(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 63 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 12/49 EP 63 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. G01N 33/7 (06.01) G01N 33/74 (06.01) G01N 33/64 (06.01) G01N 33/68 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Ulepszone sposoby testowania immunologicznego () Pierwszeństwo: US 8448 P GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/22 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/0 (73) Uprawniony z patentu: Oncimmune LTD, Nottingham, GB (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 63 T3 JOHN FORSYTH RUSSELL ROBERTSON, Nottingham, GB ANDREA MURRAY, Nottingham, GB CAROLINE CHAPMAN, Nottingham, GB TONY BARNES, Dunwoody, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 3 4 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny testów diagnostycznych lub prognostycznych, a w szczególności dotyczy testów do wykrywania przeciwciał w próbce zawierającej płyn ustrojowy pacjenta, przy czym takie przeciwciała stosuje się jako markery biologiczne stanu chorobowego lub podatności na chorobę. Tło wynalazku [0002] Wiele testów diagnostycznych, prognostycznych i/lub monitorujących opiera się na wykrywaniu markera biologicznego konkretnego stanu chorobowego lub podatności na chorobę. Takimi markerami biologicznymi są zwykle białka albo polipeptydy, które są charakterystyczne dla konkretnej choroby lub związane z podatnością na chorobę. [0003] W ostatnich latach stało się oczywiste, że jako markery biologiczne choroby lub podatności na chorobę mogą również służyć przeciwciała, a w szczególności autoprzeciwciała. Autoprzeciwciała są naturalnie występującymi przeciwciałami skierowanymi wobec antygenu, który układ immunologiczny osobnika rozpoznaje jako obcy, pomimo tego, że w rzeczywistości antygen pochodzi z tego osobnika. Mogą być one obecne w obiegu jako krążące wolne autoprzeciwciała lub w postaci krążących kompleksów immunologicznych składających się z autoprzeciwciał związanych z ich docelowym antygenem. Różnice między białkiem typu dzikiego wyrażanym przez komórki normale i zmienioną formą białka wytwarzanego przez komórki chorobowe lub podczas procesu chorobowego, prowadzą, w pewnych przypadkach, do zmienionego białka rozpoznawanego przez układ immunologiczny osobnika jako niewłasne, a tym samym wywołują u tej osoby odpowiedź immunologiczną. Może to być odpowiedź immunologiczna humoralna (tj. za pośrednictwem komórek B), prowadząca do wytwarzania autoprzeciwciał immunologicznie swoistych wobec zmienionego białka. [0004] WO 99/8978 opisuje sposoby do zastosowania w wykrywaniu/diagnozowaniu nowotworu, które opierają się na ocenie odpowiedzi immunologicznej osobnika na dwa lub więcej różnych markerów nowotworowych. Sposoby te zwykle obejmują doprowadzenie do kontaktu próbki płynu ustrojowego pobranej od osoby, z panelem dwóch lub więcej różnych antygenów - markerów nowotworowych, każdym pochodzącym z osobnego białka - markera nowotworowego, i wykrywanie tworzenia kompleksów antygenów - markerów nowotworowych związanych z krążącymi autoprzeciwciałami swoistymi immunologicznie wobec białek - markerów nowotworowych. Obecność tych krążących autoprzeciwciał uważa się za wskazanie obecności nowotworu. [000] Testy, które mierzą odpowiedź immunologiczną osobnika na obecność białka - markera nowotworowego jako wytwarzanie autoprzeciwciał dostarczają alternatywy dla bezpośredniego pomiaru lub wykrywania białka - markera nowotworowego w płynach ustrojowych. Takie testy stanowią zasadniczo pośredni sposób wykrywania obecności białka - markera nowotworowego. Ze względu na charakter odpowiedzi immunologicznej, prawdopodobne jest, że przeciwciała mogą zostać wzbudzone przez bardzo małą ilość krążącego białka - markera nowotworowego i metody pośrednie, które polegają na wykrywaniu odpowiedzi immunologicznej wobec markerów nowotworowych będą zatem w konsekwencji bardziej czułe niż metody bezpośredniego pomiaru markerów nowotworowych w płynach ustrojowych. Metody oznaczania oparte na wykrywaniu autoprzeciwciał mogą być zatem szczególnie cenne wcześnie w procesie chorobowym, a możliwe, że również w odniesieniu do przeszukiwania pod kątem pacjentów bezobjawowych, na przykład w badaniach przesiewowych w celu zidentyfikowania osobników narażonych na ryzyko rozwoju choroby w populacji osobników bezobjawowych albo w celu zidentyfikowania osobników, u których rozwinęła się choroba wśród populacji osobników bezobjawowych. Ponadto, sposoby oznaczania oparte na wykrywaniu przeciwciał mogą być szczególnie cenne wcześnie w procesie chorobowym i możliwe, 1

3 2 3 4 że będzie można je zastosować do identyfikacji osobników, u których rozwinęła się choroba wśród populacji osób z objawami. Ponadto, mogą być one użyteczne do wcześniejszego wykrywania nawrotu choroby. Sposoby oznaczania mogą być również cenne przy wybieraniu lub monitorowaniu terapii dla choroby. [0006] Przeciwciała i autoprzeciwciała mogą również służyć jako markery biologiczne innych stanów chorobowych lub podatności na choroby, których przykładami mogą być: reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy (SLE, ang. systemic lupus erythematous), pierwotna żółciowa marskość wątroby (PBC, ang. primary biliary cirrhosis), autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (np. zapalenie tarczycy Hashimoto), autoimmunologiczne zapalenie żołądka, anemia złośliwa, autoimmunologiczne zapalenie nadnerczy (np. choroba Addisona), autoimmunologiczna niedoczynność przytarczyc, autoimmunologiczna cukrzyca (np. cukrzyca typu 1), poważne osłabienie mięśni (myasthenia gravis). [0007] Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że kiedy testy w oparciu o wykrywanie przeciwciał stosuje się diagnostycznie lub prognostycznie do oceny stanu choroby, postępu choroby lub podatności na chorobę osobnika w obrębie populacji, mogą pojawić się trudności przy opracowaniu standardowej metodologii testu odpowiedniej dla całej populacji osobników, która ma być przebadana, ponieważ bezwzględne ilości obecnego przeciwciała mogą bardzo różnić od osoby do osoby. To może doprowadzić do występowania dużej liczby wyników fałszywie ujemnych, na przykład wśród osobników z małą ilością przeciwciała. Podobnie, występuje trudność w otrzymywaniu prawdziwych wyników dodatnich, ponieważ różnica w bezwzględnych ilościach przeciwciała od osoby do osoby oznacza, że trudno jest ustalić próg dla dodatniego wyniku testu, który jest odpowiedni dla wszystkich osobników w przeszukiwanej populacji. [0008] Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że wydajność, a bardziej konkretnie, przydatność kliniczna i wiarygodność testów opartych na wykrywaniu przeciwciał, w szczególności autoprzeciwciał, jako markerów biologicznych choroby można znacznie poprawić przez włączenie etapu miareczkowania antygenu. Poprzez badanie próbki podejrzanej o obecność przeciwciał wobec serii różnych ilości antygenu i sporządzenie krzywej miareczkowania możliwa jest wiarygodna identyfikacja prawdziwie dodatnich wyników przeszukiwania niezależnie od bezwzględnej ilości przeciwciała obecnego w próbce. Takie podejście jest przeciwieństwem sposobów znanych w stanie techniki, które miareczkują antygen jedynie w celu skonstruowania krzywej kalibracyjnej dla umożliwienia identyfikacji najbardziej odpowiedniego stężenia antygenu do stosowania do wykrywania przeciwciał w konkretnych próbkach pacjentów. W tych metodach dla danej diagnozy proponuje się tylko jeden punkt pomiaru. Tak więc, sposoby te nie dają możliwości wykrywania zmian ilości przeciwciała od osoby do osoby, co skutkuje otrzymywaniem wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że sposoby oznaczania w oparciu o miareczkowanie antygenu wykazują większą swoistość i czułość niż mierzenie reaktywności autoprzeciwciał dla pojedynczego stężenia antygenu. [0009] Twórcy stwierdzili ponadto, że te sposoby oznaczania, które łączą miareczkowanie antygenu z jednoczesnym miareczkowaniem próbki testowej zapewni jeszcze większe korzyści niż sposoby oparte na miareczkowaniu samego antygenu, w szczególności w kontekście wykrywania autoprzeciwciał. Te metody tak zwanego miareczkowania krzyżowego (ang. cross-titration) są przedmiotem niniejszego wynalazku. Streszczenie wynalazku [00] Zgodnie z pierwszym aspektem wynalazku dostarczony jest sposób wykrywania stanu chorobowego lub podatności na chorobę u osobnika-ssaka, gdzie taki sposób obejmuje wykrywanie przeciwciała w nieznanej badanej próbce, przy czym badana próbka zawiera płyn ustrojowy od takiego osobnika-ssaka, a przeciwciało jest markerem biologicznym stanu chorobowego lub podatności na chorobę, który to sposób obejmuje: (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: 2

4 2 3 (i) kontaktowania rozcieńczenia badanej próbki z wieloma różnymi ilościami antygenu swoistego dla tego przeciwciała, (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu użytego w etapie (i), (b) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki użytej w etapie (a), oraz (c) ustalenie obecności lub nieobecności takiego stanu chorobowego lub podatności na chorobę na podstawie ilości swoistego wiązania między tym przeciwciałem i tym antygenem dla każdego rozcieńczenia badanej próbki i ilości testowanego antygenu, przy czym wynik dodatni dla obecności przeciwciał w badanej próbce jest ustalany poprzez porównanie z wynikiem odcięcia uzyskanym dla grupy kontrolnej osobników normalnych. [0011] Zgodnie z drugim aspektem wynalazku dostarczony jest sposób wykrywania przeciwciała w badanej próbce zawierającej płyn ustrojowy od osobnika-ssaka, przy czym przeciwciało jest markerem biologicznym stanu chorobowego lub podatności na chorobę, który to sposób obejmuje: (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń tej badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: (i) kontaktowania rozcieńczenia badanej próbki z wieloma różnymi ilościami antygenu swoistego dla tego przeciwciała, (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu użytego w etapie (i), (b) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki użytej w etapie (a), przy czym na obecność w badanej próbce przeciwciała reaktywnego z antygenem stosowanym w teście wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki. [0012] Zgodnie z trzecim aspektem wynalazku dostarczony jest sposób wykrywania przeciwciała w badanej próbce zawierającej płyn ustrojowy od osobnika-ssaka, gdzie takie przeciwciało jest skierowane wobec obcej substancji wprowadzonej do takiego osobnika-ssaka, który to sposób obejmuje: (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: (i) kontaktowania rozcieńczenia badanej próbki z wieloma różnymi ilościami antygenu swoistego dla tego przeciwciała, (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu użytego w etapie (i), (b) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki użytej w etapie (a), przy czym na obecność w badanej próbce przeciwciała reaktywnego z antygenem stosowanym w teście wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki. [0013] We wszystkich aspektach wynalazku osobnikiem-ssakiem jest, korzystnie, człowiek. [0014] We wszystkich aspektach wynalazku, przeciwciałem może być autoprzeciwciało. [00] We wszystkich aspektach wynalazku, sposób przeprowadza się korzystnie in vitro na próbce zawierającej płyn ustrojowy otrzymany lub przygotowany z osobnika-ssaka. [0016] We wszystkich aspektach wynalazku, etap (a) testu będzie, korzystnie, obejmował kontaktowanie każdego rozcieńczenia badanej próbki z każdą ilością antygenu zastosowanego w teście, tak aby przetestowane zostały wszystkie możliwe kombinacje rozcieńczeń i ilości antygenu. 3

5 2 3 4 [0017] Szczególną cechą wynalazku we wszystkich jego aspektach, jest to, że ocena, czy odpowiednie przeciwciało jest obecne czy nie w badanej próbce opiera się na ilości swoistego wiązania obserwowanego dla każdej spośród różnych kombinacji rozcieńczenia badanej próbki i badanego stężenia antygenu, innymi słowy wartości zbiorczych, a nie tylko do odczytu dla pojedynczego stężenia antygenu lub pojedynczego rozcieńczenia badanej próbki. A zatem ustalenie obecności lub nieobecności stanu chorobowego lub podatności na chorobę albo przeciwciał wobec obcej substancji w próbce pacjenta będzie następować bezpośrednio w oparciu o te wartości zbiorcze. W jednym z wykonań, oceny dokonuje się na podstawie obecności krzywej zasadniczo S-kształtnej lub sigmoidalnej, kiedy ilość swoistego wiązania wykreśla się względem ilości antygenu dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki. Co będzie oczywiste z Przykładów tu przedstawionych, twórcy zaobserwowali, że sposoby według wynalazku mają wyższą czułość przy co najmniej równoważnej swoistości co sposoby diagnozowania lub wykrywania oparte jedynie na miareczkowaniu antygenu i zmniejszają występowanie oznaczeń fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. [0018] Niniejszy wynalazek zostanie teraz dalej opisany. [0019] Różne właściwości rozmaitych aspektów wynalazku są zdefiniowane poniżej bardziej szczegółowo. Każda właściwość tak zdefiniowana w powiązaniu z jednym z aspektów wynalazku, może być łączona z właściwościami opisanymi w powiązaniu z dowolnym innym aspektem wynalazku, o ile nie wskazano wyraźnie, że jest inaczej. W szczególności, każdą właściwość wskazaną jako preferowana lub korzystna można łączyć z dowolną inną właściwością lub właściwościami wskazanymi jako preferowane lub korzystne w połączeniu z każdą inną właściwością lub właściwościami wskazanymi jako preferowane lub korzystne, o ile nie wskazano wyraźnie, że jest inaczej. Krótki opis rysunków [00] Fig. 1 przedstawia serię krzywych miareczkowania krzyżowego do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko p3 (Fig. 1a do d) i c-myc (Fig. 1e do h), w próbkach surowicy pobranej od pacjentów z rakiem piersi. W każdym eksperymencie, sześć różnych rozcieńczeń surowicy pacjenta badano oddzielnie pod kątem swoistego wiązania względem serii miareczkownia różnych ilości rekombinowanego antygenu p3 lub c-myc (rozcieńczenie surowicy 1/ 000 pełni funkcję kontroli bez surowicy ). Dla każdego antygenu wykreślone zostały oddzielne krzywe swoistego wiązania (wyrażanego jako absorbancja przy 60 nm) względem stężenia antygenu dla każdego rozcieńczenia surowicy pacjenta. Fig. 2 przedstawia przykład układu płytki do miareczkowania zastosowanej do przeprowadzenia testów optymalnego stężenia surowicy i antygenu (OSAAC, ang. Optimal Serum and Antigen Concentration) zgodnie z Przykładem 3. Uwaga - rozcieńczenia surowicy i antygenu są pokazane na oddzielnych płytkach, podczas gdy w praktyce, rozcieńczenia surowicy i antygenu dodaje się do odpowiednich studzienek na tej samej pojedynczej płytce. Fig. 3 do 7 przedstawiają serię krzywych miareczkowania krzyżowego do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko p3, ECD6 (znanemu również jako domena zewnątrzkomórkowa HER2) i fragmentowi 3' ECD6 w próbkach surowicy pobranej od pacjentów z pierwotnym rakiem piersi i normalnych osobników kontrolnych. W każdym eksperymencie, sześć różnych rozcieńczeń surowicy pacjenta badano oddzielnie pod kątem swoistego wiązania wobec serii miareczkowań różnych ilości antygenów - rekombinowanego p3, ECD6 lub fragmentu 3' ECD6. Dla każdego antygenu wykreślone zostały oddzielne krzywe swoistego wiązania (wyrażanego jako absorbancja przy 60 nm) względem stężenia antygenu dla każdego rozcieńczenia surowicy pacjenta. Fig. 3 przedstawia reprezentatywne krzywe miareczkowania do wykrywania autoprzeciwciał anty-p3 w surowicy pacjentów z pierwotnym rakiem piersi (panel a) lub normalnych osobników kontrolnych (panel b). Fig. 4 przedstawia reprezentatywne krzywe 4

