Mikromacierze DNA analiza danych

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE Mikromacierze DNA analiza danych Piotr Stêpniak 1, Luiza Handschuh 1,2, Marek Figlerowicz 1 1 Centrum Doskona³oœci CENAT, Instytut Chemii Bioorganicznej, Polska Akademia Nauk, Poznañ 2 Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Krwi, Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego, Poznañ DNA microarray data anlysis Summary The paper gives an overview of common methods applied in microarray data analysis. High density oligonucleotide and low density home made microarray types are being considered. Presented exploration procedures follow preprocessing and higher analysis steps, including example methods. Describing higher analysis algorithms we focus on implementation of pattern search and machine learning approaches. Key words: DNA microarrays, microarray data analysis, background correction, normalization, summarization, filtration, clustering, support vector machines. 1. Wstêp Adres do korespondencji Piotr Stêpniak, Instytut Chemii Bioorganicznej, Polska Akademia Nauk, ul. Noskowskiego 12/14, Poznañ; piotrek.stepniak@gmail.com 4 (83) Mikromacierze stanowi¹ szczególnie interesuj¹ce narzêdzie wspó³czesnej biologii molekularnej, nie tylko ze wzglêdu na szerokie spektrum zastosowañ (analiza struktury genomu, profilu ekspresji genów, genotypowanie, sekwencjonowanie), ale i z uwagi na mo liwoœæ badania du ej liczby obiektów w jednym eksperymencie. Jednak e wy³onienie istotnych informacji z ogromnej iloœci danych uzyskiwanych przy u yciu mikromacierzy wymaga zastosowania wyrafinowanych metod bioinformatycznych. W artykule zaprezentowano próbê przybli enia podstaw tego zagadnienia i omówiono wybrane metody analityczne.

2 Mikromacierze DNA analiza danych G³ówne etapy eksperymentu mikromacierzowego zaprezentowane zosta³y na rysunku 1. Na tej podstawie mo na stwierdziæ, e wynikiem koñcowym tzw. mokrej czêœci eksperymentu jest mikromacierz, z któr¹ zwi¹zana zosta³a wyznakowana fluorescencyjnie próba. Nastêpnie p³ytkê tak¹ poddaje siê skanowaniu za pomoc¹ czytnika laserowego i uzyskuje obraz ukazuj¹cy, z jak¹ intensywnoœci¹ œwiec¹ punkty (ang. spots) zawieraj¹ce sondy specyficzne dla poszczególnych genów. W kolejnym etapie ka demu punktowi przyporz¹dkowana zostaje liczba okreœlaj¹ca natê- enie fluorescencji. Uzyskane w ten sposób surowe dane liczbowe poddawane s¹ najpierw normalizacji lokalnej (w obrêbie pojedynczej p³ytki), a nastêpnie globalnej (w obrêbie wszystkich mikromacierzy sk³adaj¹cych siê na eksperyment). Na ka dym z etapów sprawdza siê jakoœæ mikromacierzy wykluczaj¹c takie, które maj¹ powa - ne defekty techniczne. Nastêpny etap zwany jest filtrowaniem genów i ma na celu wybranie tzw. genów ró nicuj¹cych, których ekspresja zmienia siê istotnie w badanych warunkach, oraz odrzucenie tych, które nie daj¹ adnego sygna³u. Na podstawie tak zredukowanego zestawu genów prowadzi siê analizy wy szego rzêdu, poszukuj¹c grup genów o podobnym/odmiennym profilu ekspresji. Na zakoñczenie uzyskane wyniki poddawane s¹ interpretacji biologicznej, polegaj¹cej na powi¹za- Rys. 1. Schematyczny opis eksperymentu mikromacierzowego. BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

3 Piotr Stêpniak, Luiza Handschuh, Marek Figlerowicz Rys. 2. Schematyczny opis procesu analizy danych. niu obserwowanych zmian w poziomie ekspresji genów z fizjologicznymi b¹dÿ patologicznymi procesami zachodz¹cymi w badanym organizmie. Przebieg analizy przedstawiono schematycznie na rysunku Iloœciowa analiza obrazu W przypadku produkowanych komercyjnie mikromacierzy, np. wysokiej gêstoœci chipów firmy Affymetrix, etapowi odczytu obrazu poœwiêca siê ma³o uwagi, gdy sprowadza siê on do zliczenia intensywnoœci obserwowanych punktów w sektorze zawieraj¹cym konkretn¹ sondê. Proces ten przebiega w pe³ni automatycznie. Trochê wiêcej uwagi wymagaj¹ mikromacierze drukowane, gdy czêsto konieczne jest dopasowanie siatki rozmieszczenia punktów do ich rzeczywistego po³o enia na szkie³ku. Istnieje kilka algorytmów stosowanych do odczytu obrazu. Podstawowe algorytmy to: niezmiennego ko³a (ang. fixed circle), dopasowanego ko³a (ang. adaptive circle) i histogramu, przy czym ostatnie dwa uwzglêdniaj¹ ró nice w wielkoœci punktów. Interesuj¹cym rozwi¹zaniem jest te algorytm seed region growing, który obrysowuje ka dy punkt z osobna. Niestety aden nie jest odporny na b³êdy, które trzeba usuwaæ manualnie. Ka dej kropce przypisywany jest status (ang. good, bad, absent, found, not found) zakodowany w formie cyfrowej. Ten proces nosi nazwê flagowania. Po zakoñczeniu iloœciowej analizy obrazu (ang. quantitation) otrzymujemy plik tekstowy z szeregiem informacji zawartych w tabeli, w której w wierszach znajduj¹ siê informacje dla poszczególnych sond, a w kolumnach odpowiednie wartoœci. 70 PRACE PRZEGL DOWE

