ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK NA WYBRANYCH PRZYK ADACH

Transkrypt

1 POSTÊPY ROLA BIOLOGII KOMUNIKACJI/IZOLACJI KOMÓRKI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU TOM KOMÓREK NR 3 ( ) 369 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK NA WYBRANYCH PRZYK ADACH SYMPLASMIC COMMUNICATION/ISOLATION AND PLANT CELL DIFFERENTIATION Marek MARZEC, Ewa Urszula KURCZYÑSKA Zak³ad Biologii Komórki, Wydzia³ Biologii i Ochrony Œrodowiska, Uniwersytet Œl¹ski, Katowice Streszczenie: Organizm roœlinny charakteryzuje siê szczególn¹ cech¹, jak¹ jest wystêpowanie plazmodesm (PD) miêdzy s¹siaduj¹cymi ze sob¹ komórkami. Badania ostatnich lat pokaza³y, e komunikacja za poœrednictwem plazmodesm lub jej brak odgrywa istotn¹ rolê w regulacji ró nicowania komórek roœlinnych. Okaza³o siê bowiem, e przez PD przemieszczaj¹ siê bia³ka oraz RNA (w tym mrna), a wiêc cz¹steczki mog¹ce wp³ywaæ na ró nicowanie komórek. W niniejszym artykule opisano wyniki badañ nad rol¹ izolacji symplastowej w procesie ró nicowania trichoblastów i atrichoblastów na przyk³adzie korzeni Arabidopsis thaliana. Przedstawiono wyniki badañ nad zmianami komunikacji symplastowej miêdzy komórkami woreczka zal¹ kowego przed i po zap³odnieniu na przyk³adzie Torenia fournieri. Opisano równie wyniki badañ, które wykaza³y zwi¹zek miêdzy wykszta³caniem siê domen symplastowych a ró nicowaniem komórek i tkanek zarodka zygotycznego oraz izolacji symplastowej w nasieniu Arabidopsis thaliana. Informacje te poprzedzono podstawowymi wiadomoœciami na temat transportu symplastowego. Opisano podstawowe parametry transportu symplastowego zachodz¹cego w drodze dyfuzji. Przedstawiono wyniki badañ, które wykaza³y przemieszczanie siê przez PD bia³ek, takich jak: KNOTTED1, DEFICIENS, CLAVATA3 oraz LEAFY, a tak e przemieszczanie siê cz¹steczek RNA wyciszaj¹cych geny (sirna i mirna). W niniejszym artykule przedstawiono równie podstawowe informacje na temat dynamiki transportu symplastowego, ze szczególnym uwzglêdnieniem syntezy kalozy. S³owa kluczowe: domeny symplastowe, izolacja symplastowa, ró nicowanie komórek, transport symplastowy. Summary: The unique feature of plant organisms is the presence of plasmodesmata (PD) between neighboring cells. Such plasmodesmatal continuum which exists within the plant body is termed symplasm. Classical view of plasmodesmata as static structures within the cell walls between neighboring cells must be reevaluated. According to our recent knowledge symplast is divided into functional domain. It appeared that symplasmic isolation/communication of cells or group of cells (symplasmic domains or symplasmic fields) is necessary for its proper differentiation within the plant body. Namely, plasmodesmata as a highly flexible structures regulate the diffusion of molecules including proteins and mrna. This confirms

2 370 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA the role of PD in the regulation of cells differentiation. For better understanding the role of symplasmic isolation/communication in cell differentiation basic information about plasmodesmata, symplasm and symplasmic transport are also described in presented paper. Some parameters of molecules diffusion in water, through plasmalemma and plasmodesmata, dynamic of plasmodesmata closure and opening (synthesis of callose and its digestion) under different conditions were also provided. Information about movement of proteins (KNOTTED 1, DEFICIENS, CLAVATA 3, LEAFY, APETALA 3) and RNA between different zones of apical meristem (tunica and corpus) were described in details, as these results were among the first which suggested that movement of signaling molecules through plasmodesmata exist and can influence cell differentiation. In presented article information about the role of symplasmic isolation during the differentiation of trichoblast and atrichoblast cells, changes within the embryo sac in connection with the fertilization, double fertilization, zygote and seed development were described. During the differentiation of trichoblasts and atrichoblasts the importance of signals movement between cells through plasmodesmata and changes in symplasmic communication were described on the example of Arabidopsis root [13, 78]. Genetic control of hair cells differentiation and the role of symplasmic communication in this process were also shown. In the case of embryo sac development of Torenia fournieri results from experiments where symplasmic communication was investigated with the use of fluorochrome of low molecular weight (LYCH) and dextrans (3, 10 and 40 kda) were described [12, 22]. During the development of Arabidopsis thaliana seed, changes in plasmodesmata SEL were also shown [77]. The importance of symplasmic communication during zygotic and somatic embryogenesis were briefly described on the example of Arabidopsis embryo development. Presented article shows information about the symplasmic isolation between explantat and somatic embryo. Moreover, description of the analysis of ise2 mutants in connection with the symplasmic isolation was also presented. From all described examples it is evident that cell differentiation is connected with the decrease of the symplasmic communication between cells which undergo different fate during the development. It is also important to notice that plasmodesmata are not passive channels, but critical players in gene regulation, controlling intercellular transport of molecules between particular cells during development [94]. Key words: cell differentiation, symplasmic domains, symplasmic isolation, symplasmic transport. 1. WSTÊP Organizm roœlinny rozwija siê z zap³odnionej komórki jajowej. Po procesie zap³odnienia, czyli po³¹czenia ze sob¹ gamety mêskiej i eñskiej, w wyniku póÿniejszych podzia³ów, roœlina staje siê organizmem wielokomórkowym. Jest to skomplikowany i w pe³ni zintegrowany system wspó³dzia³aj¹cych ze sob¹ tkanek i organów. W trakcie rozwoju i wzrostu roœliny, z grupy pocz¹tkowo podobnych do siebie komórek, powstaj¹ komórki wyspecjalizowane ró ni¹ce siê od siebie pod wzglêdem budowy, jak i pe³nionej funkcji. Proces specjalizacji nazywamy ró nicowaniem lub dyferencjacj¹. W wyniku tego procesu powstaje oko³o 40 ró nych typów komórek [55]. Realizacja konkretnego programu rozwojowego komórki zale y od ekspresji œciœle okreœlonych genów. Jednak pojawia siê pytanie jak to mo liwe, i komórki le ¹ce w swoim s¹siedztwie mog¹ uaktywniæ i utrzymaæ tak ró ne drogi rozwoju prowadz¹ce do wytworzenia uk³adu tkanek oraz narz¹dów buduj¹cych organizm? Wyniki badañ przeprowadzonych w ostatnich latach wskazuj¹, e jednym z mechanizmów reguluj¹cych ten proces jest zjawisko izolacji symplastowej, dziêki której komórka odcina dop³yw sygna³ów p³yn¹cych do niej drog¹ symplastow¹ z otaczaj¹cych komórek, co pozwala jej realizowaæ indywidualny program rozwojowy.

3 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK TRANSPORT SYMPLASTOWY Przez transport symplastowy nale y rozumieæ transport ka dej substancji w systemie po³¹czonych protoplastów komórek. Funkcje po³¹czeñ spe³niaj¹ plazmodesmy, czyli tunele znajduj¹ce siê w œcianach s¹siaduj¹cych ze sob¹ komórek, którymi przechodz¹ b³ony ER (retikulum endoplazmatycznego) oraz pasma cytoplazmy [52, 53, 70, 75]. Kana³ plazmodesmy jest wyœcielony b³on¹ komórkow¹, a w jego centrum obecny jest cylinder nazywany desmotubul¹, który jest utworzony przez retikulum endoplazmatyczne otoczone bia³kami. Transport symplastowy mo e zachodziæ miêdzy komórkami ka dej tkanki roœlinnej zarówno merystematycznej, jak i dojrza³ej (z wyj¹tkiem martwych elementów ksylemu). Przep³yw substancji miêdzy ywymi elementami komórek mo na podzieliæ na krótkodystansowy (dziêki po³¹czeniu protoplastów s¹siednich komórek plazmodesmami) oraz d³ugodystansowy (poprzez wyspecjalizowane ci¹gi elementów sitowych we floemie). Transport symplastowy pomiêdzy s¹siaduj¹cymi ze sob¹ komórkami mo e zachodziæ poprzez plazmodesmy w drodze dyfuzji, czyli biernie. Przep³yw taki jest wolniejszy a o dwa rzêdy wielkoœci od dyfuzji substancji w czystej wodzie; np. dla karboksyfluoresceiny szybkoœæ transportu przez kana³y cytoplazmatyczne wynosi 5, ±1,5 cm 2 s 1 [5, 84], a szybkoœæ dyfuzji w czystej wodzie to 4, cm 2 s 1 [87]. Jednak porównuj¹c go z przep³ywem substancji poprzez b³onê komórkow¹, oka e siê on z kolei szybszy o dwa rzêdy wielkoœci, czego przyk³adem jest transport strumienia asymilatów: kolejno 2, mol m 2 œciany komórkowej s 1 dla przep³ywu przez plazmodesmy [90] i 5, mol m 2 œciany komórkowej s 1 dla przep³ywu przez b³ony [65, 90]. Oznacza to, e transport symplastowy pomiêdzy komórkami jest zdecydowanie szybszy i wydajniejszy ni przep³yw przez b³ony komórkowe. Ju dawno odkryto, i przez plazmodesmy zachodzi przep³yw substancji niskocz¹steczkowych, takich jak: woda, cukry, niektóre jony, ma³e zwi¹zki sygna³owe, czy te niektóre makromoleku³y [14]. Choæ nale y pamiêtaæ, i z transportu symplastowego wy³¹czone s¹ cz¹stki hydrofobowe i ujemnie na³adowane. Doœwiadczenia pokazuj¹, e droga plazmodesmalna jest zamkniêta dla niektórych hormonów roœlinnych, takich jak np. IAA (kwas indolilooctowy) i aminokwasów [85]. Jednak inne hormony, czego przyk³adem mog¹ byæ gibereliny, bez trudu przemieszczaj¹ siê przez plazmodesmy [46] Znaczenie komunikacji symplastowej w regulacji ró nicowania komórek Badania ostatnich lat pokaza³y, i ograniczenie b¹dÿ zahamowanie komunikacji symplastowej mo e mieæ kluczowe znaczenie w procesach ró nicowania komórek, które wymagaj¹ w³¹czenia indywidualnego programu rozwojowego. Doœwiadczalnie wykazano, e przez plazmodesmy mo liwy jest transport zwi¹zków wielkocz¹steczkowych: bia³ek i RNA zarówno wirusowego, jak i endogennego mrna czy RNA wyciszaj¹cego geny [17, 32, 54, 61, 71]. Oznacza to mo liwoœæ przep³ywu informacji genetycznej w formie mrna b¹dÿ bia³ek pomiêdzy komórkami po³¹czonymi plazmodesmami, a tak e przep³ywu RNAi (RNA interferencyjnego), czyli cz¹steczek

