspresji endogennego białka poprzez ekspresję rekombinazy Cre, w wyniku czego dokonalibyśmy genetycznego nockoutu. Brak danego białka mógłby doprowadzić do zmian fenotypowych fałszujących wyniki oczekiwane przez nas po rekombinacji. Z powyższego powodu elementy kodujące tkankowo specyficzną ekspresję rekombinazy Cre wprowadzane są do genomu na zasadzie integracji przypadkowej (ang. random integration). Minusem tej metody jest możliwość, iż specyficzność oraz poziom ekspresji będą zależały od miejsca integracji w genomie. Dlatego też konieczne jest zawsze stworzenie kilku linii myszy z ekspresją rekombinazy Cre i staranne przeanalizowanie każdej z nich pod względem ekspresji tego białka. W przypadku gdy modyfikujemy gen uczestniczący w regulacji funkcji behawioralnych, niezbędna jest również analiza linii wyjściowych pod tym kątem. W następnej kolejności krzyżuje się ze sobą opisane linie myszy, czego efektem jest rekombinacja materiału genetycznego występująca u osobników dziedziczących jednocześnie ekspresję rekombinazy Cre oraz fragment genomu wyznakowany sekwencjami loxp. 22

30 Założenia i cel pracy 2. Założenia i cel pracy Podstawą do podjęcia eksperymentów przedstawionych w dalszej części tej pracy stały się następujące fakty dotyczące komórek Purkinjego kory móżdżku: neurony te są jedynym źródłem impulsacji opuszczającej tę część ośrodkowego układu nerwowego, w komórkach tych jony wapnia Ca 2+ pełnią kluczową rolę, podobnie jak we wszystkich komórkach pobudliwych, kalbindyna D-28k, będąca buforem jonów wapniowych, jest obecna tylko i wyłącznie w tej grupie neuronów kory móżdżku, komórki Purkinjego posiadają zdolność do modyfikacji swych połączeń synaptycznych poprzez proces hamowania długotrwałego LTD. Wyjściowym procesem prowadzącym do powstania LTD jest aktywacja postsynaptycznych metabotropowych receptorów glutaminergicznych mglur [171]. Myszy pozbawione ekspresji receptora mglur1, będącego podtypem receptora mglur obecnym w komórkach Purkinjego [72, 130, 174], wykazują zaburzenia koordynacji ruchowej pochodzenia móżdżkowego oraz brak LTD [1, 42]. Dalsze eksperymenty wykazały, że zaburzenia kaskady sygnalizacyjnej receptora mglur1 prowadzą do zakłóceń procesu LTD oraz do dysfunkcji koordynacji ruchowej niezależnie od poziomu, na którym zaburzy się sygnalizację. Dotyczy to zarówno ingerencji w funkcję białka Gαq [152], fosfolipazy Cβ [95], czy też IP 3 [132, 137]. Jak już nadmieniłem wcześniej, ostatni z wymienionych elementów jest zaangażowany w uwalnianie Ca 2+ z wewnątrzkomórkowych zbiorników tych jonów [63, 135, 189], który to proces jest zaangażowany w synaptyczną sygnalizację wapniową prowadzącą w efekcie do LTD [175, 105]. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że zmiany dynamiki wahań stężenia jonów Ca 2+ spowodowane wyłączeniem ekspresji kalbindyny D-28k mogą również prowadzić do dysfunkcji koordynacji ruchowej [2]. Ze względu jednak na ogólny charakter mutacji genu kalbindyny, eksperymenty te nie wyjaśniły, które z wielu grup neuronów zawierających kalbindynę odpowiedzialne są za obserwowane zmiany fenotypowe. Przeprowadzone przeze mnie eksperymenty miały więc dać odpowiedź na następujące pytania: 24

31 Jarosław-Jerzy Barski czy możliwa jest specyficzna i skuteczna ekspresja rekombinazy Cre z wykorzystaniem sekwencji regulatorowych białka pcp-2? czy system rekombinacji Cre/loxP pozwoli na specyficzne wyłączenie ekspresji kalbindyny D-28k w komórkach Purkinjego móżdżku? czy zaburzenia koordynacji ruchowej obserwowanej u myszy spowodowane są brakiem kalbindyny w komórkach Purkinjego? czy kalbindyna D-28k uczestniczy w procesie tworzenia hamowania długoterminowego LTD? jak wpływa brak kalbindyny na dynamikę zmian stężenia jonów Ca 2+ komórkach Purkinjego? W tym celu stworzyłem linię myszy pozbawionych kalbindyny tylko w komórkach Purkinjego móżdżku. Eksperyment ten wykonałem poprzez mutację tkankowo specyficzną z wykorzystaniem technologii Cre/loxP, a otrzymane mutanty poddałem szczegółowej analizie na poziomie komórkowym i behawioralnym. 25

