Ćwiczenie 3: Ocena toksykologiczna i higieniczna mleka

Transkrypt

1 Ćwiczenie 3: Ocena toksykologiczna i higieniczna mleka 1. Wiadomości wprowadzające Mleko i jego przetwory to jedne z podstawowych produktów konsumpcyjnych. Poza mlekiem surowym, pasteryzowanym, traktowanym wysoką temperaturą (mleko UHT) i skondensowanym, w handlu dostępne jest mleko w proszku, śmietana, masło jogurt, kefir, maślanka oraz cała gama serów. Według Polskiej Normy PN-A mleko surowe jest produktem naturalnym, uzyskiwanym w procesie dojenia zdrowych krów, niczym nie uzupełnione i niczego nie pozbawione. Natomiast Dyrektywa Unii Europejskiej definiuje mleko surowe jako produkt wytworzony w wyniku wydzielania gruczołów mlecznych krów, owiec, kóz lub bawolic, które nie było podgrzewane do temp. powyżej 40 C, ani nie zostało poddane jakiejkolwiek obróbce, która dałaby podobny efekt. Wymagania szczegółowe odnoszące się do mleka surowego określają wymagania weterynaryjne dotyczące produkcji mleka, produktów mlecznych oraz wymagania weterynaryjne, jakie powinno spełniać mleko surowe przeznaczone do produkcji. Mleko odbierane z gospodarstw produkcyjnych nie powinno zawierać więcej niż 100 tys. drobnoustrojów w 1 ml, oznaczonych metodą płytkową w temp. 30 C, 400 tys. komórek somatycznych, nie powinno zawierać wody dodanej oraz charakteryzować się punktem zamarzania w temp. nie wyższej niż - 0,52 C. Mleko to powinno zawierać minimum 28 g białka w 1 l i nie mniej niż 8,5% suchej masy beztłuszczowej w mleku całkowicie odtłuszczonym. Mleko nie może być dopuszczone do konsumpcji, jeżeli zawiera ślady antybiotyków w ilości przekraczającej ustalony przepisami poziom (Rozporządzenie Nr 853/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r.) Mleko surowe jest bardzo dobrym środowiskiem do rozwoju różnych grup mikroorganizmów. Poza mikrokokami i koagulazo-dodatnimi gronkowcami typową mikroflorę mleka stanowią paciorkowce i pałeczki mlekowe, takie jak: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lac. lactis ssp. cremoris, Lac. lactis ssp. diacetilactis, Streptococcus thermophilus Lactobacillus acidophilus, Lb. delbruecki ssp. lactis, Lb. delbruecki ssp. bulgaricus, Lb. casei, Lb. fermentum oraz psychrofilne pałeczki Gram (-) z rodzajów Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Flavobacterium oraz Escherichia coli. Możliwe jest też występowanie mikroorganizmów patogennych jak: Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Salmonella, Coxiella burnettii, Clostridium perfringens, enteropatogennych: Escherichiacoli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Yersinia enterocolitica Mleko pasteryzowane. Pasteryzacja jest operacja polegającą na ogrzewaniu,mleka w temperaturze nie przekraczającej 100 o C,w czasie potrzebnym do całkowitego zniszczenie mikroflory chorobotwórczej i w stopniu maksymalnym mikroflory saprofitycznej oraz do istotnego obniżenia aktywności obecnych w mleku enzymów. Właściwie przeprowadzona pasteryzacja powinna zniszczyć całkowicie wegetatywne formy drobnoustrojów chorobotwórczych i 99 99,9% mikroflory saprofitycznej oraz w możliwie 1