4 Mikromacierze DNA analiza danych Intensywnoœæ sygna³u jest zwykle podawana jako mediana lub œrednia z punktów dla danej sondy. Wœród pozosta³ych danych znajduj¹ siê m.in. po³o enie i identyfikator (nazwa sondy), ID punktu, intensywnoœæ t³a (w postaci mediany i/lub œredniej), wartoœci odchyleñ standardowych intensywnoœci punktów w obrêbie sondy i status kropki. Po wykonaniu korekty t³a mo na przyst¹piæ do analizy ni szego rzêdu, czyli normalizacji danych. Czêœæ algorytmów normalizacyjnych dodatkowo wstêpnie dokonuje korekty t³a korzystaj¹c z surowych danych (ang. probe-level data). 3. Wstêpna obróbka danych Normalizacja danych umo liwia porównanie wyników zarówno w obrêbie jednej mikromacierzy, jaki i pomiêdzy mikromacierzami. G³ównym celem normalizacji jest niwelacja tej czêœci sygna³u, która jest efektem niedoskona³oœci technicznych takich jak nierównomierne odmycie poszczególnych regionów macierzy, ró nice w natê eniu sygna³u emitowanego przez zastosowane barwniki fluorescencyjne czy ró nice w wydajnoœci znakowania kolejnych próbek. Wykrywanie b³êdów technicznych u³atwia sama konstrukcja mikromacierzy, zak³adaj¹ca umieszczenie kilku kilkunastu powtórzeñ tej samej sondy w ró nych miejscach oraz zastosowanie zestawu specjalnych sond kontrolnych (ang. spikes), które nie powinny hybrydyzowaæ z badanym materia³em, a jedynie z komplementarnymi sekwencjami dodanymi w odpowiedniej iloœci na etapie znakowania (kontrole zewnêtrzne). Sondy te s¹ bardzo u yteczne podczas normalizacji w obrêbie wielu mikromacierzy, maj¹c przewagê nad sondami specyficznymi dla genów o ekspresji konstytutywnej (ang. housekeeping genes), które jak dowiedziono nie wykazuj¹ absolutnie sta³ego poziomu transkrypcji (1). Zabiegi przygotowuj¹ce dane z mikromacierzy do w³aœciwej analizy bioinformatycznej, nazywa siê wstêpn¹ obróbk¹ danych (ang. preprocessing). Jej przebieg zale y w g³ównej mierze od sposobu, w jaki analizowana macierz zosta³a skonstruowana, tzn. czy jest to macierz o wysokiej gêstoœci czy drukowana Wstêpna obróbka danych uzyskiwanych przy zastosowaniu oligonukleotydowych mikromacierzy DNA o wysokiej gêstoœci Ze wzglêdu na fakt, e mikromacierze wysokiej gêstoœci ciesz¹ siê wci¹ najwiêksz¹ popularnoœci¹, dostêpnych jest wiele gotowych programów przeznaczonych do obróbki wstêpnej danych. Zwykle sk³ada siê ona z trzech etapów: korekty t³a (ang. background adjustment), normalizacji i sumaryzacji (ang. summarisation). Korzystaj¹c z poszczególnych metod pamiêtaæ nale y, e czêsto w znacz¹cy sposób wp³ywaj¹ one na ostateczny rezultat analizy. Mikromacierze firmy Affymetrix (2) z³o one s¹ z krótkich, 25-merowowych sond oligonukleotydowych, zorganizowanych w zespo³y par komplementarnych do BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

5 Piotr Stêpniak, Luiza Handschuh, Marek Figlerowicz ró nych regionów tego samego transkryptu, co zapewnia wy sz¹ czu³oœæ detekcji sygna³u. Ka da para sk³ada siê z sondy w pe³ni komplementarnej (PM, ang. perfect match) oraz posiadaj¹cej 1 niekomplementarny nukleotyd w pozycji 13 (MM, ang. mismatch), co ma s³u yæ podwy szeniu specyficznoœci sygna³u po hybrydyzacji oraz okreœleniu wartoœci t³a. Ze wzglêdu na gêste upakowanie sond na chipie bezpoœredni pomiar intensywnoœci t³a p³ytki jest niemo liwy. Teoretycznie w³aœciwy sygna³ powinno siê zatem otrzymaæ po odjêciu wartoœci sygna³u MM od wartoœci PM. Jednak ju przy wprowadzaniu korekty t³a pojawia siê problem, poniewa w praktyce ok. 30% sond MM ma wy sz¹ wartoœæ sygna³u ni odpowiadaj¹ca im sonda PM (3). W efekcie generowane s¹ ujemne wartoœci intensywnoœci sygna³u, co nie tylko nie ma sensu merytorycznego, ale równie uniemo liwia stosowanie funkcji logarytmicznych w dalszej czêœci analizy. Do najpopularniejszych metod korekty t³a nale ¹ MAS 5.0 (nazwa pochodzi od skrótu programu j¹ implementuj¹cego Microarray Suite 5.0, Affymetrix, 2002) oraz RMA (ang. Robust Multi-array Analysis, (4)). W przypadku MAS 5.0 chip dzielony jest na k regionów (domyœlnie 16), po czym dla ka dego z nich 2% najni szej intensywnoœci sygna³u jest u ywane do wyliczenia t³a. Nastêpnie do korekty sygna³u sondy u ywa siê œredniej wa onej wszystkich wartoœci t³a, gdzie waga zale y od odleg³oœci sondy od centroidu regionu. Dodatkowo algorytm zapobiega powstaniu ujemnych wartoœci intensywnoœci oraz w regionach o niskiej intensywnoœci zmniejsza jej negatywny efekt w stosunku do ca³ej mikromacierzy. W metodzie RMA korekta t³a odbywa siê jedynie na podstawie wartoœci intensywnoœci przypisanych sondom PM, na bazie globalnego modelu rozk³adu ich intensywnoœci. Wartoœæ intensywnoœci sygna³u jest modelowana jako suma sk³adnika t³a (o przyjêtym rozk³adzie wg krzywej Gaussa), z uwzglêdnieniem jego œredniej i odchylenia standardowego oraz sk³adnika sygna³u w funkcji ekspotencjalnej z uwzglêdnieniem jego œredniej, a tak e z wykorzystaniem funkcji rozk³adu normalnego i gêstoœci. Aby unikn¹æ ujemnych wartoœci wykorzystywana jest tylko dodatnia czêœæ rozk³adu normalnego. Kolejnym etapem wstêpnej obróbki danych jest normalizacja, która polega na takim przekszta³ceniu danych, aby mo na by³o porównywaæ ich wartoœci pomiêdzy eksperymentami (mikromacierzami). Podstawow¹ metod¹ proponowan¹ przez Affymetrix jest skalowanie. Spoœród wszystkich mikromacierzy wybiera siê jedn¹, która pos³u y jako podstawa normalizacji (wzorzec). W przypadku pozosta³ych macierzy intensywnoœæ wszystkich sygna³ów zostaje proporcjonalnie zwiêkszona/zmniejszona tak, aby jej œrednia wartoœæ by³a identyczna z obliczon¹ dla wzorca. W modyfikacji metody podczas obliczania œredniej odrzuca siê po 2% najsilniejszych i najs³abszych sygna³ów. Affymetrix zaleca przeprowadzaæ skalowanie po obliczeniu wartoœci ekspresji dla zestawu sond specyficznych dla danego genu (ang. expression values), czyli po etapie sumaryzacji, ale mo na tê procedurê zastosowaæ równie na surowych danych (ang. probe-level data). 72 PRACE PRZEGL DOWE

