Auksyna,,oczami roślin transgenicznych

Transkrypt

1 Auksyna,,oczami roślin transgenicznych dr Justyna Wiśniewska, UNIWERSYTET MIKOŁAJA KOPERNIKA w TORUNIU ZAKŁAD BIOTECHNOLOGII

2 Auksyny naturalne i sztuczne Naturalne auksyny: IAA - kwas indolilo-3-octowy IBA - kwas indolilo-3-masłowy 4-Cl-IAA - kwas 4-chloroindolilo-3-octowy, związki nieindolowe o właściwościach auksyny to kwas fenylooctowy czy kwas p- hydroksyfenylooctowy Syntetyczne auksyny: NAA - kwas naftylo-1-octowy 2,4-D - kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy

3 Rola auksyny u roślin Auksyna kontroluje szeroki zakres procesów zachodzących podczas ontogenezy rośliny takich jak: -ustanowienie osi apikalno-bazalnej zarodka, -stymulowanie podziałów komórkowych kambium, -wzrost wydłużeniowy komórek, - różnicowanie się tkanek przewodzących, -utrzymanie merystemu korzenia, - tworzenie korzeni bocznych, - dominację wierzchołkową, - filotaksję, - rozwój pąków bocznych i owoców, - kontrolowanie otwierania kolanka hypokotyla, - ruchy roślin (foto- i geotropizm) (za Davies, 2004)

4 Synteza i transport auksyny u roślin Teoria chemiosmotyczna (zmodyfikowano, Jones, 1998) (zmodyfikowano, Vieten i inni, 2007) (zmodyfikowano, Vieten i inni, 2007)

5 Lokalizacja białek PIN w wierzchołku korzenia A. thaliana zidentyfikowano 8 członków rodziny PIN (PIN1-PIN8), białka transbłonowe o charakterystycznej topologi brak danych o PIN5, PIN6 i PIN8 lokalizacja i polarność białek PIN jest różna w wierzchołku korzenia i pędzie A. thaliana PIN1 PIN2 PIN3 PIN4 PIN7 (przypuszczalna topologia białek PIN, Friml i inni, 2002) (w przygotowaniu, Wiśniewska, 2008)

6 Transport auksyny Białka PIN Białka AUX1/LAX Fenotyp mutanta pin1 Fenotyp mutanta pin1/3/4/7 Fenotyp mutanta aux1

7 Dynamiczny subkomórkowy transport pęcherzykowy nośników auksyny (w przygotowaniu, Wiśniewska, 2008)

8 Wizualizacja rozmieszczenia gradientu auksyny u A. thaliana Konstrukty DR5rev::GFP i DR5rev::GUS umożliwiły pośrednią wizualizację gradientu auksyny w komórkach A, B - sygnał DR5rev::GFP zlokalizowano w stadium 4-komórkowym i późne globularne rozwoju zarodkowego C - sygnał DR5rev::GFP zlokalizowano w zawiązkach primordiów liściowych merystemu wegetatywnego wierzchołka pędu D - sygnał DR5rev::GFP w rozwijających się zawiązkach kwiatów E, F w rozwijającej się po zapłodnieniu komórce G, J, K- DR5rev::GFP lub DR5rev::GUS w komórkach inicjalnych kolumelli merystemu korzenia H-Asymmetryczna ekspresja DR5rev::GUS w hypokotylu podczas reakcji fototropcznej I -Asymmetryczna ekspresja DR5rev::GUS w kolanku hypokotyla Benková et al., 2003

9 Wizualizacja rozmieszczenia gradientu auksyny i lokalizacji białek PIN w rozwoju zarodkowym u A. thaliana (zmodyfikowano, Friml i inni, 2003)

10 Wizualizacja rozmieszczenia gradientu auksyny podczas tworzenia zawiązków korzeni bocznych in vivo u A. thaliana Sygnał aktywności GUS zlokalizowano w poszczególnych stadiach rozwojowych primordiów korzeni bocznych i w komórkach kolumelli korzenia głównego (zmodyfikowano, Benková i inni, 2003)

11 Korelacja pomiędzy gradientem auksyny a polarną lokalizacją białka PIN1 podczas tworzenia korzeni bocznych DR5::GUS PIN1-GFP (zmodyfikowano, Benková i inni, 2003)

12 Ekspresja i lokalizacja białek PIN podczas tworzenia zawiązków korzeni bocznych PIN2::GUS PIN3::GUS PIN4::GUS PIN6::GUS Brak danych o: PIN5, PIN7 i PIN8 (zmodyfikowano, Benkowa i inni, 2003)

