Mikrorozmnażanie roślin

Transkrypt

1 Mikrorozmnażanie roślin Technika mikrorozmnażania (rozmnażania klonalnego) pozwala rozmnożyć w warunkach in vitro materiał roślinny z niewielkich fragmentów roślin, tkanek lub pojedynczych komórek i otrzymać tym sposobem dużą ilość sadzonek w stosunkowo krótkim czasie. Jako eksplantaty pierwotne wykorzystywane są tu przede wszystkim tkanki merystematyczne, składające się z młodych, szybko dzielących się komórek. Tkanki te pozbawione są patogenów grzybowych i wirusów, stąd dają początek zdrowym roślinom

2 Mikrorozmnażanie (rozmnażanie klonalne, szybkie klonowanie) Tytuł scmikrorozmnażanie (rozmnażanie klonalne, szybkie klonowanie)hematu Mikrorozmnażanie Embriogeneza somatyczna Organogeneza bezpośrednia pośrednia bezpośrednia pośrednia kultura merystemów (rozwój pąków bocznych) kultura fragmentów pędów (rozwój pąków bocznych)

3 Mikrorozmnażanie in vitro Rozmnażanie cennych materiałów występujących w nielicznych egzemplarzach; Rozmnażanie materiałów matecznych; Tworzenie klonów z materiałów mieszańcowych; Produkcja zdrowego materiału; Produkcja sadzonek in vitro;?

4 Embriogeneza somatyczna

5 Embriogeneza somatyczna sposób wegetatywnego rozmnażania roślin polegający na indukcji rozwoju zarodków somatycznych (embrioidów) z tkanki somatycznej w warunkach in vitro.

6 Embriogeneza somatyczna Pozwala na uniezależnienie produkcji cennego materiału siewnego od czynników klimatycznych; Umożliwia przyspieszenie tworzenia nasion u roślin charakteryzujących się długim cyklem ich produkcji; Somatyczne zarodki mogą być bezpośrednio lub po wysuszeniu i/lub otoczkowaniu wykorzystywane jako tzw. sztuczne nasiona (someseed, artifficial seed, synthetic seed).

7 Embriogeneza somatyczna i zygotyczna - podobieństwa i różnice Embriogeneza in vivo Embriogeneza in vitro zygotyczna somatyczna gametyczna z zapłodnionej komórki jajowej apomiktyczna z komórek somatycznych kalus z mikrospor z izolowanych i połączonych gamet z niezapłodnionych komórek woreczka zalążkowego

8 Etapy embriogenezy

9 Embriogeneza somatyczna i zygotyczna - podobieństwa W procesie somatycznej embriogenezy roślin dwuliściennych występują podobne stadia rozwojowe takie jak wczesno-, środkowo- i późnoglobularne, wczesno- i późnosercowate torpedy i liścieniowe.

10 Embriogeneza somatyczna i zygotyczna - 1. Zarodki zygotyczne in vivo rozwijają się w woreczku zalążkowym w wyniku fuzji gamet. 2. Zarodki zygotyczne podczas rozwoju w stadium wczesnoglobularnym rozwijają suspensor, który zanika w stadium torpedy lub pozostaje w stadium szczątkowym. 3. Globularne stadia zarodków zygotycznych są mniejsze niż somatycznych. 4. Merystem wierzchołkowy zarodków zygotycznych jest lepiej rozwinięty. różnice 1. Zarodki somatyczne rozwijają się w warunkach in vitro bezpośrednio lub pośrednio z komórek eksplantatu pierwotnego. 2. Zarodki somatyczne nie mają suspensora. 3. Globularne stadia zarodków somatycznych są większe niż zygotycznych. 4. Merystem wierzchołkowy zarodków somatycznych jest słabiej rozwinięty.