6 Mikromacierze DNA analiza danych Innym popularnym algorytmem normalizacji jest normalizacja kwantylowa (ang. quantile normalization) (5). W tej metodzie g³ównym celem jest zachowanie rozk³adu intensywnoœci sygna³ów na ka dej macierzy. Transformacji dokonuje siê na bazie uzyskanych w doœwiadczeniu funkcji rozk³adu sygna³ów na mikromacierzy oraz rozk³adu œrednich odleg³oœci miêdzy tymi sygna³ami, tzw. kwantyli (ang. quantiles). Interesuj¹c¹ metod¹, ³¹cz¹c¹ w jeden etap korektê t³a i normalizacjê, jest vsn (ang. Variance stabilization and calibration for microarray data) (6). Jej zalet¹ jest to, e oblicza wartoœci korekty t³a na podstawie informacji z wielu macierzy, a nie tylko z jednej. Podczas normalizacji stosuje siê tzw. uogólniony lub wyciszony logarytm (ang. glog) (7), dziêki któremu przy zastosowaniu odpowiednich parametrów skalowania macierzy oraz korekty t³a mo na dopasowaæ do siebie mikromacierze zachowuj¹c przy tym niezale noœæ wariancji powtórzeñ od ich œredniej. Koñcow¹ fazê wstêpnej obróbki danych z chipów genomowych stanowi sumowanie wartoœci intensywnoœci sygna³ów pochodz¹cych od zestawu sond (ang. probe-level data) specyficznych dla pojedynczego transkryptu w celu obliczenia wartoœci ekspresji (ang. expression value). Metody sumowania mo na podzieliæ na dwie grupy: prowadzone w obrêbie jednej mikromacierzy oraz prowadzone w oparciu na ich zestawie. W obrêbie jednej mikromacierzy mo e to byæ œrednia arytmetyczna logarytmów o podstawie 2 z wartoœci sygna³ów dla zestawu sond, logarytm naturalny œredniej wartoœci sygna³ów, mediana wartoœci przedstawionych w skali logarytmicznej, logarytm naturalny mediany obliczonej dla ca³ego zestawu sygna³ów czy logarytm o podstawie 2 z wartoœci drugiego najmocniejszego sygna³u. W metodach obejmuj¹cych wiele mikromacierzy dominuje podejœcie polegaj¹ce na tworzeniu modeli opartych na skali logarytmicznej liniowej lub na algorytmie wyg³adzania mediany (ang. median polish) (8). Warto zaznaczyæ, e dostêpne narzêdzia s³u ¹ce analizie danych mikromacierzowych przewa nie ³¹cz¹ wymienione trzy etapy obróbki wstêpnej. Wspomniana popularna procedura RMA obejmuje korektê t³a, normalizacjê kwantylow¹ i oparte na zestawie macierzy sumowanie z wykorzystaniem algorytmu wyg³adzania mediany. Poniewa sekwencje sond na chipie s¹ znane zaproponowano równie metodê uwzglêdniaj¹c¹ wp³yw sekwencji sondy na powstawanie szumu t³a. Metoda GCRMA (9) stanowi¹ca rozwiniêcie metody RMA, wykorzystuje podczas korekty t³a obliczon¹ na podstawie sekwencji sond wartoœæ powinowactwa, a nastêpnie stosuje algorytmy normalizacji i sumowania typowe dla RMA Wstêpna obróbka danych uzyskiwanych przy zastosowaniu mikromacierzy drukowanych Mikromacierze drukowane sk³adaj¹ siê z sond cdna lub d³ugich sond oligonukleotydowych (najczêœciej nt), a gêstoœæ ich upakowania na powierzchni p³ytki zale y od mo liwoœci drukarki oraz w³aœciwoœci fizycznych buforów u ytych do drukowania. Eksperyment z zastosowaniem takiej mikromacierzy zak³ada jednocze- BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

7 = =

8 Mikromacierze DNA analiza danych z normalizacji mikromacierzy wysokiej gêstoœci, np. normalizacjê kwantylow¹ czy vsn. Istnieje równie mo liwoœæ zastosowania podejœcia ³¹czonego, polegaj¹cego na wykonaniu pierwszego etapu normalizacji (w obrêbie p³ytki) metod¹ dla danych dwukana³owych, a drugiego (w obrêbie zestawu p³ytek) jedn¹ z metod typowych dla mikromacierzy wysokiej gêstoœci Ocena jakoœci w eksperymentach mikromacierzowych Dodatkowym elementem analizy ni szego rzêdu jest kontrola jakoœci (ang. quality assesment) np. poprzez wizualizacjê graficzn¹. Mo na dziêki niej wykryæ uchybienia techniczne i artefakty na mikromacierzy, oceniæ przebieg normalizacji, a nawet oszacowaæ stopieñ degradacji RNA. Stosowane tu narzêdzia graficzne nadaj¹ siê do oceny jakoœci zarówno macierzy wysokiej jak i niskiej gêstoœci. Do najczêœciej stosowanych zaliczyæ mo na wykresy typu log-scale plot, spatial-plot, boxplot (rys. 3) oraz MA-plot. Przedstawiaj¹ one obraz mikromacierzy po logarytmicznej transformacji wartoœci intensywnoœci (co uwidacznia artefakty i problemy techniczne) oraz porównanie rozk³adu gêstoœci sygna³ów pomiêdzy mikromacierzami. Zestawienie wy- Rys. 3. Przyk³adowy wykres boxplot surowych danych z eksperymentów na mikromacierzach dwukolorowych. Ka dy s³upek odpowiada jednej mikromacierzy w zestawie. Pojedynczy s³upek sk³ada siê z kreski wartoœci minimalnej, dolnego kwartylu (odcina dolne 25% punktów), mediany, górnego kwartylu, wartoœci maksymalnej, oraz obserwacji odstaj¹cych (ang. outliers) (w postaci kó³ek w tym przypadku brak). Zamalowany obszar znajduje siê pomiêdzy górnym i dolnym kwartylem. BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