32 Materiał i metody 3. Materiał i metody 3.1 Klonowanie DNA Fragment genomowego DNA wykorzystany do konstrukcji wektora dla linii Calbtm.2 został wyizolowany z biblioteki DNA 129Sv (Stratagene, La Jolla, USA) [2]. Wszystkie etapy klonowania opisane w tej pracy przeprowadziłem na bazie plazmidu pbluescript SK + (Stratagene, La Jolla, USA) oraz bakterii DH5α (Stratagene, La Jolla, USA). Enzymy restrykcyjne wykorzystywane podczas prowadzonych przeze mnie eksperymentów pochodziły z firmy New England Biolabs, Beverly, USA. Fragmenty DNA izolowałem z żelu agarozowego przy pomocy zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). DNA plazmidowe izolowałem z bakterii przy pomocy zestawu Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Kasetę selekcyjną wprowadzoną do wektora Calbtm.2 otrzymałem od dr R. Fässlera z Instytutu Biochemii Maxa Plancka (Martinsried, Niemcy) [66]. Plazmid pmccre, zawierający cdna kodujące rekombinazę Cre, pochodził od dr H. Gu i dr K. Rajewskiego z Uniwersytetu w Kolonii (Kolonia, Niemcy) [74]. Plazmid L7 AUG pochodził od dr. J. Oberdicka z Uniwersytetu Stanowego w Ohio (Columbus, USA) [151]. 3.2 Przygotowanie komórek pnia. Przy tworzeniu opisanych przeze mnie w tej pracy linii myszy: Calbtm.2 i L7Cre-2 wykorzystałem komórki pnia R1, będące darem od dr. Andreasa Nagy z Uniwersytetu w Toronto (Toronto, Kanada) [145]. DNA wprowadzałem do komórek pnia poprzez elektroporację przy pomocy urządzenia Gene Pulser (BioRad, Hercules, USA). Komórki pnia hodowałem na warstwie fibroblastów w medium hodowlanym zawierającym czynnik hamujący białaczkę (LIF ang. leukemia inhibitory factor), stosując do selekcji pozytywnej preparat G418 (Stratagene, La Jolla, USA), natomiast do selekcji negatywnej Gancyclovir w postaci preparatu Cymevene (Roche, Austria). DNA klonów przeżywające selekcję, trawiłem odpowiednią endonukleazą (patrz: Wyniki ) i analizowałem metodą Southern blot. Iniekcja blastocyst została wykonana przy pomocy urządzenia FemtoJet (Eppendorf, Hamburg, Niemcy), sprzężonego z mikroskopem Axiovert (Carl Zeiss, Esslingen, Niemcy). 3.3 Zwierzęta eksperymentalne 26

