Walidacja metod analitycznych

Transkrypt

1 Kierunki rozwoju chemii analitycznej Walidacja metod analitycznych Raport z walidacji Małgorzata Jakubowska Katedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH oznaczanie coraz niŝszych w próbkach o złoŝonej matrycy przy bardzo małej objętości próbki Problem: kontrola i zapewnienie jakości uzyskiwanych wyników Elementy systemów jakości stosowanie odpowiedniej atestowanych metod analitycznych (walidacja metod) prowadzenie analiz w profesjonalny sposób (laboratoria akredytowane) stosowanie wzorców i materiałów odniesienia o znanym składzie i czystości systematyczna kontrola uzyskiwanych wyników pomiarów. Przykłady rozrzutu wyników analitycznych obserwowane w porównaniach międzylaboratoryjnych na przestrzeni kilkunastu lat Materiał Liczba Pierwiastek Rozstęp wyników laboratoriów Rok Olej opałowy Ag 0,006 0,1 µg/g Hg 0,005 0, µg/g 1973 Węgiel K µg/g 197 Mleko w proszku IAEA A-11 Cd Co Cr , ng/g 0,00 51,5 µg/g 0, µg/g 1980 Mleko w proszku IAEA A-11 Liście tytoniu typu Oriental CTA-OTL-1 Ni Pb Cr Cs Na Pb ,1 500 ng/g ng/g ,038 11,6 µg/g 0,117 11,6 µg/g 8, µg/g 0,051 19,5 µg/g 1992 Wnioski rozstęp wyników dostarczonych przez laboratoria uczestniczące w porównaniach międzylaboratoryjnych często sięga kilku rzędów wielkości za tak znaczny rozrzut wyników odpowiedzialne są błędy analityczne. Ilustracja pojęć: zasada pomiaru, metoda analityczna oraz postępowanie analityczne 1

2 Walidacja metod analitycznych (według ISO) to proces ustalania parametrów charakteryzujących sprawność działania i ograniczeń metody oraz sprawdzenie jej przydatności do określonych celów. Podczas wykonywania walidacji naleŝy: określić, które parametry charakteryzujące metodę powinny być wyznaczone wyznaczyć wartości tych parametrów na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej wymagania związane z zamierzonym zastosowaniem wyników analitycznych. W efekcie wykonania walidacji moŝna uzyskać pewność, Ŝe proces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjnie oraz daje wiarygodne wyniki. Walidację wykonujemy gdy: opracowywana jest nowa metoda analityczna prowadzone są próby rozszerzenia zakresu stosowalności znanej metody analitycznej (np. do oznaczania znanego analitu do próbek o innej matrycy) kontrola jakości stosowanej metody wykazała zmienność jej parametrów w czasie dana metoda analityczna ma być wykorzystywana w innym laboratorium przeprowadza się porównanie danej metody z inną metoda odniesienia. Warunki uzyskania wiarygodnych wyników walidacji: stosowanie substancji porównawczych i pomocniczych o odpowiedniej, znanej czystości (certyfikowane) stosowanie sprawdzonej aparatury wykonanie badań przez personel o odpowiednich kwalifikacjach dokumentowanie kaŝdego etapu procesu walidacyjnego. Proces walidacji składa się zazwyczaj z następujących etapów: określenie przeznaczenia metody analitycznej i jej zakresu, definicja testowanych parametrów analitycznych oraz kryteria akceptacji, opracowanie planu eksperymentów walidacyjnych, sprecyzowanie charakterystyki sprzętu, przygotowanie wzorców oraz odczynników, eksperymenty walidacyjne z ewentualną korektą parametrów metody, obliczenia, interpretacja wyników, sprawdzenie kryteriów akceptacji, opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla badanej metodyki, określenie kryteriów rewalidacji, sporządzenie raportu. Parametry brane pod uwagę podczas walidacji: specyficzność/selektywność precyzja (powtarzalność i odtwarzalność) dokładność zakres metody liniowość granica wykrywalności granica oznaczalności elastyczność. 2