6 2 3 4 miareczkowania do wykrywania autoprzeciwciał anty-ecd6 (przy zastosowaniu antygenu ECD6) w surowicy od pacjenta z pierwotnym rakiem piersi (panel a) lub normalnego osobnika kontrolnego (panel b). Fig. przedstawia reprezentatywne krzywe miareczkowania do wykrywania przeciwciał anty-ecd6 (przy zastosowaniu antygenu 3' ECD6) w surowicy od pacjenta z pierwotnym rakiem piersi (panel a) lub normalnego osobnika kontrolnego (panel b). Fig. 6 przedstawia reprezentatywne krzywe miareczkowania do wykrywania przeciwciał anty-p3 lub autoprzeciwciał anty-ecd6 w surowicy od tego samego pacjenta z pierwotnym rakiem piersi przy zastosowaniu antygenu p3 (panel a), antygenu ECD6 (panel b) lub antygenu 3' ECD6 (panel c). Fig. 7 (panele a do d) przedstawiają dodatkowe krzywe miareczkowania omawiane w Przykładzie 3. Szczegółowy opis wynalazku [0021] Najogólniej, wynalazek dostarcza sposobu przeprowadzania testu immunologicznego do wykrywania przeciwciała, które służy jako marker biologiczny dla stanu chorobowego lub podatności na chorobę, charakteryzującego się tym, że dwa lub więcej różne rozcieńczenia próbki, która ma być testowana na obecność przeciwciała (próbka badana) są badane pod kątem swoistego wiązania względem różnych ilości antygenu swoistego dla przeciwciała i sporządzone zostają oddzielne krzywe miareczkowania ilości wiązania przeciwciało/antygen względem ilości badanego antygenu dla każdego z różnych rozcieńczeń badanej próbki. Krótko mówiąc, test opiera się miareczkowaniu krzyżowym obydwu, badanej próbki i antygenu użytego jako odczynnik w teście immunologicznym. [0022] Ogólne właściwości testów immunologicznych, np. testów ELISA, radioimmunologicznych i podobnych, są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (patrz Immunoassay, E. Diamandis i T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996). Testy immunologiczne do wykrywania przeciwciał o określonej swoistości immunologicznej z reguły wymagają stosowania związku reagującego (antygenu), który wykazuje konkretną reaktywność immunologiczną z badanym przeciwciałem. W zależności od rodzaju testu ten antygen może być unieruchomiony na podłożu stałym. Doprowadza się do kontaktu próbkę, która ma być badana na obecność przeciwciała, z antygenem i, jeżeli przeciwciała o wymaganej swoistości immunologicznej są obecne w próbce, będą one wykazywać reakcję immunologiczną z antygenem, z wytworzeniem kompleksów przeciwciało-antygen, które można następnie wykrywać i mierzyć ilościowo. [0023] Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że każde z dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń próbki, która ma być badana na obecność przeciwciała, bada się wobec wielu różnych ilości antygenu (określanych tu jako seria miareczkowań antygenu). Test musi obejmować badanie co najmniej dwóch rozcieńczeń badanej próbki, ale może obejmować badanie trzech, czterech, pięciu lub od sześciu do dziesięciu lub nawet więcej różnych rozcieńczeń badanej próbki. Każde oddzielne rozcieńczenie próbki jest badane wobec co najmniej dwóch, a korzystnie co najmniej trzech, czterech, pięciu, sześciu, siedmiu lub więcej różnych ilości antygenu. Typowe testy mogą również obejmować kontrolę ujemną, taką jak na przykład rozcieńczenie 1/ 000 badanej próbki. [0024] W tym kontekście termin antygen odnosi się do substancji, zawierającej co najmniej jedną determinantę antygenową albo epitop zdolny do swoistego oddziaływania z docelowym przeciwciałem, którego wykrycie jest pożądane, lub dowolnego czynnika wychwytującego, oddziałującego swoiście z regionem zmiennym albo regionami determinującymi dopasowanie tego przeciwciała. Antygen będzie zazwyczaj występującą naturalnie albo syntetyczną makrocząsteczką biologiczną, taką jak na przykład białko lub peptyd, polisacharyd lub kwas nukleinowy i może obejmować przeciwciała lub ich fragmenty, takie jak przeciwciała antyidiotypowe. [002] Czytający to specjaliści będą wiedzieli, że w sposobie według wynalazku ilość determinant antygenowych lub epitopów dostępnych dla wiązania z przeciwciałem docelowym jest ważna do ustalenia

7 2 3 4 serii miareczkowań. W wielu rodzajach testów ilość determinant antygenowych lub epitopów dostępnych dla wiązania bezpośrednio koreluje z ilością obecnych cząsteczek antygenów. Jednak, w innych wykonaniach, takich jak niektóre systemy oznaczania w fazie stałej, ilość eksponowanych determinant antygenowych lub epitopów może nie korelować bezpośrednio z ilością antygenu, ale może zależeć od innych czynników, takich jak przytwierdzenie do powierzchni stałej. W tych wykonaniach, odniesienie się tutaj do różnych ilości antygenu w serii miareczkowań można traktować jako odniesienie się do różnych ilości determinanty antygenowej lub epitopu. [0026] Względną lub bezwzględną ilość swoistego wiązania między przeciwciałem (obecnym w badanej próbki) i antygenem określa się dla każdej z różnych kombinacji rozcieńczenia badanej próbki i ilości testowanego antygenu (determinanty antygenowej lub epitopu). Wyniki są następnie wykorzystywane do wykreślenia lub obliczenia serii krzywych dla (względnych lub bezwzględnych) ilości swoistego wiązania w stosunku do ilości antygenu dla każdej ilości badanego antygenu, oddzielnej krzywej sporządzanej dla każdego rozcieńczenia próbki zastosowanej w teście. Typowe wyniki są przedstawione, jedynie jako przykład, w załączonych rysunkach dla wykrywania szeregu różnych przeciwciał. Obecność w badanej próbce przeciwciała wykazującego reakcję z antygenem zastosowanym w teście, określa się w oparciu o ilość swoistego wiązania obserwowanego przy każdej ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki zastosowanej w teście i zwykle wskazuje na nią krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki. [0027] Bezwzględne ilości swoistego wiązania między antygenem i przeciwciałem zasadniczo nie są istotne, o ile nie jest to pożądane dla uzyskania pomiaru ilościowego. Dla szybkiego określenia tak/nie obecności lub nieobecności przeciwciał wystarczy tylko, aby wytworzyć krzywą o odpowiednim kształcie dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanych próbek badanych w teście. Jeśli nie ma zmiany w wykrywalnym wiązaniu przy różnych ilościach testowanego antygenu dla żadnego z rozcieńczeń badanej próbki, wówczas można to uznać jako nieobecność wykrywalnej ilości przeciwciała. W korzystnych wykonaniach według wynalazku sposób jest nieilościowy. Można zatem dokonać ustalenia tak/nie obecności lub nieobecności przeciwciała przy zastosowaniu bezwymiarowej proporcjonalnej zależności, która jest niezależna od siły sygnału. [0028] Miarę ilości obecnego przeciwciała obecnego w konkretnej próbce można, jeśli to pożądane, uzyskać z wyników testu miareczkowania krzyżowego. W nieograniczających wykonaniach obejmujących badania kliniczne populacji pacjentów, wartość odcięcia dla uznania wyniku u danego pacjenta za dodatni można ustalić w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla grupy kontrolnej osobników normalnych, na przykład jako wartość odcięcia dla średniej + 2 razy odchylenie standardowe dla grupy normalnej. Próbki od pacjentów, w których swoiste wiązanie antygenu z przeciwciałem docelowym (np. wartość uzyskana po korekcie dla wiązania nieswoistego) lokują się powyżej tej wartości odcięcia dla co najmniej jednego stężenia antygenu można uznać za dodatnie. [0029] W innych nieograniczających wykonaniach wynalazku, aby uznać nieznane próbki badane za dodatnie lub ujemne można zastosować system kalibracji. Jeden z takich systemów kalibracji może opierać się zastosowaniu znanych dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych. Dodatnie i ujemne próbki kontrolne/kalibracyjne można analizować równolegle z próbką(ami) badaną(ymi) przy zastosowaniu metodologii testu według wynalazku. Nieznane próbki badane uznaje się za dodatnie lub ujemne poprzez porównanie do znanych dodatnich lub ujemnych próbek kontrolnych stosowanych jako próbki kalibracyjne. [00] Sposób według wynalazku jest korzystny do stosowania w klinicznych testach diagnostycznych, prognostycznych, predykcyjnych i/lub monitorujących, gdzie ilości bezwzględne obecnych przeciwciał docelowych mogą różnić się niezmiernie od pacjenta do pacjenta. Twórcy zaobserwowali, że jeśli takie testy opierają się na wykrywaniu wiązania przeciwciał przy zastosowaniu pojedynczej ilości/stężenia badanego 6

8 2 3 4 antygenu, próbki od pacjentów zawierające ilość przeciwciała, która jest na bardzo niskim lub bardzo wysokim skraju prawidłowego zakresu fizjologicznego (ilości przeciwciała) w całej populacji mogą zostać pominięte ze względu na ograniczenia w metodologii testu; próbki z małą ilością przeciwciała mogą być uznane za wyniki fałszywie ujemne, podczas gdy przy bardzo wysokich poziomach przeciwciała mogą być poza skalą dla dokładnego wykrywania przy zastosowaniu wybranej metodologii testu. [0031] We wszystkich wykonaniach wynalazku, przeciwciałem wykrywanym przy użyciu metodologii testu miareczkowania krzyżowego może być autoprzeciwciało. [0032] Sposób przeprowadzania testu poprzez miareczkowanie krzyżowe według wynalazku jest szczególnie odpowiedni do wykrywania przeciwciał/autoprzeciwciał jako markerów biologicznych stanu chorobowego lub podatności na chorobę, kiedy występuje znaczne zróżnicowanie od pacjenta do pacjenta zarówno w ilościach bezwzględnych przeciwciała/autoprzeciwciała obecnego u pacjenta, jak i swoistości przeciwciał/autoprzeciwciał, w szczególności powinowactwa przeciwciała/autoprzeciwciała wobec jego docelowego antygenu. Odpowiedzi autoprzeciwciał z natury mogą znacznie różnić się od pacjenta do pacjenta, gdzie różnice występują zarówno w ilościach bezwzględnych obecnego autoprzeciwciała, jak i swoistości/powinowactwa autoprzeciwciał. Sposób według wynalazku może brać pod uwagę to zróżnicowanie od pacjenta do pacjenta, umożliwiając tym samym opracowanie standardowego formatu testu (odpowiedniego do stosowania przy badaniu wszystkich osobników w populacji) dla danego przeciwciała/autoprzeciwciała. [0033] Oddziaływania między autoprzeciwciałami i ich antygenami docelowymi wykazują zasadniczo niewielkie powinowactwo, ale siła wiązania może różnić się od pacjenta do pacjenta, jak nadmieniono powyżej. Sposób według wynalazku nadaje się zwłaszcza do wykrywania wiązania o niskim powinowactwie, jako, że o wyniku dodatnim można wnioskować z kształtu krzywych miareczkowania wytworzonych dla każdego rozcieńczenia badanej próbki zastosowanej w teście. [0034] Sposób według wynalazku różni się od sposobów przeprowadzania testów opartych na miareczkowaniu samego antygenu (tj. testów, które obejmują testowanie jednej badanej próbki w serii miareczkowań wobec antygenu), ponieważ umożliwia wykrywanie sygnałów wytwarzanych przez wiązanie przeciwciał o niskim poziomie występowania i/lub niskim powinowactwie, które w przeciwnym razie mogłyby być maskowane przez wiązanie nieswoiste (antygenu użytego w teście) z elementami nie docelowymi w badanej próbce. [003] Twórcy zaobserwowali znaczne międzyantygenowe, a także wewnątrzantygenowe różnice w optymalnym badanej próbki wymaganym dla optymalnego wykrywania przeciwciał docelowych. A zatem, badana próbka od tego samego pacjenta może mieć pierwsze optymalne rozcieńczenie dla wykrycia przeciwciał wobec pierwszego antygenu i inne optymalne rozcieńczenie dla wykrycia przeciwciał wobec drugiego antygenu pochodzącego z innego białka (zmienność międzyantygenowa). Różnica w optymalnym badanej próbki dla dwóch antygenów pochodzących z różnych białek może być o kilka rzędów wielkości. Na przykład, optymalne rozcieńczenie dla danej badanej próbki do wykrywania przeciwciał wobec pierwszego antygenu (białka A) może wynosić 1:800, ale ta sama badana próbka może wymagać optymalnego rozcieńczenia 1:0 dla wykrywania przeciwciał wobec drugiego antygenu (białka B). Podobny efekt można zaobserwować, kiedy zastosowanymi antygenami są różne fragmenty tego samego białka lub białko pełnej długości i subfragment tego białka (zmienność wewnątrzantygenowa). Tak więc, jeżeli badana próbka ma być testowana pod kątem reaktywności wobec zestawu różnych antygenów (które pochodzą z różnych białek lub fragmentów pojedynczego białka lub ich kombinacji), optymalne rozcieńczenie badanej próbki wymagane dla każdego antygenu w zestawie może być inne. Sposób według wynalazku omija ten problem poprzez badanie różnych rozcieńczeń badanej próbki wobec różnych rozcieńczeń każdego antygenu w każdym zestawie za każdym 7

9 2 3 4 razem, kiedy stosuje się ten sposób w warunkach klinicznych. Tak więc, każdy antygen w zestawie będzie automatycznie badany przy optymalnym dla niego badanej próbki. [0036] Twórcy zaobserwowali również, że mogą wystąpić różnice międzyosobnicze w optymalnym badanej próbki dla konkretnego antygenu. Tak więc, dla danego antygenu badana próbka od pierwszego osobnika może dawać optymalny wynik przy pierwszym badanej próbki (np. 1:0), podczas gdy, kiedy badaną próbkę od drugiego osobnika testuje się przy zastosowaniu tego samego antygenu, optymalne może być inne rozcieńczenie próbki (np. 1:00). Sposób według wynalazku jest w stanie uwzględnić takie zróżnicowanie od pacjenta do pacjenta, ponieważ dla każdego testowanego antygenu bada się szereg rozcieńczeń badanej próbki względem szeregu rozcieńczeń antygenu za każdym razem, kiedy stosuje się ten sposób w warunkach klinicznych. A zatem, sposób według niniejszego wynalazku będzie zawsze stosować optymalne rozcieńczenie badanej próbki dla każdego testowanego antygenu względem każdej badanej próbki. [0037] Sposób według wynalazku dostarcza także ochrony przed codziennymi różnicami (tj. różnicami z dnia na dzień) przy przeprowadzaniu testów immunologicznych stosowanych do wykrywania autoprzeciwciał/przeciwciał do celów diagnostycznych, prognostycznych i/lub monitorowania (stanu chorobowego lub terapii). Często obserwuje się, że występują znaczące różnice z dnia na dzień w sile sygnału podczas prowadzania testów immunologicznych do wykrywania przeciwciał w próbkach zawierających płyny ustrojowe pacjenta. Takie zmiany mogą powstać, na przykład, ze względu na różnice w sposobie, w jaki próbki zostały pobrane i przechowywane przed badaniem. Czynniki takie utrudniają pewną ocenę wyników testów klinicznych, na przykład, na podstawie prostej wartości progowej wiązania przeciwciała/antygenu. Wynalazek minimalizuje efekty takiego zróżnicowania z dnia na dzień, ponieważ wynik dodatni dla obecności przeciwciała jasno wynika z kształtu krzywych miareczkowania sporządzonych dla każdego rozcieńczenia badanej próbki zastosowanej w teście, niezależnie od siły sygnału. [0038] Jeszcze inną zaletą sposobu według wynalazku jest to, że umożliwia on rozcieńczenie próbki od pacjenta, a jednocześnie daje spójne wyniki, jak również, że będzie dawał zasadniczo taki sam wynik badania jakościowego (dodatni/ujemny) przy stosowaniu płynów ustrojowych z różnych źródeł od jednego osobnika (np. krwi lub surowicy versus płyn puchlinowy lub wysięk opłucnowy), chociaż bezwzględne stężenie przeciwciał może być różne w różnych płynach. [0039] Sposób według wynalazku można prowadzić w dowolnym odpowiednim formacie, który umożliwia kontakt między wieloma rozcieńczeniami próbki podejrzewanej o obecność przeciwciał i wielu różnymi ilościami antygenu. Dogodnie, jeżeli kontakt pomiędzy różnymi rozcieńczeniami próbki i różnymi ilościami antygenu może odbywać się w oddzielnych, ale równoległych komorach reakcyjnych, takich jak studzienki płytki do mikromiareczkowania. Studzienki płytki do mikromiareczkowania można powlekać różnymi ilościami antygenu poprzez przygotowanie serii rozcieńczeń z roztworu podstawowego antygenu w studzienkach płytki do mikromiareczkowania. Roztwór podstawowy antygenu może być roztworem o znanym lub nieznanym stężeniu. Próbki przygotowanych rozcieńczeń badanej próbki mogą być następnie dodawane do studzienek płytki przy utrzymywaniu stałej objętości badanej próbki w każdej studzience. Bezwzględne ilości antygenu dodawanego do studzienek płytki do mikromiareczkowania mogą się różnić w zależności od takich czynników jak charakter przeciwciała docelowego, rodzaj próbki poddawanej badaniu, rozcieńczenia badanej próbki, itp., co będzie oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. Ogólnie, ilości antygenu i rozcieńczenia badanej próbki wybiera się tak, aby wytworzyć zakres mocy sygnału, który mieści się w dopuszczalnym dla odczytu zakresie wykrywania wybranym dla wykrywania wiązania przeciwciało/antygen w tym sposobie. Typowe ilości i rozcieńczenia do badania próbek ludzkich surowic podejrzewanych o to, że zawierają autoprzeciwciała przeciw markerom nowotworowym są podane w załączonych przykładach. Jedynie przykładowo, typowe rozcieńczenia badanej próbki mogą się być różne w zakresie od 1/ do 8