33 Jarosław-Jerzy Barski Blastocysty użyte do iniekcji komórek pnia pochodziły od myszy z linii C57Bl/6 (C57Bl/6NCrl BR, Charles River, Sulzbach, Niemcy). Biorcami blastocyst były pseudociężarne myszy z linii CD-1 (CD-1(ICR)BR Charles River, Sulzbach, Niemcy). Do krzyżowania chimer i krzyżówek wstecznych linii Calbtm.2 oraz L7Cre-2 używałem myszy z linii C57Bl/6 (C57Bl/6NCrl BR, Charles River, Sulzbach, Niemcy). Myszy z linii GtROSA26 pochodziły z ze stacji hodowlanej Jackson Laboratories, Bar Harbor, USA [184]. Stworzona przeze mnie linia myszy transgenicznych L7Cre-2 jest ogólnie dostępna pod nazwą Pcp-2-cre w instytucie badawczym The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA, Dane liczbowe dotyczące zwierząt użytych do testów sprawnościowych i behawioralnych zamieszczone zostały w opisie poszczególnych eksperymentów. Wszystkie linie myszy hodowałem w standardowych warunkach świetlnych w zwierzętarni Instytutu Neurobiologii Maxa Plancka (Martinsried, Niemcy), gdzie otrzymywały standardową paszę i wodę ad libitum. Eksperymenty były prowadzone zgodnie z przepisami regulującymi eksperymenty na zwierzętach, obowiązującymi w Republice Federalnej Niemiec. 3.4 Ekstrakcja DNA i analiza metodą Southern blot DNA stosowane w genotypizacji izolowałem przy pomocy standardowej metody lizując pobrany materiał w buforze zawierającym 100mM Tris-HCl ph 8,5, 5mM EDTA, 0,2% SDS, 200mM NaCl oraz proteinazę K w ilości 100µg/ml. Otrzymane DNA trawiłem endonukleazą restrykcyjną, rozdzielałem elektroforetycznie na 0,8% żelu agarozowym, a następnie poddawałem denaturacji alkalicznej. Zdenaturowane DNA przenosiłem metodą kapilarną na membranę Hybond+ (Amersham Biosciences, Amersham Place, Wielka Brytania), którą następnie hybrydyzowałem z wyznakowaną radioktywnie sondą. Wyniki hybrydyzacji analizowałem przy pomocy urządzenia BAS (Fujifilm Medical Systems, Stanford, USA). 3.5 Analiza ekspresjii metodą RT-PCR Tkanki przeznaczone do ekstrakcji RNA homogenizowałem przy pomocy homogenizatora Ultraturrax (Janke & Kunkel, Staufen, Niemcy) w buforze do ekstrakcji Trizol (Gibco-BRL, Gaithersburg, USA). Po dodaniu chloroformu (150µl/ml homogenatu), wirowałem homogenat w temperaturze 4 o C przy 12000g. Z otrzymanego 27

34 Materiał i metody w ten sposób supernatantu wytrącałem RNA dodając izopropanol i po inkubacji przez 16 godzin w temperaturze 4 o C, wirowałem ponownie jak wyżej. Po przemyciu 70% etanolem, rozpuszczałem peletkę w 10µl H 2 O. Stężenie RNA oznaczałem przy pomocy spektrofotometru Ultrospec (Amersham Biosciences, Amersham Place, Wielka Brytania). Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzałem według poniższego schematu: 1µg RNA (1µl) rozcieńczałem w 11µl buforu TE (Tris-EDTA) ph7,4, dodając następnie 1µl primera Oligo(dt) (Invitrogene, Karlsruhe, Niemcy). Otrzymaną mieszaninę inkubowałem kolejno: 5min, 90 o C; 10min, 37 o C; 15min, 20 o C, po czym po zwirowaniu dodawałem do każdej próbki 4µl buforu RT, 2µl 0,1M DTT (dithiothreitol), 0,8µl odwrotnej trankryptazy SuperScriptII RNaseH- (Invitrogene, Karlsruhe, Niemcy), 0,5µl dntp (mieszaniny 4 nukleotydów, 25mM każdy, New England Biolabs, Beverly, USA) oraz 0,5µl inhibitora RNazy (Boehringer, Mannheim, Niemcy). Przygotowane w ten sposób próbki inkubowałem przez 1 godzinę w temperaturze 37 o C, a po zakończeniu reakcji dopełniałem je 10µl TE do objętości 30µl. W wyniku opisanej powyżej reakcji otrzymywałem cdna, które następnie służyło mi jako matryca do reakcji PCR. Reakcję tę przeprowadzałem w objętości 25µl w mieszaninie o następującym składzie: 18,425µl H 2 O, 0,75µl MgCl2 (50mM), 2,5µl buforu PCR, 0,125µl polimerazy DNA Taq (Invitrogene, Karlsruhe, Niemcy), 0,2µl dntp oraz po 1µl obu primerów o stężeniu 10µM (synteza: Metabion GmbH, Martinsried, Niemcy), stosując jako matrycę 1µl cdna otrzymanego w wyniku odwrotnej transkrypcji. Reakcję PCR wykonywałem w urządzeniu Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Niemcy) przy następujących parametrach: dla Cb-28k: 95 o C 5min; [95 o C 30s; 66 o C 30s; 72 o C 30s] x 30; 72 o C 5min primery: Cb sense: 5 -GCAGAATCCCACCTGCAGTCA-3 Cb anti: 5 -TCGATGAAGCCGCTGTGGTCA-3 dla GAPDH: 95 o C 5min; [95 o C 30s; 61 o C 30s; 72 o C 30s] x 21; 72 o C 5min primery: GAPDH 5 : 5 -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 28