4 372 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA RYCINA 1. Rozmieszczenie mrna (po lewej stronie) i powsta³ych z niego bia³ek (po prawej stronie) w wierzcho³ku pêdu. Zamalowano obszary, w których stwierdzono obecnoœæ mrna i odpowadaj¹cego mu bia³ka. Intensywnoœæ zabarwienia na poszczególnych ilustracjach odpowiada gradientowi wystêpowania bia³ka w komórkach wierzcho³ka. L1, L2 kolejne warstwy tuniki; L3 pierwsza warstwa komórek korpusu [wg 20, 29, 41, 66, 72] FIGURE 1. Diagrammatic representation of the expression pattern of various transcription factors in apical and floral meristems. Relative quantities of RNA and protein are represented by gradations of colour [acc. to 20, 29, 41, 66, 72]

5 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 373 RNA mog¹cych po transkrypcji przemieszczaæ siê symplastem i wy³¹czaæ okreœlone geny w komórkach docelowych (patrz dalej). Pierwsze doniesienia o mo liwoœci przemieszczania siê bia³ek przez plazmodesmy (bia³ko KNOTTED1 KN1) pochodz¹ z obserwacji merystemów apikalnych kukurydzy (ryc.1). Bia³ko KN1, odpowiedzialne za utrzymanie merystematycznego stanu komórek wierzcho³ka przechodzi z korpusu do tuniki [41]. Dowodem na to, i bia³ko mo e przemieszczaæ siê kana³ami cytoplazmatycznymi, s¹ wyniki pokazuj¹ce obecnoœæ mrna KN1 tylko w warstwie komórek L2 tuniki. Natomiast bia³ko KN1 jest wykrywane zarówno w warstwie L2, jak i L1 (ryc.1). Dalsze badania wykaza³y, e transport taki jest zjawiskiem rozpowszechnionym i dotyczy wielu rodzajów bia³ek syntetyzowanych w obrêbie merystemu, miêdzy innymi DEFICIENS [66], CLAVATA3 [20] czy LEAFY [72]. Jednak trzeba zauwa yæ, i przep³yw przez plazmodesmy nie dotyczy wszystkich bia³ek transkrybowanych w komórkach wierzcho³ka pêdu. Przyk³adem mo e byæ APATALA3, dla którego wzory wystêpowania mrna i dojrza³ego bia³ka w komórkach merystemu s¹ identyczne (ryc. 1.) [29]. Na szczególn¹ uwagê zas³uguje fakt, e transport bia³ek i RNA mo e zachodziæ w ró nych kierunkach, pomiêdzy wszystkimi warstwami wierzcho³ka. Jednak kierunek nie jest przypadkowy, a precyzyjnie okreœlony, co dobrze widaæ na przyk³adzie CLAVATA3; bia³ko to przemieszcza siê tylko do niektórych komórek w poszczególnych warstwach wierzcho³ka (ryc.1) [20]. O samym mechanizmie przep³ywu zwi¹zków wielkocz¹steczkowych wiemy coraz wiêcej (dok³adny opis w [58]), jednak rozpatruj¹c znaczenie tego zjawiska w procesie ró nicowania komórki wa niejszy jest jego skutek. Bia³ka pe³ni¹ w komórce funkcje budulcowe, regulacyjne i enzymatyczne. Informacja zapisana w DNA decyduje o losach komórki, ale decyduje w³aœnie poprzez bia³ka i ich potranslacyjn¹ obróbkê. Dlatego mo liwoœæ przemieszczania siê mrna i/lub bia³ek b¹dÿ brak tej mo liwoœci (poprzez zamkniêcie plazmodesm) ma znaczenie w regulacji ró nicowania komórek. Symplastem mog¹ przemieszczaæ siê równie cz¹steczki RNA wyciszaj¹ce geny, czyli wspomniane wczeœniej interferencyjne RNA (ryc.2). Od momentu pierwszego opisu mechanizmu interferencji RNA [18] coraz wiêcej wiadomo o znaczeniu tego zjawiska w funkcjonowaniu komórek i powszechnoœci jego wystêpowania (m.in. [57, 81, 93]). Potwierdzono, e zarówno sirna [31], jak i mirna [50, 51] bior¹ udzia³ w procesie potranskrypcyjnego wyciszania genów. Polega on na tym, i ma³e cz¹steczki kwasu rybonukleinowego (sirna, mirna) maj¹ zdolnoœæ przy³¹czania siê do fragmentów mrna na terenie cytoplazmy, a nastêpnie ich degradowania (ryc.2). Oznacza to, i nawet poprawnie odczytany zapis z DNA i przekazany na mrna, mo e zostaæ usuniêty z cytoplazmy komórki. Co najwa niejsze, informacja ta zostaje usuniêta przez dzia³anie RNAi, które mo e pochodziæ z komórek s¹siednich i jest transportowane do komórki docelowej przez plazmodesmy. Ponadto, poniewa proces przekazywania informacji z DNA na bia³ka jest wieloetapowy, jego regulacja tak e mo e zachodziæ na wielu poziomach. Dowodem na to mo e byæ odkryty niedawno mechanizm wyciszania samego procesu transkrypcji, przez zmianê struktury chromatyny, przy udziale sirna na terenie j¹dra [31]. Zapewne najbli sze lata przynios¹ kolejne doniesienia o wp³ywie RNAi na regulacjê ekspresji genów.

6 374 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA RYCINA 2. Schemat pokazuj¹cy potranskrypcyjne wyciszanie genu, poprzez cz¹steczkê mirna pochodz¹c¹ z komórki s¹siedniej, która przedosta³a siê do komórki docelowej poprzez plazmodesmê [wg 30, 31, 38, 90] FIGURE 2. Scheme showing post-transcriptonal gene silencing [acc. to 30, 31, 38, 90] Opisane wczeœniej informacje pokazuj¹, i drogi transportu symplastowego mog¹ pe³niæ funkcjê magistrali informacyjnych, zapewniaj¹cych przep³yw podstawowych regulatorów procesów yciowych komórki. 3. DYNAMIKA PLAZMODESM Granica przepuszczalnoœci plazmodesm okreœlana terminem SEL (ang. Size Exclusion Limit) oznacza masê cz¹steczki podawan¹ w daltonach (Da), która mo e jeszcze przejœæ przez plazmodesmê na zasadzie dyfuzji [25]. Jednak e nie ma œcis³ej zale noœci pomiêdzy mas¹ i œrednic¹ cz¹steczki. Cz¹steczka o wiêkszej masie, w porównaniu z cz¹steczk¹ o masie mniejszej, mo e byæ s³abiej rozga³êziona, a co za tym idzie mo e ona przechodziæ przez plazmodesmê o danej œrednicy mikrokana³u, w przeciwieñstwie do cz¹steczki o mniejszej masie cz¹steczkowej, ale wiêkszej œrednicy (tab.1) [24, 43]. Dlatego stosuje siê jeszcze inny sposób okreœlenia przepuszczalnoœci plazmodesm, tak zwany MEL (ang. Molecular Exclusion Limit), czyli œrednicê kana³u podawan¹ w nanometrach (nm), która bardziej precyzyjnie okreœla granice przepuszczalnoœci plazmodesm. Znaj¹c SEL lub MEL plazmodesmy, mo emy teoretycznie ustaliæ czy analizowane substancje s¹ w stanie przemieœciæ