11 5. Zarodki zygotyczne wytwarzają jeden liścień (rośliny jednoliścienne) lub dwa liścienie (rośliny dwuliścienne). 6. Rozwojowi zarodka zygotycznego towarzyszy rozwój bielma. 7. Zarodki zygotyczne otoczone są zawsze okrywą nasienną. 8. Rozwój zygotycznego zarodka kończy się powolnym odwodnieniem, które powoduje stopniową redukcję metabolizmu, zatem wraz z utrata wody z tkanek nasienia zarodek przechodzi w stan spoczynku. 5. Zarodki somatyczne wytwarzają dwa i więcej liścieni i często są one drobne. 6. W rozwoju zarodka somatycznego nie ma procesu tworzenia się bielma. 7. Zarodki somatyczne nie są okryte okrywą nasienną, stąd nie ma stadium liścieniowego w postaci laski. 8. Zarodki somatyczne naturalnie nie przechodzą procesu uśpienia, kiełkują przedwcześnie. 9. Zarodki somatyczne produkują takie same materiały zapasowe jak zygotyczne, ale w innym czasie i w innych ilościach.

12 Geneza zarodków powstających w wyniku embriogenezy somatycznej: 1. Pojedyncza komórka zarodek 2. Pojedyncza komórka PEM zarodek

13 Embriogeneza somatyczna

14 Pojedyncza komórka zarodek Większość zarodków somatycznych wywodzi się bezpośrednio z pojedynczej komórki. Jest to możliwe, gdy eksplantatami są zarodki zygotyczne, komórki ośrodka, synergidy lub epiderma liścieni.

15 Pojedyncza komórka PEM zarodek Pojedyncza komórka dzieląc się doprowadza do wytworzenia niewielkiej grupy komórek zwanej proembriogeniczną masą komórek PEM (ang. pre-embryogenic mass). Cechą charakterystyczną komórek tworzących PEM jest to, że nie rozłączają się po podziałach i wszystkie komórki wchodzące w skład pojedynczego PEM-u uczestniczą w formowaniu jednego lub kilku zarodków somatycznych. Jest to możliwe w przypadku zawiesin komórkowych, kultur kalusa lub protoplastów.

16 Bezpośrednia embriogeneza somatyczna Zarodki somatyczne formują się bezpośrednio tylko z tych komórek roślinnych, które są kompetentne już w momencie izolowania z rośliny macierzystej, czyli z proembriogenicznie zdeterminowanych komórek PEDCs (ang. preembryogenically determined cells) - komórek predysponowanych do różnicowania zarodków. PEDCs charakteryzują się małymi rozmiarami, stosunkowo gęstą cytoplazmą, małymi wakuolami, dużym jądrem z wyraźnymi jąderkami oraz plastydami z ziarnami skrobi. Cechują się dużą aktywnością podziałową i metaboliczną.

17 Bezpośrednia embriogeneza somatyczna Po przeniesieniu na pożywkę PEDCs następuje wyzwolenie naturalnych zdolności embriogennych komórek i rozpoczynają się intensywne podziały komórkowe. Bodźcem wyzwalającym proces embriogenezy bezpośredniej jest głównie egzogenna auksyna. eksplantat (zawiera PEDCs) zarodek

18 Pośrednia embriogeneza somatyczna

19

20

21

22 Pośrednia embriogeneza somatyczna 1. Zarodki somatyczne formują się z komórek kalusa, który powstaje na eksplantatach roślinnych. 2. Żywe komórki eksplantatu pod wpływem czynników kultury ulęgają odróżnicowaniu (dedyferencjacji) do stanu merystematycznego, następnie w wyniku podziałów wytwarzają kalus embriogenny. 3. W obrębie kalusa powstają indukowane embriogenicznie zdeterminowane komórki IEDCs (ang. Induced embryogenic determined cells).

23 4. IEDCs - komórki małe o stosunkowo gęstej cytoplazmie, słabo zwakualizowane, mające duże jądro z wyraźnymi jąderkami i plastydy zawierające ziarna skrobi. 5. Komórki te po kolejnych podziałach nie rozłączają się i w efekcie doprowadzają do powstania PEM-u, a z niej do formowania jednego lub kilku zarodków.

24 Pośrednia embriogeneza somatyczna Czynnikiem indukującym proces pośredniej embriogenezy somatycznej jest auksyna zawarta w pożywce. Eksplantat Kalus (zawiera IEDCs) PEM Zarodek lub zarodki

25 Prawidłowy przebieg ES w warunkach in vitro zależy od spełnienia dwóch warunków: 1. Do zapoczątkowania procesu niezbędna jest w pożywce obecność auksyny lub substancji auksynopochodnej. Dlaczego? Stymuluje podziały i wzrost komórek oraz powoduje rozdzielanie się komórek potomnych po podziale. Zwiększa się zagęszczenie komórek. Dochodzi do powstania IEDCs a następnie PEM-u.