9 Piotr Stêpniak, Luiza Handschuh, Marek Figlerowicz Zestaw wykresów diagnostycznych Rys. 4. Przyk³adowy zestaw wykresów diagnostycznych przed i po normalizacji. W lewym górnym rogu wykres scatterplot typu M A dla surowych danych. Linie oznaczaj¹ trendy wartoœci intensywnoœci punktów w danym bloku mikromacierzy. Poni ej wykres typu M A po normalizacji loess, kolor obrazuje iloœæ punktów o danych wartoœciach. W œrodku na górze wykresy spatial plot po lewej wartoœci M, a po prawej A dla surowych danych. Poni ej spatial plot wartoœci M po normalizacji oraz wykresy obrazuj¹ce rozk³ad gêstoœci punktów o ró nych intensywnoœciach (tzw. density plot) w osobnych kana³ach. Po prawej wykresy obrazuj¹ce rozk³ad wartoœci sond kontrolnych w stosunku do pozosta³ych mikromacierzy w analizowanym zbiorze. Wykresy wykonano dla tych samych danych co wczeœniej przedstawiony boxplot. kresów typów boxplot i MA przed i po normalizacji obrazuje efektywnoœæ tego procesu (rys. 4). Analiza stopnia degradacji RNA na mikromacierzach wysokiej gêstoœci firmy Affymetrix opiera siê na porównaniu logarytmicznych wartoœci sygna³ów w obrêbie zestawu sond, komplementarnych do ró nych regionów tego samego transkryptu (fragmentów po³o onych blisko koñca 3 i 5 ). Wyznacznikiem jest tu stosunek sygna³ów 3 /5 w obrêbie wszystkich zestawów sond na mikromacierzy. 4. Analiza wy szego rzêdu Analiza wy szego rzêdu skupia siê na najwa niejszym z biologicznego punktu widzenia problemie, a mianowicie poszukiwaniu biologicznych zale noœci w danych uzyskanych z eksperymentu mikromacierzowego. Wiêkszoœæ metod wykorzystywa- 76 PRACE PRZEGL DOWE

10 Mikromacierze DNA analiza danych nych na tym etapie opiera siê na klasyfikacji b¹dÿ grupowaniu zarówno genów jak i próbek w zespo³y, wykazuj¹ce wspólne cechy, np. profil ekspresji, regulacja przez ten sam czynnik, zwi¹zek z procesem chorobowym, itd. Pierwszym etapem analizy wy szego rzêdu jest filtracja, czyli wykluczanie genów, których poziom ekspresji lub jego zmianê uznamy za zbyt niski. U³atwia to dalsz¹ analizê, gdy prowadzi siê j¹ na zredukowanym zestawie danych, a tak e chroni przed nadmiarem wyników fa³szywie pozytywnych. Nastêpnie za pomoc¹ specjalnych funkcji matematycznych okreœla siê bliskoœæ lub podobieñstwo danych genów i próbek. Wa nym elementem analizy wy szego rzêdu jest konfrontacja otrzymanych wyników z informacjami zdeponowanymi w internetowych bazach danych. Na przyk³ad sprawdzenie ontologii genów (GO, ang. Gene Ontology, mo e potwierdziæ, e otrzymane zale noœci maj¹ swoje Ÿród³o biologiczne, a nie s¹ wy³¹cznie pochodzenia matematyczno-statystycznego Filtracja Przeciêtna mikromacierz mo e zawieraæ sondy identyfikuj¹ce od kilkuset do kilkudziesiêciu tysiêcy transkryptów. Poniewa nie wszystkie geny ulegaj¹ w danym momencie transkrypcji od czêœci sond nie otrzymamy adnego sygna³u, a dla czêœci sygna³y bardzo s³abe. Jednym z zadañ filtracji jest odsianie takich w³aœnie sond. Ponadto porównuj¹c próbkê badan¹ z kontroln¹, stwierdziæ mo na, e zmianê poziomu ekspresji wykazuje jeszcze mniejsza liczba genów. Aby wy³owiæ interesuj¹ce geny z ca³ej puli stosuje siê wiele metod filtracji i oceny statystycznej uzyskanych danych. Najprostszy sposób selekcji sond, stosowany w mikromacierzach dwukolorowych, polega na wprowadzeniu progów zmiany poziomu ekspresji. Ocenia siê wówczas stosunek intensywnoœci sygna³u próbki wzglêdem kontroli przedstawiony w skali logarytmicznej. Wartoœci zazwyczaj powy ej 1,75 lub 2 (oznaczaj¹ce przyrost ekspresji 1,75 lub 2-krotny) oraz poni ej 0,5 lub 0,75 (oznaczaj¹ce spadek ekspresji o po³owê lub ¾) pozostaj¹ jako istotne, a reszta sond jest wykluczana z dalszej analizy. Takie podejœcie, choæ doœæ skuteczne, nie jest odporne na b³êdy, zarówno typu I jak i II. B³êdy typu I wi¹ ¹ siê z ryzykiem uzyskania wyników fa³szywie pozytywnych (ang. flase positives) poprzez pozostawienie genów, które faktycznie nie wykazuj¹ zmienionej ekspresji, natomiast b³êdy typu II generuj¹ wyniki fa³szywie negatywne (ang. false negative) poprzez wykluczenie z analizy genów wykazuj¹cych w rzeczywistoœci zmianê poziomu ekspresji. Aby rozwi¹zaæ ten problem w obu typach mikromacierzy (jedno- i dwukolorowych) stosuje siê szereg testów statystycznych. Najpopularniejszy test T wylicza tzw. wartoœæ p (ang. p-value), która ocenia prawdopodobieñstwo uzyskania takiego samego lub lepszego wyniku losowego. Zwykle za podstawowy punkt odciêcia przyjmuje siê p < 0,05, co oznacza, e istnieje mniej ni 5% szans, e obserwowany wynik mo e byæ przypadkowy. Niestety w analizie genów oznacza to, e istnieje mo liwoœæ b³êdnej klasyfi- BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