7 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 375 Nazwa zwi¹zku Chemicals TABELA 1. Masa cz¹steczkowa i œrednica cz¹steczki na przyk³adzie wybranych fluoro- chromów wykorzystywanych w badaniu transportu symplastowego oraz GFP i dekstranu [wg 3, 24 43] TABLE 1. Molecular weight and molecule diamete r of molecules on the example of some fluoro- chromes, GFP and dextran [acc. to 3, 24, 43] 5-(i 6)-karboksyfluoresceina (CFDA) Sól sodowa kwasu 8-hydroksypireno-1,3,6 -trójsulfonowego (HPTS) Zielone bia³ko fluorescencji (GFP) Masa cz¹steczki Molecular weight [Da] 460,39 1, 3 524,39 0, , 8 Dekstran , 3 Œrednica cz¹steczki Molecule diameter [nm] siê przez plazmodesmê na drodze dyfuzji, bior¹c pod uwagê ich masê (SEL) b¹dÿ œrednicê cz¹stki w jej najszerszym miejscu (MEL). Przez izolacjê symplastow¹ nale y rozumieæ ograniczenie lub zupe³ne zahamowanie transportu przez plazmodesmy. Mo e ona zachodziæ na trzy sposoby: fizyczne ograniczenie liczby plazmodesm b¹dÿ zupe³ny ich brak, jak to jest w przypadku komórek szparkowych [1, 6, 91, 92], zmniejszenie œrednicy plazmodesmy czy te zaczopowanie jej œwiat³a. Ograniczanie MEL mo liwe jest miêdzy innymi dziêki tworzeniu zwieraczy, które zmniejszaj¹ œrednicê kana³u cytoplazmatycznego. Badania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej wykaza³y ich bia³kopodobny charakter [2, 60]. Jednym z bia³ek zwieracza jest syntaza 1,3-β-D-glikanu. Synteza 1,3-β-D-glikanu mo e prowadziæ, poprzez stopniowe zwê anie œwiat³a plazmodesmy, do jej zamkniêcia. Syntaza 1,3-β-Dglikanu jest integralnym bia³kiem b³onowym, a jej produkt kaloza jest kumulowana pomiêdzy œcian¹ komórkow¹ a plazmolemm¹ [52, 60]. Sugeruje to, e poprzez regulacjê aktywnoœci enzymu syntazy, komórka mo e bardzo precyzyjnie zmniejszaæ œrednicê plazmodesmy, a co za tym idzie jej MEL, w sytuacji skrajnej prowadz¹c do ca³kowitego wstrzymania transportu symplastowego. Oprócz zwieraczy, opisano inny system zamykania plazmodesm, poprzez tak zwane czopy bia³kopodobnych substancji znajduj¹cych siê w ich kanale. Obserwowano bowiem komórki nieoddzielone zwieraczami, jednak LYCH (ang. Lucifer Yellow CH, fluorochrom transportu symplastowego) podany do nich nie przemieszcza³ siê do komórek s¹siednich [69]. Wœród bia³kopodobnych substancji blokuj¹cych œwiat³o plazmodesmy wykazano obecnoœæ 1,3-β-D-glikanu [69]. Zjawisko odwracalnego czopowania plazmodesm zosta³o opisane w trakcie spermatogenezy u Chara vulgaris [45, 47, 48]. Nale y przyj¹æ, i tworzenie pierœcienia zwieracza i czopowanie kana³u zachodzi niezale nie od siebie. Co nie zmienia faktu, e powstanie zwieracza umo liwia precyzyjn¹ regulacjê MEL, natomiast czopowanie szczelnie zamyka ca³y kana³ plazmodesmy [45, 69]. Plazmodesmy s¹ strukturami bardzo wra liwymi na zmieniaj¹ce siê warunki œrodowiska otaczaj¹cego i wewnêtrznego. Nawet na niewielkie zmiany œrodowiska komórka reaguje syntez¹ kalozy i jej od³o eniem w œwietle plazmodesmy, przez co nastêpuje zwê enie œwiat³a kana³u cytoplazmatycznego, a nastêpnie jego zamkniêcie [69]. Na zmniejszenie SEL mo e mieæ wp³yw stê enie jonów Ca 2+ [3, 15, 86], zmiany turgoru komórek [62], a nawet warunki hodowli roœlin [94]. Ka de zranienie [70]

8 376 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA czy te wnikniêcie patogenów, np. wirusów [7] do organizmu roœliny wywo³uje szybk¹ odpowiedÿ w postaci syntezy kalozy, aby odizolowaæ zara on¹ b¹dÿ uszkodzon¹ komórkê od zdrowych komórek s¹siednich. Wykazano, e synteza kalozy rozpoczyna siê ju po 5 minutach od zranienia roœliny [21]. Natomiast w odpowiedzi na zmiany stê enia jonów wapnia, synteza 1,3-β-D-glikanu nastêpuje znacznie szybciej, w czasie od 10 do 30 sekund [83]. Oznacza to, e roœliny maj¹ mechanizm, którego uruchomienie umo liwia b³yskawiczne izolowanie komórek od otoczenia. Hydroliza kalozy (i przywrócenie ³¹cznoœci symplastowej) mo liwa jest dziêki dzia³alnoœci enzymu 1,3-β-D-glukanazy [69], który tak e zale ny jest od stê enia jonów wapnia wewn¹trz komórki [83]. Czas potrzebny na rozk³ad kalozy mo e byæ równie krótki jak czas jej syntezy i wynosi oko³o 90 sekund [83]. Przypuszcza siê, e tak szybkie odpowiedzi komórki, jeœli chodzi o syntezê i rozk³ad kalozy, s¹ mo liwe dziêki dzia³alnoœci kinazy IP3 (kinaza 3-fosfatydyloinozytolu) wp³ywaj¹cej na otwarcie b¹dÿ zamkniêcie kana³ów wapniowych, a co za tym idzie zmiany poziomu Ca 2+ w cytoplazmie [80, 83]. 4. ZNACZENIE IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W PROCESIE RÓ NICOWANIA KOMÓREK W trakcie rozwoju oraz w dojrza³ej roœlinie pojawiaj¹ siê pojedyncze komórki, b¹dÿ ca³e ich zespo³y, które s¹ symplastowo izolowane od otoczenia. Ograniczenie komunikacji miêdzy komórkami jest czêsto spotykane zarówno w tkankach merystematycznych, takich jak merystem apikalny pêdu [68, 69], ale tak e w komórkach ju zró nicowanych, czego przyk³adem mo e byæ aparat szparkowy [16, 63], czy komórki epidermy strefy w³oœnikowej korzenia [13]. Obszary takie nazywamy domenami lub polami symplastowymi, i o ile na ich granicy wystêpuj¹ ograniczenia w po³¹czeniu protoplastów, o tyle wewn¹trz tych obszarów dro ne plazmodesmy zapewniaj¹ ³¹cznoœæ miêdzy komórkami. Oznacza to, e pola symplastowe i domeny tworz¹ grupy komórek, które mog¹ byæ w organizmie odrêbnymi jednostkami, tak rozwojowymi, jak i funkcjonalnymi [23]. Definicje domeny i pola symplastowego zosta³y przedstawione w poprzednich pracach [43, 74], tu przypominamy tylko, e przez domenê symplastow¹ nale y rozumieæ izolowan¹ od otoczenia grupê po³¹czonych ze sob¹ komórek obecnych w tkance ju dojrza³ej. Przyk³adem domeny mo e byæ aparat szparkowy w liœciach Comemelina i Allium [63], komórki epidermy korzenia Arabidopsis thaliana [13], zarodek rzodkiewnika (do pewnego etapu rozwoju) [34, 35, 36, 43, 44, 78] czy te dojrza³y woreczek zal¹ kowy Torenia fournieri [12, 22]. Natomiast pole symplastowe to obszar komórek w tkankach merystematycznych, który jest izolowany symplastowo od otoczenia. W odró nieniu od domen, w obrêbie pola symplastowego wystêpuj¹ ci¹g³e zmiany uk³adów komórkowych, które s¹ zwi¹zane z proliferacj¹ komórek [68]. Przyk³adem wystêpowania takiej izolacji symplastowej jest merystem apikalny roœlin okrytonasiennych. Doœwiadczalnie wykazano, i na styku warstwy

9 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 377 zewnêtrznej komórek (tuniki) i warstw po³o onych g³êbiej (korpusu) wystêpuje wyraÿna granica dla komunikacji symplastowej. Dodatkowo tak e, w obrêbie samej tuniki mo na zaobserwowaæ izolacjê symplastow¹ obszaru centralnego i czêœci proksymalnej [68, 69, 73]. Najlepiej poznane do tej pory przyk³ady ró nicowania komórek, w których izolacja symplastowa odgrywa istotn¹ rolê, szczegó³owo opisano poni ej Izolacja symplastowa w ró nicowaniu komórki w³oœnikowej W³oœniki to wytwory komórek epidermy korzenia, które zwiêkszaj¹ jego powierzchniê ch³onn¹, umo liwiaj¹ lepsze umocowanie korzenia w glebie, a tak e s¹ miejscem nawi¹zywania interakcji z mikroorganizmami. O ile ka da z komórek epidermy wchodz¹c w strefê ró nicowania mo e wykszta³ciæ wypustkê w³oœnikow¹, to tylko niektóre z nich wytworz¹ w³oœniki. Badania ostatnich lat pozwoli³y na dok³adne poznanie ka dego z etapów tworzenia w³oœników u modelowej Arabidopsis thaliana, wraz z genami i ich bia³kowymi produktami charakterystycznymi dla tego procesu [4, 28, 49, 67]. Dodatkowo prowadzone by³y badania nad bia³kami, maj¹cymi charakter enzymatyczny, transportowanymi symplastowo miêdzy komórkami ryzodermy [69, 89], które w po³¹czeniu ze studiami prowadzonymi nad izolacj¹ symplastow¹ w ró nicuj¹cej siê epidermie korzenia [13] daj¹ pe³en obraz procesu specjalizacji trichoblastów i atrichoblastów. Mog¹ tak e byæ modelem w rozwa aniu znaczenia czynnika izolacji symplastowej w ró nicowaniu komórki. W epidermie korzenia (ryzodermie) roœlin okrytonasiennych mo emy wyró - niæ dwa rodzaje komórek: trichoblasty wytwarzaj¹ce wypustkê w³oœnikow¹ oraz atrichoblasty, które w³oœników nie produkuj¹. Te dwa rodzaje komórek tworz¹ specyficzny wzór epidermy zwi¹zany z rozmieszczeniem w³oœników. Wyznaczono trzy modele uk³adu komórek epidermy (ryc. 3). W modelu I ka da z komórek ma zdolnoœæ do wytworzenia w³oœnika, w modelu II komórki w strefie ró nicowania przechodz¹ asymetryczny podzia³ i tylko mniejsza z potomnych ró nicuje siê w komórkê w³oœnikow¹, natomiast w modelu III komórki w³oœnikowe s¹ u³o one w pionowe rzêdy przedzielone jednym b¹dÿ kilkoma pionowymi rzêdami atrichoblastów [9, 11]. RYCINA 3. Modele rozmieszczenia trichoblastów i atrichoblastów w ryzodermie. Komórki zaznaczone czarnym kolorem odpowiadaj¹ atrichoblastom, zaœ komórki zaznaczone kolorem szarym odpowiadaj¹ trichoblastom (za [40], zmienione) FIGURE 3. Three types of root epidermal pattering in mature root of vascular plants. Black cells are non-hair cells and gray cells are root hair cells (acc. to [40], changed)