13 Model transportu i dystrybucji auksyny podczas tworzenia zawiązków korzeni bocznych i pędu korzeń boczny zawiązek pędu (Benková i inni, 2003)

14 Wizualizacja rozmieszczenia gradientu auksyny w merystemie pędu i lokalizacji białka PIN1:GFP u A. thaliana DR5::GFP PIN1-GFP A,B sygnał DR5::GFP w merystemie wierzchołkowym pędu (akumulacja auksyny na szczycie zawiązków liści i epidermie merystemu)(a) zaś brak sygnału po potraktowaniu NPA C - sygnał DR5::GFP na szczycie zawiązków kwiatów brak sygnału po potraktowaniu NPA D,E,F apikalna lokalizacja białka PIN1:GFP w epidermie i stopniowo bazalna w zawiązkach tkanki waskularnej merystemu wegetatywnego (D,E) i generatywnego (F) (zmodyfikowano, Benková i inni, 2003)

15 Gradient auksyny i lokalizacja białek PIN w wierzchołku korzenia głównego A. thaliana DR5::GUS DR5::GFP

16 Polarna lokalizacja białek PIN3 determinuje kierunek transportu auksyny podczas grawitropizmu korzenia 0 min 3 min DR5rev::GFP bazalna lokalizacja PIN3 w komórkach I i II rzędu kolumelli

17 Polarna lokalizacja białek PIN3 determinuje kierunek transportu auksyny podczas foto- i grawitropizmu pędu światło lateralna lokalizacja PIN3 w komórkach endodermy hypokotyla (Friml i Wiśniewska, 2005) - NPA + NPA

18 Co determinuje polarną lokalizację białek PIN? 1) typ komórek w których podlegają one ekspresji i struktura pierwszorzędowa białek PIN (Wiśniewska i inni, 2006) 2) aktywność białek: PINOID (proces fosforylacji), BIG, GNOM (transport pęcherzykowy), sterole (składniki plazmalemmy), włókna aktynowe (cytoszkielet) (Friml i inni, 2004; Michniewicz i inni, 2007) 3) poziom auksyny w komórce a tym samym szlak transdukcji sygnału komórkowego tego hormonu 4) sygnały zewnątrzkomórkowe (fototropizm, geotropizm) oraz sygnały wewnątrzkomórkowe (tworzenie korzeni bocznych) (Friml i inni, 2002; Benkova i inni, 2003) (Vieten i inni, 2007)

19 Co determinuje polarną lokalizację białek PIN? PIN2promotor::PINx:HA oraz PIN2promotor::PIN1:GFP Promotor PIN2 PIN2 HA tag Terminator polia NOS PIN2 Promotor PIN2 PIN1 HA tag Terminator polia NOS Promotor PIN2 PIN1 GFP PIN1 Terminator polia NOS (Wiśniewska i inni, 2006) Promotor PIN2 PIN3 HA tag Terminator polia NOS Promotor PIN2 PIN4 HA tag Terminator polia NOS Transformacja do roślin wt i pin2 (eir1) A.thaliana

20 Polarna lokalizacja białek PIN w wierzchołku korzenia PIN1 PIN3 PIN2 PIN4

21 Immunolokalizacja PIN2 w wierzchołku korzenia roślin transgenicznych Wt-Col eir1 PIN2pr::PIN2:HA (eir1) apikalna bazalna lokalizacja brak ekspresji apikalna bazalna lokalizacja

22 Immunolokalizacja PIN2 w wierzchołku korzenia roślin transgenicznych Wt-Col eir1 PIN2pr::PIN1:HA (eir1) 35S::PIN1 brak ekspresji w epidermie i korze apikalna bazalna lokalizacja bazalna lokalizacja PIN1 bazalnie zlokalizowany we wszystkich typach komórek

23 Immunolokalizacja PIN2 w wierzchołku korzenia roślin transgenicznych Wt-Col i eir1 PIN2pr::PIN3:HA (eir1) apikalna i bazalna lokalizacja symetrycznie zlokalizowane w komórkach kolumelli bazalna lokalizacja

24 Immunolokalizacja PIN2 w wierzchołku korzenia roślin transgenicznych Wt-Col i eir1 PIN2pr::PIN4:HA (eir1) apikalna i bazalna lokalizacja symetrycznie zlokalizowany w QC, komórkach inicjalnlnych kolumelli a bazalnie w komórkach merystemu proksymalnego bazalna lokalizacja

25 Co determinuje polarną lokalizację białek PIN? Opowiedz grawitropiczna linii transgenicznych (Wiśniewska i inni, 2006) Białka PIN pełnie tą samą funkcję a ich polarna lokalizacja w komórce determinuje kierunek transportu auksyny

26 DZIĘKUJĘ za uwagę