10 /000 (lub 1:0 do 1:1600). Testowane ilości antygenu mogą być różne, typowo w zakresie od μg/ml 0,01 μg/ml (lub 160 nm do 0,16 nm), przy czym nie ma być to traktowane jako ograniczanie. [00] Jak nadmieniono powyżej, możliwe jest skonstruowanie krzywych miareczkowania dla dwóch lub więcej rozcieńczeń badanej próbki poczynając od jednego roztworu podstawowego antygenu nawet jeżeli bezwzględne stężenie antygenu w tym roztworze nie jest znane. Zakładając, że stosowany jest ten sam jeden roztwór podstawowy i jest kolejno rozcieńczany w taki sam sposób, możliwe jest porównanie wyników odrębnych testów miareczkowania dla tego antygenu wykonywanych dla badanych próbek różnego pochodzenia. [0041] W kolejnym wykonaniu testu różne ilości antygenu (determinant antygenowych lub epitopów) mogą być unieruchomione w wyodrębnionych miejscach lub miejscach reakcji na podłożu stałym. Całe podłoże lub wyodrębniony obszar zawierający subfrakcję miejsc reakcji, można następnie doprowadzić do kontaktu z rozcieńczeniem badanej próbki i wiązanie się przeciwciała do antygenu wykrywać albo zmierzyć oddzielnie w każdym z wyodrębnionych miejsc lub miejsc reakcji. Odpowiednie podłoża stałe obejmują również mikromacierze, na przykład zgrupowania, gdzie oddzielne miejsca albo plamy w zgrupowaniu mogą zawierać różne ilości antygenu. Mikromacierze można wytwarzać poprzez unieruchomienie różnych ilości konkternego antygenu, w wyodrębnionych, rozróżnialnych miejscach reakcji w zgrupowaniu. W innych wykonaniach rzeczywista ilość unieruchomionych cząsteczek antygenu może być utrzymywana zasadniczo na stałym poziomie, ale rozmiar miejsc lub wielkość plam w zgrupowaniu jest zróżnicowana w celu zmiany ilości epitopu wiążącego, dostarczając serii miejsc lub plam do miareczkowania z różnymi ilościami dostępnego epitopu wiążącego. W takich wykonaniach przy przygotowywaniu serii miareczkowań ważne jest dwuwymiarowe stężenie powierzchniowe epitopu(ów) wiążących na antygenie, a nie bezwzględna ilość antygenu. Techniki sporządzania i uzyskiwania sygnałów z mikromacierzy białkowych/peptydowych są ogólnie znane w tej dziedzinie. [0042] Będzie zrozumiałe z powyższej dyskusji, że we wszystkich wykonaniach wynalazku, zmiany w ilości antygenu można uzyskać poprzez zmianę gęstości antygenu lub epitopu, względem których badane są rozcieńczenia badanej próbki, albo poprzez utrzymywanie gęstości antygenu lub epitopu, ale zwiększenie powierzchni na której antygen jest unieruchamiany, lub jedno i drugie. [0043] Mikromacierze mogą być wykorzystywane do wykonywania równolegle wielu testów dla przeciwciał o różnej swoistości. Można tego dokonywać przy użyciu zgrupowań, zawierających wiele zestawów różnych antygenów, gdzie czym każdy zestaw zawiera określony antygen w wielu różnych ilościach lub stężeniach. Określenie różne antygeny obejmuje antygeny pochodzące z różnych białek lub polipeptydów (np. antygeny pochodzące z niespokrewnionych białek kodowanych przez różne geny), jak również antygeny, które pochodzą z różnych epitopów peptydowych pojedynczego białka lub polipeptydu. Dana mikromacierz może zawierać wyłącznie zastawy różnych antygenów pochodzących z różnych białek lub polipeptydów albo wyłącznie zestawy różnych antygenów pochodzących z różnych epitopów peptydowych jednego białka lub polipeptydu, lub mieszaninę tych dwóch, w dowolnej proporcji. Należy odnotować, że we wszystkich wykonaniach według wynalazku korzystne jest, jeżeli każda seria miareczkowań pojedynczego antygenu zawiera różne ilości lub stężenia jednego typu antygenu, a nie mieszaniny antygenów. [0044] Stosowany tu termin płyn ustrojowy, gdy odnosi się do materiału, który ma być badany pod kątem obecności przeciwciał przy zastosowaniu sposobu według wynalazku, obejmuje, między innymi, osocze, surowicę, pełną krew, mocz, pot, limfę, kał, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn puchlinowy, wysięk opłucnowy, płyn nasienny, plwocinę, płyn po aspiracji sutka, pooperacyjny płyn surowiczy lub płyn z drenażu rany. Jak wspominano powyżej, sposoby według wynalazku korzystnie przeprowadza się in vitro na rozcieńczeniach badanej próbki zawierającej płyn ustrojowy pobrany od badanego osobnika. Rodzaj płynu ustrojowego może być różny w zależności konkretnego przeciwciała, które ma być testowane i sytuacji klinicznej, w której test 9

11 2 3 jest stosowany. Zasadniczo, korzystne jest wykonywanie testów na próbkach surowicy lub osocza. Badana próbka może zawierać dalsze składniki oprócz płynu ustrojowego, takie jak, na przykład, rozcieńczalniki, środki konserwujące, środki stabilizujące, bufory itp. Rozcieńczenia badanej próbki można sporządzić stosując dowolny odpowiedni rozpuszczalnik. Czytelnik specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że powodem przygotowania rozcieńczeń badanej próbki jest jedynie otrzymanie serii badanych próbek, z których każda zawiera różne ilości bezwzględne docelowego przeciwciała, które ma być wykryte w teście immunologicznym. Nie ma ono na celu wykluczenia innych sposobów uzyskiwania badanych próbek zawierających różne ilości przeciwciała docelowego. Przykładowo, badana próbka pobrana od pacjenta mogłaby być w rzeczywistości zatężona zamiast rozcieńczania, na przykład poprzez zastosowanie dializy, w celu uzyskania badanej próbki, zawierającej wyższe stężenie przeciwciała niż występuje naturalnie. W innych wykonaniach, na przykład w przypadku, kiedy płyn ustrojowy pobrany od pacjenta jest względnie rozcieńczony w odniesieniu do przeciwciała docelowego, płyn ustrojowy można najpierw zatężyć (np. poprzez dializę lub podobne techniki) w celu otrzymania stężonego roztworu podstawowego, który stosuje się następnie do sporządzenia serii rozcieńczeń do stosowania w teście według wynalazku. [004] Termin antygen stosuje się tu w szerokim znaczeniu w odniesieniu do substancji, która wykazuje swoistą reaktywność immunologiczną z docelowym przeciwciałem, które ma być wykrywane. Odpowiednie antygeny mogą obejmować, ale nie ograniczają się do tego, białka naturalnie występujące, białka lub polipeptydy rekombinowane lub syntetyczne, peptydy syntetyczne, mimetyki peptydów, itp, a także polisacharydy i kwasy nukleinowe. Konkretnie, w przypadku, gdy stosuje się tu antygen, ma to obejmować dowolny czynnik wychwytujący, czy to pochodzenia ludzkiego, pochodzenia ssaczego lub inny, zdolny do swoistego oddziaływania immunologicznego z regionami zmiennymi lub determinującymi dopasowanie przeciwciała, które ma być wykrywane. Przykładowo, przeciwciała antyidiotypowe można uznać jako antygen dla tego celu, jak również wiele antygenów wytwarzanych poprzez prezentację na fagach. [0046] Niektóre antygeny mogą zawierać lub mogą pochodzić z białek lub polipeptydów izolowanych ze źródeł naturalnych, w tym, ale bez ograniczania się do tego, białek lub polipeptydów izolowanych z tkanek lub płynów ustrojowych pacjenta. W takich wykonaniach antygen może stanowić zasadniczo całe białko występujące naturalnie, tj. białko zasadniczo w postaci, w której jest izolowane z naturalnego źródła, albo może stanowić fragment białka występującego naturalnie. Aby działać skutecznie jako antygen w sposobie według wynalazku dowolny taki fragment musi zachowywać reaktywność immunologiczną z przeciwciałami wobec których będzie on stosowany przy testowaniu. Odpowiednie fragmenty możnaby, na przykład, wytworzyć poprzez cięcie chemiczne lub enzymatyczne wyizolowanego białka. [0047] W zależności od dokładnego charakteru testu, w którym będzie on stosowany, antygen może stanowić występująca naturalnie biocząsteczka (np. białko lub jego fragment), związana z jedną lub więcej dalszych cząsteczek, które nadają pewne pożądane cechy nie występuje naturalnie w biocząsteczce. Na przykład, biocząsteczka (np. fragment białka lub polipeptydu), może być połączony z ujawniającym się znacznikiem, takim jak, na przykład, znacznik fluorescencyjny, znacznik barwny, znacznik luminescencyjny, znacznik radioaktywny lub metale ciężkie, takie jak złoto koloidalne. W innych wykonaniach, białko lub fragment mogą być wyrażane jako fuzja białkowa. Przykładowo, fuzje białkowe mogą zawierać znacznik peptydowy na końcu N lub C, aby pomóc w oczyszczaniu antygenu uzyskanego przez ekspresję rekombinowanego DNA. [0048] W zależności od rodzaju testu, w którym ma być on zastosowany, antygen może być unieruchomiony na podłożu stałym, takim jak, na przykład, studzienki płytki do mikromiareczkowania, mikromacierze w postaci kulek lub chipów lub kulki magnetyczne. Unieruchomienie może nastąpić poprzez niekowalencyjną adsorpcję lub przyłączenie kowalencyjne.

12 2 3 4 [0049] Można zastosować dowolne odpowiednie sposoby przytwierdzania pod warunkiem, że nie wpływają niekorzystnie na zdolność antygenu do reakcji immunologicznej z przeciwciałem docelowym w znaczącym stopniu. [000] Wynalazek nie ogranicza się do testów w fazie stałej, ale obejmuje również testy, które w całości lub w części przeprowadza się w fazie płynnej, na przykład testy w roztworze z kulkami. [001] W jednym z wykonań, antygeny mogą być znakowane ligandem, który ułatwiałby unieruchomienie, takim jak biotyna. Antygen może być rozcieńczony do odpowiedniego zakresu miareczkowania, a następnie umożliwia się jego reakcję z autoprzeciwciałami w próbkach od pacjentów w roztworze. Powstałe kompleksy immunologiczne mogą być unieruchamiane na podłożu stałym poprzez oddziaływanie ligand-receptor (np. biotyna-streptawidyna), a pozostała część testu przeprowadzana jak opisano poniżej. [002] Aby ułatwić wytwarzanie biotynylowanych antygenów polipeptydowych do zastosowania w sposobach przeprowadzania testu według wynalazku, cdna kodujące antygen polipeptydowy pełnej długości, jego skróconą wersję lub jego fragment antygenowy można wyrażać jako fuzję białkową wyznakowaną znacznikiem białkowym lub polipeptydowym, do którego kofaktor biotynowy może być dołączony poprzez reakcję enzymatyczną. Wektory do wytwarzania rekombinowanych biotynylowanych antygenów są dostępne handlowo z kilku źródeł. [003] Dodatkową zaletą stosowania podejścia miareczkowania krzyżowego z zastosowaniem biotynylowanych antygenów jest to, że w teście można odróżnić wiązanie składnika biotynowego z przeciwciałami anty-biotyna i prawdziwego wiązania antygenu ze swoim pokrewnym przeciwciałem. Twórcy zaobserwowali, że znaczna liczba populacji ludzkiej naturalnie wytwarza przeciwciała anty-biotyna, które mogą prowadzić do powstawania wyników fałszywie dodatnich w testach opartych na wykorzystaniu biotynylowanego antygenu. [004] Jak nadmieniono powyżej, test immunologiczny stosowany do wykrywania przeciwciał według wynalazku może być oparty na standardowych technikach znanych w tej dziedzinie, z tą różnicą, że wiele ilości antygenu stosuje się do wytworzenia serii miareczkowań, które można poddać reakcji z wieloma różnymi rozcieńczeniami wybranej badanej próbki. W najbardziej korzystnym wykonaniu testem immunologicznym może być ELISA. Testy ELISA są dobrze znane w tej dziedzinie. W typowym pośrednim teście ELISA antygen mający swoistość wobec przeciwciał badanych w teście jest unieruchamiany na stałej powierzchni (np. studzienkach standardowej płytki do mikromiareczkowania albo na powierzchni mikrokulek lub mikromacierzy) i próbkę zawierającą płyn ustrojowy, który ma być testowany pod kątem obecności przeciwciał, doprowadza się do kontaktu z unieruchomionym antygenem. Wszystkie przeciwciała o pożądanej swoistości obecne w próbce będą wiązać się z unieruchomionym antygenem. Kompleksy związanego przeciwciała/antygenu można następnie wykryć przy zastosowaniu dowolnej odpowiedniej metody. W jednym z korzystnych wykonań wyznakowane przeciwciało drugorzędowe anty-ludzka immunoglobulina, które rozpoznaje swoiście epitop wspólny dla jednej lub większej liczby klas ludzkich immunoglobulin, stosuje się do wykrywania kompleksów przeciwciało/antygen. Typowo, przeciwciałem drugorzędowym jest anty-igg lub anty-igm. Przeciwciało drugorzędowe jest zazwyczaj wyznakowane wykrywalnym markerem, typowo markerem enzymatycznym takim jak, na przykład, peroksydaza lub fosfataza alkaliczna, umożliwiającym wykrywanie ilościowe poprzez dodanie substratu dla enzymu, co generuje wykrywalny produkt, na przykład w produkt barwny, chemiluminescencyjny lub fluorescencyjny. Można zastosować inne rodzaje wykrywalnych znaczników znanych w tej dziedzinie. [00] Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania przeciwciał, które są markerami biologicznymi stanu chorobowego lub podatności na chorobę. Korzystne jest, jeżeli ten konkretny aspekt wynalazku wyklucza testy zaprojektowane do badania przeciwciał wytwarzanych w wyniku zastosowania protokołu prowokacji szczepionkowej lub immunizacji, innego niż szczepienie markerami nowotworowymi. A zatem korzystne jest, 11