10 378 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA RYCINA 4. Schemat przekroju poprzecznego przez korzeñ Arabidopsis thaliana pokazuj¹cy uk³ad komórek epidermy nad komórkami kory (za [11], zmienione): 1 komórki w³oœnikowe (trichoblasty), 2 komórki bezw³oœnikowe (atrichoblasty), 3 komórki kory; A antyklinalne œciany komórkowe, B peryklinalne œciany komórkowe FIGURE 4. Organization of cells and tissues in the Arabidopsis root on the cross section (acc. to [11], changed): 1 hair cells (trichoblasts), 2 non-hair cells (atrichoblasts), 3 cortex cells; A anticlinal cell walls, B periclinal cell walls U Arabidopsis wystêpuje III typ (model) wzoru epidermalnego (ryc. 3), a wspomniane wczeœniej ci¹gi komórek w³oœnikowych le ¹ nad œcianami antyklinalnymi komórek kory korzenia (ryc. 4.). Pomiêdzy pionowymi rzêdami trichoblastów znajduj¹ siê jeden lub dwa pionowe rzêdy atrichoblastów, le ¹ce nad peryklinalnymi œcianami komórek kory [10]. Czy to zatem informacja pozycyjna determinuje drogê specjalizacji komórki epidermy, czy te inne czynniki okazuj¹ siê decyduj¹ce? Analizuj¹c mechanizmy ró nicowania komórek w³oœnikowych i procesy zachodz¹ce w atrichoblastach oraz œledz¹c produkty genów odpowiedzialnych za ten proces odkryto, i czêœæ bia³kowych produktów przemieszcza siê symplastowo przez plazmodesmy determinuj¹c losy komórek. Ju w 1994 roku wykazano, e w trakcie rozwoju epidermy korzenia pomiêdzy s¹siaduj¹cymi komórkami musz¹ przemieszczaæ siê czynniki transkrypcyjne decyduj¹ce o losach komórek [40]. Nazwano je HCIF (ang. Hair Cell Inducing Factor, czyli czynnik indukuj¹cy powstawanie komórki w³oœnikowej) oraz HCSF (ang. Hair Cell Suppressor Factor, czyli czynnik hamuj¹cy rozwój komórki w³oœnikowej) [40]. Wynikiem ich dzia³ania w komórce docelowej mia³o byæ aktywowanie (poprzez HCSF) lub wy³¹czanie (poprzez HCIF) genów GL2 (GLABRA2) i TTG (TRANSPARENT TESTA GLABRA). Za³o enie to oparto na wynikach obserwacji mutantów gl2 i ttg, u których komórki w³oœnikowe rozwija³y siê niezale nie od po³o enia nad œcianami antyklinalnymi komórek kory. Dzisiaj wiemy, e jednym z najwa niejszych genów decyduj¹cych o losach komórki ryzodermy jest gen GLABRA2 (GL2). Jego znaczenie jest tak wa ne, poniewa jest on odpowiedzialny za negatywn¹ regulacjê fosfolipazy Dζ1, która z kolei jest czynnikiem transdukcji sygna³ów bior¹cych udzia³ w indukowaniu ró nicowania trichoblastów [59]. Oznacza to, e w momencie mutacji GL2 negatywna regulacja Dζ1 zostanie zaburzona, a co za tym idzie, komórki epidermy nie bêd¹ siê ró nicowa³y w trichoblasty. Jednoczeœnie o znaczeniu genu GL2 w procesie ró nicowania komórek w³oœnikowych mo e œwiadczyæ to, e on tak e jest

11 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 379 kontrolowany przez ca³¹ grupê czynników transkrypcyjnych, spoœród których mo na wyró niæ bia³ka typu MYB (odgrywaj¹ce kluczow¹ rolê w kontroli wzrostu i ró nicowania komórek), które s¹ kodowane m.in. przez geny CAPRICE (CPC) i WEREWOLF (WER) [49, 88]. Doœwiadczalnie wykazano, i mutacje w CPC powoduj¹ powstanie roœlin bezw³oœnikowych [37]. Oznacza to, e CPC jest pozytywnym regulatorem ró nicowania komórek w³oœnikowych. Jednoczeœnie dzia³a on jako represor GL2, o czym mo e œwiadczyæ brak domeny aktywuj¹cej w CPC [37]. Zgodnie w powy szymi informacjami oczywiste wydaje siê, e akumulacja mrna genu CPC bêdzie wystêpowa³a w j¹drze atrichoblastów. Jednak badania z wykorzystaniem GFP (ang. Green Fluorescent Protein, bia³ko zielonej fluorescencji) po³¹czonego z bia³kiem CPC, wykaza³y obecnoœæ CPC we wszystkich komórkach ryzodermy [89]. Wyjaœnieniem tego zjawiska mo e byæ tylko symplastowy transport fuzyjnego bia³ka poprzez plazmodesmy miêdzy komórkami. Innymi czynnikami transkrypcyjnymi negatywnie reguluj¹cymi specjalizacjê komórek w³oœnikowych s¹ GLABRA3 (GL3) i ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3), a ich mutacje powoduj¹ zmniejszenie liczby atrichoblastów lub zupe³ny ich brak (u mutantów gl3gl3) [4]. Jednak badania prowadzone 2 lata po odkryciu funkcji tych genów wykaza³y, i s¹ one transkrybowane w komórkach w³oœnikowych [42], natomiast obecnoœæ bia³ka GL3 obserwowana by³a w j¹drach komórek niew³oœnikowych. Oznacza to, i mamy do czynienia, tak jak to by³o w wypadku bia³ka CPC, z przemieszczaniem siê GL3 pomiêdzy protoplastami komórek za poœrednictwem plazmodesm. Omawiane powy ej prace, pokazuj¹ce genetyczne podstawy inicjowania rozwoju w³oœnika wskazuj¹, e w tym skomplikowanym procesie du ¹ rolê odgrywa transport symplastowy, reguluj¹cy przep³yw produktów genów istotnych dla procesu ró nicowania komórek ryzodermy. Natomiast wystêpowanie zjawiska izolacji symplastowej w ryzodermie, zosta³o wykazane przy zastosowaniu fluorochromów: mikroiniekcji LYCH oraz nieinwazyjnego podania karboksyfluoresceiny [13]. Komórki ryzodermy znajduj¹ce siê blisko wierzcho³ka korzenia, poni ej strefy ró nicowania, zachowuj¹ po³¹czenia symplastowe, co wykaza³a analiza przemieszczania siê wspomnianych wy ej fluorochromów. Jednak najszybsze rozprzestrzenianie siê fluorochromów obserwowano pomiêdzy komórkami tego samego typu, do którego fluorochrom zosta³ podany. To sugeruje, i pomiêdzy komórkami, które w wyniku pierwszego podzia³u zosta³y ju predysponowane do realizowania okreœlonej drogi rozwojowej [8, 11], plazmodesmy przez swoj¹ liczbê i œrednicê zapewniaj¹ sprawniejsz¹ komunikacjê symplastow¹ [13]. W tych samych badaniach sprawdzono, jak wygl¹da model komunikacji symplastowej w strefie ró nicowania korzenia, gdzie nastêpuje realizacja opisanych wczeœniej programów genetycznych. Dziêki zastosowaniu precyzyjnych metod podawania fluorochromów do pojedynczej komórki mo liwe by³o zbadanie stopnia ich komunikacji z otoczeniem [13]. Zarówno przy podaniu fluorochromu do cytoplazmy trichoblastu, jak i atrichoblastu, w ponad 94% wypadków nie obserwowano adnego przep³ywu znacznika do komórek s¹siednich, to znaczy z atrichoblastów do trichoblastów i odwrotnie. Jednoznacznie wskazuje to, i w momencie rozpoczêcia ró nicowania, komórki epidermy korzenia trichoblasty i atrichoblasty,