2 najmniejszym stopniu zmienić cechy fizyczne i biologiczne mleka. Obecnie w Polsce najczęściej przeprowadza się pasteryzację w płytowych wymiennikach ciepła, tzw. pasteryzatorach płytowych, w temperaturze o C, zachowując czas przetrzymywania sekund Pasteryzację mleka przeżywają tylko drobnoustroje oporne na ogrzewanie takie, jak: Bacillus, Clostridium, Microbacterium, Enterococcus, Streptococcus oraz zarodniki pleśni. W mleku pasteryzowanym, które przechowywane jest w niskich temperaturach mogą rozwijać się drobnoustroje psychrofilne z rodzaju: Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Aeromonas, Enterobacter, Corynebacterium oraz Bacillus (B. cereus, B. sphaericus, B. circulans). Rozwój drobnoustrojów w mleku pasteryzowanym może prowadzić do jego zepsucia przejawiającego się kwaśnieniem - spowodowanym przez bakterie fermentacji mlekowej (Lactobacilus i Lactococcus) oraz przez coliformy (bakterie z grupy coli), lipolizą i proteolizą - spowodowaną przez Pseudomonas i rodzaje pokrewne, nadające mleku, w zależności od przewagi danego drobnoustroju, obcy smak i zapach. Mleko sterylizowane (UHT) to mleko homogenizowane o znormalizowanej zawartości tłuszczu lub mleko odtłuszczone, poddane działaniu temperatury powyżej 100 o C (w czasie gwarantującym całkowite zniszczenie wegetatywnych form wszystkich rodzajów drobnoustrojów oraz przetrwalników), a następnie schłodzone i zapakowane w sposób uniemożliwiający zakażenie mikrobiologiczne (pakowanie aseptyczne). Obecnie, przy produkcji mleka sterylizowanego, jest stosowana sterylizacja momentalna, polegająca na ogrzewaniu przepływającego mleka w temperaturze o C, w ciągu kilku sekund (2 10) i szybkim chłodzeniu do temperatury ok. 20 o C. W trakcie takiej obróbki termicznej niszczy się prawie całą mikroflorę mleka, proces ten mogą przeżyć jedynie nieliczne bakterie przetrwalnikujące. Zastosowana w procesie UHT temperatura nie niszczy jednak termicznie opornych enzymów proteolitycznych, głównie proteaz bakterii G (-), które mogą powodować wady takiego mleka poprzez tworzenie gorzkich peptydów i precypitację białek. Wymagania jakościowe dla mleka spożywczego określa norma PN-90/A Mleko spożywcze pasteryzowane i sterylizowane powinno charakteryzować się: barwą białą lub białą z odcieniem jasnokremowym właściwym smakiem i zapachem, bez obcych posmaków i zapachów dopuszczalna ogólna liczba drobnoustrojów: w 1ml mleka pasteryzowanego krowiego w 1ml mleka sterylizowanego krowiego nieobecne w 1 ml ogólna liczba drobnoustrojów dopuszczalna dla mleka koziego pasteryzowanego wynosi w 1 ml mleko uznaje się za świeże jeśli jego kwasowość mieści się w przedziale 6 7,2 0 SH 2