13 2 3 4 jeżeli testy według tego aspektu wynalazku, korzystnie nie obejmują testów zaprojektowanych do badania pod kątem obecności przeciwciał anty-wirusowych lub anty-bakteryjnych po szczepieniu/immunizacji. [006] W niektórych wykonaniach wynalazku przeciwciałem może być autoprzeciwciało. Jak wskazano powyżej, termin autoprzeciwciało odnosi się do występującego naturalnie przeciwciała skierowanego wobec antygenu, który układ immunologiczny osobnika rozpoznaje jako obcy, mimo tego, że antygen rzeczywiście pochodzi z tego osobnika. Autoprzeciwciała obejmują przeciwciała skierowane przeciwko zmienionym formom występującego naturalnie białka wytwarzanym przez komórki chorobowe lub podczas procesu chorobowego. Zmieniona forma białka pochodzi z osobnika, ale może być postrzegana przez układ immunologiczny osobnika jako nie-własna, a zatem wzbudza odpowiedź immunologiczną u tego osobnika w postaci autoprzeciwciał swoistych immunologicznie wobec zmienionego białka. Takie zmodyfikowane formy białka mogą obejmować, na przykład, mutanty o zmienionej sekwencji aminokwasowej, czemu towarzyszą ewentualnie zmiany w strukturze drugorzędowej, trzeciorzędowej lub czwartorzędowej, formy skrócone, warianty składania, zmienione glikoformy itp. W innych wykonaniach autoprzeciwciało może być skierowane wobec białka, które ulega nadekspresji w stanie chorobowym, na przykład, jako wynik amplifikacji genu lub nieprawidłowej regulacji transkrypcji. Nadekspresja białka, z którym komórki układu odpornościowego nie stykają się normalnie w znaczących ilościach, może wywołać odpowiedź immunologiczną, prowadzącą do wytwarzania autoprzeciwciał. W jeszcze innych kolejnych wykonaniach autoprzeciwciało może być skierowane wobec płodowej formy białka, która zaczyna być wyrażana w stanie chorobowym. Jeśli białko płodowe, które jest zazwyczaj wyrażane tylko w początkowych stadiach rozwoju, zanim układ immunologiczny jest sprawny, zaczyna być wyrażana w stanie chorobowym, forma płodowa może być rozpoznawana przez układ immunologiczny jako obca, wywołując reakcję immunologiczną prowadzącą do wytwarzania autoprzeciwciał. [007] W jednym z wykonań przeciwciałem może być autoprzeciwciało swoiste wobec białka - markera nowotworowego, a w szczególności autoprzeciwciało przeciwnowotworowe związane z nowotworem. [008] Termin autoprzeciwciało przeciwnowotworowe związane z nowotworem odnosi się do autoprzeciwciała, która jest skierowane przeciwko epitopowi obecnemu na formach białek - markerów nowotworowych, które są preferencyjnie wyrażane w stanie choroby nowotworowej. Obecność tych autoprzeciwciał jest charakterystyczna dla stanu choroby nowotworowej lub predyspozycji do nowotworu u pacjentów bezobjawowych. [009] W korzystnych zastosowaniach, sposób według wynalazku będzie można stosować do wykrywania obecności autoprzeciwciał przeciwnowotworowych związanych z nowotworem w badanych próbkach od osób lub pacjentów ludzi (jakkolwiek sposób można zastosować wobec próbek pochodzących z innych ssaków, nie ludzi), a najkorzystniej, jeżeli będzie w formie testu immunologicznego in vitro, przeprowadzanego dla dwóch lub więcej rozcieńczeń badanej próbki zawierającej próbkę płynów ustrojowych pobraną od osobnika/pacjenta. Próbkę płynu ustrojowego można rozcieńczyć w dowolnym odpowiednim buforze i może być ona poddana traktowaniu dla długoterminowego przechowywania lub w inny sposób przed badaniem. [0060] Testy immunologiczne in vitro są nieinwazyjne i można je powtarzać tak często, jak uważa się za konieczne w celu sporządzenia profilu wytwarzania autoprzeciwciał u pacjenta, bądź przed wystąpieniem choroby, jak przy przeszukiwaniu osobników wysokiego ryzyka, bądź w trakcie przebiegu choroby (dyskutowane dalej poniżej w odniesieniu do korzystnych zastosowań sposobu). [0061] Konkretnie, ale bez ograniczania wykonania, sposoby według wynalazku mogą obejmować testy immunologiczne do (jednoczesnego) wykrywania dwóch lub więcej typów przeciwciał, z których każdy posiada swoistość wobec różnych epitopów na tych samych lub spokrewnionych białkach - markerach nowotworowych (np. różnych izoform lub wariantów kodowanych przez pojedynczy gen) lub wobec epitopów 12

14 2 3 na różnych białkach markerów nowotworowych (co oznacza białka kodowane przez różne geny). Sposoby te będą zazwyczaj obejmowały stosowanie panelu dwóch lub więcej zestawów antygenów, każdy z antygenów zazwyczaj pochodzący z innego białka - markera nowotworowego (różny w tym kontekście oznacza, że białka są produktami różnych genów), chociaż, jak wspomniano powyżej zestaw antygenów może również obejmować różne epitopy na tym samym białku - markerze nowotworowym. Zestaw antygenów odnosi się do jednego antygenu, który ma być badany w różnych ilościach/stężeniach w sposobie według wynalazku. Sposoby te, które mogą być dalej określane jako testy panelowe, wykorzystują panel dwóch lub większej liczby zestawów antygenów do śledzenia ogólnej odpowiedzi immunologicznej osobnika wobec nowotworu lub innej zmiany rakowej/nowotworowej. Te metody wykrywają zatem profil odpowiedzi immunologicznej u danego osobnika, wskazujący, które markery nowotworowe wzbudzają odpowiedź immunologiczną skutkującą wytwarzaniem autoprzeciwciał. Zastosowanie panelu dwóch lub więcej antygenów do śledzenia wytwarzania autoprzeciwciał wobec dwóch lub więcej różnych markerów nowotworowych jest zasadniczo bardziej czułe niż wykrywanie autoprzeciwciał wobec pojedynczych markerów i daje znacznie mniejszą częstość wyników fałszywie ujemnych (patrz WO 99/8978 i WO 04/04490, których treść jest tu włączona w całości jako odniesienie). [0062] A zatem w nieograniczającym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu wykrywania dwóch lub więcej przeciwciał w badanej próbce zawierającej płyn ustrojowy od osobnika-ssaka, gdzie co najmniej jednym z takich przeciwciał jest marker biologiczny stanu chorobowego lub podatności na chorobę, który to sposób obejmuje: (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń tej badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: (i) doprowadzenia do kontaktu rozcieńczenia badanej próbki z dwoma lub większą liczbą zestawów antygenów, gdzie każdy z tych zestawów antygenów jest swoisty wobec jednego z tych przeciwciał, które mają być wykrywane w badanej próbce, i gdzie każdy zestaw antygenów zawiera wiele różnych ilości tego samego antygenu, (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu w każdym zestawie użytym w etapie (i), (b) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki w każdym zestawie użytym w etapie (a), gdzie na obecność w badanej próbce przeciwciała wykazującego reakcję z dowolnym zestawu antygenów zastosowanych w teście wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki z tym zestawem antygenów. [0063] W jednym wykonań tego sposobu każdy z tych dwóch lub większej liczby przeciwciał będzie markerem biologicznym stanu chorobowego lub podatności na choroby, jednak jest w zakresie wynalazku kojarzenie testu miareczkowania krzyżowego dla antygenu markera chorobowego z testem miareczkowania krzyżowego dla innego rodzaju przeciwciała, które może być lub może nie być markerem chorobowym, w tej samej badanej próbce. [0064] W każdym przypadku ocena, czy odpowiednie przeciwciała są lub nie są obecne w badanej próbce opiera się na ilości swoistego wiązania obserwowanego dla każdego z różnych stężeń antygenu w stosunku do każdego z różnych antygenów w teście, innymi słowy zbiorczych wartości dla każdego antygenu, a nie jednego odczytu dla jednego stężenia każdego antygenu. A zatem ustalenie obecności lub nieobecności stanu chorobowego lub podatności na chorobę opartej na obecności dwóch lub więcej rodzajów przeciwciała w próbce pacjenta może opierać się na tych wartościach zbiorczych dla każdego antygenu. Korzystnie, jeżeli oceny dokonuje się na podstawie wykazania krzywej zasadniczo S-kształtnej lub sigmoidalnej dla co 13

15 2 3 4 najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki w stosunku do dowolnego lub wszystkich antygenów obecnych w teście. [006] Dla uniknięcia wątpliwości, testy oparte na stosowaniu jednego typu antygenu w celu wykrycia przeciwciał mogą być tu określane jako testy z pojedynczym markerem, natomiast testy na podstawie zastosowania panelu dwóch lub więcej antygenów są określane jako testy panelowe. [0066] W korzystnym wykonaniu sposobu przeprowadzania testu panelowego, co najmniej jeden, a korzystnie wszystkie przeciwciała wykrywane w teście są autoprzeciwciałami reaktywnymi wobec białek - markerów nowotworowych. [0067] Testy miareczkowania krzyżowego według wynalazku można zaadaptować do stosowania przy wykrywaniu przeciwciał wobec zasadniczo dowolnego białka - markera nowotworowego, dla którego można otrzymać odpowiedni antygen, jako test jednomarkerowy albo jako składnik testu panelowego. Konkretnie, sposób można zaadaptować do wykrywania/mierzenia autoprzeciwciał swoistych immunologicznie do dowolnej lub jakiejkolwiek kombinacji dwóch lub większej liczby następujących białek - markerów nowotworowych, poprzez zastosowanie odpowiednich antygenów: Białko receptorowe naskórkowego czynnika wzrostu protein EGFR (ang. epidermal growth factor receptor) (Downward i wsp. (1984) Nature. 7: 21-27; Robertson i wsp. (01) Archives of Pathology and Laboratory Medicine 126;177-81); MUC1 (Batra, S. K. i wsp. (1992) Int. J. Pancreatology. 12: ); Myc (c-myc) (Blackwood, E. M. i wsp. (1994) Molecular Biology of the Cell : ); p3 (Matlashewski, G. i wsp. (1984) EMBO J. 3: ; Wolf, D. i wsp. (198) Mol. Cell. Biol. : ); ras (lub Ras) (Capella, G. i wsp. (1991) Environ Health Perspectives. 93: ); BRCA1 (Scully, R. i wsp. (1997) PNAS 94: 60-); BRCA2 (Sharan, S. K. i wsp. (1997) Nature. 386: 804-8); APC (Su, L. K. i wsp. (1993) Cancer Res. 3: ; Munemitsu, S. i wsp. (199) PNAS 92: 46-0); CA12 (Nouwen, E. J. i wsp. (1990) Differentiation. 4: 192-8; Norum L. F. i wsp., Tumour Biol. 01 Lipsierp.; 22(4):223-8; Perey L. i wsp., Br J Cancer. Paźdź. 1990; 62(4):668-70; Devine P. L. i wsp., Anticancer Res. Maj-czer. 1992;12(3):709-17); PSA (Rosenberg, R. S. i wsp. (1998) Biochem Biophys Res Commun. 248: ); Antygen kanceroembrionalny CEA (ang. carcinoembryonic antigen) (Duffy, M. J. (01) Clin Chem, kwiec. 47 (4): 624-); CA19.9 (Haga, Y. i wsp. (1989) Clin Biochem (1989) 22 paźdź. (): 363-8); NY-ESO-1 (antygen nowotworowy/jądrowy; Chen, Y.-T. i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 94: , 1997); PSMA (antygen błonowy swoisty dla prostaty, ang. prostate specific membrane antigen; Israeli, R. S. i wsp., Cancer Res. 3: 227-2, 1993); PSCA (antygen komórek macierzystych prostaty, ang. prostate stem cell antigen; Reiter, R. E. i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 9: , 1998); EpCam (nabłonkowa cząsteczka adhezji komórkowej, ang. epithelial cellular adhesion molecule; Szala, S. i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: , 1990); HER2-neu (znany również jako c-erbb2) (Coussens, L. i wsp., Science 2: , 198); EDC6, który jest alternatywną nazwą dla domeny zewnątrzkomórkowej HER2; CAGE (Jager D. i wsp., Cancer Res. grudz. 1999; 9(24):6197-4; Mashino K. i wsp., Br J Cancer. 1 wrz. 01; 8():713-); 14

16 2 3 Cytokeratyny (Moll R. i wsp., Cell List.; 31(1):11-24; Braun S. i wsp., N Engl J Med. 00; 342: 2-33). Termin cytokeratyna jest stosowany jako nazwa rodzajowa w odniesieniu do dowolnego przedstawiciela rodziny cytokeratyn, dla którego odpowiednie autoprzeciwciała działają jako markery nowotworowe. Korzystnymi przykładami są cytokeratyny /14, 8/18 (Kim M. J., Ro J. Y., Ahn S. H., Kim H. H., Kim S. B., Gong G. Hum Pathol. 06 Wrz.; 37(9): Epub, lip ); cytokeratyny 7, (Vang R., Gown A. M., Barry T. S., Wheeler D. T., Yemelyanova A., Seidman J. D., Ronnett B. M. Am J Surg Pathol. Wrz. 06; (9): ) i cytokeratyny 8/18/19 (Barak V., Goike H., Panaretakis K. W., Einarsson R. Clin Biochem. Lip. 04; 37(7):29-). Rekoweryna (Maeda A. i wsp., Cancer Res. 1 kwiec. 00; 60(7):1914-); Kalikreiny (Kim H. i wsp., Br J Cancer 01;84:643-60; Yousef G. M. i wsp., Tumor Biol 02; 23:18-192). Termin kalikreina jest stosowany jako nazwa rodzajowa w odniesieniu do dowolnego przedstawiciela rodziny kalikrein, dla którego odpowiednie autoprzeciwciała działają jako markery nowotworowe. Korzystnymi przykładami są kalikreina 1 do (KLK 1-/Hk1-Hk) (Obiezu C. V., Diamandis E. P. Cancer Lett czerw.; 224(1):1-22; Diamandis E. P., Yousef G. M. Clin Chem. Sierp. 02; 48(8):1198-), a w szczególności KLK 4-7 (Prezas P., Arlt M. J., Viktorov P., Soosaipillai A., Holzscheiter L., Schmitt M., Talieri M., Diamandis E. P., Kruger A., Magdolen V. Biol Chem. Czerw. 06; 387(6):807-11; Diamandis E. P., Yousef G. M., Luo L. Y., Magklara A., Obiezu C. V. The new human kallikrein gene family: implications in carcinogenesis. Trends Endocrinol Metab. Mar. 00; 11(2):4-60. Praca przeglądowa.); Aneksyny (Hudelist G. i wsp., Breast Cancer Res Treat. Sier. 04, 86 (3):281-91; Gerke, V. & Moss, S. E. Physiological Reviews 02 82: ). Termin aneksyna jest stosowany jako nazwa rodzajowa w odniesieniu do dowolnego przedstawiciela rodziny aneksyn, dla którego odpowiednie autoprzeciwciała działają jako markery nowotworowe. Korzystnymi przykładami są aneksyna 1 i 2 (Pedrero, J. M. G., Fernandez, M. P., Morgan, O., Zapatero, A. H., Gonzalez, M. V., Nieto, C. S. & Rodrigo, J. P. American Journal of Pathology (1): 73-79; Brichory, F. M., Misek, D. E., Yim, A., Krause, M. C., Giordano, T. J., Beer, D. G., Hanash, S. M. 01 Medical Sciences 98(17): ) oraz aneksyna XI-A (Fernández-Madrid, F., Tang, N., Alansari, H., Granda, J. L., Tait, L., Amirikia, K. C., Moroianu, M., Wang, X. & Karvonen, R. L. Cancer Research 04 64: ); α-fetoproteina (AFP) (Stiller D. i wsp., Acta Histochem Suppl. 1986; 33:22-31); GRP78 (Block T. M. i wsp., Proc Natl Acad Sci USA. 18 stycz. 0; 2(3):779-84; Hsu W. M. i wsp., Int J Cancer. 1 mar. 0; 113(6):9-7); Mammaglobina (Zehentner B. K. i wsp., Clin Chem. 04 List; 0(11):69-76; Zehentner B. K., Carter D. Clin Biochem. Kwiec. 04; 37(4):249-7); raf (Callans L. S. i wsp., Ann Surg Oncol. Stycz. 199; 2(1):38-42; Pratt M. A. i wsp., Mol Cell Biochem. Grudz. 1998; 189(1-2):119-2); Ludzka gonadotropina kosmówkowa beta (b-hcg, ang. human chorionic gonadotropin) (Ayala A. R. i wsp., Am J Reprod Immunol Kwiec.-maj;3(3):149-1; Gregory J. J. Jr i wsp., Drugs Kwiec.; 7(4):463-7); Antygen 4- (Krause P. i wsp., J Immunol Methods. 03 Grud.; 283(1-2):261-7); NY-BR-1 (Jage D., Stockert E., Gure A. O., Scenlan M. J., Karbach J., Jage E., Knuth A., Old L. J., Chen Y. T. (01) Identification of a tissue-specific putative transcription factor in breast tissue by serological screening of a breast cancer library. Cancer Res 61 (): -61); Liwina (Kasof G. M., Gomes B. C. (01) Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family. J Biol Chem, 276 (): );

