Chemia analityczna. Parametry charakteryzujące metodę analityczną. Zakład Chemii Medycznej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego

Transkrypt

1 Chemia analityczna Parametry charakteryzujące metodę analityczną Zakład Chemii Medycznej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego 1

2 Chemia analityczna Chemia analityczna jest nauką stosowaną, zajmującą się odkrywaniem i formułowaniem: praw kryteriów metod umożliwiających ustalenie z określoną: czułością precyzją dokładnością składu obiektów materialnych Komitet Chemii Analitycznej PAN, III Kongres Nauki Polskiej,

3 analizie poddawane są zarówno związki nieorganiczne, jak i organiczne Analiza chemiczna szereg czynności prowadzący do ustalenia składu chemicznego jakościowego i ilościowego badanej substancji. Analiza jakościowa ustalanie z jakich indywiduów chemicznych (pierwiastków lub struktur) zbudowana jest badana substancja Analiza ilościowa ustalanie składu ilościowego substancji zawartości lub/i stężenia poszczególnych składników Chemiczna analiza strukturalna ustalanie struktury badanego związku chemicznego - sposobu, w jaki atomy (grupy funkcyjne, inne struktury) są połączone 3

4 Analiza klasyczna i instrumentalna Analiza klasyczna (chemiczna) związków nieorganicznych analiza jakościowa analiza ilościowa metody wagowe polegają na oznaczeniu zawartości składnika na podstawie masy strąconego osadu. metody miareczkowe polegają na dodawaniu reagenta tak długo, aż całkowicie przereaguje z oznaczaną substancją. Na podstawie ilości dodanego titranta obliczamy stężenie (zawartość) naszej substancji. Analiza instrumentalna (fizyko-chemiczna) - do wykonania tych oznaczeń konieczny przyrząd zajścia reakcji lub jej końca nie rejestrujemy za pomocą naszych zmysłów, a wykorzystujemy urządzenia zdolne do pomiaru różnych zjawisk fizycznych lub fizykochemicznych. Metody biochemiczne wykorzystujące procesy enzymatyczne i immunochemiczne 4

5 Metody analizy ilościowej Obserwowane zjawisko Absorpcja promieniowania Emisja promieniowania Promieniowanie wtórne (wywołane napromieniowaniem), Rozproszenie promieniowania Skręcanie płaszczyzny światła spolaryzowanego Przemiany jądrowe Załamanie światła Współdziałanie pola magnetycznego z jonami lub fragmentami jonów Fizyczne Metoda spektroskopia w nadfiolecie, w świetle widzialnym (kolorymetria), w podczerwieni, turbidymetria, absorpcja atomowa, absorpcjometria rentgenowska spektrografia emisyjna, fotometria płomieniowa fluorymetria, fluorescencja rentgenowska, spektrografia ramanowska nefelometria, dyfrakcja promieni rentgenowskich polarymetria analiza aktywacyjna, radiometria refraktometria, interferometria spektrometria masowa, magnetyczny rezonans jądrowy i elektronowy, rezonans jądrowy 5

6 Podstawy analizy W zależności od ilości badanej substancji, metody analizy chemicznej dzieli się na: makroanalizę - próbki do 10 mg mikroanalizę - próbki poniżej 10 mg ultramikroanalizę - próbki poniżej 1 mg analizę śladową najważniejszy kierunek rozwoju chemii analitycznej próbki poniżej 10-2 % zawartość składników z próbce ślady % mikroślady % nanoślady % pikoślady % 6

7 Podstawy analizy Analit oznaczany (analiza ilościowa) lub wykrywany (analiza jakościowa) składnik próbki: pierwiastek Fe, Ca, F 2 jon Fe +3, SO 4 2- grupa funkcyjna -NH 2 związek chemiczny NH 3 inne indywiduum chemiczne O 2 -* Metoda analityczna sposób wykrywania (metoda analityczna jakościowa) lub oznaczania (metoda analityczna ilościowa) określonej substancji miareczkowanie przeprowadzenie reakcji charakterystycznych elektroforeza Procedura analityczna wszystkie etapy prowadzące do wykrycia obecności i/lub oznacznia stężenie analitu 7

8 Podstawy analizy Matryca próbki wszystkie składniki próbki prócz analitu Zanieczyszczenia próbki zmiana zawartości próbki, nie związana z planowym procesem analitycznym, w trakcie różnych etapów jego przebiegu Źródła zanieczyszczeń środowisko - np. CO 2 z atmosfery reagujący z NaOH urządzenia do pobierania próbek, procedury pobierania, sprzęt laboratoryjny, odczynniki i rozpuszczalniki, mikroorganizmy rozwój mikroorganizmów i glonów w buforze węglanowym, rozplanowanie i urządzenie laboratorium krzyżowanie się dróg personel źle oczyszczona woda do płukania naczyń zawierająca np. jony Ca 2+ 8