11 Piotr Stêpniak, Luiza Handschuh, Marek Figlerowicz kacji a 500 z nich. Dlatego coraz czêœciej stosuje siê zaawansowane metody statystyczne: analizê wariancji (ANOVA, ang. analysis of variance), wieloczynnikow¹ analizê wariancji (MANOVA, ang. multifactor analysis of variance) czy wieloetapowe procedury testowania (MTP, ang. Multiple Testing Procedures) (12,13) Obliczanie odleg³oœci Wartoœci ekspresji genów s¹ podawane, albo w bezwzglêdnej wartoœci intensywnoœci (zlogarytmizowanej), albo relatywnego poziomu ekspresji wzglêdem próbki kontrolnej (iloraz logarytmów). Bezwzglêdna wartoœæ intensywnoœci obliczana jest dla danych pochodz¹cych z mikromacierzy typu Affymetrix, gdzie tylko jedna próbka jest hybrydyzowana z mikromacierz¹. Natê enie sygna³u jest wówczas uwa ane za liniowo zale ne od iloœci mrna. Okazuje siê jednak, e dwa ró ne geny bardzo czêsto maj¹ ró ny rozk³ad sygna³u, innymi s³owy dwa ró ne mrna wystêpuj¹ce w tym samym stê eniu mog¹ dawaæ inny poziom intensywnoœci sygna³u, co sprawia, e porównanie pomiêdzy genami w obrêbie jednej próbki jest problematyczne. Nie przeszkadza to natomiast w porównywaniu poziomu ekspresji danego genu pomiêdzy próbkami. W przypadku macierzy dwukolorowej okreœlanie relatywnego poziomu ekspresji wzglêdem kontroli pozwala porównywaæ zmiany ekspresji ró nych genów w obrêbie pojedynczej mikromacierzy. Nie mo na natomiast okreœliæ bezwzglêdnego poziomu ekspresji genów, a tym samym oszacowaæ rzeczywistej iloœci mrna dla danego genu. Oczywiœcie w przypadku mikromacierzy typu Affymetrix mo na tak e uzyskaæ relatywn¹ wartoœæ poziomu ekspresji genów poprzez porównanie poszczególnych macierzy z jedn¹ mikromacierz¹, do której hybyrdyzowano próbkê kontroln¹. Nie jest to jednak pomiar bezpoœredni jak w mikromacierzach dwukolorowych, gdzie zarówno próba jak i kontrola hybrydyzuj¹ razem na tej samej p³ytce w identycznych warunkach. U yta skala definiuj¹ca zakres poziomu ekspresji ma bezpoœredni wp³yw na wartoœæ funkcji okreœlaj¹cych parametr zwany odleg³oœci¹ miêdzy genami i próbkami. Funkcja okreœlaj¹ca odleg³oœæ to taka, która spe³nia warunki nieujemnoœci, symetrii i identyfikacji (warunki 1-3, tab.). Funkcjê spe³niaj¹c¹ równie warunki 4i5nazywa siê funkcj¹ metryczn¹ (ang. metric). W niektórych przypadkach mówi siê równie o funkcji podobieñstwa (ang. similarity), która spe³nia jedynie warunki nieujemnoœci i symetrii, a jej wartoœæ roœnie wraz ze wzrostem podobieñstwa dwóch genów/próbek. 78 PRACE PRZEGL DOWE