17 2 3 4 Surwiwina (Ambrosini G., Adida C., Altieri D. C. (1997) A novel anti-apoptois gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nature Med, 3 (8): ); MUC2 (glikoproteina) (Griffiths B., Matthews D. J., West L., Attwood J., Povey S., Swallow D. M., Gum J. R., Kim Y. S. (1990) Assignment of the polymorphic intestinal mucin gene MUC2 to chromosome-11p. Ann Hum Genet, 4: 277-8). Endostatyna (Standker L., Schrader M., Kanse S. M., Jurgens M., Forssmann W. G., Preissner K. T. (1997) Isolation and characterisation of the circulating form of human endostatin. FEBS Lett, 4 (2-3): ); Bcl-2 (Tsujimoto Y., Croce C. M. (1986) Analysis of the structure, transcripts, and protein products of Bcl- 2, the gene involved in human follicular lymphoma. PNAS USA, 83 (14): 214-8); BIRC7 (Wu H. Y., Ma Y. H., Zhu Y. K, Shen Y., Gu C. M., Ye Z. Y., Lin H. L. (06) The expression of BIRC7 protein and mrna in non-hodgkin's lymphoma. Leukemia & Lymphoma 47 (6): 11-6); [0068] Białka szoku cieplnego (termin białka szoku cieplnego jest stosowany jako nazwa rodzajowa w odniesieniu do dowolnych białek szoku cieplnego, dla których odpowiednie autoprzeciwciała działają jako markery nowotworowe), obejmujące, ale nie wyłącznie: HSP70 (Tauchi K., Tsutsumi Y., Hori S., Yoshimura S., Osamura R. Y., Watanabe K. (1991) Expression of heat shock protein-70 and c-myc protein in human breast-cancer - an immunohistochemical study. Jap J Clin Oncol, 21 (4): 26-63), HSP27 (Differential expression of alphab-crystallin and Hsp27-1 in anaplastic thyroid carcinomas because of tumor-specific alphab-crystallin gene (CRYAB) silencing. Mineva I., Gartner W., Hauser P., Kainz A., Loffler M., Wolf G., Oberbauer R., Weissel M., Wagner L. Cell Stress Chaperones. 0 Jesień; (3:171-84); oraz CRYAB (Seitz S., Korsching E., Weimer J., Jacobsen A., Arnold N., Meindl A., Arnold W., Gustavus D., Klebig C., Petersen I., Scherneck S. Genes Chromosomes Cancer. 06 Czerw.; 4(6):612-27). [0069] No (Fossa A., Siebert R., Aasheim H. C., Maelandsmo G. M., Berner A., Fossa S. D., Smeland E. B., Gaudernack G. (00) Identification of a nucleolar protein No as a tumour-associated auto-antigen in patients with prostate cancer. Br J Cancer 83 (6): 743-9). [0070] Aktywator plazminogenu typu urokinazy (upa, ang. Urokinase-type Plasminogen Activator) (Booyse F. M., Osikowicz G., Feder S., Scheinbuks J. (1984) Isolation and characterisation of a urokinase-type plasminogen activator (MR = 4,000) from cultures human epithelial cells indistinguishable from urinary urokinase. J Biol Chem 29 (11): 7198-); [0071] Tetranektyna (białko wiążące plazminogen) (Clemmensen I., Petersen L. C., Kluft C. (1986) Purification and characterization of a novel, Oligomeric, Plasminogen Kringle 4 binding-protein from human plasma - Tetranectin. Eur J Biochem 6 (2): ); [0072] Prolaktyna (Riddle O., Bates R. W., Dykshorn S. W. (1933) The preparation, identification and assay of prolactin - A hormone of the anterior pituitary. Am J Physiol (1): ); [0073] Osteopontyna (Butler W. T., Martin T. J., Raisz L. G., Slavkin H. C., Termine J. D., Rodan G. A., Veis A. (1988) Osteopontin - Structure and biological activity. CBA Foundation Symposia 136: 3-6; Kiefer M. C., Bauer D. M., Barr P. J. (1989) The cdna and derived amino-acid sequence for human osteopontin. Nucleic Acids Res 17 (8): 36-36); [0074] Białko swoiste dla ludzkich nadjądrzy (HE4) Kirchoff C., Habben I., Ivell R., Krull N. (1991) A major human epididymis-specific cdna encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinaseinhibitors. Biology of Reproduction 4 (2): -37); [007] Związany z nowotworem inhibitor trypsyny (TATI, ang. Tumour Asscociated Trypsin Inhibitor) (Huhtala M. L., Kahanpaa K., Seppala M., Halila H., Stenman U. H. (1983) Excretion of a tumour associated trypsin-inhibitor (TATI) in urine of patients with Gynecological Malignancy. Int J Cancer 31 (6): , 1983; 16

18 2 3 4 [0076] Inhibina (Chari S., Hopkinson C. R. N., Fritze E., Sturm G., Hirschhauser C. (1977) Partial-Purification of Inhibin from Human Testicular Extracts. ACTA Endocrinologia 8 (Suppl 212): 2-219); [0077] Wimentyna (Yang Y. C., Li X., Chen W. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 06 Wrz.; 38(9):602- ); [0078] Cox-1 i Cox-2 (Xu Z., Choudhary S., Voznesensky O., Mehrotra M., Woodard M., Hansen M., Herschman H., Pilbeam C. Cancer Res. 1 lip. 06; 66(13):667-64; Cervello M., Montalto G. World J Gastroenterol. 28 sierp. 06; 12(28): ). [0079] Będzie docenione, że wynalazek nie ma ograniczać się do wykrywania autoprzeciwciał wobec konkretnych markerów nowotworowych, wymienionych powyżej jedynie na drodze przykładu. [0080] Sposoby przeprowadzania testów według wynalazku oparte na wykrywaniu autoprzeciwciał przeciw markerom nowotworowym (w postaci testu jednomarkerowego lub panelowego) mogą być stosowane w wielu różnych sytuacjach klinicznych. W szczególności, sposób można stosować przy wykrywaniu lub diagnozowaniu nowotworu u osobników ludzi z objawami lub bez objawów, przy dokonywaniu prognozy dla pacjenta, u którego zdiagnozowano nowotwór, przy przewidywania odpowiedzi na leczenie, przy monitorowaniu postępów raka lub innych chorób nowotworowych u pacjenta, przy wykrywaniu wczesnej zmiany nowotworowej lub wczesnej zmiany rakotwórczej u osobnika człowieka bez objawów, przy badaniach przesiewowych populacji osobników ludzi bez objawów w celu bądź identyfikacji tych pacjentów, którzy są w grupie podwyższonego ryzyka rozwinięcia się nowotworu, bądź zdiagnozowania obecności nowotworu, przy przewidywaniu odpowiedzi pacjenta z nowotworem na leczenie przeciwnowotworowe (np. szczepienie, terapie przeciw-czynnikowi wzrostu lub przekazywaniu sygnału, radioterapię, leczenie hormonalne, leczenie przeciwciałami ludzkimi, chemioterapię), przy wykrywaniu nawrotu choroby u pacjenta wcześniej zdiagnozowanego jako mającego nowotwór, który został poddany leczeniu przeciwnowotworowemu w celu zmniejszenia ilości obecnego nowotworu lub przy wyborze terapii przeciwnowotworowej (np. szczepionki, terapii przeciw-czynnikowi wzrostu lub przekazywaniu sygnału, radioterapii, leczenia hormonalnego, leczenia przeciwciałami ludzkimi, chemioterapii), do stosowania u konkretnego pacjenta. [0081] Twórcy zaobserwowali zasadniczo, że poziomy autoprzeciwciał związanych nowotworem wykazują dodatnią korelację ze stanem chorobowym (patrz również WO 99/8979). A zatem, kiedy sposób według wynalazku stosuje się w zastosowaniach klinicznych, zwiększone poziomy autoprzeciwciał przeciw markerom nowotworowym, w porównaniu do odpowiednich kontroli, na ogół przyjmuje się za wskaźnik nowotworowego stanu chorobowego, o ile nie zaznaczono tu, że jest inaczej. [0082] Kiedy testy immunologiczne stosuje się przy diagnozowaniu nowotworu u jednostki ludzkiej (z objawami lub bez objawów nowotworu), obecność podwyższonego poziomu autoprzeciwciał, w porównaniu z normalnymi osobami kontrolnymi, jest zwykle przyjmowane jako wskazanie, że ta osoba ma nowotwór. Korzystne jest, jeżeli normalne osoby kontrolne będą kontrolami pasującymi wiekowo, nie mającymi żadnego rozpoznania nowotworu na podstawie kryteriów klinicznych, obrazowania i/lub biochemicznych. Szczególnie przydatnym zastosowaniem tego sposobu jest badanie osób, którzy już przejawiają objawy nowotworu (np. na podstawie kryteriów klinicznych, obrazowania i/lub biochemicznych), aby pomóc w dokonaniu lub potwierdzeniu rozpoznania nowotworu. [0083] Kiedy testy immunologiczne stosuje się przy przewidywaniu odpowiedzi pacjenta z nowotworem na leczenie przeciwnowotworowe (np. szczepienie, terapie przeciw-czynnikowi wzrostu lub przekazywaniu sygnału, radioterapię, leczenie hormonalne, leczenie przeciwciałami ludzkimi, chemioterapię), obecność podwyższonego poziomu autoprzeciwciał, w porównaniu z normalnymi osobami kontrolnymi, można przyjąć jako wskazanie, czy dana osoba prawdopodobne będzie, czy nie odpowiadać na leczenie przeciwnowotworowe. Korzystne jest, jeżeli normalne osoby kontrolne będą kontrolami pasującymi 17

19 2 3 4 wiekowo, nie mającymi żadnego rozpoznania nowotworu na podstawie kryteriów klinicznych, obrazowania i/lub biochemicznych. Dla każdego ze sposobów leczenia wymienionych powyżej, zależność pomiędzy poziomem autoprzeciwciał w porównaniu do kontroli i prawdopodobne powodzenie leczenia można ustalić poprzez obserwację wyniku takiego leczenia u pacjentów, u których status autoprzeciwciał jest monitorowany w trakcie leczenia. Wcześniej ustaloną zależność można następnie wykorzystać do przewidywania prawdopodobieństwa powodzenia dla każdego leczenia u danego pacjenta na podstawie oceny statusu autoprzeciwciał. [0084] Kiedy testy immunologiczne stosuje się przy monitorowaniu postępu raka lub innej choroby nowotworowej u pacjenta, obecność podwyższonego poziomu autoprzeciwciał, w porównaniu z normalnymi osobami kontrolnymi, przyjmuje się jako wskazanie obecności nowotworu u pacjenta. Normalną kontrolą mogą być poziomy autoprzeciwciał obecnych u jednostek kontrolnych, korzystnie dopasowanych wiekowo, nie mających żadnego rozpoznania nowotworu na podstawie kryteriów klinicznych, obrazowania i/lub biochemicznych. Alternatywnie, normalną kontrolą może być poziom podstawowy wyznaczony dla danego pacjenta poddanego badaniu. Poziomem podstawowym może być, na przykład, poziom przeciwciał obecnych przy dokonywaniu pierwszej diagnozy nowotworu, bądź diagnozy nawrotu nowotworu. Dowolny wzrost ponad poziom podstawowy byłby przyjmowany jako wskazanie skuteczności terapii. Kierunek zmiany (tj. wzrost vs spadek) wskazujący na pozytywną odpowiedź na leczenie będzie zależał od dokładnego charakteru leczenia. Dla dowolnego danego leczenia kierunek zmiany poziomu autoprzeciwciał wskazujący na efekt pozytywny można łatwo określić, na przykład poprzez monitorowanie stężenia autoprzeciwciał w porównaniu do innych wskaźników klinicznych lub biochemicznych odpowiedzi na leczenie. [008] Kiedy testy immunologiczne stosuje się przy badaniach przesiewowych populacji bezobjawowych osobników ludzi, może to być w celu zidentyfikowania tych osobników, którzy są narażeni na ryzyko rozwinięcia się nowotworu - osoby mające podwyższony poziom autoprzeciwciał, w porównaniu z normalnymi osobami kontrolnymi, identyfikuje się narażone na ryzyko rozwoju nowotworu. Korzystne jest, jeżeli normalne osoby kontrolne będą kontrolami pasującymi wiekowo, nie zidentyfikowanymi jako mające jakiekolwiek predyspozycje do rozwoju nowotworu lub jakiegokolwiek znacząco podwyższone ryzyko rozwoju nowotworu. Wyjątkiem może być sytuacja, kiedy sam wiek jest głównym czynnikiem ryzyka. [0086] Kiedy testy immunologiczne stosuje się przy badaniach przesiewowych populacji bezobjawowych osobników ludzi może to być w celu zdiagnozowania nowotworu u tych pacjentów, u których już rozwinął się nowotwór - osoby mające podwyższony poziom autoprzeciwciał, w porównaniu z normalnymi osobami kontrolnymi, uznaje się jako mające raka lub inną postać zmiany nowotworowej. Korzystne jest, jeżeli normalne osoby kontrolne będą kontrolami pasującymi wiekowo, nie zidentyfikowanymi jako mające jakiekolwiek predyspozycje do rozwoju nowotworu lub jakiegokolwiek znacząco podwyższone ryzyko rozwoju nowotworu. Wyjątkiem może być sytuacja, kiedy sam wiek jest głównym czynnikiem ryzyka. Alternatywnie, normalną kontrolą może być poziom podstawowy wyznaczony dla danego pacjenta poddanego badaniu. Poziomem podstawowym może być, na przykład, poziom autoprzeciwciał obecnych, kiedy pacjent był badany po raz pierwszy i stwierdzono, że ma poziomy nie przewyższające normalnej kontroli dla populacji. Każdy późniejszy wzrost względem tego pomiaru podstawowego byłby przyjmowany jako wskazanie obecności nowotworu u tej osoby. Zatem osoba mogłaby dzięki takiemu testowi podstawowemu stać się swoją własną kontrolą dla przyszłych pomiarów autoprzeciwciał. [0087] Kiedy testy immunologiczne stosuje się przy monitorowaniu odpowiedzi pacjenta z nowotworem na leczenie przeciwnowotworowe (np. szczepienie, terapie przeciw-czynnikowi wzrostu lub przekazywaniu sygnału, radioterapię, leczenie hormonalne, leczenie przeciwciałami ludzkimi, chemioterapię), obecność podwyższonego poziomu autoprzeciwciał po leczeniu przyjmuje się jako wskazanie, że pacjent pozytywnie 18