26 Prawidłowy przebieg ES w warunkach in vitro zależy od spełnienia dwóch warunków: 2. Z chwilą rozpoczęcia embriogenezy konieczne jest obniżenie stężenia lub całkowite usunięcie auksyny z pożywki, gdyż hamuje ona rozwój zarodków. Dlaczego? Z chwilą powstania PEM-u następuje zmiana reakcji komórek na auksynę. Auksyna powoduje zwiększenie kwasowości ściany komórkowej, przez co staje się ona bardziej rozciągliwa, wskutek czego komórka może rosnąć (kwasowa teoria wzrostu). Auksyna hamuje wnikanie jonów wapnia do komórek PEM-u, co ogranicza prawidłową ekspresję genów i tworzenie struktur biegunowych.

27 Przebieg somatycznej embriogenezy in vitro INDUKCJA Indukcja kalusa Indukcja embriogeniczności IEDCs Pożywka stała z 2,4-D i kinetyną NAMNAŻANIE Proliferacja agregatów PEM Indukcja embriogeniczności Pożywka płynna z 2,4-D i NAA RÓŻNICOWANIE Inicjacja różnicowania Rozwój somatycznych zarodków Pożywka stała bez fitohormonów DOJRZEWANIE Indukcja tolerancji na desykację Spoczynek zarodków Pożywka stała z ABA

28 Kiełkowanie i konwersja zarodków zygotycznych i somatycznych

29 Sztuczne nasionko Zarodek somatyczny Membrana hydrofobowa Sztuczne bielmo

30 Otoczkowane zarodki somatyczne

31 Organogeneza Powstawanie przybyszowych struktur jednobiegunowych, tj. pędów, korzeni, kwiatów. W zależności od eksplantatu zawiązki nowych organów powstają z różnych warstw komórek, np. w eksplantatach łodygowych lub liściowych z epidermy lub warstw subepidermalnych, w eksplantatach korzeniowych z merystemów wtórnych, z kory pierwotnej lub okolic protoksylemu.

32 Organogeneza bezpośrednia Tworzenie zawiązków jednobiegunowych organów przybyszowych bezpośrednio z komórek pobranych z rośliny dawcy. Kompetentnymi do organogenezy bezpośredniej w obrębie eksplantatu mogą być: Pojedyncze komórki Niewielkie skupiska komórek

33 Organogeneza bezpośrednia Eksplantat (komórka / komórki kompetentne organ

34 Organogeneza bezpośrednia - pojedyncze komórki kompetentne Postępujące po sobie podziały doprowadzają do wytworzenia grupy kilku lub kilkunastu komórek merystematycznych, tworzących razem jeden zawiązek organu (inicjał).

35 Organogeneza bezpośrednia skupisko komórek kompetentnych 1. Utworzenie przez dzielące się komórki jednego zawiązka; 2. Powstawanie tylu zawiązków ile było komórek kompetentnych.

36 Organogeneza pośrednia Proces formowania de novo zawiązków organów przybyszowych z komórek kalusa powstającego wtórnie na eksplantacie roślinnym. Żywe komórki wyizolowane z rośliny dawcy, a nie mające kompetencji morfogenetycznych, pod wpływem czynników kultury in vitro podlegają odróżnicowaniu (dedyferencjacji) do stanu merystematycznego. Komórki te poprzez szybkie i wielokrotne podziały doprowadzają do wytworzenia kalusa. W niektórych jego komórkach dochodzi do indukcji kompetencji i w wyniku zmiany ekspresji określonych genów rozpoczyna się proces powtórnego różnicowania się (redyferencjacji) w wybranym kierunku.

37 Organogeneza pośrednia Eksplantat kalus (komórka / komórki o indukowanej kompetencji) organ

38 Organogeneza in vitro przez fazę kalusa

39 Kultury in vitro merystemów i fragmentów pędów

40 Multiplikacja na pożywce z cytokininą Ukorzenianie in vitro Merystemy wierzchołkowe lub kątowe - sterylizacja Inicjacja kultury in vitro

41 Po uprzedniej sterylizacji na pożywkę wykładane są młode pąki