9 Podstawy analizy Zapobieganie zanieczyszczaniu próbki dokładne mycie szkła laboratoryjnego stosowanie odczynników o odpowiednim stopniu czystości oczyszczanie odczynników w celu zwiększenia stopnia czystości destylacja rozpuszczalników rekrystalizacja substancji stałych przepuszczanie gazów przez odpowiednie płuczki prowadzenie prac z zachowaniem zasad czystości prowadzenie prac przez odpowiedzialny personel 9

10 Etapy procesu analitycznego Czynności wstępne: przygotowanie literaturowe, wybór techniki analitycznej, metody i liczby oznaczeń, sprzętu i odczynników. pobranie średniej próbki, przygotowanie jej do analizy: rozdrobnienie, oczyszczenie, przeprowadzenie do roztworu (roztwarzanie,rozpuszczanie, oddzielenie od elementów morfotycznych, homogenizacja.) oddzielenie lub zagęszczenie oznaczonego składnika (np. przez wytrącenie osadu, elektrolizę, ekstrakcję, destylację, chromatografię, wymianę jonową), maskowanie przeszkadzających składników (np. za pomocą odczynników kompleksotwórczych, redukujących) derywatyzacja przeprowadzenie analitu w pochodną Pomiar Opracowanie wyników Wnioski i informacja analityczna 10

11 Metody pobierania i wykorzystania próbek niszczące - próbka ulega w trakcie analizy bezpowrotnemu zniszczeniu nieniszczące - próbka nie ulega zniszczeniu po wykonaniu analizy nie zmienia się jej struktura ani skład chemiczny analizy zdalne (np. analiza widmowa (spektralna)) - próbki nie są wyodrębniane; analizę wykonuje się na odległość bez wyodrębniania próbki z masy analizowanego materiału przepływowe - strumień materiału przepuszcza się przez aparat pomiarowy zaopatrzony w odpowiednie detektory i dokonuje automatycznej analizy bez jego zatrzymywania 11

12 Metody pobierania i wykorzystania próbek - nieniszczące Widmo UV/VIS hemoglobiny i hemoglobiny utlenowanej 12 %82y%20spektroskopiaUV%20PDF.pdf

13 Podstawowe parametry statystyczne Średnia arytmetyczna Σ x i suma wszystkich pomiarów n liczba pomiarów Mediana: Wartość środkowa z uszeregowanych według wzrastających wartości wyników pomiarowych. W przypadku parzystej liczby wyników, mediana jest średnią arytmetyczną z dwóch wyników środkowych. Rozrzut (rozstęp): Różnica między dwoma skrajnymi wynikami największym i najmniejszym: 13

14 Podstawowe parametry statystyczne Wariancja: iloraz sumy kwadratów odchyleń (różnic) poszczególnych wyników od wartości średniej i ilości pomiarów pomniejszonych o 1. Klasyczna miara zmienności. Utożsamiana ze zróżnicowaniem zbiorowości Odchylenie standardowe określa bezwzględne zróżnicowanie cechy Odchylenie standardowe określa, jak szeroko wartości pewnej wielkości są rozrzucone wokół jej średniej. Im mniejsza wartość odchylenia tym obserwacje są bardziej skupione wokół średniej. Względne odchylenie standardowe (współczynnik zmienności) określa względne zróżnicowanie cechy Współczynnik zmienności - względna miara zróżnicowania rozkładu cechy. Jest zależny od wielkości średniej arytmetycznej

15 Wielkości charakteryzujące metodę analityczną Specyficzność (metody, odczynnika, reakcji) możliwość zastosowania w określonych warunkach do wykrywania lub oznaczania tylko jednego konkretnego składnika Selektywność stopień w jakim metoda może być stosowana do oznaczania analitu w obecności innych składników próbki bez występowania interferencji. (IUPAC, 2001) Specyficzność oznacza 100 % selektywność IUPAC zaleca unikania stosowania terminu specyficzność 15

16 Wielkości charakteryzujące metodę analityczną Granica wykrywalności, wykrywalność (GW) LOD (ang. limit of determination) najmniejsze stężenie (lub ilość) substancji możliwe do wykrycia za pomocą danej procedury analitycznej z określonym prawdopodobieństwem Granica oznaczalności, oznaczalność (GO) LOQ (ang. limit of quantification) najmniejsze stężenie (lub ilość) substancji możliwe do ilościowego oznaczenia za pomocą danej procedury analitycznej z założoną dokładnością i precyzją GO=3 GW 16