20 2 3 4 odpowiedział na leczenie. Poziom podstawowy autoprzeciwciał pobranych przed rozpoczęciem leczenia może być wykorzystywany do celów porównawczych w celu ustalenia, czy leczenie skutkuje wzrostem lub spadkiem poziomów autoprzeciwciał. Zmiana poziomu autoprzeciwciał byłaby przyjmowana jako wskazanie skuteczności terapii. Kierunek zmiany (tj. wzrost vs spadek) wskazujący na pozytywną odpowiedź na leczenie będzie zależał od dokładnego charakteru leczenia. Dla dowolnego danego leczenia kierunek zmiany poziomu autoprzeciwciał wskazujący na efekt pozytywny można łatwo określić, na przykład poprzez monitorowanie stężenia autoprzeciwciał w porównaniu do innych wskaźników klinicznych lub biochemicznych odpowiedzi na leczenie. [0088] Sposób według wynalazku może być stosowany przy przewidywaniu i/lub monitorowaniu odpowiedzi osobnika na zasadniczo dowolne znane leczenie przeciwnowotworowe. Obejmuje to, na przykład leczenie przeciwciałami ludzkimi, gdzie przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne podaje się poprzez wlew pacjentowi nieograniczającym konkretnym przykładem jest leczenie przeciwciałem przeciw czynnikowi wzrostu Herceptin (Baselga, J., D. Tripathy i wsp., J Clin Oncol., 14(3), , 1996). Obecność naturalnej odpowiedzi autoprzeciwciałowej może zwiększyć lub zahamować skuteczność leczenia sztucznie wlewanymi przeciwciałami terapeutycznymi. Stosując sposób według wynalazku możliwe jest skorelowanie odpowiedzi na dowolne leczenie przeciwnowotworowe, w tym terapii przeciwciałami, z naturalnymi poziomami przeciwciał przed i w trakcie leczenia dowolnego pacjenta lub grupy pacjentów. Wiedzę tę można następnie z kolei wykorzystać do przewidywania, jak inni pacjenci (lub ten sam pacjent w przypadku powtarzanego leczenia) będzie reagować na to samo leczenie. [0089] Kiedy testy immunologiczne stosuje się przy wykrywaniu nawrotu choroby, obecność podwyższonego poziomu autoprzeciwciał, w porównaniu z normalnymi osobami kontrolnymi, przyjmuje się jako wskazanie nawrotu choroby. Normalną kontrolą mogą być poziomy autoprzeciwciał obecnych u jednostek kontrolnych, korzystnie dopasowanych wiekowo, nie mających żadnego rozpoznania nowotworu na podstawie kryteriów klinicznych, obrazowania i/lub biochemicznych. Alternatywnie, normalną kontrolą może być poziom podstawowy wyznaczony dla danego pacjenta poddanego badaniu. Poziomem podstawowym może być, na przykład, poziom przeciwciał obecnych w okresie remisji choroby na podstawie kryteriów klinicznych, obrazowania i/lub biochemicznych. [0090] Sposób przeprowadzania testu według wynalazku można stosować do wykrywania wielu różnych rodzajów nowotworów, których przykładami są raki piersi, pęcherza, okrężnicy, prostaty, płuc, trzustki i jajnika. Testy mogą uzupełniać istniejące sposoby przeprowadzania testów przesiewowych i kontroli. Na przykład, w przypadku pierwotnego raka piersi testy immunologiczne dla autoprzeciwciał można by zastosować do zaalarmowania klinicystów, aby wykonali biopsję małych zmian na mammografach, które radiologicznie nie wydają się podejrzane lub przeprowadzenia obrazowania piersi lub powtórzenia obrazowania wcześniej niż planowano. Można się spodziewać, że w postępowaniu klinicznym sposoby przeprowadzania testu według wynalazku będą bardziej obiektywne i powtarzalne w porównaniu z obecnymi technikami obrazowania (tj. mammografią i ultradźwiękami), gdzie sukces może zależeć od operatora. [0091] Testy panelowe (ang. panel assays) można dostosować do konkretnego zastosowania klinicznego. Panel antygenów do wykrywania autoprzeciwciał wobec co najmniej p3 i HER2-neu (c-erbb2) jest szczególnie przydatny dla wielu typów nowotworów i może być ewentualnie uzupełniony innymi markerami o znanym powiązaniu z konkretnym nowotworem lub stadium konkretnego nowotworu, które ma być wykrywane. Na przykład w przypadku raka piersi panel mógłby dodatkowo zawierać MUC 1 i/lub c-myc i/lub BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub PSA i/lub mammaglobinę i/lub EpCam i/lub EGFR i/lub cytokeratyny i/lub NY-ESO- 1 i/lub NY-BR-1 i/lub aneksynę 11A i/lub surwiwinę, podczas gdy dla raka pęcherza panel mógłby ewentualnie zawierać MUC 1 i/lub c-myc, dla raka jelita RAS i/lub APC i/lub MUC2, dla na raka prostaty PSA i/lub BRCA 1 i/lub BRCA2 i/lub p62, dla raka jajnika BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub CA12 i/lub beta-hcg i/lub 19

21 2 3 4 kallikreiny i/lub APC i dla raka płuc liwinę i/lub surwiwinę i/lub EpCam i/lub rekowerynę i/lub cytokeratyny i/lub 1-myc i/lub CEA i/lub MUC 1 i/lub rekowerynę, dla raka wątrobowokomórkowego AFP i/lub beta HCG i/lub gp78 i/lub p62 i/lub surwiwinę. Istnieją inne korzystne wykonania, w których p3 lub HER2-neu nie są absolutnie niezbędne. [0092] W przypadku raka piersi odpowiednie panele mogłyby być wybrane spośród następujących: [0093] p3 i MUC 1 z opcjonalnym HER2-neu i/lub c-myc, i/lub BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub PSA i/lub NY- ESO-1 i/lub NY-BR-1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub EpCam; p3 i c-myc, ewentualnie z HER2-neu i/lub BRCA1 i/lub MUC1 i/lub BRCA2 i/lub PSA i/lub NY- ESO-1 i/lub NY-BR 1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub z EpCam; p3 i BRCA1, ewentualnie z c-erb2 i/lub MUC 1 i/lub C-myc i/lub BRCA2 i/lub PSA i/lub NY- ESO-1 i/lub NY-BR-1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub z EpCAM; p3 i BRCA2, ewentualnie z HER2-neu i/lub MUC 1 i/lub c-myc i/lub BRCA1 i/lub PSA i/lub NY-ESO-1 i/lub NY-BR-1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub EpCam; HER2-neu i MUC 1, ewentualnie z p3 i/lub c-myc i/lub BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub PSA i/lub NY-ESO-1 i/lub NY-BR-1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub EpCam; HER2-neu i c-myc, ewentualnie z p3 i/lub MUC1 i/lub BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub PSA i/lub NY-ESO-1 i/lub NY-BR-1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub EpCam; HER2-neu i BRCA1, ewentualnie z p3 i/lub MUC 1 i/lub c-myc i/lub BRCA2 i/lub PSA i/lub NY-ESO-1 i/lub NY-BR-1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub EpCam; HER2-neu i BRCA2, ewentualnie z p3 i/lub MUC 1 i/lub c-myc i/lub BRCA1 i/lub PSA i/lub NY-ESO-1 i/lub NY-BR-1 i/lub EpCam i/lub mammaglobina i/lub surwiwina i/lub aneksyna 11A i/lub cytokeratyny i/lub EpCam. Takie panele mogą również zawierać p3 i/lub c-myc i/lub NY-ESO-1 i/lub BRCA2. [0094] W przypadku raka jelita grubego odpowiednie panele mogą być wybrane na przykład spośród następujących: [009] p3 i ras, ewentualnie z HER2-neu i/lub APC i/lub MUC 2; p3 i APC, ewentualnie z HER2-neu i/lub Ras i/lub MUC2; Ras i APC, ewentualnie z p3 i/lub HER2-neu i/lub MUC2. Takie panele mogą również zawierać CEA i/lub CA19-9. [0096] W przypadku raka prostaty odpowiednie panele mogą być wybrane na przykład spośród następujących: p3 i PSA, ewentualnie z BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub HER2-neu i/lub P62; HER2-neu i PSA, ewentualnie z p3 i/lub BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub P62. [0097] Takie panele mogą również zawierać PSMA i/lub PSCA i/lub kalikreiny. [0098] W przypadku raka jajnika odpowiednie panele mogą być wybrane na przykład spośród następujących: p3 i CA12, ewentualnie z HER2-neu i/lub BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub APC; HER2-neu i CA12, ewentualnie z p3 i/lub BRCA1 i/lub BRCA2 i/lub APC. [0099] Takie panele mogą również zawierać aneksyny i/lub CAGE i/lub antygen 4-. [00] W przypadku raka płuc, odpowiednie panele mogą być wybrane spośród następujących: p3 i NY-ESO-1, ewentualnie z dalszymi markerami; HER2, aneksyny, liwina, surwiwina, rekoweryna, MUC 1, c-myc, 1-myc, CEA, beta HCG, CAGE i antygen 4-. [01] Tam gdzie sposób według wynalazku jest stosowany do przeprowadzenia testu panelowego opartego na dwóch lub więcej antygenach - markerach nowotworowych pochodzących z różnych białek, co najmniej jeden z tych antygenów w panelu musi być badany w teście miareczkowania krzyżowego według

22 2 3 4 wynalazku opartym na badaniu dwóch lub większej liczby rozcieńczeń badanej próbki wobec wielu różnych ilości antygenu, z wytworzeniem serii krzywych miareczkowania, po jednej dla każdego zastosowanego rozcieńczenia badanej próbki. Korzystnie każdy z antygenów tworzących panel jest testowany zgodnie z testem miareczkowania krzyżowego według wynalazku, a serie krzywych miareczkowania wykreślone/obliczone dla każdego pojedynczego antygenu w panelu. [02] Wynalazek bierze również pod uwagę, że test miareczkowania krzyżowego do wykrywania co najmniej jednego przeciwciała przeciw markerowi nowotworowemu może być stosowany łącznie z testem zaprojektowanym do wykrywania co najmniej jednego białka - markera nowotworowego (które może być związane lub niezwiązane z antygenem użytym w teście miareczkowania krzyżowego) w tej samej próbce od pacjenta. A zatem testy dla autoprzeciwciał przeciw markerom nowotworowym i testy dla białek - markerów nowotworowych można przeprowadzać równolegle dla jednej próbki pacjenta. [03] W dalszym wykonaniu, sposób przeprowadzania testu immunologicznego według wynalazku można stosować przy wyborze szczepionki przeciwnowotworowej do zastosowania u danego pacjenta. W tym wykonaniu próbkę płynu ustrojowego pobranego od pacjenta bada się przy użyciu panelu dwóch lub więcej antygenów, z których każdy odpowiada różnym białkom - markerom nowotworowym w celu określenia względnej siły odpowiedzi immunologicznej pacjenta wobec każdego z różnych białek - markerów nowotworowych. Siła odpowiedzi immunologicznej wobec danego białka lub białek - markerów nowotworowych wskazuje na obecność i/lub ilość autoprzeciwciał powiązanych z nowotworem swoistych wobec tego białka markera nowotworowego wykrywanego przy zastosowaniu testu immunologicznego; tam gdzie autoprzeciwciała oznacza się ilościowo, im większy poziom autoprzeciwciał powiązanych z nowotworem, tym silniejsza odpowiedź immunologiczna. Białko lub białka markerów nowotworowych zidentyfikowane jako wywołujące najsilniejszą odpowiedź immunologiczną lub silne odpowiedzi u pacjenta (tj. najwyższy poziom autoprzeciwciał) jest lub są następnie wybierane dla stworzenia podstawy szczepionki przeciwnowotworowej do zastosowania u pacjenta. [04] Przydatność sposobu według wynalazku nie ogranicza się do wykrywania autoprzeciwciał przeciwnowotworowych, chociaż test jest szczególnie przydatny do tego celu. Nowotwór jest tylko jednym z przykładów wykrywania choroby, gdzie wykrywanie autoprzeciwciał może być stosowane jako marker biologiczny stanu chorobowego/podatności na chorobę. Twórcy pokazali, że znaczne korzyści uzyskuje się poprzez zastosowanie podejścia miareczkowania krzyżowego do wykrywania autoprzeciwciał w próbkach pacjentów. Jest zatem uzasadnione wnioskowanie, że podobne korzyści zostaną osiągnięte poprzez zastosowanie podejścia miareczkowania krzyżowego do wykrywania autoprzeciwciał, które są markerami biologicznymi chorób innych niż nowotwór. Sposób ma zatem zastosowanie do wykrywania dowolnego autoprzeciwciała, które służy jako marker biologiczny stanu chorobowego lub podatności na chorobę, w dowolnej chorobie dla której pokazano (lub można pokazać), że jest związana z wytwarzaniem autoprzeciwciała. [0] Inne zastosowania sposobu według wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do tego, wykrywanie autoprzeciwciał, które są markerami biologicznymi choroby autoimmunologicznej, takiej jak na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy (SLE), pierwotna żółciowa marskość wątroby (PBC), autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (np. zapalenie tarczycy Hashimoto), autoimmunologiczne zapalenie żołądka (np. anemia złośliwa), autoimmunologiczne zapalenie nadnerczy (np. choroba Addisona), autoimmunologiczna niedoczynność przytarczyc, autoimmunologiczna cukrzyca (np. cukrzyca typu 1) lub poważne osłabienie mięśni, oraz przeszukiwanie próbek pacjentów z chorobą nerek lub wątroby, prowadzącą do niedomagania lub niewydolności któregoś z tych narządów i przeszukiwanie próbek pacjentów po transplantacji do wykrywania obecności przeciwciał skierowanych bądź przeciw chorej tkance (która pozostała na miejscu po transplantacji), bądź przeciw przeszczepionej tkance. 21

23 2 3 [06] W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wykrywania przeciwciała w próbce zawierającej płyn ustrojowy od osobnika ssaka, gdzie takie przeciwciało jest skierowane wobec obcej substancji wprowadzonej do tego osobnika-ssaka, który to sposób obejmuje: (a) doprowadzenie do kontaktu oddzielnie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń tej badanej próbki z wieloma różnymi ilościami antygenu swoistego dla tego przeciwciała, (b) wykrywanie ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej kombinacji próbki badanej i antygenu zastosowanego w etapie (a), (c) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki zastosowanego w etapie (a), gdzie na obecność w badanej próbce przeciwciał wykazujących reakcję z antygenem zastosowanym w teście wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych stężeń badanej próbki. [07] W tym aspekcie wynalazku, metodologię miareczkowania krzyżowego można zastosować do oceny odpowiedzi immunologicznej u osobnika-ssaka, a korzystnie osobnika-człowieka, wobec dowolnej obcej substancji wprowadzonej do tego osobnika. [08] W jednym z wykonań substancją obcą może być środek terapeutyczny, taki jak, na przykład lek lub prolek, leczenie ludzkim przeciwciałem lub szczepionka. Sposób według wynalazku można zastosować do oceny, czy podawanie środka terapeutycznego pacjentowi wywołuje odpowiedź immunologiczną prowadzącą do wytwarzania przeciwciał swoistych wobec epitopu na środku terapeutycznym lub składnika przenośnika do dostarczania, zaróbki, nośnika itp. podawanych ze środkiem terapeutycznym. [09] Antygeny stosowane w tym wykonaniu wynalazku, mogą być syntetyczne lub występujące naturalnie. [01] Dokładna natura środka terapeutycznego nie jest ograniczająca dla wynalazku. W nieograniczających wykonaniach, sposób według wynalazku może być stosowany do oceny odpowiedzi immunologicznej na małe cząsteczki syntetyczne, substancje występujące naturalnie, czynniki biologiczne występujące naturalnie lub wytworzone syntetycznie albo dowolną kombinację dwóch lub więcej z wyżej wymienionych, ewentualnie w połączeniu z zaróbkami, nośnikami lub przenośnikami do dostarczania. [0111] W jednym z przydatnych wykonań, sposób według wynalazku może być stosowany do oceny odpowiedzi immunologicznej na niedocelową część środka terapeutycznego lub szczepionki. Część niedocelowa ma oznaczać część składową podawanego środka terapeutycznego lub szczepionki, która, w przypadku środka terapeutycznego, nie uczestniczy bezpośrednio w aktywności terapeutycznej lub, w przypadku szczepionki, nie jest przeznaczona do wzbudzania wytwarzania przeciwciał u gospodarza. Część niedocelowa może być obecna na przykład, dla ułatwienia oczyszczania środka terapeutycznego lub szczepionki albo może być zaprojektowana do pomocy w dostarczaniu, pobieraniu lub kierowaniu do celu środka terapeutycznego/szczepionki. Przykłady takich części niedocelowych obejmują, ale nie są do nich ograniczone, łączniki lub markery powszechnie przyłączane do polipeptydów wyrażanych poprzez rekombinowanie, takich jak znaczniki biotynowe, znaczniki histydynowe itp. [0112] W innym wykonaniu tego aspektu wynalazku substancją obcą może być czynnik zakaźny, taki jak grzyb, bakterie, wirus lub pasożyt. [0113] Wynalazek będzie bardziej zrozumiały w odniesieniu do następujących, nie ograniczających przykładów doświadczalnych: 4 Przykład 1 - protokół ogólny miareczkowania antygenu w teście dla autoprzeciwciał - optymalnego stężenia surowicy i antygenu (OSAAC) [0114] Próbki antygenów - markerów nowotworowych można wytworzyć poprzez ekspresję poprzez rekombinowanie DNA postępując zgodnie z metodami analogicznymi do tych opisanych w WO 99/