3 Przeprowadzenie procesu walidacji wymaga zastosowania: ślepych próbek ( w tym takŝe ślepych próbek odczynnikowych) roztworów wzorcowych (roztworów kalibracyjnych, próbek testowych) próbek ze znaną ilością dodanego analitu (wzbogaconych w analit) powtórzeń pomiaru analizy statystycznej zbiorów wyników. Specyficzność/selektywność: specyficzność - jedynie analit jest źródłem niezakłóconego sygnału analitycznego, zaś interferencje nie występują selektywność - zdolność jednoznacznego określenia substancji analizowanej w obecności składników, które mogą być zawarte w próbce, np. substancji pomocniczych, zanieczyszczeń, itd. badanie prowadzimy dla próbki zawierającej testowany składnik (test pozytywny) i próbki nie zawierającej analizowanej substancji (test negatywny). W przypadku, gdy nie jest moŝliwe udowodnienie specyficzności/selektywności danej metody analitycznej, naleŝy zastosować kombinację dwu lub więcej metod analitycznych by osiągnąć odpowiedni poziom pewności; muszą to być metody niezaleŝne, dobrze scharakteryzowane. Precyzja: stopień zgodności między pojedynczymi wynikami analizy (rozrzut wyników), gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezaleŝnych oznaczeń jednorodnej próbki najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe S, względne odchylenie standardowe RSD lub współczynnik zmienności CV obejmuje dwa pojęcia: powtarzalność i odtwarzalność. Kryteria akceptacji CV wyników zawartości składnika głównego nie powinno być większe niŝ 3% CV wyników oznaczania zawartości składników na poziomie śladowym nie powinno być większe niŝ 15%. Powtarzalność : wyraŝa precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie czasu, przez tego samego analityka i w tych samych warunkach (te same odczynniki, ten sam sprzęt) naleŝy wykonać minimum 6 powtórzeń dla poziomu stęŝenia 100% lub po trzy powtórzenia dla kaŝdego z minimum trzech poziomów w zakresie metody (zalecane % nominalnego stęŝenia) wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników. Odtwarzalność: pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych rezultatów w róŝnych laboratoriach z róŝnymi analitykami, na innym sprzęcie i w innych warunkach, z zachowaniem parametrów wymaganych w opisie metody badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku powtarzalności wyznacza się wartośćśrednią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników. Dokładność: zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością, stęŝeniem) a wartością będącą wynikiem analizy miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej błędu systematycznego metoda niedokładna moŝe być obarczona błędem systematycznym stałym (niezaleŝnym od poziomu zawartości oznaczanego składnika) i zmiennym (zaleŝnym od stęŝenia oznaczanego składnika) powinna być oszacowana na podstawie minimum 9 wyników oznaczeń dla minimum trzech róŝnych poziomów z badanego zakresu (np. trzykrotne oznaczenie dla trzech poziomów) najczęściej wynik przedstawia się jako błąd bezwzględny lub względny. 3

4 Szacowanie dokładności metody : przez analizę próbki o znanym stęŝeniu (np. certyfikowany materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wartością prawdziwą przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której dokładność jest znana przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą. Dokładność moŝe być przedstawiona jako procent odzysku, który oblicza się wg wzoru: x i oznaczona ilość analitu w badanej próbce, µ- znana ilość analitu w badanej próbce Kryteria akceptacji x i *100%, gdzie µ Odzysk powinien wynosić % w przypadku składnika głównego i % dla składników na poziomie śladowym (wartości te zaleŝą między innymi od stęŝenia analitu w badanej próbie i metody badania). Precyzja i dokładność metod analitycznych a) metoda dokładna i precyzyjna b) metoda precyzyjna ale mało dokładna c) metoda mało precyzyjna ale dokładna d) metoda mało dokładna i mało precyzyjna Liniowość: zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego wprost proporcjonalnych do stęŝenia (zawartości) substancji oznaczanej w próbce, w określonym zakresie zgodnie z wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b zaleŝność między obu zmiennymi charakteryzuje współczynnik korelacji r liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stęŝeniach analitu, obejmujących deklarowany zakres metody naleŝy wykonać badanie minimum 5-ciu serii wzorców (3-6 powtórzeń), których stęŝenia obejmują % stęŝenia spodziewanego w próbce. Kryterium akceptacji: w przypadku oznaczania substancji głównej współczynnik r powinien być większy od 0,995, w przypadku oznaczania śladów powinien być większy od 0,98. Liniowość: 0,30 Granica wykrywalności (DL) jest to najmniejsza ilość (stęŝenie) badanej substancji w próbce, które moŝe być wykryta, lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednią dokładnością. y,zmierzony sygnał 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 y = 0,0085x + 0,00235 r = 0,99662 Granica oznaczalności (QL) jest to najmniejsza ilość (stęŝenie) badanej substancji w próbce, jaka moŝe być ilościowo oznaczona z odpowiednią precyzją i dokładnością. 3.3* S DL = b 10* S QL = b 0, x,odwaŝka badanej próbki [mg] S odchylenie standardowe ślepej próby b nachylenie prostej kalibracji