17 Wielkości charakteryzujące metodę analityczną Parametrami określającymi liczbowo czułość reakcji są stężenie graniczne i minimum wykrywalne Minimum wykrywalne to najmniejsza ilość substancji (wyrażona najczęściej w μg), którą można wykryć za pomocą danej metody w ustalonych warunkach wykonania reakcji Stężenie graniczne to najmniejsze stężenie substancji w roztworze, przy którym można ją jeszcze wykryć daną metodą. Określa się je stosunkiem masy substancji wykrywanej do masy (objętości) rozpuszczalnika. Rozcieńczenie graniczne odwrotność stężenia granicznego. Jest to stosunek masy rozpuszczalnika do masy substancji wykrywanej. 17

18 Wielkości charakteryzujące metodę analityczną Dokładność stopień zgodności między wynikiem pomiaru mierzonej wielkości lub średnią kilku pomiarów a wartością prawdziwą lub akceptowaną jako prawdziwą; liczbowo określana poprzez błąd względny i bezwzględny Precyzja wzajemna zgodność wyników wielokrotnego (seria pomiarowa) oznaczania danego składnika tą samą metodą, liczbowo określana przez odchylenie standardowe lub względne odchylenie standardowe 18

19 Precyzja i dokładność metody Wysoka dokładność Wysoka precyzja Wysoka dokładność Niska precyzja Niskadokładność Wysoka precyzja Niska dokładność Niska precyzja 19

20 Precyzja i dokładność metody 20

21 Wielkości charakteryzujące metodę analityczną Powtarzalność precyzja odnosząca się do pomiarów wykonanych w tych samych warunkach. Określana jest przez rozrzut wyników uzyskanych: tą samą procedurą pomiarową i tym samym przyrządem przez tę samą osobę, w tym samym laboratorium, w krótkich odstępach czasu Odtwarzalność precyzja odnosząca się do pomiarów wykonanych w różnych warunkach. Określana jest przez rozrzut wyników uzyskanych: przez różne laboratoria (odtwarzalność międzylaboratoryjna), w jednym laboratorium, lecz w różnych odstępach czasu (odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna) przez różne osoby i za pomocą różnych przyrządów 21

22 Walidacja metody Walidacja - proces, którego celem jest: zapewnienie, że niepewność wyniku jest możliwa do zaakceptowania przez odbiorcę wyniku oszacowanie wpływu różnych czynników (instrumentalnego, ludzkiego, środowiskowego) na niepewność wyniku wskazanie, że metoda jest odpowiednia do osiągnięcia założonego celu Stosowanie walidacji: opracowywanie nowej metody przy wprowadzaniu zmian w metodzie przy zmianach parametrów metody w czasie gdy ustaloną metodę wykorzystuje się w innym laboratorium albo przez innych analityków, albo za pomocą innych przyrządów 22

23 Walidacja metody Walidacja metody obejmuje oszacowanie następujących parametrów: granica wykrywalności granica oznaczalności powtarzalność odtwarzalność odporność na zmianę warunków poprawność (obciążenie, błąd systematyczny całkowity) selektywność, specyficzność odzysk, zakres liniowości czułość niepewność dokładność 23

24 Błędy w analizie chemicznej Błędy przypadkowe przyczyną są różnego pochodzenia zakłócenia oddziałujące na sygnał mierzony w czasie doświadczenia. przyczyna nie jest dokładnie znana zwykle błędów tych nie można wyeliminować. wyniki w serii pomiarów zwykle różnią się między sobą. błędy te powodują niewielki przypadkowy rozrzut wokół pewnej wartości średniej nie wpływają na wynik końcowy (???) w celu zmniejszenia efektu błędu przypadkowego należy ściśle realizować założoną procedurę 24

25 Błędy w analizie chemicznej Błędy systematyczne charakter stały stałe odchylenie otrzymanego wyniku zmiana sygnału zachodzi w tym samym kierunku (wynik zawyżony lub zaniżony) przyczyny takiego błędu są ściśle określone mogą być zwykle ustalone i usunięte poprzez korektę postępowania jeżeli przyczyna błędu systematycznego nie może być usunięta, może zostać wprowadzona odpowiednia poprawka lub standaryzacja Główne przyczyny: metoda pomiaru błąd przyrządu zanieczyszczenie odczynników 25

26 Błędy w analizie chemicznej - systematyczne Błędy metodyczne wynikają one z istoty metody pomiarowej i nie mogą być usunięte (wolno prebiegająca reakcja) Błędy aparaturowe - związane są z niedokładnością urządzenia pomiarowego lub ich niestabilną pracą pipety - błąd kalibracji lub odmienna temperatura użycia wahania napięcia źródła prądu zmniejszenie intensywności promieniowania spowodowane zużyciem źródła. Błędy są usuwane przez staranne i częste kalibrowanie przyrządów pracujących w tych samych warunkach Błędy indywidualne wynikają z niedoświadczenie lub brak umiejętności analityka nadmierne przemywanie osadu, ważenie ciepłych naczyń wagowych, nieprawidłowa lokalizacja menisku w biurecie, daltonizm, wada wzroku. Błędy te usuwa się poprzez nabieranie wprawy przez analityka 26