24 2 3 [01] Pokrótce, cdna kodujące antygeny markerowe będące przedmiotem sklonowano do wektora pet21 (Invitrogen), który został zmodyfikowany tak, aby kodował znacznik biotynowy i znacznik 6 x histydyna, aby pomóc w oczyszczaniu wyrażanego białka. Otrzymane w rezultacie klony hoduje się w odpowiedniej bakteryjnej komórce gospodarza (w ciałach inkluzyjnych), bakterie poddaje się lizie i denaturacji i wyrażone antygeny odzyskuje się przy zastosowaniu kolumny powinowactwa z chelatem niklu (Hi-trap, dostępna handlowo z firmy Amersham, zgodnie z protokołem producenta). Wyrażane antygeny były renaturowane poprzez dializę w odpowiednim buforze i uzysk wyrażonego białka oceniano poprzez SDS-PAGE, analizę Western i ELISA i oznaczano ilościowo przed przechowywaniem. Jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie antygeny stosowane w poniższych przykładach wytworzono poprzez ekspresję poprzez rekombinowanie DNA ze zmodyfikowanego wektora pet21, a zatem były wyrażone jako fuzje białkowe zawierające N- końcowy biotynylowany znacznik (pochodzący z pet21) i C-końcowy znacznik His. [0116] Numery dostępu GenBank dla kilku cdna (lub zakodowanych białek) markerów, są następujące: P3: B00396 c-myc: V0068 HER2 (erbb-2) izoformy: NP_ Antygeny rozcieńczano do odpowiednich stężeń w 0,1 M buforze węglanowym, a następnie rozcieńczono seryjnie, aby utworzyć półlogartmiczny zakres miareczkowania (patrz Tabela 1). Rozcieńczenia antygenu umieszczano w ilości 0 μl/studzienkę w rzędach na płytce do mikromiareczkowania według układu płytki przy zastosowaniu automatycznej stacji pipetującej Tecan Evolyzer. Płytki przykrywano i przechowywano w 4 C przez 48 godzin. 2. Płytki płukano raz PBS + 0,1% Tween przy użyciu automatycznego urządzenia do płukania płytek, następnie postukano w nie w celu osuszenia na bibule. 3. Płytki blokowano buforem do inkubacji z wysoką solą (HSB, PBS + 0, M NaCl + 0,1% kazeiny) przy 0 l/studzienkę przez 90 min (przechowywać przykryte w 4 C). 4. Podczas inkubacji w celu blokowania, próbki surowicy rozmrażano, mieszano na worteksie i rozcieńczano w półlogartmicznej serii od 1/ do 1/ 000 w HSB w temperaturze pokojowej w probówkach.. Płytki opróżniano i postukano w nie na bibule w celu osuszenia. Rozcieńczone próbki surowicy umieszczano w ilości 0 μl/studzienkę we wszystkich studzienkach płytki do mikromiareczkowania stosując wielokanałową pipetę, z wytworzeniem półlogarytmicznego zakresu miareczkowania (patrz Tabela 1). Płytki przykrywano i inkubowano przez 90 min w temperaturze pokojowej z wstrząsaniem. 6. Etap płukania: Płytki płukano trzykrotnie w PBS + 0,1% Tween, przy użyciu automatycznego urządzenia do płukania płytek, następnie postukano w nie w celu osuszenia na bibule. 7. Królicze, sprzężone z peroksydazą chrzanową przeciwciało anty-ludzka Ig (Jackson, 1/ 000 w HSB) rozporcjowano w ilości 0 l/studzienkę do wszystkich studzienek na płytce do mikromiareczkowania. Królicze, sprzężone z HRP przeciwciało anty-ludzka Ig (1/00 w HSB) rozporcjowano w studzienkach kontrolnych zawierających przeciwciało anty-antygen. Płytki inkubowano następnie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem. 8. Płytki płukano jak w etapie Wstępnie przygotowany substrat TMB dodawano w ilości 0 μl/studzienkę i płytkę inkubowano na stole laboratoryjnym przez min. Płytki delikatnie opukiwano w celu wymieszania.. Gęstość optyczną studzienek określono przy 60 nm, stosując standardowy protokół czytnika płytek. 23

25 Tabela 1: Standardowe układy na płytce antygen antygen antygen antygen antygen antygen 1 na 1 na 0 1 z 0 1 w 00 1 w 00 1 w 000 B antygen 3 antygen 3 antygen 3 antygen 3 antygen 3 antygen 3 1 w C antygen 1 1 w D antygen 0,3 1 w E antygen 0,1 1 w F Antygen 0,03 1 w G Antygen 0,01 1 w H bufor węglanowy 1 na 0 antygen 1 1 na 0 antygen 0,3 1 na 0 antygen 0,1 1 na 0 Antygen 0,03 1 na 0 antygen 0,01 1 na 0 bufor węglanowy 1 w 0 antygen 1 1 w 0 antygen 0,03 1 z 0 antygen 0,1 1 z 0 Antygen 0,03 1 z 0 antygen 0,01 1 z 0 bufor węglanowy 1 w 00 antygen 1 1 w 00 antygen 0,03 1 w 00 antygen 0,1 1 in00 Antygen 0,03 1 w 00 antygen 0,01 1 w 00 bufor węglanowy 1 w 00 antygen 1 1 w 00 antygen 0,03 1 w 00 antygen 0,1 1 in00 Antygen 0,03 1 w 00 antygen 0,01 1 w 00 bufor węglanowy 1 w 000 antygen 1 1 w 000 antygen 0,03 1 w 000 antygen 0,1 1 in000 Antygen 0,03 1 w 000 antygen 0,01 1 w 000 bufor węglanowy [0117] Krzywe miareczkowania antygenu skonstruowano stosując średnie wartości dla powtórzeń każdej próbki w całym zakresie rozcieńczeń surowicy. Wartość odpowiadającą poziomowi wiązania nieswoistego dla każdego rozcieńczenia surowicy obliczano przez odjęcie poziomu tła (surowica w 1/ 000 i bez antygenu) od wartości uzyskanej dla wiązania przy braku antygenu dla każdego rozcieńczenia surowicy. Zostało to następnie użyte do skorygowania wiązania nieswoistego w każdym zestawie powtórzeń. Przykład 2 - wykrywanie autoprzeciwciał dla pierwotnego raka piersi [0118] Poniższe dane uzyskano z badania pilotażowego w celu oceny czułości i powtarzalności panelu testów miareczkowania krzyżowego dla autoprzeciwciał (OSAAC) w pierwotnym raku piersi (PBC, ang. primary breast cancer). Badaniami objęto surowicę od 14 kobiet bez objawów raka i przedoperacyjnych próbek surowicy od 14 kobiet z pierwotnym rakiem piersi. Próbki normalne i nowotworowe były dopasowane wiekowo. [0119] Test przeprowadzono według protokołu podanego w Przykładzie 1, przy zastosowaniu antygenów p3 i c-myc. Dwie próbki normalne (jedna dla p3) musiały być usunięte z badania, ponieważ wykazywały 24

26 2 3 utrzymujące się i niezmiernie wysokie poziomy wiązania autoprzeciwciał w całym zakresie stężeń surowicy i antygenu. [01] Fig. 1 daje przykłady krzywych otrzymanych, kiedy test miareczkowania krzyżowego zastosowano do pomiaru autoprzeciwciał wobec p3 i c-myc w surowicy. Można zauważyć, że w przypadku niektórych próbek (np. próbek i 18781), zakres miareczkowania otrzymano z najbardziej stężonymi surowicami dającymi najsilniejsze sygnały, zgodnie z oczekiwaniami. Jednak w innych próbkach (np. próbkach 190 i 1807), krzywe były zasadniczo płaskie, ale z sygnałem rosnącym wraz ze wzrostem stężenia surowicy. Uważa się, że jest to spowodowane nieswoistym wiązaniem immunoglobulin w surowicy i zostało skompensowane przez korektę dla nieswoistego wiązania, jak opisano powyżej. [0121] Poziomy autoprzeciwciał wyrażono jako gęstość optyczną (60 nm) wynikającą z wiązania się z badanym antygenem minus ta wynikająca z wiązania nieswoistego. Wartość odcięcia stanowiącą normę obliczono jako 9 percentyl (średnia + 2 odchylenia standardowe) dla grupy normalnej. Próbki zostały uznane za dodatnie, jeżeli wykazały poziomy powyżej wartości odcięcia w co najmniej 2 rozcieńczeniach surowicy pomiędzy 1/ i 1/00 i 2 stężeniach antygenu pomiędzy μg/ml i 1 μg/ml. Próbki dodatnie zostały zamieszczone w Tabeli 2. Tabela 2: Wyniki dodatnie pomiarów AAb (autoprzeciwciało, ang. autoantibody) surowicach normalnych i dla raka piersi. Próbka została uznana za dodatnią, jeżeli wartość skorygowana dla wiązania nieswoistego była wyższa od średniej + 2SD względem próbek normalnych badanych przy co najmniej dwóch stężeniach antygenu i dwóch rozcieńczenia surowicy. Antygen Dodatnie próbki surowicy Normalna PBC p3 J p3 + ve pula Łącznie 1/14 (7%) 7/14 (0%) c-myc J J p3 + pula ve Łącznie 2/14 (14%) /14 (36%) Przykład 3 - Analiza czułości i swoistości testów miareczkowania krzyżowego w porównaniu miareczkowaniem samego antygenu [0122] Pomiary autoprzeciwciał (AAb) przeprowadzono dla 14 kobiet z pierwotnym rakiem piersi (PBC) stosując zarówno test miareczkowania krzyżowego (OSAAC), jak i metodę miareczkowania jedynie antygenu, w której pomiary autoprzeciwciał przeprowadzono jedynie przy surowicy 1/0. Próbki uznawano za dodatnie, jeżeli przekraczały poziomy odcięcia zarówno przy, jak i 3 na krzywej miareczkowania antygenu. Tabela 2, poniżej, przedstawia bezpośrednie porównanie z dwóch metod: Tabela 3: Porównanie metody miareczkowania antygenu dla obliczenia czułości AAb tylko dla jednego rozcieńczenia surowicy w porównaniu z testem OSAAC. Antygen Metoda miareczkowania antygenu Analiza OSAAC p3 czułość /14 (36%) 7/14 (0%) swoistość 13/14 (93%) 13/14 (93%) c-myc czułość 3/14 (21%) /14 (36%) swoistość 12/14 (86%) 12/14 (86%) [0123] Można zauważyć, że poprzez zastosowanie serii krzywych miareczkowania antygenu, gdzie zarówno stężenia antygenu, jak i stężenia surowicy są zróżnicowane, uzyskano zarówno wyższą czułość, jak i co najmniej taką samą dobrą swoistość w porównaniu z krzywymi miareczkowania, dla którym tylko w stężenie antygenu jest zróżnicowane. 2

27 [0124] Test miareczkowania krzyżowego (OSAAC) do pomiaru autoprzeciwciał okazał się lepszym testem niż test oparty na miareczkowaniu antygenu wobec jednego rozcieńczenia surowicy pod względem czułości wykrywania pierwotnego raka piersi. Jest tak w przypadku zarówno przeciwciał dla p3, jak i c-myc, i nie ma powodów do przypuszczania, że nie będzie się to odnosić do szeregu innych antygenów. Bez ograniczeń teoretycznych, zgłaszający uważają, że istnieje wiele przyczyn obserwowanej wyższej czułości testów opartych na miareczkowaniu krzyżowym antygenu i badanej próbki. (i) Sposób przeprowadzania testu ma znacznie szerszy zakres dynamiczny. Dostarcza to możliwości wykrywania zarówno przeciwciał o niskim powinowactwie przy wysokich stężeniach antygenu, jak również przeciwciał występujących w dużej ilości, które w przeciwnym razie łapałyby się przy wysokich stężeniach antygenu. (ii) Przeciwciała o niskim powinowactwie, które mogą być maskowane przez wysokie poziomy wiązania nieswoistego, można wykryć przy niskim stężeniu surowicy. (iii) Zastosowane tu ostre kryteria dla zdefiniowania próbki jako dodatniej (powyżej średniej + 2SD dla normalnej populacji dla co najmniej 2 stężeń antygenu i 2 rozcieńczeń surowicy) oznaczają, że technik może być bardziej pewien, że pomiar dodatni jest prawdziwym wynikiem dodatnim Przykład 4 - wykrywanie surowic dla pierwotnego raka piersi przez miareczkowanie krzyżowe antygenu [012] W tym badaniu użyto surowice od kobiet z pierwotnym rakiem piersi (PBC, n=8 (6 surowic dla PBC było takich samych pod względem wszystkich antygenów, a 2 surowice dla PBC były swoiste wobec białek bądź p3, bądź ECD6)) i kobiet bez objawów występowania choroby nowotworowej (n = ). Test przeprowadzono w dwóch powtórzeniach stosując modyfikację ogólnego protokołu opisanego w Przykładzie 1. Pokrótce, zestaw płytek do mikromiareczkowania powleczono białkami antygenowymi: rekombinowanym p3, ECD6 (znanym także jako domena zewnętrzna HER2) lub fragmentem 3' ECD6. Antygen ECD6 zawiera aminokwasy od 1 do 647 sekwencji aminokwasowej HER2 (erbb-2) pełnej długości, przedstawionej pod numerem dostępu NM_004439, w fuzji z N-końcową sekwencją biotynylacji i C- końcowym znacznikiem His. Antygen - fragment 3' ECD6 zawiera aminokwasy od 361 do 647 sekwencji aminokwasowej HER2 (erbb-2) pełnej długości, przedstawionej pod numerem dostępu NM_004439, znowu w fuzji z N-końcową sekwencją biotynylacji i C-końcowym znacznikiem His. [0126] Przeprowadzono serię miareczkowań wzdłuż każdej płytki przy stężeniach (od góry do dołu), 160 nm, 0 nm, 16 nm, nm, 1,6 nm, 0, nm, 0,16 nm. Kontrolę bez antygenu samego buforu włączono jako dolny rząd każdej płytce. Umożliwiono adsorpcję antygenów przez 48 godzin, po czym płytki przełukano i blokowano przez 90 min PBS, zawierającym kazeinę 0,1% (wag./obj.) i NaCl (0, M). [0127] Podczas inkubacji w celu blokowania sporządzono zestaw seryjnych miareczkowań surowicy w probówkach, w rozcieńczeniach 1:800, 1:1600, 1:0, 1:0, 1:0, 1:0. Po usunięciu buforu blokującego, dodawano je do płytek powleczonych antygenem (rozcieńczenia 1:1600, 1:800, 1:0, 1:0, 1:0 i 1:0, dodane do płytek od lewej do prawej) i inkubowano przez 90 min. Resztę testu prowadzono jak opisano w Przykładzie 1. (Układ płytki jest przedstawiony na Fig. 2). [0128] Krzywe miareczkowania antygenu sporządzono stosując średnie wartości z dwóch powtórzeń dla każdej próbki wzdłuż całego zakresu rozcieńczeń surowicy. Wartość odpowiadającą poziomowi odpowiedzi autoprzeciwciał uzyskano odejmując nieswoiste tło (odpowiedź surowicy wobec 0,16 nm antygenu). Wyniki [0129] Reprezentatywne krzywe miareczkowania są pokazane na Fig. 3 do 7. Można zobaczyć, że dla niektórych próbek (np. próbek 6 i 642 dla ECD6), otrzymano zakres miareczkowań z najbardziej stężonymi surowicami dającymi najsilniejsze sygnały, zgodnie z oczekiwaniami. Jednak w innych próbkach 26

