ĆWICZENIE Nr 1 FERMENTACJA MLEKOWA

Transkrypt

1 ĆWICZENIE Nr 1 FERMENTACJA MLEKOWA UWAGA: Ze względu na laboratoryjny charakter zajęć oraz na kontakt z materiałem biologicznym, studenci zobowiązani są uŝywać fartuchów i rękawiczek jednorazowych. Fermentacja mlekowa jest mikrobiologicznym, beztlenowym procesem przemiany cukrów do kwasu mlekowego. Wywoływana jest przez bakterie fermentacji mlekowej w mleku i jego przetworach oraz w kiszonych warzywach. Substratem dla tej fermentacji jest glukoza i inne heksozy oraz laktoza jako główny węglowodan mleka. Bakterie fermentacji mlekowej zaliczane są do rodzajów: Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium. Są to Gram-dodatnie nie przetrwalnikujące ziarniaki lub pałeczki bez zdolności do ruchu. Biorąc pod uwagę zdolność bakterii mlekowych do przeprowadzania fermentacji róŝnych cukrów i wytwarzania róŝnych produktów końcowych, moŝna podzielić je na trzy grupy: BAKTERIE HOMOFERMENTACYJNE bakterie właściwej fermentacji mlekowej. Wykorzystują cukry proste i dwucukry. Wytwarzają niemal wyłącznie kwas mlekowy jako końcowy produkt przemiany materii. Przedstawicielami tej grupy są: - Lactococcus lactis subsp. lactis - występuje w mleku surowym - Lactococcus lactis subsp. cremoris - występuje w ukwaszonej śmietanie - Lactobacillus casei obecny w mleku i dojrzewających serach - Lactobabacillus plantarum- czynny podczas zakiszania kapusty i ogórków BAKTERIE HETEROFERMENTACYJNE bakterie właściwej fermentacji mlekowej. Oprócz heksoz, przeprowadzają fermentację pentoz, wytwarzają obok kwasu mlekowego (50% końcowych produktów metabolizmu) kwas octowy, etanol, CO 2, glicerol, mannitol. Są to bakterie z rodzaju Leuconostoc. - Leuconostoc mesenteroides powoduje śluzowacenie słodkich napojów i fermentujących warzyw - Leuconostoc cremoris wytwarza kwas octowy i CO 2, stosowany do ukwaszania śmietany 1

2 - Lactobacillus brevis występuje w mleku, serach i kiszonkach - Lactobacillus fermenti występuje w zalewie kiszonych ogórków i kapusty - Bifidobacterium bifidum ściśle beztlenowa bakteria, stanowiąca większość mikroflory jelita grubego niemowląt karmionych mlekiem matki oraz do 50% tejŝe mikroflory u dzieci i dorosłych. Wytwarza kwas L(+)-mlekowy, dzięki czemu ma duŝy wpływ na prawidłowe funkcjonowanie przewodu pokarmowego BAKTERIE PSEUDOMLEKOWE są to bakterie zakaŝające róŝne produkty (wino, piwo). Mogą powodować np. obniŝenie zawartości kwasu jabłkowego w winach, zamieniając go w kwas mlekowy z wydzieleniem CO 2 (tzw. odkwaszanie win). NaleŜą tu m.in. Bacterium gracile i Bacterium mannitopem. Bakterii mlekowych uŝywa się w przemyśle owocowo - warzywnym do kiszenia ogórków, kapusty i innych warzyw; w rolnictwie do otrzymywania kiszonek paszowych. W mleczarstwie w produkcji masła, serów i napojów mlecznych; zsiadłe mleko zawiera 0,8-2% kwasu mlekowego, stosuje się tu bakterie kwaszące i aromatyzujące: L. lactis, L. cremoris; jogurt szczepionka jogurtowa zawierająca w proporcji 1:1 lub 1:2 Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus termophilus; kefir napój lekko musujący zawierający 0,1-0,8% alkoholu. Do jego otrzymywania stosuje się grzybki kefirowe, w skład wchodzą liczne bakterie: L. lactis, L. cremoris, L. diacetilactis, L. brevis, L. casei oraz Candida kefir, Saccharomyces florentinum, Torula kefir. NaleŜy zauwaŝyć, Ŝe kwas mlekowy jest właściwie jedynym kwasem powstającym fermentacji mlekowej znajdującym się w wyŝej wymienionych produktach. 2