27 Błędy w analizie chemicznej Błędy grube przyczyny trudne do ustalenia powstają zawsze z winy wykonawcy analizy występują tylko przy niektórych pomiarach efekt jednorazowego wpływu przyczyn działających przejściowo wynik pomiaru znacznie odbiega od pozostałych wyników serii Powody błędów: złe pobranie próbki zły dobór procedury oznaczeń błąd w obliczeniach złe ustawienie pokręteł, nie przepłukana biureta złe odczytanie lub przepisanie wyniku itd. 27

28 Błędy w analizie chemicznej Błąd bezwzględny (absolutny) różnica między zmierzoną wartością x a wartością rzeczywistą może mieć wartość dodatnią lub ujemną podawany jest w postaci wartości bezwzględnej dla wartości średniej z pomiarów jest to: różnica tej wartości i wartości rzeczywistej Błąd względny odnosi wartość błędu bezwzględnego do wartości rzeczywistej (µ) określa jego znaczenie dla oznaczenia E Eabs x x wzg % E wzg

29 Karty Levey a i Jenningsa metoda statystycznej kontroli jakości Na kartę kontrolną nanosi się poszczególne wyniki pomiarów W metodzie tej wykorzystuje się materiał kontrolny jako próbkę, którą analizuje się dla przeprowadzenia kontroli jakości. W tym celu przeprowadza się szereg pomiarów z wykorzystaniem próbek materiału kontrolnego, umieszczonych obok rutynowo badanych. Minimalny okres pomiarów nie powinien być krótszy od 10 dni. Optymalnie - 20 dni - zbyt krótki okres oceny wstępnej jest źródłem niedoszacowania zmienności P. Otomański: Wybrane zagadnienia oceny wiarygodności wyniku pomiaru w medycznym laboratorium diagnostycznym 29

30 Karty Levey a i Jenningsa metoda statystycznej kontroli jakości Najprostszym sposobem oceny wyników kontrolnych jest metoda oparta na wykorzystaniu jednej, prostej reguły interpretacyjnej, np. reguły 12,5s, gdzie s oznacza wartość odchylenia standardowego eksperymentalnego. W regule tej zakłada się, że metoda pozostaje poza kontrolą w sytuacji, gdy przynajmniej jeden wynik kontrolny uzyskany w serii pomiarowej wykracza poza granice określone przedziałem ± 2,5s 30 P. Otomański: Wybrane zagadnienia oceny wiarygodności wyniku pomiaru w medycznym laboratorium diagnostycznym

31 Jedną z najbardziej znanych i rozpowszechnionych reguł złożonych jest reguła 13s/22s/R4s/41s/10x nazywana od nazwiska głównego twórcy, regułą Westgarda W metodzie tej pierwszym elementem jest reguła 13s, która zakłada, że metoda pomiarowa znajduje się poza kontrolą, kiedy przynajmniej jeden wynik kontrolny uzyskany w serii pomiarowej wykracza poza granice trzech odchyleń standardowych. Jeżeli taka sytuacja ma miejsce wstrzymujemy wykonywanie badań i odrzucamy obliczenia, ponieważ uznajemy, że taka metoda jest niewiarygodna. Jeżeli wyniki pomiarowe nie przekraczają dopuszczalnego zakresu trzech odchyleń standardowych przechodzimy do kolejnego etapu algorytmu. Drugim elementem reguły złożonej jest reguła 22s. ITD P. Otomański: Wybrane zagadnienia oceny wiarygodności wyniku pomiaru w medycznym laboratorium diagnostycznym

32 Wykres Levey-Jennings Roztwory cholesterolu: Kontrolna 1: średnie stężenie 200 mg/dl, SD= 4.0 mg/dl. Kontrolna 1: średnie stężenie 250 mg/dl, SD= 5.0 mg/dl. Day Control 1 Value Control 2 Value s Rule Violation 1 3s Rule Violation Accept(A), Warning (W), or Reject(R)? Comments

33 Da y Control 1 Value Control 2 Value 1 2s Rule Violation 1 3s Rule Violation Accept(A), Warning (W), Comments or Reject(R)? K1: śr.=200 mg/dl, SD= 4.0 mg/dl. K2: śr.=250 mg/dl, SD= 5.0 mg/dl A A A A s - 3s R s W(A) A s (2x) R Both exceed + 2s A A s and - 2s A s W(A) s R A A s W(A) A A A A A A A R both exceed 2s in opposite directions. 2 days in a row exceeding - 2s s W(A) Negative shift A s W(A) Follow to see if negative shift continues or worsens A