5 Zakres: przedział między minimalną i maksymalną zawartością (stęŝeniem) substancji aktywnej w badanej próbie, w którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość, dokładność i precyzję. Minimalny zakres stosowania metody analitycznej powinien wynosić (kryteria akceptacji): dla zawartości substancji głównej od 80% do 120% deklarowanej ilości analitu w badanej próbie w przypadku oznaczania substancji na poziomie śladowym zakres powinien wynosić od 10% do 120% maksymalnej dopuszczalnej zawartości tej substancji określonej w specyfikacji. Elastyczność (stabilność metody): badanie elastyczności metody powinno udowodnić niezawodność analizy po wprowadzeniu niewielkich celowych zmian parametrów metody jeśli pomiar jest wraŝliwy na zmianę warunków analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio kontrolowane lub dokładnie opisane w procedurze. Raport z walidacji metod analitycznych (wykonany po zakończeniu prac laboratoryjnych) powinien zawierać: przedmiot i zakres walidacji rodzaj oznaczanych związków i matrycy opis metody kryteria akceptacji stosowane odczynniki, substancje porównawcze i wzorce opis aparatury (producent, typ) względy bezpieczeństwa parametry pomiaru opis przeprowadzonego eksperymentu postępowanie statystyczne i obliczenia reprezentatywne wykresy kryteria rewalidacji podsumowanie i wnioski. 1. Oznaczana metoda analityczna ogólne informacje o metodzie i zastosowanej aparaturze z podaniem jej typu roztwory wzorcowe rozwory badane wykonanie pomiaru. 2. Wybór optymalnych warunków pomiaru badania jakie wykonano w celu określenia optymalnych warunków pomiaru parametry podlegające modyfikacji wyniki osobno dla kaŝdego zmienianego parametru (w tabeli wartość parametru, wyniki np. 7 powtórzeń, średnia, odchylenie standardowe) wnioski. 5

6 Przykład: Dobór optymalnego przepływu acetylenu (fragment tabeli wyników) Numer poziomu 2 Absorbancja Średnia absorbancja Odchylenie standardowe 3. ZałoŜenia walidacyjne 3.1. Specyficzność/selektywność opis pomiarów jakie naleŝy wykonać wymagane wzorce wraz z określeniem sposób obliczenia wyniku kryterium akceptacji Powtarzalność 3.3. Precyzja pośrednia 3.. Dokładność 3.5. Liniowość 3.6. Zakres metody 3.7. Granica oznaczalności..1. Specyficzność/selektywność opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem wyniki pomiarów wyniki obliczeń Przykład. Badanie wpływu Na na wynik oznaczenia Ca metodą ASA. Stosunek Na:Ca 0:1 1:10 1:5 1:2 Średnia absorbancja RóŜnica średnich absorbancji wzorca bez dodatku Na i wzorca z dodatkiem Na Kryterium akceptacji :1 10: Powtarzalność opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem wyniki pomiarów wyniki obliczeń Przykład. Badanie powtarzalności oznaczania Ca metodą ASA. StęŜe nie [mg/l] A A A A A A A A S CV [%]

7 .2. Precyzja pośrednia tak jak powtarzalność ale dwóch róŝnych dniach.. Dokładność opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem wyniki pomiarów obliczony wynik wraz z podaniem poziomu niepewności pozostałe wyniki obliczeń Przykład. Badanie dokładności oznaczeania Ca metoda ASA. StęŜenie [mg/l] Absorbancja Średnia absorbancja Średnie stęŝenie Prosta kalibracji: y=0.085x Stopień odzysku [%].5. Liniowość opis pomiarów jakie wykonano lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem wyniki pomiarów wyniki obliczeń (współczynniki prostej kalibracji, współczynnik korelacji) wykres prostej kalibracji Przykład. Badanie liniowości oznaczania Ca metodą ASA. StęŜenie [mg/l] Średnia absorbancja Zakres metody informacja jak obliczono zakres metody uzyskany wynik (tj. zakres)

8 .7. Granica oznaczalności informacja jak obliczono granicę oznaczalności uzyskany wynik (tj. DL) 5. Wnioski końcowe informacja czy walidacja została zakończona wynikiem pozytywnym i metoda moŝe być stosowana. Wykonał: xxx KONIEC RAPORTU Dziękuję za uwagę! 8