28 2 3 (np. próbkach MVV272 i EA02 dla fragmentu 3' ECD6), krzywe były zasadniczo płaskie, ale z sygnałem rosnącym wraz ze wzrostem stężenia surowicy. Uważa się, że jest to spowodowane niespecyficznym wiązaniem immunoglobulin z surowicy. [01] Wartości dodatnie względem wartości odcięcia obliczono jako średnią + 2SD dla normalnej populacji. Próbki były uważane za dodatnie, jeżeli wykazały poziomy powyżej wartości odcięcia w obu seriach i przy stężeniach antygenów bądź 160 nm, bądź 0 nm. Tabela 4 pokazuje, że rozcieńczenie surowicy 1:0 aktualnie używane do wykrywania autoprzeciwciała jest nie zawsze optymalne. Ponadto Tabela pokazuje, że istnieje zróżnicowanie optymalnego rozcieńczenia surowicy między antygenami. Najwyższy poziom czułości dla ECD6 wynosił 7%, gdy surowica była rozcieńczona 1:0. Było to przeciwieństwem wobec fragmentu 3' ECD6 gdzie 1:0 miało 0% czułości. Było tak po części ze względu na wzrost sygnału wobec fragmentu 3' ECD6 w analizowanych normalnych próbkach (np. próbkach MMV272 i EA02). Tabela 4: Czułość testu dla autoprzeciwciał wobec 8 próbek PBC analizowanych pod kątem każdego antygenu. Próbkę uznawano za dodatnią, jeżeli wartość skorygowana pod względem wiązania nieswoistego była wyższa od średniej + 2SD dla próbek normalnych badanych przy każdym z dwóch stężeń antygenu. Rozcieńczenie surowicy 1:1600 1:800 1:0 1:0 1:0 1:0 p3 0% 2% 37,% 37,% 37,% 37,% ECD6 2% 37,% 0% 0% 0% 7% ECD6 3 37,% 37,% 37,% 37,% 12,% 0% [0131] Tabela podsumowuje swoistość testu, gdzie surowicę rozcieńczano do różnych stężeń. Nie zaobserwowano różnic w swoistości przy zastosowaniu próbek analizowanych w tym teście. Tabela : Swoistość testu dla autoprzeciwciał teście z próbkami PBC. Próbka była uznawana za dodatnią, jeżeli wartość skorygowana pod względem wiązania nieswoistego była wyższa od średniej + 2SD dla próbek normalnych badanych przy każdym z dwóch stężeń antygenu. Rozcieńczenie surowicy 1:1600 1:800 1:0 1:0 1:0 1:0 p3 0% 0% 0% 0% 0% 0% ECD6 0% 0% 0% 0% 0% 0% ECD6 3 0% 0% 0% 0% 0% 0% [0132] W Tabeli 6 optimum rozcieńczenia surowicy jest porównane dla 6 surowic PBC, które były analizowane przeciwko wszystkim antygenom. Optimum rozcieńczenia surowicy to najwyższe rozcieńczenie, gdzie można wykryć odpowiedź autoprzeciwciał. Przykładowo, surowicę 628 można by rozcieńczyć do 1:800 i odpowiedź (tj. autoprzeciwciała) przeciwko p3 można by było wykryć, ale ta sama surowica wymagałaby rozcieńczenia 1:0 do wykrywania przeciwciał wobec ECD6. Optymalnym rozcieńczeniem dla tego antygenu byłoby zatem 1:0, tak, aby można było zidentyfikować wszystkie dodatnie odpowiedzi autoprzeciwciał. Tabela 6: Optymalne międzyosobnicze rozcieńczenie 6 próbek surowicy PBC, które były analizowane wobec wszystkich antygenów. Pokazane jest najniższe rozcieńczenie, które było wymagane do wykrywania odpowiedzi autoprzeciwciał przeciw bądź P3, bądź ECD6 bądź fragmentu ECD6 3'. Optimum rozcieńczenia dla antygenu Surowica P3 ECD6 ECD6 3 Optimum rozcieńczenia :0-1:0 6-1:1600 1:1600 1: :800 1:0-1: :0 1:0-1:0 [0133] Tabela 7 podsumowuje zwiększoną ogólną czułość testu dla wykrywania pierwotnego raka piersi, kiedy stosuje się sposób miareczkowania krzyżowego do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko każdemu z badanych antygenów. 27

29 2 3 Tabela 7: Ogólna czułość i swoistość testu z zastosowaniem obydwu, ECD6 i fragmentu 3' ECD6, jeśli stosuje się sposób miareczkowania krzyżowego zamiast surowicy rozcieńczonej 1:0 dla 6 próbek surowicy PBC analizowanych wobec wszystkich antygenów. Miareczkowanie krzyżowe 1:0 Czułość 66,7% 33,3% Swoistość 0% 0% Wnioski [0134] Wykazano, że test OSAAC dla pomiaru autoprzeciwciał jest lepszy od miareczkowania samego antygenu pod względem czułości wykrywania pierwotnego raka piersi. Tak jest w przypadku autoprzeciwciał dla p3, ECD6 i ECD6 3', i nie ma powodu przypuszczać, że nie będzie to prawdą dla autoprzeciwciał dla wszystkich markerów nowotworowych. Wydaje się, że jest to spowodowane tym, że ten format testu ma znacznie szerszy zakres dynamiczny. Zapewnia to możliwość wykrywania zarówno autoprzeciwciał o niskim powinowactwie przy wysokich stężeniach antygenu, jak również autoprzeciwciał obecnych w dużej ilości, które w przeciwnym przypadku łapałyby się przy wysokim stężeniu antygenu. [013] Ponadto wydaje się, że autoprzeciwciała obecne w małej ilości, które mogą być maskowane przez wysokie poziomy wiązania nieswoistego mogą być wykrywane przy niskim stężeniu surowicy. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wykrywania stanu chorobowego lub podatności na chorobę u osobnika-ssaka, gdzie taki sposób obejmuje wykrywanie przeciwciała w nieznanej badanej próbce, przy czym badana próbka zawiera płyn ustrojowy od takiego osobnika-ssaka, a przeciwciało jest markerem biologicznym stanu chorobowego lub podatności na chorobę, który to sposób obejmuje: (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: (i) kontaktowania rozcieńczenia badanej próbki z wieloma różnymi ilościami antygenu swoistego dla tego przeciwciała, (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu stosowanego w etapie (i), (b) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki użytej w etapie (a), oraz (c) ustalenie obecności lub nieobecności takiego stanu chorobowego lub podatności na chorobę na podstawie ilości swoistego wiązania między tym przeciwciałem i tym antygenem dla każdego rozcieńczenia badanej próbki i ilości testowanego antygenu, przy czym wynik dodatni dla obecności przeciwciał w badanej próbce jest ustalany przez porównanie z wynikiem odcięcia uzyskanym dla grupy kontrolnej osobników normalnych. 2. Sposób według zastrz. 1, w którym obecność lub nieobecność tego stanu chorobowego lub podatności na chorobę ustala się w oparciu o wartości zbiorcze ilości swoistego wiązania dla wszystkich testowanych rozcieńczeń badanej próbki i stężeń antygenu. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, w którym obecność lub nieobecność tego stanu chorobowego lub podatności na chorobę ustala się przez dokonanie oceny krzywych uzyskanych w etapie (b) pod kątem obecności jednej lub większej liczby krzywych zasadniczo S-kształtnych lub sigmoidalnych. 4. Sposób według zastrz. 3, w którym na obecność takiego przeciwciała w badanej próbce wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki.. Sposób wykrywania przeciwciała w badanej próbce zawierającej płyn ustrojowy od osobnika-ssaka, przy czym przeciwciało jest markerem biologicznym stanu chorobowego lub podatności na chorobę, który to sposób obejmuje: 28

30 2 3 4 (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń tej badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: (i) kontaktowania rozcieńczenia badanej próbki z wieloma różnymi ilościami antygenu swoistego dla tego przeciwciała, (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu użytego w etapie (i), (b) wykreślanie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki użytej w etapie (a), przy czym na obecność takiego reaktywnego z antygenem przeciwciała w badanej próbce wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki. 6. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym przeciwciałem jest autoprzeciwciało. 7. Sposób według zastrz. 6, przy czym autoprzeciwciało jest swoiste wobec białka markera nowotworowego. 8. Sposób według zastrz. 7, przy czym antygen obejmuje białko markera nowotworowego albo jego antygenowy fragment lub epitop. 9. Sposób według zastrz 8, przy czym białko markera nowotworowego jest wybrane z grupy składającej się z MUC1, MUC16, c-myc, EGFR, p3, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2-neu, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, antygenu 4-, CAGE, PSMA, PSCA, EpCAM, cytokeratyny, rekoweryny, kalikreiny, aneksyny, AFP, b-hcg, GRP78, CA12, mammaglobiny, raf, NY-BR-1, liwiny, surwiwiny, MUC2, endostatyny, Bcl-2, BIRC7, HSP70, No, upa, tetranektyny, prolaktyny, osteopontyny, HE4, TATI, inhibiny, wimentyny, cox-1 i cox-2.. Zastosowanie sposobu według dowolnego z zastrz. od 7 do 9 w (a) diagnozowaniu, prognozowaniu lub monitorowaniu raka lub (b) badaniu przesiewowym populacji bezobjawowych osobników-ludzi w celu zidentyfikowania tych osobników, które są w grupie podwyższonego ryzyka rozwinięcia się raka, przy czym próbkami do badania przy zastosowaniu tego sposobu są próbki płynu ustrojowego pobrane od osobników, a osobniki o podwyższonym, w porównaniu do normalnych osobników kontrolnych, poziomie autoprzeciwciał są identyfikowane jako narażone na ryzyko rozwoju raka, lub (c) wykrywaniu wczesnej zmiany nowotworowej lub wczesnej zmiany rakotwórczej u bezobjawowego osobnika-człowieka, przy czym próbką do badania przy zastosowaniu tego sposobu jest próbka płynu ustrojowego pobrana od osobnika, a obecność podwyższonego poziomu autoprzeciwciał, w porównaniu do normalnych osób kontrolnych, przyjmuje się jako wskaźnik wczesnej zmiany nowotworowej lub wczesnej zmiany rakotwórczej u osobnika, lub (d) badaniu przesiewowym w populacji bezobjawowych osobników-ludzi w celu identyfikacji tych osobników, u których rozwinął się rak, przy czym próbkami do badania przy zastosowaniu tego sposobu są próbki płynu ustrojowego pobrane od osobników, a osobniki o podwyższonym, w porównaniu do normalnych osobników kontrolnych, poziomie autoprzeciwciał są zdiagnozowane jako mające raka, lub (e) badaniu populacji osobników-ludzi z objawami w celu identyfikacji tych osobników, u których rozwinął się rak, przy czym próbkami do badania przy zastosowaniu tego sposobu są próbki płynu ustrojowego pobrane od osobników, a osobniki o podwyższonym, w porównaniu do normalnych osobników kontrolnych, poziomie autoprzeciwciał są zdiagnozowane jako mające raka, lub (f) monitorowaniu postępów raka lub innej choroby nowotworowej u pacjenta, przy czym próbkami do badania przy zastosowaniu tego sposobu są próbki płynu ustrojowego pobrane od pacjentów, a obecność podwyższonego, w porównaniu do normalnej kontroli, poziomu autoprzeciwciał przyjmuje się jako wskaźnik obecności raka u pacjenta, lub (g) wykrywaniu nawrotu choroby u pacjenta człowieka, który został uprzednio zdiagnozowany jako mający raka, który to pacjent został poddany leczeniu przeciwnowotworowemu w celu zmniejszenia ilości obecnego 29

31 2 3 raka, przy czym próbką do badania przy zastosowaniu tego sposobu jest próbka płynu ustrojowego pobrana od pacjenta, a obecność podwyższonego, w porównaniu do normalnej kontroli, poziomu autoprzeciwciał przyjmuje się jako wskaźnik, że nastąpił nawrót choroby, lub (h) ocenie prognozy dla raka, przy czym próbką do badania przy zastosowaniu tego sposobu jest próbka płynu ustrojowego pobrana od pacjenta, a obecność podwyższonego, w porównaniu do normalnej kontroli, poziomu autoprzeciwciał przyjmuje się jako wskaźnik prognozy dla pacjenta pod względem raka, lub (i) przewidywaniu odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe, przy czym próbką do badania przy zastosowaniu tego sposobu jest próbka płynu ustrojowego pobrana od pacjenta, a porównanie poziomu autoprzeciwciał u tego pacjenta z wcześniej ustaloną zależnością pomiędzy poziomami autoprzeciwciał i prawdopodobnym wynikiem leczenia jest wykorzystywane w celu uzyskania wskazówki, czy pacjent będzie reagował na takie leczenie przeciwnowotworowe, lub (j) monitorowaniu odpowiedzi pacjenta człowieka z rakiem na leczenie przeciwnowotworowe, przy czym próbką do badania przy zastosowaniu tego sposobu jest próbka płynu ustrojowego pobrana od pacjenta, a zmianę w poziomie autoprzeciwciał po leczeniu przyjmuje się jako wskaźnik, czy pacjent odpowiedział czy nie na leczenie. 11. Zastosowanie według zastrz., w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe, przy czym leczeniem przeciwnowotworowym jest szczepienie, terapia przeciwko czynnikowi wzrostu lub przekazywaniu sygnału, radioterapia, leczenie hormonalne, leczenie przeciwciałami ludzkimi lub chemioterapia. 12. Zastosowanie według zastrz., w monitorowaniu odpowiedzi pacjenta z rakiem na leczenie przeciwnowotworowe, przy czym leczeniem jest szczepienie, terapia przeciwko czynnikowi wzrostu lub przekazywaniu sygnału, radioterapia, leczenie hormonalne, leczenie przeciwciałami ludzkimi lub chemioterapia, a zmianę poziomu autoprzeciwciał po leczeniu przyjmuje się jako wskazówkę, że pacjent odpowiedział pozytywnie na leczenie. 13. Sposób według zastrz. 6, przy czym przeciwciałem jest autoprzeciwciało charakterystyczne dla lub związane z chorobą autoimmunologiczną. 14. Sposób według zastrz. 13, przy czym chorobą autoimmunologiczną jest reumatoidalne zapalenie stawów, układowy toczeń rumieniowaty (SLE), pierwotna żółciowa marskość wątroby (PBC), autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, zapalenie tarczycy Hashimoto, autoimmunologiczne zapalenie żołądka, anemia złośliwa, autoimmunologiczne zapalenie nadnerczy, choroba Addisona, autoimmunologiczna niedoczynność przytarczyc, autoimmunologiczna cukrzyca lub poważne osłabienie mięśni.. Sposób według zastrz. 6, przy czym przeciwciałem jest autoprzeciwciało charakterystyczne dla lub związane z chorobą nerek lub wątroby prowadzącą do niedomagania lub niewydolności któregoś z tych narządów. 16. Sposób według zastrz. 1, przy czym przeciwciało jest skierowane przeciw epitopowi obecnemu na tkance przeszczepionej do osobnika-ssaka. 17. Sposób wykrywania przeciwciała w badanej próbce zawierającej płyn ustrojowy od osobnika-ssaka, przy czym takie przeciwciało jest skierowane wobec obcej substancji wprowadzonej do tego ssaka, który to sposób obejmuje: (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń tej badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: (i) kontaktowania rozcieńczenia badanej próbki z wieloma różnymi ilościami antygenu swoistego dla tego przeciwciała,

32 2 3 (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu użytego w etapie (i), (b) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki użytej w etapie (a), przy czym na obecność takiego przeciwciała w badanej próbce wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki. 18. Sposób według zastrz. 17, przy czym osobnikiem ssakiem jest człowiek. 19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, przy czym obcą substancją jest środek terapeutyczny.. Sposób według zastrz. 19, przy czym środkiem terapeutycznym jest lek, prolek lub leczenie przeciwciałem. 21. Sposób według zastrz. 17 albo 18, przy czym obcą substancją jest szczepionka. 22. Sposób według zastrz. 19 albo, przy czym obcą substancją jest niedocelowa część środka terapeutycznego lub szczepionki. 23. Sposób według zastrz. 22, przy czym niedocelową częścią jest biotyna. 24. Sposób według zastrz. 17 albo 18, przy czym obcą substancją jest czynnik zakaźny, taki jak grzyb, bakterie, wirus lub pasożyt. 2. Sposób wykrywania dwóch lub więcej przeciwciał w badanej próbce zawierającej płyn ustrojowy od osobnika-ssaka, przy czym co najmniej jedno z tych przeciwciał jest markerem biologicznym stanu chorobowego lub podatności na chorobę, który to sposób obejmuje: (a) przygotowanie dwóch lub więcej różnych rozcieńczeń tej badanej próbki i przeprowadzenie następujących etapów (i) i (ii) w odniesieniu do każdego z rozcieńczeń badanej próbki: (i) kontaktowania rozcieńczenia badanej próbki z dwoma lub większą liczbą zestawów antygenów, gdzie każdy z tych zestawów antygenów jest swoisty wobec jednego z przeciwciał, które mają być wykrywane w badanej próbce, i gdzie każdy zestaw antygenów zawiera wiele różnych ilości tego samego antygenu, (ii) wykrywania ilości swoistego wiązania między przeciwciałem i antygenem dla każdej ilości antygenu w każdym zestawie użytym w etapie (i), (b) wykreślenie albo obliczenie oddzielnej krzywej dla ilości swoistego wiązania względem ilości antygenu dla każdego rozcieńczenia badanej próbki z każdym zestawem użytym w etapie (a), przy czym na obecność w badanej próbce przeciwciała reaktywnego z dowolnym z zestawów antygenów zastosowanych w teście wskazuje krzywa zasadniczo S-kształtna lub sigmoidalna dla co najmniej dwóch różnych rozcieńczeń badanej próbki z tym zestawem antygenów. 26. Sposób według zastrz. 2, przy czym co najmniej jednym z tych dwóch lub więcej przeciwciał jest autoprzeciwciało. 27. Sposób według zastrz. 26, przy czym jednym z tych dwóch lub więcej przeciwciał jest autoprzeciwciało swoiste wobec białka markera nowotworowego. 31

33 32

34 33

35 34

36 3

37 36

38 37

39 38

40 39

41

42 41

43 42

44 43

45 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 44

46 4

47 46