12 380 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA staj¹ siê domenami symplastowymi izolowanymi od otoczenia [13]. Wyniki te potwierdzaj¹ jak istotna jest kontrola komunikacji symplastowej i jak wa na jest czasowa korelacja miêdzy pojawianiem siê izolacji symplastowej a ró nicowaniem komórek Znaczenie izolacji symplastowej w procesie ró nicowania woreczka zal¹ kowego Torenia fournieri Doœwiadczenia nad komunikacj¹ protoplastów komórek woreczka zal¹ kowego by³y prowadzone przy zastosowaniu mikroiniekcji fluorochromu LYCH, a tak e dekstranów o ró nych masach cz¹steczkowych (3, 10 i 40 kda). Dziêki temu mo liwe by³o œledzenie nie tylko obecnoœci czy braku po³¹czeñ symplastowych, ale tak e stopnia przepuszczalnoœci plazmodesm dla substancji o okreœlonej wielkoœci cz¹steczki [22]. Badania przeprowadzono na Torenia fournieri i obejmowa³y: m³ody zal¹ ek zaraz po zakoñczeniu przezeñ podzia³ów, dojrza³y gdy mo liwe by³o ju jego zap³odnienie, a tak e zmiany zachodz¹ce po zapyleniu i podwójnym zap³odnieniu [12, 22]. Fluorochrom i dekstrany by³y wprowadzane do komórki centralnej, a nastêpnie analizowano ich przemieszczanie siê. U Torenia fournieri, jako typowego przedstawiciela roœlin okrytozal¹ kowych, mo na wyró niæ w dojrza³ym woreczku zal¹ kowym siedem komórek: dwie synergidy, jedn¹ komórkê jajow¹, jedn¹ komórkê centraln¹ i trzy antypody. Jednak charakterystyczne dla tego gatunku jest to, i woreczek zal¹ kowy nie jest otoczony adnymi tkankami somatycznymi [82]. Woreczek zal¹ kowy wyrasta poza mikropylarn¹ czêœæ zal¹ ka, i niczym nieos³oniêty styka siê bezpoœrednio z ³o yskiem [26, 82]. W czêœci nieos³oniêtej przez tkanki roœliny macierzystej znajduj¹ siê synergidy, komórka jajowa oraz prawie po³owa komórki centralnej [26]. W³aœnie z powodu mo liwoœci ³atwego obserwowania zmian w komunikacji symplastowej pomiêdzy komórk¹ jajow¹, synergidami i komórk¹ centraln¹ obiekt ten zosta³ wybrany do badañ [22]. W m³odym zal¹ ku obserwowano swobodny ruch dekstranów o masie 3 i 10 kda z komórki centralnej do komórki jajowej i synergid. Ró nice dotyczy³y jedynie czasu potrzebnego na przep³yw tych znaczników. W wypadku dekstranu o masie 3 kda fluorescencjê w synergidach i komórce jajowej obserwowano po 5 minutach. Natomiast przy zastosowaniu dekstranów o masie 10 kda, czas potrzebny na ich przedostanie siê do aparatu jajowego wynosi³ 30 minut [22]. Nawet przy przed³u- onych czasach obserwacji nie wykazano jakiegokolwiek ruchu znaczników o masie 40 kda pomiêdzy analizowanymi komórkami. W zal¹ ku dojrza³ym (czyli takim, którego mo liwe jest zap³odnienie) swobodny ruch miêdzy komórkami mo liwy by³ tylko dla dekstranów o masie 3 kda. Substancje o wiêkszej masie cz¹steczkowej (10 kda) przemieszcza³y siê miêdzy komórk¹ centraln¹ a jajow¹ i synergidami tylko w 41% wypadków (14 z 34 badanych). Natomiast w 2 dni po osi¹gniêciu dojrza³oœci przez woreczek nie obserwowano adnego ruchu znaczników o masie 10 kda, a przep³yw dekstranów o masie 3 kda wystêpowa³ tylko w 51% prób (16 z 31 badanych) [22]. Z powodu tego spadku komunikacji symplastowej dalsze badania przemian w woreczku zal¹ kowym oparto na

13 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 381 mikroiniekcji LYCH, którego masa cz¹steczkowa wynosi 521 Da. U Torenia fournieri od zapylenia do zap³odnienia mija 9 godzin i przez ca³y ten czas nie stwierdzono adnych zmian w komunikacji symplastowej w porównaniu do dojrza³ego woreczka zal¹ kowego nastêpowa³ swobodny przep³yw LYCH z komórki centralnej do komórki jajowej [22]. Po 24 godzinach od podwójnego zap³odnienia tylko w 55% przypadków (u 12 z 22 zal¹ ków) ó³cieñ lucyferowa przedostawa³a siê z bielma pierwotnego do zygoty powsta³ej z zap³odnionej komórki jajowej [22]. Wskazuje to na gwa³towny spadek ³¹cznoœci miêdzy protoplastami. Zastosowanie znacznika o najmniejszej masie cz¹steczkowej (ze wszystkich u ytych), pokazuje, i po zap³odnieniu nastêpuje istotne ograniczenie SEL plazmodesm. Szczególnie w porównaniu do dojrza³ego woreczka zal¹ kowego (który pozwala³ na przep³yw dekstranów nawet o masie 10 kda). Warto zauwa yæ, e opisane powy ej badania wykaza³y, e miêdzy komórkami gametofitu eñskiego istnieje pe³na komunikacja a SEL plazmodesm jest wyj¹tkowo du a, pozwalaj¹ca na przemieszczanie siê cz¹steczek o masie 10 kda oraz, e transport ten jest wyj¹tkowo intensywny. Pojawienie siê izolacji symplastowej miêdzy zygot¹ a endosperm¹ oznacza zsynchronizowanie zmniejszania SEL plazmodesm z powstaniem nowego sporofitu. Taki wynik oznacza nie tylko izolacjê miêdzy ró nymi genotypami, ale tak e miêdzy kolejnymi pokoleniami. Doœwiadczenia te wyraÿnie wskazuj¹, e komunikacja symplastowa, istniej¹ca dziêki wystêpowaniu plazmodesm, ma za zadanie m.in. koordynowanie rozwoju komórek po³o onych blisko siebie. W momencie, gdy ich rozwój musi przebiegaæ równoczeœnie, jak by³o to w przypadku przygotowywania siê komórki jajowej i centralnej do jednoczesnego zap³odnienia, istnia³a koniecznoœæ wyst¹pienia miêdzy nimi ³¹cznoœci symplastowej. Jednak w czasie, gdy komórki te s¹ przygotowywane do pe³nienia ró nych funkcji, wymagane jest ograniczenie ich komunikacji symplastowej przez zmniejszenie wartoœci SEL ³¹cz¹cych je plazmodesm Izolacja symplastowa w trakcie rozwoju nasiona Arabidopsis thaliana Po procesie zap³odnienia woreczek zal¹ kowy przekszta³ca siê w nasiono otoczone ³upin¹ nasienn¹ i zawieraj¹ce rozwijaj¹cy siê zarodek. W badaniach nad ³¹cznoœci¹ symplastow¹ komórek w obrêbie nasion wykorzystano bia³ko GFP, które by³o transkrybowane pod promotorami ró nych genów, m.in. AtSUC2 czy AtGL2 [77]. Gen AtSUC koduje transporter sacharozy [76], który odpowiada za transport tego cukru z komórek towarzysz¹cych do elementów sitowych w ci¹gach floemowych. Transport floemowy asymilatów w roœlinie przebiega w kierunku od Ÿróde³, gdzie zachodzi fotosynteza, do tkanek i organów zlewni (akceptorów) wykorzystuj¹cych substancje od ywcze. To w³aœnie tu nastêpuje roz³adunek floemu i póÿniejszy postfloemowy transport asymilatów miêdzy komórkami. Oba te procesy mo liwe s¹ dziêki wystêpowaniu plazmodesm i zachodz¹ drog¹ symplastow¹ [19, 27, 64, 77], chocia pojawi³y siê pierwsze doniesienia o zaanga owaniu apoplastu w mechanizmy roz³adunku floemu [95]. Poszczególne organy zlewni rywalizuj¹ ze sob¹ o strumieñ asymilatów, a na ich typ, liczbê i rozmiar wp³ywaj¹: stan rozwojowy roœliny i warunki