3 Mleko spożywcze pasteryzowane i sterylizowane nie może zawierać substancji hamujących: antybiotyków, środków myjących lub dezynfekujących ani aflatoksyn: substancji szkodliwych dla zdrowia, pochodzenia pleśniowego. Źródła i rodzaj substancji hamujących w mleku Nieprawidłowe warunki udoju i utrzymania krów mlecznych oraz wiele innych czynników środowiskowych może prowadzić do ich zachorowania. Wówczas w leczeniu najczęściej stosowane są dowymieniowo i dożylnie antybiotyki i sulfonamidy. Podawane są w okresie laktacji zazwyczaj w wysokich dawkach, jako leki szybko działające i mogące być jednocześnie wydalone w krótkim czasie. Nieprzestrzeganie zalecanych dawek leków podawanych zwierzęciu lub czasu karencji po ich podaniu jest najczęstszą przyczyną obecności owych leków w mleku oddawanym do skupu. Pozostałości antybiotyków i innych substancji o działaniu leczniczym, obecne w mleku, określane są mianem substancji hamujących. Są nimi także resztki preparatów używanych do mycia i odkażania, stosowanych podczas mycia strzyków, aparatury udojowej, zbiorników, które nie zostały usunięte podczas procesu płukania wodą. Mleko surowe powinno pochodzić od krów, którym nie podawano substancji mających negatywny wpływ na zdrowie ludzi, mogących przenikać do mleka, lub którym podano substancje, dla których upłynął okres karencji. Wykrywalność substancji hamujących W ramach kontroli zagrożeń przeprowadza się testy w celu wykrycia w mleku i produktach mlecznych pozostałości substancji mogących powodować negatywny wpływ na zdrowie ludzi, w zakresie, w jakim pozostałości te przekraczają dozwolone poziomy tolerancji. Dozwolony poziom tolerancji jest to maksymalny limit pozostałości MRL (Maximum Residue Limit) lub MRL EU dla określenia limitu obowiązującego w krajach Unii Europejskiej. Podstawą okreslenia poziomu MRL jest wartość ADI (Acceptable Daily Intake) oznaczająca dopuszczalne dzienne pobranie tej substancji przez człowieka w stosunku do ilości pobieranej w ciągu dnia oraz w oparciu o wartość NOEL (No Observed Effect Level), czyli poziom dawkowania, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian. Wartości MRL wyrażane są w ppm (part per million, 10-6, mg/kg) lub ppb (part per billion, 10-9, μg/kg). 2. Część praktyczna 2.1. Ocena toksykologiczna mleka Wykrywanie substancji hamujących rozwój bakterii przy użyciu testu dyfuzyjnego Delvotest SP NT Zasada metody: Delvotest SP-NT jest testem do wykrywania obecności środków hamujących takich jak antybiotyki i sulfonamidy. Ampułka (studzienka) zawiera zestalone podłoże agarowe ze standardową ilością 3

4 zarodników szczepu Bacillus stearothermophilus var. Calidolactis C953, pożywkę oraz wskaźnik ph. Zarodniki są czułe na większość antybiotyków, a w szczególności na penicylinę przechowywane w obniżonej temperaturze pozostają niezmienione i zdolne do kiełkowania przez wiele miesięcy. Gdy temperatura wzrasta i zostaje ustabilizowana na poziomie 64 o C, zarodniki gwałtownie kiełkują, zaczyna się ich rozmnażanie i przemiany, których wynikiem jest zakwaszenie środowiska. Podczas inkubacji wytwarzana jest wystarczająca ilość kwasu, aby zmienić barwę wskaźnika z purpurowej na żółtą. Gdy próbka mleka zawiera substancje hamujące będą one dyfundować do agaru i jeżeli jest ich wystarczająco dużo zwolnią one lub zahamują proces rozwoju bakterii. W takim wypadku nie zostaje wytworzona wystarczająca ilość kwasu i zabarwienie wskaźnika pozostaje purpurowe, nie zmienia się na żółte. Wykonanie: 1. Odetnij nożyczkami ampułkę z bloczka, starając się nie uszkodzić sąsiednich ampułek. 2. Otwórz ampułkę nakłuwając folię ochronną strzykawką (bez pipety). 3. Nałóż na strzykawkę nową, jednorazową pipetą dla każdej próbki mleka. Naciśnij tłoczek strzykawki, zanurz w próbce mleka i pobierz wymaganą ilość (0,1 ml). 4. Zawartość pipety (próbkę mleka) wprowadź do ampułki. 5. Sprawdź temperaturę bloku grzejnego (64 0 C ± 2 0 C). Umieść ampułkę w bloku grzejnym. Ustaw czas inkubacji (3 h). 6. Po inkubacji wyjmij ampułkę i sprawdź barwę dolnych 2/3 agaru w ampułce. Zabarwienie żółte wskazuje na wynik negatywny (mleko nie zawiera substancji hamujących), natomiast zabarwienie purpurowe świadczy o obecności substancji hamujących w próbie Ocena higieniczna mleka Wykrywanie skażenia bakteriologicznego mleka na podstawie oceny aktywności reduktazy bakteryjnej Zasada metody: Zasada próby opiera się na zdolności reduktazy do odbarwienia roztworu błękitu metylenowego zgodnie z reakcją Forma utleniona błękitu metylenowego Forma zredukowana błękitu metylenowego 4