12

13 τ = =

14 Mikromacierze DNA analiza danych rametryczne) lub co najmniej sposobu jej ustalenia (w przypadku podejœcia nieparametrycznego). Bardzo wa nym elementem jest odpowiednie dobranie kryterium optymalizowanego przez algorytm. Kryterium jest funkcj¹ znaczników klastrów, wed³ug której okreœla siê stopieñ podobieñstwa elementów w obrêbie grupy lub stopieñ zró nicowania pomiêdzy elementami nale ¹cymi do ró nych grup. Algorytmy grupuj¹ce mo emy podzieliæ wed³ug strategii ich dzia³ania na dwie g³ówne klasy, tj. strategie podzia³u na czêœci (ang. partitioning) oraz hierarchiczne. Istniej¹ równie metody ³¹cz¹ce oba podejœcia. Strategia podzia³u na czêœci zak³ada podzia³ przestrzeni punktów (genów) na obszary (grupy) niezale ne od siebie. Do algorytmów tej klasy zalicza siê klastrowanie k-œrednich (ang. k-means clustering), podzia³ wokó³ medoidów (PAMs, ang. partitioning around medoids) oraz samoorganizuj¹ce siê mapy (SOMs, ang. self-organizing maps). Cech¹ wspóln¹ tych algorytmów jest to, e wyniki obliczeñ dla danego klastra nie s¹ u ywane w obliczeniach prowadzonych dla pozosta³ych klastrów. Algorytmy hierarchiczne z kolei polegaj¹ na tworzeniu drzewa, w którym korzeñ to klaster zawieraj¹cy wszystkie geny, a liœcie to pojedyncze geny. Drzewa te maj¹ zazwyczaj charakter binarny ka dy wêze³ rozdziela siê na dwie ga³êzie b¹dÿ liœcie. Koñcowym efektem grupowania hierarchicznego jest uszeregowanie elementów w taki sposób, aby te wykazuj¹ce najwiêksze podobieñstwo by³y najbli ej siebie (na tej samej ga³êzi). S¹ dwa sposoby budowy drzewa: podzia³owa (ang. divisive) i aglomeratywna (ang. agglomerative). W pierwszym wychodzimy od korzenia (klastra zawieraj¹cego wszystkie elementy) drzewa i dzielimy go na coraz mniejsze klastry, a do pojedynczych genów ( liœci ). Metoda aglomeratywna rozpoczyna budowê drzewa od liœci, kolejno ³¹cz¹c elementy najbardziej podobne do siebie. W tej metodzie uwzglêdnia siê kryterium powinowactwa klastrów (ang. linkage), które jest jednoczeœnie miar¹ odleg³oœci pomiêdzy nimi. Œrednie powinowactwo (ang. average linkage) to odleg³oœæ liczona pomiêdzy œrednimi obu grup. Pojedyncze powinowactwo (ang. single linkage) to odleg³oœæ pomiêdzy najbli szymi sobie elementami dwóch zbiorów (najbli szymi s¹siadami), czyli minimalna odleg³oœæ dwóch grup. Niekiedy u ywa siê równie kryterium ca³kowitego powinowactwa (ang. complete linkage), które mierzy odleg³oœæ pomiêdzy najbardziej oddalonymi od siebie elementami dwóch klastrów, czyli stanowi maksymaln¹ odleg³oœæ dwóch grup. Okreœlaj¹c liczbê klastrów mo emy pos³u yæ siê podejœciem parametrycznym, czyli z góry wybraæ liczbê docelowych grup na podstawie hipotezy w³asnej lub oczekiwanego wyniku (np. chc¹c podzieliæ próbki pochodz¹ce od pacjentów cierpi¹cych na ró ne odmiany choroby). Czêsto jednak, szczególnie grupuj¹c geny a nie próbki, trudno dobraæ odgórnie docelow¹ liczbê klastrów, w zwi¹zku z czym opracowano szereg metod nieparametrycznych s³u ¹cych do okreœlenia ich liczby. Metody te dziel¹ siê na bezpoœrednie oraz testuj¹ce. Te ostatnie nastawione s¹ na testowanie hipotezy wobec hipotezy zerowej i zazwyczaj opieraj¹ siê na ponownym próbkowaniu (ang. resampling) danych. S¹ wiêc bardzo kosztowne jeœli chodzi o moc oblicze- BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

15 = =

16 Mikromacierze DNA analiza danych strów, ale na ka dym poziomie budowanego drzewa hierarchicznego stosuje siê dodatkowy etap aglomeratywny w celu sprawdzenia czy podzia³ na klastry jest poprawny. Jeœli algorytm wykryje, e nast¹pi³ b³¹d, ³¹czy dwa najbli sze sobie klastry. Wybór liczby klastrów na ka dym etapie oraz decyzja czy któreœ z nich nale y po³¹czyæ podejmowane s¹ na podstawie algorytmu MSS. Inn¹ interesuj¹c¹ strategi¹ analizy skupieñ jest grupowanie próbek poprzez grupowanie genów. Do grupowania próbek wykorzystuje siê wtedy profile ekspresji (medoid lub œredni¹) otrzymane dla klastrów genów (17), co znacznie redukuje iloœæ wymiarów danych (liczbê parametrów dla ka dej próbki), a przez to upraszcza procedurê grupowania. Dodatkow¹ zalet¹ jest to, e profile ekspresji klastrów s¹ stabilne, st¹d wynik grupowania próbek bêdzie równie bardziej wiarygodny. Obecnoœæ kilku Ÿle dopasowanych genów w obrêbie klastrów nie bêdzie mia³a wp³ywu na rezultat analizy. Na podstawie technik grupowania genów mo na identyfikowaæ bardzo ciekawe zale noœci pomiêdzy danymi, ale niestety doœæ czêsto brakuje im oparcia statystycznego. Dodatkowo zaobserwowano, e w wiêkszoœci algorytmów grupowania hierarchicznego ostateczny wynik jest w du ej mierze zale ny od pocz¹tkowego u³o enia danych. Problem wynika przede wszystkim z wielowymiarowej struktury danych (bardzo du o genów) pozyskiwanych z relatywnie ma³ej iloœci próbek. Powoduje to, e obserwujemy eksperymentalny rozk³ad wyników nie znaj¹c rzeczywistego ich rozk³adu, przy czym jest bardzo ma³o prawdopodobne, eby dane mikromacierzowe prezentowa³y rozk³ad normalny. Dlatego trudno jest go testowaæ i z tego te powodu powsta³o wiele metod za pomoc¹ których próbuje siê rozwi¹zaæ ten problem. Najpopularniejsze z nich to metoda jacknife (18) oraz bootstrap (19,20). Obie metody generuj¹ przypuszczalny rzeczywisty rozk³ad danych i na jego podstawie sprawdzaj¹ na ile otrzymany przez nas wynik jest losowy. Podstaw¹ tego podejœcia jest za³o enie, e uzyskane dane to tylko przyk³adowe warianty z niewiadomego rozk³adu. Na ich podstawie mo emy wygenerowaæ pozosta³e, teoretycznie mo liwe do uzyskania obserwacje poprzez wielokrotne ponowne próbkowanie i przemieszanie danych eksperymentalnych. Na bazie tak otrzymanego zbioru wyznacza siê jego rozk³ad, a nastêpnie okreœla prawdopodobieñstwo uzyskania danych takich jak w przeprowadzonym eksperymencie. Dodatkowo w metodzie jacknife zmienia siê te rozmiar generowanych danych, poniewa ma on równie wp³yw na ich rozk³ad. Dla przyk³adu podczas testowania drzewa grupowania hierarchicznego metod¹ bootstrap na podstawie oryginalnych danych generuje siê n losowych drzew, a nastêpnie sprawdza jak czêsto uzyskane przez nas w eksperymencie pary klastrów znajduj¹ siê wœród tych drzew. Im czêœciej dane u³o enie powtarza siê w losowych wynikach, tym jest mniej istotne statystycznie. Innym podejœciem do testowania tego samego drzewa mo e byæ ponowne próbkowanie i podmienianie tylko czêœci oryginalnych danych przed budow¹ nowego drzewa. Tym razem im czêœciej w nowo generowanych drzewach powtarza siê dany uk³ad klastrów, tym bardziej prawdopodobne, e jest on wynikiem zale noœci opartej na wiêkszej czêœci danych (w domyœle o pod³o u biologicznym), a nie o lokaln¹ wariancjê czy szum t³a. BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