3 1. Oznaczanie ogólnej liczby bakterii w mleku metodą próby reduktazowej Metoda ta stosowana jest w mleczarstwie do oznaczanie ogólnego zakaŝenia mleka. Drobnoustroje obecne w mleku zuŝywają zawarty w nim tlen, w skutek czego obserwuje się stopniowy spadek potencjału oksydoredukcyjnego. Wzrasta jednocześnie zapotrzebowanie na akceptor wodoru, jakim jest tlen rozpuszczony w mleku. Dodany do mleka błękit metylenowy stanowi akceptor wodoru. Po wyczerpaniu tlenu zawartego w mleku związki te zmieniają barwę wraz ze zmiana potencjału. Błękit metylenowy w postaci zredukowanej przechodzi w bezbarwna postać leukozwiązku. Szybkość zuŝycia tlenu, związana z odbarwieniem błękitu metylenowego, zaleŝy od liczby drobnoustrojów w mleku, ich rodzaju, zdolności redukujących, stanu fizjologicznego i obecności w mleku substancji hamujących np. antybiotyków. Próby te pozwalają na wykrywanie bakterii mlekowych i E. coli. Ocena mleka: mleko surowe nie moŝe zawierać więcej niŝ 1, bakterii w jednym ml. Miano coli nie moŝe być niŝsze od 0,1. Ogólna liczba bakterii w mleku pasteryzowanym butelkowym nie moŝe przekroczyć w 1 ml. Wykonanie: a) Do 10 ml kefiru, zsiadłego mleka, świeŝego mleka oraz jogurtu naturalnego dodać 0,5 ml wodno-etanolowego roztworu błękitu metylenowego b) Próby inkubować w temp. 37 o C bez dostępu światła i zanotować czas odbarwienia. c) Odczyt wyników wg Jensena: jeŝeli w 1ml mleka znajduje się: < 10 5 czas odbarwienia trwa ponad 7 godzin czas odbarwienia: ponad 5 godzin odbarwienie w ciągu 2-5 godzin czas odbarwienia: od 20 minut do 2 godzin 3

4 2. Przygotowanie hodowli fermentacyjnej oraz wyznaczanie stęŝenia kwasu mlekowego a) Przygotować poŝywkę hodowlaną: Do kolby miarowej o pojemności 1000ml dodać: Ekstrakt droŝdŝowy 5.0 g; Pepton: 10.0 g; Glukoza: 20.0 g; KH 2 PO 4 : 0.5 g; K 2 HPO 4 : 0.5 g; FeSO 4 7H 2 O: 10.0 mg; MgSO 4 7H 2 O mg; MnSO 4 H 2 O: 7.5 mg; Octan sodu: 20.0 g; Laktoza 10.0 g; Doprowadzić ph poŝywki do 5,2 za pomocą H 2 SO 4 lub NaOH i zautoklawować (temp. 121 o C, czas ok. 45Min) b) Do dwóch kolb płaskodennych o pojemności 250ml wprowadzić po 100ml poŝywki. Medium w kolbie pierwszej inokulować 1ml przygotowanych kultur bakteryjnych (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, zawiesina A), natomiast do drugiej dodać 1ml zawiesiny kultur bakteryjnych B (Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus kefyr, Klyveromyces marxianus, Saccaromyces unisporus, zawiesina B). c) Hodowlę prowadzić w temp. 30 o C; po 24, 48 i 96h pobrać po 22ml mieszaniny, uzyskane próbki odwirować (10 min, 5000 rpm), a supernatant pozostawić do dalszej analizy. d) 10ml supernatantu miareczkować 0,2 M NaOH wobec fenoloftaleiny. Wszystkie miareczkowania wykonać dwukrotnie. e) Oznaczona kwasowość ogólna przeliczyć na ogólną ilość kwasu mlekowego i jego stęŝenie, wykonać wykres zaleŝności stęŝenia kwasu mlekowego od czasu i uzasadnić wyniki. 4

5 Odczynniki: - Wodno-etanolowy roztwór błękitu metylenowego (5ml nasyconego alkoholowego roztworu błękitu metylenowego w zmieszanego z 195ml wody destylowanej) - PoŜywka hodowlana: w 1000ml roztworu znajduje się: ekstrakt droŝdŝowy: 5.0 g; pepton: 10.0 g; glukoza: 20.0 g; KH 2 PO 4 : 0.5 g; K 2 HPO 4 : 0.5 g; FeSO 4 7H 2 O: 10.0 mg; MgSO 4 7H 2 O mg; MnSO 4 H 2 O: 7.5 mg; octan sodu: 20.0 g; laktoza 10g - Próbki kefiru, zsiadłego mleka, świeŝego mleka oraz jogurtu naturalnego - Zawiesina A: kultury Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus; - Zawiesina B: kultury Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus kefyr, Klyveromyces marxianus, Saccaromyces unisporus. - 0,2M NaOH - 0,2M H 2 SO 4 - Fenoloftaleina (roztwór 2% w etanolu) 5