14 382 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA œrodowiska [79]. Jednym z najsilniejszych akceptorów jest rozwijaj¹ce siê nasiono, poniewa jego prawid³owe wykszta³cenie jest niezbêdne do zachowania ci¹g³oœci gatunku. Dlatego u roœlin w trakcie wykszta³cania i dojrzewania nasion, bia³ko GFP pod promotorem genu AtSUC2, mo e byæ u yte do bezinwazyjnego badania komunikacji symplastowej pomiêdzy rozwijaj¹cym siê nasionem a roœlin¹. Nasiono Arabidopsis otoczone jest ³upin¹ nasienn¹ sk³adaj¹c¹ siê z dwóch os³onek. Badania przy u yciu GFP wykaza³y, i zewnêtrzna os³onka ³upiny nasiennej pozwala na roz³adunek floemu, dziêki wystêpowaniu dro nych po³¹czeñ plazmodesmowych [78]. Oznacza to, e zewnêtrzna os³onka jest przed³u eniem symplastu floemowego suspensora, a pomiêdzy warstwami komórek zewnêtrznej czêœci ³upiny mo e zachodziæ przep³yw bia³ek o masie powy ej 27 kda (GFP), ale mniejszej ni 47 kda (GFP po³¹czone ze sporamin¹). Jednak dok³adne analizy w mikroskopie konfokalnym na nasionach z zarodkami w stadium torpedo, wykaza³y brak przemieszczania siê GFP z os³onki zewnêtrznej do komórek os³onki wewnêtrznej. Natomiast zarodek znajduj¹cy siê w stadium globularnym utrzymywa³ z suspensorem czêœciow¹ ci¹g³oœæ symplastow¹ wykazan¹ przez obecnoœæ, w zarodkowym obszarze roz³adunku floemu, fluorescencji GFP transkrybowanego pod promotorem genu AtSUC2 [77]. Dalsze doœwiadczenia z u yciem GFP pod promotorem genu TRANSPARENT TESTA 12 (AtTT12), którego ekspresja wystêpowa³a tylko w najg³êbszej warstwie komórek ³upiny, ujawni³y wystêpowanie komunikacji symplastowej miêdzy komórkami tylko w obrêbie wewnêtrznej os³onki. Aby sprawdziæ ³¹cznoœæ symplastow¹ pomiêdzy zewnêtrzn¹ i wewnêtrzn¹ os³onk¹ zastosowano niskocz¹steczkowy fluorochrom HPTS, który podany do floemu przedostawa³ siê tylko do zewnêtrznej warstwy ³upiny. Jednoznacznie wskazuje to, i wewnêtrzna os³onka jest izolowana symplastowo, tak od zewnêtrznej warstwy ³upiny nasiennej, jak i od le ¹cej pod ni¹ endospermy. Z kolei dalsze badania ruchu znaczników obecnych w zarodku wykaza³y jego izolowanie od endospermy [77]. Wyniki tych doœwiadczeñ wyraÿnie wskazuj¹ a 3 granice transportu symplastowego: pomiêdzy zewnêtrzn¹ i wewnêtrzn¹ warstw¹ ³upiny nasiennej, pomiêdzy wewnêtrzn¹ warstw¹ ³upiny a zarodkiem oraz pomiêdzy floemem suspensora a zarodkiem. Daje to gwarancjê, i adna informacja, mog¹ca zaburzyæ procesy embriogenezy, pochodz¹ca z komórek roœliny macierzystej zawieraj¹cych inn¹ informacjê genetyczn¹ i realizuj¹cych inny program rozwojowy, nie przedostanie siê do zarodka. Natomiast sam transport substancji pokarmowych poprzez wspomniane granice mo e zachodziæ poprzez specyficzne dla nich przenoœniki, takie jak: AtSUC3 (w komórkach suspensora i os³onek) [56] czy AtSUC5 (wystêpuj¹cy w endospermie) [56]. Oprócz wspominanych wczeœniej granic symplastowych pomiêdzy rozwijaj¹cym siê zarodkiem a roœlin¹ macierzyst¹ badania Stadler i wspó³pracowników [77] wykaza³y, i w trakcie dojrzewania nasion zaczynaj¹ siê pojawiaæ ograniczenia komunikacji symplastowej równie wewn¹trz zarodka. Dane te zosta³y potwierdzone w innych doœwiadczeniach sprawdzaj¹cych ³¹cznoœæ symplastow¹ w trakcie embriogenezy [34, 35, 36, 43].

15 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 383 Warto zaznaczyæ, i symplastowe izolowanie rozwijaj¹cego siê zarodka od tkanek macierzystych jest tak e opisane dla procesu somatycznej embriogenezy [44]. W tym wypadku granice dla komunikacji symplastowej zbadano przy u yciu fluorochromu CFDA (ang. 5-(and-6)-CarboxyFluorescein DiAcetate, dwuoctan karboksyfluoresceiny), który podany do tkanek eksplantatu nie przedostawa³ siê do komórek zarodka. Wyniki te pokazuj¹, i proces symplastowego izolowania ró nicuj¹cych siê komórek od otoczenia jest mechanizmem uniwersalnym, wystêpuj¹cym tak e w wypadku zaistnienia warunków sztucznych Znaczenie izolacji symplastowej w embriogenezie Arabidopsis Zmiany w komunikacji symplastowej podczas embriogenezy Arabidopsis thaliana zosta³y ju dok³adnie opisane we wczeœniejszych pracach [33, 34, 35, 36, 39, 43, 77]. Mówi¹c o znaczeniu izolacji symplastowej w trakcie tego procesu warto zwróciæ uwagê na pracê Kim i wspó³pracowników z 2002 [33]. W doœwiadczeniach tych wykorzystano zarodki mutantów ise1 (ang. Increased Size Exclusion limit of plasmodesmata), które charakteryzuj¹ siê brakiem spadku stopnia komunikacji symplastowej (œrednica ich plazmodesm nie zmniejsza siê) podczas wejœcia w stadium torpedo. Próby wyhodowania siewki mutanta mo liwe by³y tylko na pod³o u agarowym z po ywk¹, jednak roœliny te by³y kar³owate, bardzo wolno siê rozwija³y, a w ryzodermie ka da komórka ró nicowa³a siê w trichoblast [33]. Przyk³ad mutanta ise1 najlepiej wskazuje, i wyst¹pienie izolacji symplastowej w odpowiednim stadium rozwojowym jest niezbêdne, aby wszystkie mechanizmy regulacji genetycznej mog³y prawid³owo pokierowaæ procesem ró nicowania komórek ryzodermy. Tak e mutanty ise2, niewykazuj¹ce spadku ³¹cznoœci symplastowej w trakcie trwania stadium torpedo i charakteryzuj¹ce siê nie tylko prostymi, ale tak e rozga³êzionymi plazmodesmami [39] wykazywa³y powa ne zaburzenia rozwojowe. Dok³adna analiza genetyczna i ultrastrukturalna wykaza³a, e ISE2 wp³ywa na strukturê i funkcjê plazmodesm poprzez regulacjê metabolizmu RNA i w konsekwencji ekspresjê genów [39]. 5. PODSUMOWANIE Komórka zachowuj¹ca ³¹cznoœæ symplastow¹ (to znaczy, e jej protoplast jest po³¹czony z protoplastami komórek s¹siednich za pomoc¹ kana³ów cytoplazmatycznych plazmodesm) przez ca³y czas odbiera ró ne sygna³y, mog¹ce modyfikowaæ procesy w niej zachodz¹ce. Hormony, czy te bia³ka, produkowane w jednej komórce s¹ transportowane przez plazmodesmy w drodze dyfuzji do komórek s¹siednich. St¹d mo liwe jest koordynowanie wzrostu i rozwoju ca³ych grup komórek czy te poszczególnych organów. Jednak w roœlinie, która jest organizmem z³o onym, konieczne jest wystêpowanie i funkcjonowanie obok siebie komórek na ró nych etapach rozwoju oraz pe³ni¹cych odmienne funkcje. Specjalizacja komórek jest

16 384 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA mo liwa tylko w wypadku wyst¹pienia przynajmniej czêœciowej izolacji symplastowej. Dziêki temu nastêpuje ograniczenie przemieszczania siê do komórki z jej otoczenia informacji wp³ywaj¹cych na jej procesy transkrypcji i translacji, a tak e dop³ywu bia³ek uczestnicz¹cych w procesach ró nicowania. Ju wczesne badania wykaza³y u roœlin obecnoœæ barier symplastowych. Erwee i Goodwin [16] opisuj¹ je u nasady liœcia, w ³odydze (pomiêdzy epiderm¹ a kor¹ pierwotn¹ miêdzywêÿli), a tak e w korzeniu (pomiêdzy stref¹ czapeczki a innymi strefami rozwojowymi oraz miêdzy epiderm¹ i kor¹ pierwotn¹). S¹ to miejsca, w których nastêpuje ograniczenie komunikacji symplastowej komórek, co zwi¹zane jest z pe³nieniem przez nie odmiennych funkcji, b¹dÿ wystêpowaniem ró nych etapów rozwojowych (granica miêdzy czapeczk¹ a pozosta³ymi strefami rozwojowymi korzenia). Dok³adniejsze badania, z u yciem fluorochromów oraz bia³ek fluorescencyjnych (w g³ównej mierze GFP), pozwoli³y na scharakteryzowanie grup, czy te pojedynczych komórek, które s¹ izolowane w tkankach merystematycznych (pola symplastowe), jak i tkankach dojrza³ych (domeny symplastowe). O tym jak wielkie znaczenie ma zahamowanie transportu symplastowego mo e œwiadczyæ powszechnoœæ wystêpowania tego zjawiska w organizmie roœliny oraz to, jak istotne procesy s¹ od niego zale ne. W wierzcho³kach wzrostu konieczne jest rozdzielenie dwóch odmiennych procesów: podzia³ów komórek oraz ich wstêpnego ró nicowania. W centrum merystemów apikalnych zachodz¹ szybkie podzia³y, dostarczaj¹ce komórek niezbêdnych do wzrostu roœliny, z kolei na obwodzie merystemu rozpoczynaj¹ siê ju procesy ich ró nicowania [69, 73]. Pomiêdzy tymi obszarami konieczne jest wystêpowanie granicy dla przep³ywu symplastowego. Komórki czêœci centralnej (przez plazmodesmy) swobodnie przekazuj¹ miêdzy sob¹ informacje, które pobudzaj¹ je do szybkich podzia³ów. Czêœæ z nich zostaje przesuniêta poza obszar centralny, a czêœæ rozpoczyna krótki etap wzrostu i kolejny podzia³. Natomiast komórki przesuniête do obszaru peryferycznego rozpoczynaj¹ ró nicowanie zwi¹zane z pe³nieniem przez nie przysz³ych funkcji. Gdyby nie nast¹pi³o zahamowanie transportu symplastowego pomiêdzy tymi grupami, nie by³aby mo liwa specjalizacja komórek obszaru peryferycznego, poniewa informacja niesiona w symplaœcie kierowa³aby je na drogê dalszych podzia³ów. Opisana sytuacja ma miejsce w merystemach pêdu, gdzie granica miêdzy polami symplastowymi mo e przebiegaæ w obrêbie jednej warstwy komórek. Natomiast w korzeniu izolacja symplastowa wystêpuje miêdzy komórkami znajduj¹cymi siê w merystemie i strefie wyd³u ania a komórkami znajduj¹cymi siê w strefie ró nicowania [13] co wykaza³y miêdzy innymi badania z zastosowaniem GFP [78]. Co wa ne, pojawianie siê izolacji tych obszarów mo na obserwowaæ ju podczas embriogenezy [35]. Tak e w dojrza³ych organach odciêcie komórek od transportu symplastowego jest czêsto spotykane i niezbêdne, by mog³y one spe³niaæ swoje funkcje. Tak jest w wypadku powstawania w³oœników korzenia [13], czy te rozwoju komórek aparatu szparkowego w epidermie liœci [63]. W drugim przypadku zachowanie pe³nej izolacji protoplastu komórki jest konieczne nie tylko na etapie ró nicowania, ale przede