17 Piotr Stêpniak, Luiza Handschuh, Marek Figlerowicz 4.4. Algorytmy ucz¹ce siê Ró nego rodzaju metody grupowania genów najczêœciej u ywane s¹ w badaniach mechanizmów odpowiedzialnych za regulacjê ekspresji genów, szlaków metabolicznych, odpowiedzi na stres lub terapiê. Ca³kowicie innego podejœcia wymagaj¹ eksperymenty zmierzaj¹ce do identyfikacji tzw. genów markerowych stosowanych w diagnostyce medycznej. W takich sytuacjach zwykle wykorzystywane s¹ algorytmy ucz¹ce siê. Pod pojêciem uczenia maszyn (ang. machine learning) kryje siê szereg metod, których zadaniem jest utworzenie klasyfikatorów przyporz¹dkowuj¹cych nieznane im próbki do okreœlonych grup. Metody te dziel¹ siê na nadzorowane (ang. supervised) i nienadzorowane (ang. unsupervised). W podejœciu nadzorowanym czêœæ próbek (tzw. zestaw treningowy) wykorzystywana jest jako materia³, na podstawie którego algorytm ma nauczyæ siê rozpoznawaæ zadane klasy (np. pacjenci chorzy na chorobê A, chorobê B i zdrowi). W metodach nienadzorowanych algorytm sam dokonuje grupowania na klasy w obrêbie zestawu treningowego próbek, a nastêpnie buduje na ich podstawie klasyfikator do segregacji kolejnych próbek (tzw. zestawu testowego). Ze wzglêdów praktycznych najczêœciej stosowane jest podejœcie nadzorowane. Wiêkszoœæ eksperymentów nastawiona jest na ustalenie jak najlepszej metody rozpoznania danego typu schorzenia i zazwyczaj dysponuje siê wiedz¹ a priori w tym zakresie. Schemat dzia³ania wiêkszoœci nadzorowanych algorytmów ucz¹cych siê zosta³ przedstawiony na rysunku 5. W pierwszym etapie zawsze okreœlany jest zestaw klas oraz oznaczenie przynale noœci ka dej próbki do danej klasy. Nastêpnie algorytm uczy siê rozpoznawaæ próbki nale ¹ce do ró nych klas. Proces uczenia siê przebie- Rys. 5. Ogólny schemat dzia³ania algorytmów uczenia maszyn. Ciemne strza³ki przedstawiaj¹ proces uczenia maszyny, bia³e strza³ki symuluj¹ proces klasyfikacji na bazie ustalonego wzorca. 84 PRACE PRZEGL DOWE

18 Mikromacierze DNA analiza danych ga dwustopniowo: najpierw nale y wybraæ cechy (geny), na podstawie których tworzony bêdzie klasyfikator, a nastêpnie za ich pomoc¹ opisaæ etykietê ka dej klasy, stanowi¹c¹ czynnik selekcyjny w procesie rozró niania próbek. Elementem krytycznym jest wybór genów s³u ¹cych za podstawê klasyfikatora. Czêœæ algorytmów ucz¹cych siê, takich jak sztuczne sieci neuronowe (ANN, ang. artificial neural networks) czy drzewa decyzyjne (ang. decision trees), same wybieraj¹ odpowiednie geny w trakcie tworzenia etykiety klasyfikacyjnej. Jednak w wiêkszoœci przypadków stosuje siê poprzedzaj¹ce etap uczenia metody filtrowania lub oceny u ytecznoœci genów w tworzeniu klasyfikatora. Najpopularniejsze metody filtrowania opieraj¹ siê na ocenie: 1) statystyki t (ang. t-statistic), 2) stosunku sygna³u do t³a (SNR, ang. signal-to-noise ratio) oraz 3) korelacji. Do oceny u ytecznoœci genów w procesie klasyfikacji stosuje siê metody genów dyskryminuj¹cych (IDG, ang. individual discriminatory gene, JDG, jointly discriminatory gene) oraz metody oparte na algorytmach genetycznych (GAs, ang. genetic algorithms). Dot¹d zaproponowano bardzo wiele algorytmów klasyfikuj¹cych próbki. Najprostsze z nich pos³uguj¹ siê kombinacjami liniowych zale noœci cech (LDA, ang. linear discriminant analysis), modyfikacji regresji liniowej (ang. logistic regression) czy przypisywania wag (ang. weighted voting). Wœród bardziej skomplikowanych algorytmów znajduj¹ siê np. takie, które opieraj¹ siê na sieci wspó³pracuj¹cych, u³o onych warstwami elementów wykonuj¹cych obliczenia klasyfikuj¹ce, tzw. sieci neuronowe. Nale ¹ do nich np. algorytm MLPs (ang. multilayer perceptrons) czy oparty na strategii Bayesa PNN (ang. probabilistic neural network). Interesuj¹cy i doœæ popularny algorytm oparty na tzw. maszynach wektorowych (SVMs, ang. support vector machines), zamiast opracowywaæ skomplikowane funkcje w przestrzeni o wymiarach równych iloœci genów w próbkach treningowych, tak jak to robi¹ sztuczne sieci neuronowe, mapuje wprowadzone elementy do hipotetycznej przestrzeni o wiêkszej iloœci wymiarów, a nastêpnie rozdziela je u ywaj¹c prostych liniowych funkcji klasyfikacyjnych. Poniewa SVMs opiera siê na binarnym systemie decyzyjnym mo e jedynie dzieliæ próbki na te, które znajd¹ siê w grupie oraz te, które siê do niej nie klasyfikuj¹. Aby móc dzieliæ próbki na wiêcej ni dwie grupy zastosowano podejœcie jeden kontra wszyscy (OVA, ang. one-vs.-all), polegaj¹ce na utworzeniu dla podzia³u na k klasy k klasyfikatorów binarnych SVM konkuruj¹cych ze sob¹ o ka d¹ próbkê. Ostatecznie próbka trafia do grupy reprezentowanej przez SVM o najwy szej wartoœci klasyfikacji (najdalej od granicy klasyfikacyjnej) (21). Podobnie jak przy metodach klastruj¹cych nie mo na jednoznacznie okreœliæ, który z algorytmów ucz¹cych siê jest najlepszy. Wynik i skutecznoœæ otrzymanych klasyfikatorów zale ¹ g³ównie od jakoœci i iloœci danych u ytych do trenowania algorytmu (np. wielkoœci zestawu próbek) oraz parametrów zastosowanych podczas analizy. Jedyn¹ ró nic¹ jest mo liwoœæ bezpoœredniej weryfikacji skutecznoœci algorytmów ucz¹cych siê poprzez zastosowanie otrzymanych klasyfikatorów na niezale - nym zbiorze próbek o znanych klasach. BIOTECHNOLOGIA 4 (83)

19 Piotr Stêpniak, Luiza Handschuh, Marek Figlerowicz 5. Podsumowanie Liczba narzêdzi s³u ¹cych do uzyskiwania informacji z ogromu danych dostarczanych przez eksperyment mikromacierzowy wci¹ roœnie, a te ju opisane s¹ bezustannie udoskonalane, zarówno poprzez stosowanie coraz bardziej wysublimowanych metod statystycznych, jak i poprzez wykorzystanie coraz bardziej skomplikowanych uk³adów analitycznych. Metody s³u ¹ce do wstêpnej obróbki danych otrzymywanych z klasycznych mikromacierzy ekspresyjnych s¹ ju ca³kiem dobrze opracowane. Niestety szczegó³owe opisanie wiêkszoœci algorytmów przekracza mo liwoœci tego opracowania. Warto jednak pamiêtaæ, e ka da z metod ma swoje zalety i wady, a ostateczny wynik analizy powinno siê porównaæ z wynikiem uzyskanym inn¹ metod¹. Jeœli dana zale noœæ znajduje potwierdzenie w wynikach uzyskanych ró nymi metodami istnieje wiêksze prawdopodobieñstwo, e jej pod³o e ma podstawy biologiczne. Równie wa ne jest konfrontowanie otrzymanych wyników z informacjami zawartymi w literaturze i bazach danych, w tym Gene Ontology. Stosowanie wszelkiego rodzaju testów statystycznych oceniaj¹cych wiarygodnoœæ stawianych hipotez ma ogromne znaczenie, szczególnie ze wzglêdu na specyfikê danych mikromacierzowych, w których iloœæ obserwowanych cech (genów) wielokrotnie przewy sza iloœæ próbek (obserwacji jednostkowych). Planuj¹c eksperyment mikromacierzowy nale y oprócz ustalenia platformy i rodzaju mikromacierzy odgórnie dokonaæ wyboru metod analizy, dostosowuj¹c je do problemu biologicznego, który chcemy rozwi¹zaæ. Wszystkie etapy analizy, pocz¹wszy od normalizacji, poprzez sposób przedstawienia wartoœci poziomu ekspresji genów, metody obliczania odleg³oœci, filtrowania, a po analizê wy szego rzêdu, maj¹ wp³yw na ostateczny wynik. Dlatego tak istotne jest dok³adne zrozumienie poszczególnych elementów analizy. Warto równie wiedzieæ, e zmieniaj¹c nieco dobór parametrów statystycznych, np. zmniejszaj¹c selektywnoœæ stosowanych metod, mo - na pozyskaæ dodatkowe, istotne biologicznie informacje. Opracowanie powsta³o w ramach realizacji projektu badawczego finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wy szego: nr PBZ-MNiI-2/1/2005. Literatura 1. Kågedal B., Farnebäck M., et al., (2007), Clin. Chem. Lab. Med., 45, Affymetrix, (2002), Technical Report, 19, Santa Clara, CA. 3. Neaf F., Lim D. A., Patil N., Magnasco M. A., (2001), 4. Irizarry R. A., Hobbs B., Collin F., et al., (2003), Biostatistics, 4, Bolstad B. M., Irizarry R. A., Astrand M., et al., (2003), Bioinformatics, 19, Huber W., von Heydebreck A., Sultmann H., et al., (2003), Stat. Appl. Genet. Mol. Biol., Rocke D. M., Durbin B., (2003), Bioinformatics, 19, Emerson J. D., Hoaglin D. C., (1983), Understanding robust and exploratory data analysis, Eds. Hoaglin D. C., Mosteller F., Turkey J. W., John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork. 86 PRACE PRZEGL DOWE

20 Mikromacierze DNA analiza danych 9. Wu Z., Irizarry R., Gentleman R., et al., (2004), Journal of the American Statistical Association, 468, Smyth G.. K., Speed T., (2003), Methods, 31, Yang Y. H., Paquet A. C., (2005), Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor, Eds. Gentleman R., Carey V. J., Irizarry, et al., Springer, New York. 12. Dudoit S., van der Laan M. J., Brikner M. D., (2004), Technical Report, 166, Division of Biostatistics, University of California, Berkeley. 13. Dudoit S., van der Laan M. J., Pollard K. S., (2004), Stat. Appl. Genet. Mol. Biol., 3, Kaufman L., Rousseeuw P. J., (1990), Finding Groups in Data, Wiley. 15. Pollard K., van der Laan M., (2002), W SCI2002 Proceedings, vol. II, van der Laan M., Pollard K., (2003), Journal of Statistical Planning and Inference, 117, Pollard K., van der Laan M., (2002), Math. Biosci., 176, Yeung K. Y., Haynor D. R., Ruzzo W. L., (2001), Bioinformatics, 20, Kerr M., Churchill G. A., (2001), Proc. of Natl. Acad. Sci. USA, 98, van der Laan M., Bryan J., (2001), Biostatistics, 2, Ressom H. W., Varghese R. S., Zhang Z., et all, (2008), Front. Biosci., 13, BIOTECHNOLOGIA 4 (83)