5 Powrót barwy płynów w próbie odbarwionej (szczególnie w górnej warstwie) tłumaczy się odwracalnością reakcji. Czynnikiem sprzyjającym ponownemu zabarwieniu może być spadek temperatury łaźni lub kontakt z tlenem z powietrza. Sprzęt: - probówki szklane ze szlifem i korkami; - łaźnie wodna z regulacja temperatury i termometrem (probówki umieszczać w dużej zlewce, zatkać korkami); - pipety wielomiarowe o obj. 5 ml Odczynniki: - alkoholowy nasycony roztwór błękitu metylenowego; - wodny roztwór błękitu metylenowego Wykonanie: Do probówki szklanej ze szlifem i z korkiem odmierzyć 5ml badanego mleka. Dodać 2,5 ml wodnego roztworu błękitu metylenowego. Probówkę zamknąć korkiem i wymieszać, następnie wstawić do łaźni wodnej o temp C, tak aby poziom wody znajdował się nad poziomem mleka. Następnie należy zanotować czas po jakim nastąpiło odbarwienie Czas odbarwiania się roztworu błękitu metylenowego Liczba bakterii w 1 ml mleka Jakość mleka powyżej 5½ godz. powyżej dobra od 2 do 5½ godz średnia od 20 min. do 2 godz zła do 20 min. ponad bardzo zła Ocena świeżości mleka Zasada metody: Bakterie kwasu mlekowego (Lactobacilliaceae) przekształcają cukier mleczny (laktozę) od kwasu mlekowego oraz w niewielkim stopniu do kwasu octowego, powodując wzrost kwasowości mleka w czasie. Ogólny zapis fermentacji mlekowej: C 6 H 12 O 6 + bakterie fermentacji mlekowej 2CH 3 CHOHCOOH + 22,5 kcal 5

6 Sprzęt: - probówki szklane; - łaźnia wodna; - pipety wielomiarowe o obj. 5 i 25ml Odczynniki: - 70% alkohol etylowy -2% r-r alkoholowy fenoloftaleiny -0,25 M r-r NaOH Próba gotowania Wykonanie: 10 ml badanego mleka ogrzewać w probówce w łaźni wodnej do wrzenia. Ścięcie się mleka wskazuje na jego skwaśnienie (kwasowość ponad 10 0 SH} lub też na wady pochodzenia bakteryjnego Próba alkoholowa Wykonanie 2,5 ml badanego mleka wymieszać w probówce z 5 ml 70% alkoholu etylowego i silnie wytrząsnąć. Ścięcie się mleka świadczy o jego nadmiernej kwasowości (7,5-8 0 SH) Oznaczenie kwasowości mleka metodą Soxhleta Henkela Wykonanie Do kolby stożkowej pobrać 25ml badanego mleka, dodać 1 cm 3 2% r-u alkoholowego fenoloftaleiny i miareczkować 0,25M r-em NaOH do uzyskania trwałego różowego zabarwienia utrzymującego się prze 30s. Wynik (objętość NaOH zużyta do miareczkowania) pomnożony przez 2 wyraża kwasowość mleka w 0 SH. Zakres wiadomości wymaganych do kolokwium wprowadzającego: 1. Zasady metod oceny toksykologicznej i higienicznej mleka stosowanych w trakcie ćwiczenia 2. Informacje zawarte w rozdziale 1. Wiadomości wprowadzające 6

7 Opracowano na podstawie: 1. Cais-Sokolińska D., Danków R. Pikul J.: Standaryzacja i zarządzanie jakością mleka surowego. surowego,98,hodowla,artykul.html 2. PN-A Mleko surowe do skupu 3. Rozporządzenie(We) Nr 853/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. 4. PN-90/A Mleko i przetwory mleczne 5. Orzeł D., Biernat J.: Wybrane zagadnienia z toksykologii żywności. Wyd. UWP, Wrocław, Olędzka R.: Ćwiczenia z bromatologii. Wyd. Akademii Medycznej w Warszawie, Warszawa,