17 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 385 wszystkim w trakcie jej funkcjonowania (aby aparat szparkowy móg³ spe³niaæ swoje funkcje zwi¹zane z oddychaniem i transpiracj¹ musi zostaæ zupe³nie odciêty od komórek s¹siednich). Innym przyk³adem, wskazuj¹cym na znaczenie zmniejszenia lub zahamowania transportu symplastowego, jest ograniczanie po³¹czeñ miêdzy komórkami we wczesnych etapach rozwoju roœliny. Przyk³adami mog¹ byæ: proces tworzenia woreczka zal¹ kowego [22], podwójne zap³odnienie [12], rozwój nasion [77] czy embriogeneza [34, 35, 36, 43; 44, 77]. Dziêki technikom badawczym z zastosowaniem fluorochromów i bia³ek fluorescencyjnych sta³a siê mo liwa obserwacja nie tylko transportu symplastowego czy jego braku, ale tak e stopnia przepuszczalnoœci plazmodesm, które s¹ odpowiedzialne za po³¹czenie protoplastów komórek le ¹cych obok siebie. Wyniki tych doœwiadczeñ okreœlaj¹ jakiej wielkoœci cz¹steczki mog¹ byæ przenoszone miêdzy komórkami w danych tkankach, na œciœle okreœlonych etapach rozwoju. Ma to niebagatelne znaczenie, poniewa dostarcza informacji o tym jakie substancje, mog¹ce ingerowaæ w ró nicowanie siê komórki, s¹ w stanie przedostaæ siê do jej wnêtrza. Dlatego proces ró nicowania komórek jest zale ny od informacji niesionej przez transport symplastowy dotycz¹cy ca³ego organizmu, jak i przep³ywu krótkodystansowego, miêdzy s¹siednimi komórkami. Jak wykazano w pracy, procesy izolowania symplastowego u roœlin s¹ obecne zarówno w najwczeœniejszych etapach rozwoju, podczas formowania m³odego organizmu oraz w pe³ni ju ukszta³towanych organach. LITERATURA [1] ALLAWAY WG, SETTERFIELD G. Ultrastructural observations on guard cells of Vicia faba and Allium porrum. Can J Bot 1972; 50: [2] BADELT K, WHITE RG, OVERALL RL, VESK M. Ultrastructural Specializations of the Cell Wall Sleeve Around Plasmodesmata. Am J Bot 1994; 81: [3] BARON-EPEL O, GHARYAL PK, SCHINDLER M. Pectins as mediators of wall porosity in soybean cells. Planta 1988; 173: [4] BERNHARDT C, LEE MM, GONZALES A, ZHANG V, LLOYD A, SCHIEFELBEIN J. The ghlh genes GLABRA3 (GL3) and ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3) specify epidermal cell fate in the Arabidopsis root. Development 2003; 130: [5] BRET-HARTE MS, SILK WK. Fluxes and deposition rates of solutes in growing roots of Zea mays. J Exp Bot 1994; 45: [6] CARR DJ. Plasmodesmata in growth and development. W: Gunning BES, Robards AW [red.] In Intercellular Communication in Plants: Studies on Plasmodesmata. Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1976: [7] CHOI CW. Modified plasmodesmata in Sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) leaf tissues infected by maize dwarf mosaic virus. J Plant Biol 1999; 42: [8] CORMACK RGH. A comparative study of developing epidermal cell in white mustard and tomato roots. Am J Bot 1947; 34: [9] DOLAN L. Pattern in the root epidermis: an interplay of difusible signals and cellular geometry. Ann Bot 1996; 77: [10] DOLAN L, DUCKETT CM, GRIERSON C, LINSTEAD P, SCHNEIDER K, LAWSON E, DEAN C, ROBERTS K. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development 1994; 120:

18 386 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA [11] DOLAN L, JANMAAT K, WILLEMSEN V, LINSTEAD P, POETHIG S, ROBERTS B, SCHERES B. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 1993; 119: [12] DRESSELHAUS T. Cell-cell communication during double fertilization. Curr Opin Plant Biol 2006; 9: [13] DUCKETT CM, OPARKA KJ, PRIOR DAM, DOLAN L, ROBERTS K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development 1994; 120: [14] EPEL BL. Plasmodesmata: composition, structure and trafficking. Plant Mol Biol 1994; 26: [15] ERWEE MG, GOODWIN PB. Characterization of the Egeria densa Planch. leaf symplast: inhibition of the intercellular movement of fluorescent probes by group II ions. Planta 1983; 158: [16] ERWEE MG, GOODWIN PB. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa planch. Planta 1985; 163: [17] FAULKNER C, BRANDOM J, MAULE A, OPARKA K. Plasmodesmata Surfing the symplasm. Plant Physiol 2005; 137: [18] FIRE A, XU S, MONTGOMERY MK, KOSTAS SA, DRIVER SE, MELLO CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391(6673): [19] FISHER DB, OPARKA KJ. Post-phloem transport : principles and problems. J Exp Bot 1996; 47: [20] FLETCHER JC, BRAND U, RUNNING MP, SIMON R, MEYEROWITZ EM. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3. Arabidopsis shoot meristems. Science 1999; 283: [21] GALWAY ME, McCULLY ME. The time course of the induction of callose in wounded pea roots. Protoplasma 1987; 139: [22] HAN YZ, HUANG BQ, ZEE SY, YUAN M.. Symplastic communication between the central cell and the egg apparatus cells in the embryo sac of Torenia fournieri Lind. before and during fertilization. Planta 2000; 211: [23] HEINLEIN M. Plasmodesmata: dynamic regulation and role in macromolecular cell-to-cell signaling. Curr Opin Plant Biol 2002; 5(6): [24] HEINLEIN M, EPEL BL. Macromolecular transport and signaling through plasmodesmata. Int Rev Cytol 2004; 235: [25] HEJNOWICZ Z. Anatomia i histogeneza roœlin naczyniowych. Wydawn. Nauk. PWN, Warszawa [26] HIGASHIYAMA T, KUROIWA H, KAWANO S, KUROIWA T. Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri. Plant Cell 1998; 10: [27] HOTH S, SCHNEIDEREIT A, LAUTERBACH C, SCHOLZ-STARKE J, SAUER N. Nematode infection triggers the de novo formation of unloading phloem that allows macromolecular trafficking of green fluorescent protein into syncytia. Plant Physiol 2005; 138(1): [28] JANIAK A, SZAREJKO I. Genetyczne i molekularne podstawy rozwoju w³oœników u Arabidopsis thaliana. Post Biol Kom 2007; 34: [29] JENIK P, IRISH V. The Arabidopsis floral homeotic gene APETALA3 differentially regulates intercellular signaling required for petal and stamen development. Development 2001; 128: [30] JORGENSEN RA. RNA traffics information systemically in plants. PNAS 2002; 99: [31] KIM DH, ROSSI JJ. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet 2007; 8(3): [32] KIM J-Y. Regulation of short-distance transport of RNA and protein. Curr Opin Plant Biol 2005; 8: [33] KIM I, HEMPEL FD, SHA K, PFLUGER J, ZAMBRYSKI PC. Identification of a developmental transition in plasmodesmata function during embryogenesis in Arabidopsis thaliana. Development 2002; 129: [34] KIM I, KOBAYASHI K, CHO E, ZAMBRYSKI PC. Subdomains for transport via plasmodesmata corresponding to the apical-basal axis established during Arabidopsis embryogenesis. PNAS 2005a; 102: [35] KIM I, CHO E, CRAWFORD K, HEMPEL FD, ZAMBRYSKI PC. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. PNAS 2005b; 102: [36] KIM I, ZAMBRYSKI PC. Cell-to-cell communication via plasmodesmata during Arabidopsis embryogenesis. Curr Opin Plant Biol 2005; 8: [37] KIRKV, SIMON M, HULSKAMP M, SCHEIFELBEIN J. The ENAHANCER OF TRY AND CPC1 (ETC1) gene acts redundantly with TRIPTYCHON and CAPPRICE in trichome and root hair cell patterning in Arabidopsis. Dev Biol 2004; 268:

19 ROLA KOMUNIKACJI/IZOLACJI SYMPLASTOWEJ W RÓ NICOWANIU KOMÓREK 387 [38] KLAHRE U, CRETE P, LEUENBERGER SA, IGLESIAS VA, MEINS F JR. High molecular weight RNAs and small interfering RNAs induce systemic posttranscriptional gene silencing in plants. PNAS 2002; 99: [39] KOBAYASHI K, OTEGUI MS, KRISHNAKUMAR S, MINDRINOS M, ZAMBRYSKI P. Increased size exclusion limit2 encodes a putative DEVH Box RNA helicaces involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. Plant Cell 2007; 19: [40] KRAGLER F, LUCAS JW, MONZER J. Plasmodesmata: dynamies, domains and pattering. Ann Bot 1998; 81: [41] KRAGLER F, MONZER J, SHASH K, XOCONOSTLE-CAZARES B, LUCAS WJ. Cell-to-cell transport of proteins: Requirement for unfolding and characterization of binding to a putative plasmodesmal receptor. Plant J 1998; 15: [42] KURATA T, OKADA K, WADA T. Intercellular movement of transcription factors. Curr Opin Plant Biol 2005; 8(6): [43] KURCZYÑSKA EU. Komunikacja symplastowa: terminologia, fluorochromy i embriogeneza Arabidopsis thaliana. Post Biol Kom 2008; 35: [44] KURCZYÑSKA EU, GAJ MD, UJCZAK A, MAZUR E. Histological analysis of direct somatic embryogenesis in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Planta 2007; 226(3): [45] KWIATKOWSKA M. Zmiany ultrastruktury i rozmieszczenia plazmodesm a proces dyferencjacji na przyk³adzie anterydiostanów glonów z rodzaju Chara. Post Biol Kom 2004; 31 supl. 22: [46] KWIATKOWSKA M. Autoradiographic studies on the role of plasmodesmata in the transport of gibberellin. Planta 1991; 183: [47] KWIATKOWSKA M, MASZEWSKI J. Changes in ultrastructure of plasmodesmata during spermatogenesis in Chara vulgaris L. Planta 1985; 166: [48] KWIATKOWSKA M, MASZEWSKI J. Changes in occurence and ultrastructure of plasmodesmata in antherida of Chara vulgaris L during different stages of spermatogenesis. Protoplasma 1986; 132: [49] LEE MM, SCHIEFELBEIN J. WEREWOLF, a MYB-related protein in Arabidopsis, is a positiondependent regulator of epidermal cell patterning. Cell 1999; 99: [50] LEE YS, NAKAHARA K, PHAM JW, KIM K, HE Z, SONTHEIMER EJ, CARTHEW RW. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the sirna/mirna silencing pathways. Cell 2004; 117(1): [51] LLAVE C, XIE Z, KASSCHAU KD, CARRINGTON JC. Cleavage of Scarecrow-like mrna targets directed by a class of Arabidopsis mirna. Science 2002; 297(5589): [52] LUCAS JW, DING B, van der SCHOOT C. Plasmodesmata and the supracellular nature of plants. J Physiol 1993; 125: [53] LUCAS JW, LEE J-Y. Plasmodesmata as a supracellular control network in plants. Nature 2004; 5: [54] LUCAS JW, YOO BC, KRAGLER F. RNA as a long-distance information macromolecule in plants. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2(11): [55] LYNDON RF. The Shoot Apical Meristem Its Growth and Development. Cambridge, UK, Cambridge University Press [56] MAYER S, LAUTERBACH C, NIEDERMEIER M, BARTH I, SJOLUND RD, SAUER N. Wounding enhances expression of AtSUC3, a sucrose transporter from Arabidopsis sieve elements and sink tissue. Plant Physiol 2004; 134: [57] MURCHISON EP, HANNON GJ. mirnas on the move: mirna biogenesis and the RNAi machinery. Curr Opin Cell Biol 2004; 16(3): [58] NOWAKOWSKA P, KOPCEWICZ J. Symplastowy transport bia³ek i RNA u roœlin. Post Biol Kom 2006; 33: [59] OHASHI Y, OKA A, RODRIGUES-POUSADA R, POSSENTI M, RUBERTI I, MORELLI G, AOYAMA T. Modulation of phospholipid signaling by GLABRA2 in root-hair pattern formation. Science 2003; 300(5624): [60] OLESON P, ROBARDS AW. The neck region of plasmodesmata:general architecture and some functional aspects. W: Parallels in Cell to Cell Junctions in Plants and Animals, [red.] AW Robards, WJ Lucas, JD Pitts, HJ Jongsma, Berlin/New York/Tokyo: Springer-Verlag, 1990: [61] OPARKA KJ, CRUZ SS. The great escape: phloem transport and unloading of macromolecules. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 2000; 52: [62] OPARKA KJ, PRIOR DAM. Direct evidence for pressure-generated closure of plasmodesmata. Plant J 1992; 2:

20 388 M. MARZEC, E. U. KURCZYÑSKA [63] PALEVITZ BA, HEPLER PK. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microiniection of lucifer yellow. Planta 1985; 16: [64] PATRICK JW. Phloem unloading: sieve element unloading and post-sieve element transport. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1997; 48: [65] PATRICK JW, OFFLER CE. Post-sieve element transport of photoassimilates in sink regions. J Exp Bot 1996; 47: [66] PERBAL M-C, HAUGHN G, SAEDLER H,SCHWARZ-SOMMER Z. Non-cell-autonomous function of the Antirrhinum floral homeotic proteins DEFICIENS and GLOBOSA is exerted by their polar cell-tocell trafficking. Development 1996; 122: [67] RAMSAY NA, GLOVER BJ. MYB-bHLH-WD40 protein complex and the evolution of cellular diversity. Trends Plant Sci 2005; 10(2): [68] RINNE PL, KAIKURANTA PM, VAN DER SCHOOT C. The shoot apical meristem restores its symplasmic organization during chilling-induced release from dormancy. Plant J 2001; 26(3): [69] RINNE PLH, VAN DER SCHOOT C. Symplasmic fields in the tunica of the shoot apical meristem coordinate morphogenetic events. Development 1998; 125: [70] ROBERTS AG, OPARKA KJ. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant Cell Environ 2003; 26: [71] RUIZ-MEDRANO R, XOCONOSTALE-CÁZARES B, KRAGLER F. The plasmodesmatal transport pathway for homeotic proteins, silencing signals and viruses. Curr Opin Plant Biol 2004; 7: [72] SESSIONS A, YANOFSKY MF, WEIGEL D. Cell-cell signaling and movement by the floral transcription factors LEAFY and APETALA1. Science 2000; 289: [73] van der SCHOOT C, RINNE P. Networks for shoot design. Trends Plant Sci 1999; 4: [74] SOKO OWSKA K. Regulacja ³¹cznoœci symplastowej w procesach wzrostu i rozwoju roœlin. Post Biol Kom 2005; 35: [75] SOWIÑSKI P. Plazmodesmy, jako element systemu komunikacji w roœlinach. Post Biol Kom 2002; 29: [76] STADLER R, SAUER N. The Arabidopsis thaliana AtSUC2 gene is specifically expressed in companion cells. Bot Acta 1996; 109: [77] STADLER R, LAUTERBACH C, SAUER N. Cell-to-cell movement of green fluorescent protein reveals post-phloem transport in the outer integument and identifies symplastic domains in Arabidopsis seeds and embryos. Plant Physiol 2005; 139: [78] STADLER R, WRIGHT KM, LAUTERBACH C, AMON G, GAHRTZ M, FEUERSTEIN A, OPARKA KJ, SAUER N. Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots. Plant J 2005; 41(2): [79] SUN K, HUNT K, HAUSER BA. Ovule abortion in Arabidopsis triggered by stress. Plant Physiol 2004; 135(4): [80] SNEYD J, DUFOUR JF. A dynamic model of the type-2 inositol trisphosphate receptor Proc Natl Acad Sci USA 2002; 4(99): [81] STEWART SA, DYKXHOORN DM, PALLISER D, MIZUNO H, YU EY, AN DS, SABATINI DM, CHEN IS, HAHN WC, SHARP PA, WEINBERG RA, NOVINA CD. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA 2003; 9(4): [82] ŒNIE KO R, CHUDZIK B. Zal¹ ek jako aktywny partner w procesie rozmna ania generatywnego roœlin kwiatowych. Kosmos 2003; 52: [83] TUCKER EB, BOSS WF. Mastoparan-Induced Intracellular Ca 2+ Fluxes May Regulate Cell-to-Cell Communication in Plants. Plant Physiol 1996; 111(2): [84] TRUCKER JE, MAUZERALL D, TUCKER EB. Symplastic transport of carboxyfluorescein in staminal hairs of Setcreasea purpurea is diffusive and includes loss to the vacuole. Plant Physiol 1989; 90: [85] TRUCKER EB, TRUCKER JE. Cell-to-cell diffusion in staminal hairs of Setcreasea purpurea. Protoplasma 1993; 174: [86] TUCKER EB. Calcium-loaded 1,2-bis (2-aminophenoxy) ethane-n,n,n0,n0-tetraacetic acid blocks cell-to-cell diffusion of carboxyfluorescein in staminal hairs of Setcreasea purpurea. Planta 1990, 182: [87] TYREE MT, TAMMES PML. Translocation of uranin in the symplasm of staminal hairs of Tradescantia. Revue canadienne de botanique 1975; 53: