(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/19 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/40 ( ) A61K 39/395 ( ) A61P 37/00 ( ) C07K 16/44 ( ) G01N 33/573 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała skierowane przeciwko NIK, ich wytwarzanie i zastosowanie (30) Pierwszeństwo: IL IL (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/28 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/09 (73) Uprawniony z patentu: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO., LTD., Rehovot, IL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 DAVID WALLACH, Rehovot, IL PARAMESWARAN RAMAKRISHNAN, Rehovot, IL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP.Z O.O. SKR. POCZT WARSZAWA Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek immunoregulacyjnych. W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał lub fragmentów przeciwciał zdolnych do swoistego wiązania kinazy indukującej NF-κB (NIK)/MAP3K14, lub jej specyficznej części, oraz ich zastosowania, przykładowo do regulacji aktywności biochemicznej NIK i/lub umożliwienia wykrywania NIK lub jego specyficznej części. Podstawa wynalazku [0002] Nie istnieje leczenie lub zadowalające leczenie licznych letalnych i/lub wysoce osłabiających chorób, związanych z deregulacją aktywności cząsteczek NF-κB, w tym chorób złośliwych i związanych z patologicznymi odpowiedziami immunologicznymi, takich jak choroby autoimmunologiczne, alergiczne, zapalne lub związane z przeszczepami. [0003] Cząsteczki rodziny NF-κB są kompleksami eukariotycznych czynników transkrypcyjnych, kluczowymi w regulacji odpowiedzi immunologicznych, wzrostu i przeżycia komórki (Ghosh S. i wsp., Annu Rev Immunol. 16:225-60), które są aktywowane indukowalnie przez prawie wszystkich przedstawicieli rodziny receptorów TNF/NGF. Cząsteczki NF-κB są zazwyczaj oddzielone w cytoplazmatycznym przedziale przez fizyczne związanie z rodziną inhibitorów cytoplazmatycznych, bogatych w ankyrynę, zwanych IκB, w tym IκBα i białka pokrewne (Baldwin AS. Jr., Annu Rev Immunol. 14:649-83). W odpowiedzi na rozmaite bodźce, w tym cytokiny, miogeny i produkty pewnych genów wirusowych, IκB jest szybko fosforylowany w Ser32 i Ser36, i jest ubikwitynowany, a następnie degradowany przez proteosom 26S. Pozwala to na uwolnienie NF-κB, translokację do jądra i udział w transaktywacji docelowego genu (Mercurio F. i Manning A.M., Curr Opin Cell Biol. 11:226-32; Pahl, H.L., Oncogene 18: ). Ostatnie badania dotyczące klonowania molekularnego zidentyfikowały kompleks wielu podjednostek kinazy IκB (IKK), który pośredniczy w indukowanej sygnałem fosforylacji IκB, będącego inhibitorem NF-κB. Kompleks IKK składa się z dwóch katalitycznych podjednostek, IKKα i IKKβ, oraz podjednostki regulacyjnej IKKγ (NEMO). Katalityczna aktywność zarówno IKKα jak i IKKβ może być aktywowana przez dużą grupę induktorów NF-κB, w tym cytokin zapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworów (TNF) i interleukina (IL)-1, receptor limfocytów T (TCR) i białko kostymulujące limfocyty T, CD28 (Karin, M. i Ben-Neriah, Y., Annu Rev Immunol. 18:621-63). [0004] Kinaza indukująca NF-κB (NIK)/MAP3K-14 (WIPO nr publ. WO A1 zgłoszona przez twórców niniejszego wynalazku) jest kluczowa w aktywacji of NF-κB. Przykładowo, wykazano, że nadekspresja NIK prowadzi do dramatycznej aktywacji NF-κB (artykuł przeglądowy Wallach D. i wsp., Arthritis Res. 4 Suppl 3:S189-96), a także pokazano, że ekspresja katalitycznie nieaktywnych mutantów NIK prowadzi do skutecznego zahamowania aktywacji NF-κB w odpowiedzi na różnorodne znane aktywatory NF-κB, takie jak LMP1, receptor TNF (TNFR)-1, TNFR-2, RANK, ludzki receptor Toll, CD3/CD28, receptor IL-1 (IL-1R), białko Tax wirusa limfotropowego ludzkich limfocytów T (HTLV)-1 oraz lipopolisacharyd (LPS) (Malinin, N.L. i wsp., Nature 385:540-4; Sylla, B.S. i wsp., Proc Natl Acad Sci USA. 95: ; Darnay, B.G. i wsp., J Biol Chem. 274: ; Lin, X. i wsp., Immunity 10:271-80; Geleziunas, R. i wsp., Mol Cell Biol. 18: ). Ukierunkowane rozerwanie genu NIK (Yin, L. i wsp., Science 291:2162-5) oraz badanie szczepu myszy alimfoplastycznej (aly), niosącego naturalną mutację punktową typu missens (niesynonimiczną) Gly855Arg w NIK (Shinkura, R. i wsp., Nat Genet. 22:74-7), ujawniły, że NIK odgrywa zasadniczą rolę w rozwoju narządów limfatycznych. Zarówno myszy aly/aly jak

3 nokauty NIK miały objawy układowego braku węzłów chłonnych i kępek Peyera, nieprawidłową budowę śledziony i grasicy oraz niedobór odporności, którego najbardziej charakterystycznymi cechami są niskie poziomy immunoglobulin i brak odrzucenia przeszczepu (Shinkura, R. i wsp., Nat Genet. 22:74-7). Nieprawidłowości te najwyraźniej odzwierciedlają zmienione przekazywanie sygnału przez różnorodne receptory. Rozwojowe niedobory mysich mutantów NIK są podobne do tych, które można zaobserwować u myszy z niedoborem receptora LT-β (LT-βR), co sugeruje, że NIK bierze także udział w przekazywaniu sygnału przez ten konkretny receptor. Wykazano, że osłabiona zdolność proliferacyjna limfocytów B u myszy aly/aly koreluje z upośledzoną odpowiedzią tych komórek na LPS i ligand CD40 (CD40L; Garceau, N. i wsp., J Exp Med. 191:381-6), a obecność zbyt dużej liczby limfocytów B1, w jamie otrzewnowej myszy, przypisano brakowi zasiedlania komórek otrzewnowych w tkance limfatycznej, występującej w obrębie przewodu pokarmowego (GALT, ang. gut-associated lymphatic tissue), w wyniku defektywnego przekazu sygnału za pośrednictwem receptora chemokin, we wtórnej tkance limfatycznej (Fagarasan, S. i wsp., J Exp Med. 191: ). [0005] Ważna i główna rola NIK, w przekazie sygnału za pośrednictwem receptora cytokin, została przedstawiona w badaniach prowadzonych przez Wallach i wsp., który pokazał przy użyciu systemu dwuhybrydowego, że łańcuch γ receptora IL-2 lub wspólny łańcuch γ", który jest elementem sygnałowym receptorów IL-2, -4, -7, IL-9, -13, -15 i -21, łączy się specyficznie z NIK (WO 03/087380). Ujawniono, że nadekspresja wspólnego łańcucha y podnosi aktywację NF-κB za pośrednictwem NIK oraz, że przy pobudzaniu przez IL-2 lub IL-15, NIK i elementy sygnałosomu wiążą się ze wspólnym łańcuchem γ. Wyniki te wskazują zatem na zaangażowanie NIK w przekazywanie sygnału za pośrednictwem wielu różnych receptorów cytokin, obejmujących wspólny łańcuch γ, jako podjednostkę sygnałową. [0006] Oprócz tych i innych wkładów w regulację rozwoju i funkcji układu immunologicznego, NIK jest także zaangażowana w regulację różnych funkcji innych niż odpornościowe. Myszy aly/aly (mimo, że nie są nokautami NIK) wykazują niekompletny rozwój gruczołu sutkowego (Miyawaki, S. i wsp., Eur J Immunol. 24:429-34). Ponadto, badania in vitro wskazują na udział NIK w przekazywaniu sygnału prowadzącego do różnicowania komórek mięśni szkieletowych (Canicio, J. i wsp., J Biol Chem. 276: ), oraz do przeżycia i różnicowania neuronów (Foehr, E.D. i wsp., J Biol Chem. 275: ). [0007] Zgodnie z sugerowaną rolą NIK, jako pośrednika aktywacji NF-κB, fibroblasty pochodzące od myszy aly/aly i nokautów NIK nie są w stanie aktywować NF-κB w odpowiedzi na aktywację LT-βR. Ponadto, podniesienie poziomu regulacji VCAM-1 przez LT-βR, która pojawia się na skutek aktywacji NF-κB, jest nieprawidłowa w fibroblastach zarodkowych myszy aly/aly (MEF, ang. mouse embryonic fibroblast; Matsumoto, M. i wsp., J Immunol. 163: ). Zaobserwowano także upośledzoną fosforylację IκB w odpowiedzi limfocytów B aly/aly na ligację CD40. Przeciwnie, w komórkach dendrytycznych tych myszy, fosforylacja IκB indukowana przez CD40 wydaje się prawidłowa (Garceau, N. i wsp., J Exp Med. 191:381-6). Komórki otrzewnowe aly/aly także nie są zdolne, aby odpowiedzieć na chemokinę SLC zwiększoną aktywnością NF-κB (Fagarasan, S. i wsp., J Exp Med. 191: ). [0008] Oszacowanie wzoru wytwarzanych rodzajów cząsteczek NF-κB w narządach limfatycznych myszy aly/aly pokazało, że oprócz roli jaką odgrywa w regulacji kompleksu(ów) NF-κB obejmujących białka Rel (A+p50) i IκB, NIK bierze także udział w kontroli ekspresji/aktywacji innych rodzajów NF-κB. W szczególności, limfocyty aly/aly są defektywne w p52, rodzaju NF-κB, które jest specyficznie wytwarzane w

4 dojrzałych limfocytach B, na drodze przekształcenia proteolitycznego nieaktywnego prekursora, p100 (NF-κB2), co sugeruje brak przekształcenia p100 w p52 (Yamada, T. i wsp., J Immunol. 165:804-12). Rzeczywiście, pokazano, że NIK bierze udział w miejscowo specyficznej fosforylacji p100. Oba bezpośrednio uczestniczą w fosforylacji IKKα, który z kolei fosforyluje p100. Fosforylacja ta służy jako molekularny wyzwalacz ubikwitynacji i aktywnego przekształcania p100 do formy p52. Wykazano, że aktywność przekształcająca p100 była usuwana przez mutację aly (Xiao, G. i wsp., Mol Cell 7:401-9; Senftleben, U. i wsp., Science 293:1495-9). [0009] Zważywszy na strukturalną homologię NIK z kinazami MAP3K, poczyniono pewne starania w celu zbadania zaangażowania NIK w kaskady ERK, JNK i p38, trzy inne główne kaskady kinaz białkowych, w których biorą udział kinazy MAP3K (Akiba, H. i wsp., J Biol Chem. 273: ). Pokazano, że NIK jest zaangażowana w kaskadę ERK w komórkach PC12 barwiaka chromochłonnego (Foehr, E.D. i wsp., J Biol Chem. 275: ). Pokazano także dowód na to, że w pewnych komórkach NIK może uczestniczyć w przekazywaniu sygnału dla fosforylacji Jun, leżącego w szlaku poniżej miejsca docelowego kaskady JNK, niezależnie od tej konkretnej kaskady (Akiba, H. i wsp., J Biol Chem. 273: ; Natoli, G. i wsp., J Biol Chem. 272: ). Ogólnie, ujawnienia te wskazują, że NIK rzeczywiście służy jako mediator aktywacji NF-κB, lecz może także pełnić inne funkcje, oraz, że funkcje te są komórkowolub receptorowo-specyficzne. [0010] Podobnie do innych kinaz MAP3K, NIK może być aktywowana w wyniku fosforylacji pętli aktywacyjnej w cząsteczce NIK. Rzeczywiście, mutacja miejsca fosforylacji w tej pętli (Thr559) zapobiega aktywacji NF-κB w warunkach nadekspresji NIK (Lin, X. i wsp., Immunity 10:271-80). Dodatkowo, wydaje się, że aktywność NIK jest regulowana przez zdolność regionów położonych powyżej i poniżej jej motywu kinazowego do wzajemnego wiązania się (Lin i wsp. Molec. Cell Biol. (18) ). Pokazano, że region końca C z NIK, położony poniżej motywu kinazowego jest zdolny do bezpośredniego wiązania się z IKKα (Regnier, C.H. i wsp., Cell 90:373-83), jak również z p100 (Xiao, G. i Sun, S.C., J Biol Chem. 275: ) i z TRAF2 (Malinin, N.L. i wsp., Nature 385:540-4). Oddziaływania takie są najwyraźniej wymagane do funkcjonowania NIK w przekazywaniu sygnału NF-κB. Region końca N z NIK zawiera negatywną domenę regulacyjną (NRD, ang. negative-regulatory domain), złożoną z motywu zasadowego (BR) oraz motywu z powtórzeniami bogatymi w prolinę (Xiao, G. i wsp., Mol Cell 7:401-9). Najwyraźniej, NRD na końcu N oddziałuje z regionem końca C z NIK w cis, hamując tym samym wiązanie NIK ze swoim substratem (IKKα i p100). Wydaje się, że ektopowo wyrażana NIK tworzy spontanicznie oligomery, w których wiązania regionów końca N i końca C, w każdej cząsteczce NIK, są najwyraźniej przerwane i wykazują wysoki poziom konstytutywnej aktywności (Lin, X. i wsp., Immunity 10:271-80). Wiązanie regionu końca C NIK z adaptorowym białkiem TRAF2, związanym z receptorem TNF, jak również z innymi białkami TRAF, (Malinin, N.L. i wsp., Nature 385:540-4; Rothe, M. i wsp.,1994. Cell 78:681-92; Takeuchi, M. i wsp., J Biol Chem. 271: ) najprawdopodobniej bierze udział w aktywacji NF-κB przez NIK. [0011] Przedstawiono dowód na to, że NIK, przez wiązanie się jej regionu końca C z IKKα, może aktywować kompleks IKK. Pokazano, że jest zdolna do fosforylacji Ser176 w pętli aktywacyjnej IKKα i tym samym aktywuje tę cząsteczkę (Ling, L. i wsp., Proc Natl Acad Sci USA. 95:3792-7). Spójnie z takim sposobem działania, badania dotyczące mechanizmów wyjaśniających brak aktywacji NF-κB przez LT-βR u myszy MEF aly/aly wykazały, że mutacja w NIK usuwa aktywację sygnałosomu IKK, a w konsekwencji

5 fosforylację IκB (Matsushima, A, i wsp., J Exp Med. 193:631-6). Zdolność NIK do bezpośredniego wiązania p100 za pośrednictwem regionu jej końca C oraz jego fosforylowania sugeruje, że p100 stanowi bezpośredni substrat NIK (Xiao, G. i Sun, S.C., J Biol Chem. 275: ). Pomimo to, ostatnie badania sugerują, że NIK pośredniczy w fosforylacji p100 w sposób pośredni, przez fosforylację, a zatem i aktywację IKKα, który z kolei fosforyluje p100 (Senftleben, U. i wsp., Science 293:1495-9). [0012] Zatem, aktywacja cząsteczek NF-κB przez NIK stanowi kluczowy punkt kontrolny dla regulacji aktywności NF-κB. [0013] Jak opisano powyżej, deregulacja aktywności NF-κB jest związana z patogenezą wielu poważnych chorób ludzkich, takich jak szereg chorób złośliwych i chorób związanych z patologicznymi odpowiedziami immunologicznymi (przegląd w Yamamoto i Gaynor, J Clin Invest. 107: ). Przykładowo, aktywacja szlaku NFκB jest znacznie zaangażowana w patogenezę przewlekłej choroby zapalnej, takiej jak astma i reumatoidalne zapalenie stawów (Tak i Firestein, J Clin Invest. 107:7-11; Karin, M. i Ben- Neriah, Y., Annu Rev Immunol. 18:621-63), oraz nieswoiste zapalenie jelit. Ponadto, wydaje się, że zmieniona regulacja NF-κB jest zaangażowana w patogenezę innych chorób, takich jak miażdżyca tętnic (Collins i Cybulsky, J Clin Invest. 107:255-64; Leonard, W.J. i wsp., Immunol Rev. 148:97-114) oraz choroba Alzheimera (Mattson i Camandola, J Clin Invest 107:247-54; Lin, X. i wsp., Immunity 10:271-80), w których przynajmniej częściowo zaangażowana jest odpowiedź zapalna. [0014] Kilka rodzajów dowodów wskazuje na to, że aktywacja genów cytokin za pomocą NF-κB jest ważnym czynnikiem wspierającym patogenezę astmy, która charakteryzuje się infiltracją komórek zapalnych i deregulacją wielu cytokin i chemokin w płucach (Ling, L. i wsp., Proc Natl Acad Sci USA. 95:3792-7). Cytokiny, takie jak TNF, które aktywują NF-κB mają występują na podwyższonym poziomie w mazi stawowej pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów i przyczyniają się do przewlekłych zmian zapalnych oraz hiperplazji błony maziowej obserwowanej w stawach tych pacjentów (Malinin, N.L. i wsp., Nature 385:540-4). Podawanie przeciwciał skierowanych wobec TNF lub skróconemu receptorowi TNF, który wiążą się z TNF może wyraźnie złagodzić objawy u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. [0015] Wzrosty wytwarzania cytokin prozapalnych, przez zarówno limfocyty jak i makrofagi były także wiązane z patogenezą nieswoistego zapalenia jelit, włączając chorobę Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (Matsumoto, M. i wsp., J Immunol. 163: ). Aktywacja NF-κB jest obserwowana w próbkach bioptatów śluzówki od pacjentów z aktywną chorobą Crohna i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego. Leczenie pacjentów cierpiących na nieswoiste zapalenia jelit steroidami obniża aktywność NF-κB w próbkach pobranych do badań tkanek i zmniejsza objawy kliniczne. Wyniki te wskazują na to, że pobudzenie szlaku NF-κB jest zaangażowane we wzmocnienie odpowiedzi zapalnej związanej z tymi chorobami. [0016] Miażdżyca tętnic jest wyzwalana przez szereg urazów śródbłonka i mięśnia gładkiego uszkodzonej ściany naczyń (Matsushima i wsp., 2001). W tym przewlekłym zapaleniu i procesie proliferacji tkanki włóknistej bierze udział duża liczba czynników wzrostu, cytokin i chemokin uwalnianych przez komórki śródbłonkowe, mięśnie gładkie, makrofagi i limfocyty (Matsushima, A. i wsp., J Exp Med. 193:631-6). Regulacja genów zaangażowanych w odpowiedź zapalną oraz w kontrolę proliferacji komórek przez NF-κB jest powszechnie uważana za odgrywającą ważną rolę w zapoczątkowaniu i progresji miażdżycy tętnic. [0017] Jak opisano powyżej, pokazano, że nieprawidłowości w regulacji szlaku NF-κB są zaangażowane w patogenezę choroby Alzheimera. Przykładowo, immunoreaktywność NF-κB jest odnajdywana głównie w i wokół płytek neurytycznych w chorobie Alzheimera we wczesnych etapach ich rozwoju, podczas gdy

6 dojrzałe rodzaje płytek wykazują zdecydowanie zredukowaną aktywność NF-κB (Mercurio F. i Manning A.M., Curr Opin Cell Biol. 11:226-32). Zatem, aktywacja NF-κB występuje w podczas początkowego etapu powstawania miażdżycowych płytek neurogennych i apoptozy neuronów we wczesnej fazie choroby Alzheimera. Wyniki te wskazują zatem na to, że aktywacja szlaku NF-κB odgrywa rolę w szeregu chorób z komponentą zapalną, zaangażowaną w ich patogenezę. [0018] Dodatkowo, oprócz roli w patogenezie chorób związanych z deregulacją odpowiedzi immunologicznych, nadmierna aktywacja lub aktywacja konstytutywna szlaku NF-κB była także wiązana z patogenezą różnych ludzkich nowotworów. Nieprawidłowo wysoka i/lub konstytutywna aktywacja szlaku NF-κB jest często obserwowana w różnych chorobach o charakterze nowotworowym u ludzi, w tym w białaczkach, chłoniakach oraz guzach litych (Miyawaki, S. i wsp., Eur J Immunol. 24:429-34). Nieprawidłowości te są wynikiem nieprawidłowo i/lub konstytutywnie wysokich poziomów NF-κB w jądrze wielu guzów, w tym raka sutka, jajnika, gruczołu krokowego i okrężnicy. Większość z tych zmian wynika prawdopodobnie ze zmian w białkach regulacyjnych, które aktywują drogi przekazywania sygnału prowadzące do aktywacji szlaku NF-κB. Chociaż, w wyniku mutacji, które inaktywują białka IκB, oprócz amplifikacji i rearanżacji genów kodujących przedstawicieli rodziny NF-κB, może dochodzić do wzmocnienia poziomów NF-κB w jądrze obserwowanego w niektórych nowotworach (Emmerich i wsp. Blood Nov 1;94 (9): , 1999). [0019] Ponieważ, jak opisano powyżej, NIK jest kluczowa w aktywacji NF-κB, jedna z teoretycznie wydajnych strategii regulacji aktywacji NF-κB, a tym samym leczenia chorób związanych z deregulacją aktywności NF-κB, wymaga zidentyfikowania przeciwciał zdolnych do swoistego wiązania NIK lub jej specyficznego fragmentu, co powodowałoby zapobieganie lub hamowanie aktywacji NF-κB przez NIK. [0020] Podejścia znane ze stanu techniki nie zdołały dostarczyć przeciwciał zdolnych do wiązania NIK fosforylowanej w aminokwasie T559. Jedno z takich przeciwciał, które rzekomo miało być swoiste wobec NIK fosforylowanej w T559, zakupiono w ostatnim roku (2002) w Santa Cruz (SC12957R w Nacalai Tesque News, [on-line] tom 12, 2001). Jednakże, przeciwciało to nie działało odpowiednio w naszych rękach i wiązało także mutanta NIK, który nie mógł być fosforylowany w T559. Tego roku Santa Cruz usunęła je ze swojego katalogu. EP-A opisuje przeciwciała skierowane wobec innej kinazy, zwanej kinazą oddziałującą z Nck (NIK) / MAP4k4. Obecnie, sposób wykrywania różnych rodzajów cząsteczek NIK, obejmujących aktywne fosforylowane i niefosforylowane rodzaje, wykorzystuje nadekspresję NIK ze znacznikiem epitopowym w komórkach i przeciwciało przeciw temu znacznikowi. Metoda ta ma wiele ograniczeń przy wykrywaniu fosforylowanego NIK, z których jednym jest takie, że metoda ta nie może być stosowana do specyficznie wykrywanej, endogennie aktywowanej NIK. [0021] Istnieje zatem znaczące zapotrzebowanie na przeciwciała zdolne do wiązania endogennej fosforylowanej NIK i ich posiadanie byłoby bardzo korzystne. Streszczenie wynalazku [0022] Wynalazek dotyczy poliklonalnego, monoklonalnego, chimerycznego, humanizowanego, ludzkiego lub anty-anty-idiotypowego przeciwciała lub jego fragmentów, zdolnego do swoistego wiązania sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, lub jej części, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 z SEKW. NR ID.: 5.

7 [0023] W jednym wykonaniu wynalazku, fragment przeciwciała jest wybrany z grupy składającej się z jednołańcuchowego Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 oraz CDR, zdolnych do swoistego wiązania sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, lub jej części, takiej jak ta w SEKW. NR ID. 6 i 3, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5. [0024] W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała IgG, poliklonalnego, monoklonalnego, takiego jak przeciwciała wytworzone przez hybrydomę NIK-P , zdeponowaną w CNCM pod nr I [0025] Opisane jest także poliklonalne, monoklonalne, chimeryczne, humanizowane, ludzkie lub anty-antyidiotypowe przeciwciało lub jego fragment, zdolne do swoistego wiązania NIK lub muteiny, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji, permutowanej kołowo pochodnej lub ich soli, przy czym przeciwciało jest wytworzone przez immunizację ssaka sekwencją aminokwasową, lub częścią sekwencji aminokwasowej, przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, korzystnie części aminokwasowej w SEKW. NR ID.:3. W korzystnym wykonaniu wynalazku, przeciwciało według wynalazku jest zdolne do regulowania aktywności biologicznej cząsteczki NIK i/lub do specyficznego wykrywania ufosforylowanej NIK lub jej specyficznej części np. za pomocą analizy typu Western immunoblotting, ELISA lub immunoprecypitacji. [0026] W innym aspekcie, wynalazek dostarcza przeciwciał monoklonalnych wytworzonych przez hybrydomę NIK-P , zdeponowaną w CNCM pod nr I [0027] Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz jako aktywny składnik, poliklonalne, monoklonalne, chimeryczne, humanizowane, ludzkie lub anty-antyidiotypowe przeciwciało lub jego fragmenty, zdolne do swoistego wiązania sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5 lub jej części, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5. Bardziej szczegółowo, kompozycja farmaceutyczna obejmuje przeciwciało lub fragment przeciwciała, które jest ponadto zdolne do regulacji aktywności biochemicznej cząsteczki NIK, np. hamowania przekazywania sygnału przez CD40 i/lub CD70. [0028] W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu regulowania aktywności biochemicznej NIK, który obejmuje kontaktowanie cząsteczki NIK z poliklonalnym, monoklonalnym, chimerycznym, humanizowanym, ludzkim lub anty-anty-idiotypowym przeciwciałem lub jego fragmentami zdolnymi do swoistego wiązania sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, lub jej części, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5, przez co reguluje się biochemiczną aktywność cząsteczki NIK. Bardziej szczegółowo, wyżej wskazane kontaktowanie cząsteczki NIK z omawianym preparatem może być przeprowadzone przez podanie tego preparatu osobnikowi. [0029] W jednym wykonaniu, wynalazek dotyczy kompozycji obejmującej podłoże, takie jak matryca do chromatografii powinowactwa, kowalencyjnie połączony z peptydem o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, lub jej części, np. tej z SEKW. NR ID.: 3, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5, do selektywnego wychwytywania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała zdolnego do swoistego wiązania docelowego antygenu. [0030] W dalszym wykonaniu, wynalazek dotyczy sposobu leczenia choroby wywołanej lub postępującej w wyniku aktywności NIK, który obejmuje podawanie potrzebującemu osobnikowi przeciwciała zdolnego do

8 swoistego wiązania sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, lub jej części, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5. [0031] W dalszym wykonaniu, wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania białka wiążącego NIK, który obejmuje kontaktowanie próbki, takiej jak płyny ustrojowe, ekstrakty komórkowe i biblioteki ekspresyjne DNA, próbki zawirające NIK oraz białko wiążące NIK z przeciwciałem według wynalazku, koimmunoprecypitację NIK i białka wiążącego NIK, płukanie kompleksu immunologicznego oraz odzyskiwanie białka wiążącego NIK z kompleksu immunologicznego z zastosowaniem peptydu kompetycyjnego otrzymanego z NIK. [0032] W dalszym wykonaniu, wynalazek dostarcza zastosowania przeciwciała według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 12 do opracowania testu ELISA. [0033] W dalszym wykonaniu, wynalazek dostarcza zastosowania przeciwciała według wynalazku do immunologicznego oczyszczania NIK lub muteiny, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji, permutowanej kołowo pochodnej lub ich soli. [0034] Dodatkowo, w jednym wykonaniu wynalazek ujawnia zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała zdolnego do swoistego wiązania sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, lub jej części, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5, do wytwarzania leku do leczenia choroby wywołanej lub postępującej w wyniku aktywności NIK. [0035] W korzystnym wykonaniu wynalazku, choroba jest związana z patologicznymi odpowiedziami immunologicznymi, takimi jak odpowiedzi autoimmunologiczne, alergiczne i związane z przeszczepem oraz korzystnie z astmą, reumatoidalnym zapaleniem stawów, nieswoistym zapaleniem jelit, miażdżycą tętnic i chorobą Alzheimera. W innym korzystnym wykonaniu według wynalazku choroba jest chorobą złośliwą. [0036] Dodatkowo, wynalazek ujawnia zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała według wynalazku w sposobie identyfikowania liganda zdolnego do indukowania w komórce aktywacji NFκB za pośrednictwem NIK. W jednym wykonaniu wynalazku, sposób obejmuje etap wprowadzenia przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do komórki, inkubowania komórki z poszczególnymi ligandami, monitorowania aktywacji NFκB, a korzystnie aktywacji NFκB za pomocą klasycznego szlaku np. przez monitorowanie degradacji IκBa, i selekcjonowania liganda, za pomocą którego aktywacja NFκB jest zaburzona specyficzną blokadą NIK przez przeciwciało. W korzystnym wykonaniu, komórka w tym sposobie identyfikowania liganda pochodzi z linii komórek limfoblastycznych, takich jak komórki Ramos, BJAB i Jurkat. [0037] Wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, który obejmuje hodowanie sklonowanej hybrydomy obejmującej komórkę śledziony ze ssaka immunizowanego sekwencją aminokwasową zawierającą SEKW. NR ID.: 6, lub jej część, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5, oraz homogennej lub heterogennej komórki limfoidalnej w podłożu ciekłym lub brzuchu ssaka, tak aby umożliwić hybrydomie wytwarzanie i gromadzenie przeciwciała monoklonalnego. [0038] Wynalazek jest zdefiniowany za pomocą zastrzeżeń patentowych.

9 Krótki opis rysunków [0039] Wynalazek jest niniejszym opisany tylko na drodze przykładów w odniesieniu do załączonych rysunków. W odniesieniu do rysunków przedstawionych szczegółowo, należy podkreślić, że szczegóły są pokazane jedynie na drodze przykładu tylko w celu zilustrowania i omówienia korzystnych wykonań niniejszego wynalazku i są przedstawione, ponieważ są uważane za najbardziej przydatne i łatwo zrozumiałe w opisie zasad i aspektów koncepcyjnych wynalazku. W tym odniesieniu, nie podjęto prób przedstawienia strukturalnych szczegółów wynalazku bardziej skrupulatnie niż jest to konieczne dla podstawowego zrozumienia wynalazku; opis wraz z rysunkami przedstawia specjalistom w dziedzinie w jaki sposób kilka postaci wykonania wynalazku może być wykorzystane w praktyce. [0040] Na rysunku: Fig. 1 przedstawia schemat obrazujący domeny NIK, T559, koniec N kinazy oraz domenę końca C z NIK ( ), itd. Fig. 2 przedstawia sekwencję obrazującą sekwencję aminokwasową ludzkiej NIK (SEKW. NR ID.: 5). Podkreślono pochodzący z NIK peptyd przedstawiony w SEKW. NR ID.:3, stosowany do immunizacji. Fig. 3 przedstawia sekwencję aminokwasową pętli aktywacyjnej NIK (SEKW. NR ID.: 4) Fig. 4 przedstawia immunoprecypitację (IP) z różnymi przeciwciałami monoklonalnymi przygotowanymi przy użyciu fosforylowanego peptydu przedstawionego w SEKW. NR ID.:3. Komórki transfekowano pcs3mtnik (WT-NIK) lub wektorem kodującym wersję nie poddającego się fosforylacji białka pcs3mtnikt559a (NIK-). Stransfekowane komórki zbierano i lizowano w 2 ml 1% buforu NP-40. Do każdej IP stosowano 100µl lizatu. IP prowadzono z kulkami opłaszczonymi białkiem G ze wskazanymi przeciwciałami. Wykrywanie typu Western blotting oraz kontrolę pozytywną IP prowadzono z przeciwciałem anty-myc. Fig. 5 przedstawia zróżnicowanie wiązania przeciwciała przygotowanego z peptydem z SEKW. NR ID.:3, z ufosforylowanym peptydem pochodzącym z pętli aktywacyjnej za pomocą testu ELISA. Kontrolą oraz ufosforylowanym peptydem pochodzącym z peptydu pętli aktywacyjnej (SEKW. NR ID.:3) opłaszczono płytki mikrotitracyjne w stężeniu 10µg/ml. Dodawano nierozcieńczony nadsącz hodowli hybrydomy klonu NIK-P na 1 godz. w temp. 37 C. Jako przeciwciało drugorzędowe stosowano anty mysie HRP w rozcieńczeniu 1:10K i mierzono OD 405, stosując jako substrat ABTS. Fig. 6 przedstawia wpływ NIK-P na degradację IkB indukowaną przez CD70, CD40 lub TNF. Komórki Ramos transfekowano IgG (kontrola negatywna) lub przeciwciałem NIK-P (α-pnik). Stransfekowane komórki pozostawiano bez traktowania lub traktowano CD70, CD40 i TNF, odpowiednio, przez 20 min., 30 min. i 20 min. Po traktowaniu ligandem, komórki lizowano i poddawano analizie typu Western immunoblotting, stosując jako sondę przeciwciało anty-ikb. Fig. 7 przedstawia wpływ NIK-P , na degradację IkB indukowaną CD40, przy użyciu różnych przeciwciał otrzymanych wobec peptydu NIK, zlokalizowanego również w domenie kinazowej, lecz na zewnątrz pętli aktywacyjnej. Komórki transfekowano IgG (kontrola negatywna), przeciwciałem NIK-P (p4) lub innym przeciwciałem otrzymanym wobec peptydu NIK, zlokalizowanego również w domenie kinazowej, lecz na zewnątrz pętli aktywacyjnej (SEKW. NR ID.:7, 81). Stransfekowane komórki pozostawiano bez traktowania (-cd40) lub traktowano CD40 (+cd40) przez 30 min. Po traktowaniu ligandem, komórki lizowano i poddawano analizie typu Western immunoblotting, stosując jako sondę przeciwciało anty-ikb.

10 Opis korzystnych wykonań [0041] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała lub fragmentu przeciwciała zdolnego do swoistego wiązania kinazy indukującej NF-κB (NIK)/MAP3KI4 (SEKW. NR ID.:5) fosforylowanej w reszcie T559 lub jej specyficznej części oraz ich zastosowania. Konkretnie, przeciwciało według wynalazku można stosować do regulowania aktywności biochemicznej NIK oraz do specyficznego wykrywania NIK ufosforylowanej w reszcie T559 lub jej specyficznej części. Z uwagi na umożliwienie takiej regulacji i takiego wykrywania, przeciwciało można zastosować, odpowiednio, do regulowania aktywacji NF-κB i w związku z tym, do leczenia chorób związanych z deregulacją aktywności NF-κB, oraz do charakteryzowania aspektów prawidłowych/patologicznych, biologicznych/biochemicznych, procesów/stanów, w które zaangażowana jest NIK lub jej specyficzna część. [0042] Nie istnieje sposób leczenia, ani zadowalającego leczenia, licznych letalnych i/lub wysoce osłabiających chorób związanych z deregulacją aktywności NF-κB. Choroby takie obejmują choroby złośliwe oraz choroby, takie jak choroby autoimmunologiczne, alergiczne, zapalne lub związane z przeszczepami, które są związane z patologicznymi odpowiedziami immunologicznymi. Ponieważ NIK jest kluczowym aktywatorem NF-κB, jedna teoretycznie wydajna strategia leczenia choroby związanej z deregulacją aktywności NF-κB wymaga zidentyfikowania przeciwciał zdolnych do swoistego wiązania ufosforylowanej NIK lub jej specyficznego fragmentu, oraz zastosowania takich przeciwciał do terapeutycznej regulacji aktywności NF-κB. Z uwagi na umożliwienie specyficznego wykrywania ufosforylowanej NIK lub jej specyficznej części, przeciwciała umożliwiłyby charakteryzację aspektów prawidłowych/patologicznych, biologicznych/biochemicznych, procesów/stanów, w które zaangażowana jest ufosforylowana NIK lub jej specyficzna część. [0043] Ograniczając niniejszy wynalazek do praktyki, niespodziewanie wytworzono przeciwciało zdolne do swoistego wiązania lub optymalnie swoistego wiązania NIK (SEKW. NR ID.:5) ufosforylowanej w T559, lub jej specyficznej części, takiej jak przedstawiono w SEKW. NR ID.:3. Zdolność przeciwciała według wynalazku do swoistego wiązania NIK ufosforylowanej w T559, lub jej specyficznej części, takiej jak przedstawiono w SEKW. NR ID.:3 jest unikatowa w odniesieniu do wszystkich wcześniejszych przeciwciał. [0044] W związku z tym, w ostrym kontraście do wcześniejszych przeciwciał, przeciwciało według wynalazku może być stosowane do optymalnej regulacji biochemicznej aktywności, takiej jak aktywność kinazowa NIK, lub jej specyficznej części, oraz do optymalnego wykrywania NIK ufosforylowanej w T559 lub jej specyficznej części. Przeciwciało według wynalazku może także być stosowane do ko-immunoprecypitacji i izolacji czynników regulacyjnych wiążących NIK ufosforylowaną w T559. [0045] Zwykli specjaliści w dziedzinie docenią, że przeciwciało, takie jak to według wynalazku może być traktowane przy użyciu standardowych metod, przykładowo, takich jak opisano poniżej, tak aby wytworzyć jedno lub większą liczbę rodzajów fragmentów przeciwciała, posiadających cechy charakterystyczne wiązania antygenu zasadniczo identyczne z tymi dla nietraktowanego przeciwciała. [0046] Zatem, według jednego aspektu według wynalazku, dostarczane jest przeciwciało lub fragment przeciwciała, zdolne do swoistego wiązania NIK ufosforylowanej w T559, lub jej części, takiej jak sekwencja aminokwasowa przedstawiona w SEKW. NR ID.: 3. [0047] Terminem część peptydu określony jest co najmniej tripeptyd w pętli aktywacyjnej, przy czym jeden z aminokwasów jest ufosforylowaną treoniną, a aminokwasy przylegające na końcu N i końcu C są, odpowiednio, glicyną i kwasem glutaminowym, tzn. GT(p)E.

11 Części ufosforylowanej pętli aktywującej (SEKW. NR ID.: 4) posiadające jako przedostatni aminokwas ufosforylowaną T599 są tu określone jako antygen docelowy. T599 jest resztą treoninową w pozycji T599 w całym białku NIK (SEKW. NR ID.:5) i jest także resztą treoninową, konserwowaną w jej częściach pochodnych, np. treonina w pozycji 11 w SEKW. NR ID.:3, treonina w pozycji 26 w SEKW. NR ID.: 4, treonina w pozycji 26 w SEKW. NR ID.:6. [0048] Jak opisano poniżej, przeciwciało może być stosowane do optymalnej regulacji biochemicznej aktywności kinazy indukującej NF-κB (NIK)/MAP3K14, takiej jak aktywność kinazowa, w związku z tym może być stosowane do optymalnej regulacji aktywacji NF-κB, i przez to może być stosowane do optymalnego leczenia choroby związanej z deregulacją aktywności NF-κB. Ponadto, przeciwciało może być unikatowo stosowane do wykrywania fosforylacji regionu pętli aktywacyjnej NIK, lub różnych, dowolnych specyficznych części regionu pętli aktywacyjnej NIK. Jako takie, przeciwciało może być wykorzystywane do charakteryzacji aspektów prawidłowych/patologicznych, biologicznych/biochemicznych, procesów/stanów, w które zaangażowana jest NIK ufosforylowana w T559 lub jej specyficzna część. [0049] W użytym tu znaczeniu, termin leczenie", wówczas gdy odnosi się do choroby oznacza zapobieganie rozpoczęciu choroby, łagodzenie choroby, tłumienie lub eliminowanie objawów choroby, spowalnianie lub cofanie progresji choroby lub wyleczenie z choroby. [0050] W użytym tu znaczeniu, termin przeciwciało odnosi się do zasadniczo całej lub nieuszkodzonej cząsteczki przeciwciała. [0051] W użytym tu znaczeniu, fraza fragment przeciwciała odnosi się do cząsteczki obejmującej część przeciwciała zdolną do swoistego wiązania antygenu, determinanty antygenowej lub epitopu. [0052] Jak opisano w Przykładach poniżej: Sekwencja aminokwasowa przedstawiona w SEKW. NR ID.: 3, 4 i 6 reprezentuje, odpowiednio, reszty aminokwasowe , i ludzkiej NIK, które leżą w pętli aktywującej ludzkiej NIK. [0053] Korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest zdolne do wiązania docelowego antygenu z maksymalnym powinowactwem. Przeciwciała według wynalazku, np. przeciwciała posiadające możliwość celowania w antygen według wynalazku, są zdolne do specyficznego i efektywnego wykrywania NIK ufosforylowanej w T559, za pomocą analizy typu Western immunoblotting. [0054] Przeciwciała według wynalazku, np. przeciwciała posiadające możliwość celowania w antygen według wynalazku, są zdolne do specyficznego i efektywnego wykrywania NIK ufosforylowanej w T559, za pomocą testu ELISA. [0055] Przeciwciała według wynalazku, np. przeciwciała posiadające możliwość celowania w antygen według wynalazku, są zdolne do specyficznej i efektywnej immunoprecypitacji NIK ufosforylowanej w T559. [0056] W konkretnym wykonaniu przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, swoiste wobec ufosforylowanej NIK, wytwarzano stosując immunizację peptydem (SEKW. NR ID.:3) o sekwencji aminokwasowej SLLTGDYIPGT(p) E, w której T(p) jest ufosforylowaną treoniną i leży w przedostatnim aminokwasie sekwencji. [0057] Dodatkowe peptydy, pochodzące z pętli aktywacyjnej o sekwencji aminokwasowej DFGHAVCLQPDGLG KSLLTGDYIPGT(p)E (SEKW. NR ID.:6) lub jej części, mogą także służyć jako peptydy immunizacyjne pod warunkiem, że ufosforylowana T559 leży w przedostatnim aminokwasie sekwencji.

12 Dodatkowe peptydy, obejmujące sekwencję aminokwasową pętli aktywacyjnej DFGHAVCLQPDGLG KSLLTGDYIPGT(p)E (SEKW. NR ID.:6) lub jej część, mogą także służyć jako peptydy immunizacyjne pod warunkiem, że ufosforylowana T559 leży w przedostatnim aminokwasie sekwencji. Alternatywnie, cysteina, lizyna lub inny aminokwas może być chemicznie połączony z końcem N peptydu immunizacyjnego. Termin swoiście wiąże według wynalazku odnosi się do przeciwciał, które mogą wiązać NIK ufosforylowaną w T559, lecz dla kontrastu, mają niską zdolność wiązania, lub nie mają jej wcale, z niefosforylowaną NIK. Zróżnicowane wiązanie przeciwciała według wynalazku można badać za pomocą różnych testów np. testem ELISA, analizą typu Western immunoblotting i immunoprecypitacją. Do wytworzenia przeciwciała monoklonalnego według wynalazku można wykorzystać różne rodzaje immunizowanych myszy, korzystnie szczep SJL. Różne narządy krwiotwórcze immunizowanej myszy można także wykorzystać w fuzji do wytworzenia hybridomy, np. śledzionę i /lub węzeł chłonny. [0058] Przeciwciała wytwarzane według wynalazku są zdolne do rozpoznawania całego białka NIK lub jego fragmentów w stanie ufosforylowania. W innym wykonaniu zademonstrowano, że przeciwciała według wynalazku mogą hamować degradację IkB i w następstwie aktywację indukcji NFκ-B przez ligand CD40 lub CD70 lecz nie przez TNF. Wyniki te pokazują, że przeciwciało według wynalazku może hamować specyficznie aktywację NFκ-B. [0059] Zatem, przeciwciało według wynalazku można stosować w terapii chorób, w których w patogenezę choroby zaangażowane jest przekazywanie sygnału przez CD70 i CD40 i/lub chorób, w których ligandy rodziny TNF/NGF indukują aktywację NFk-B, za pośrednictwem NIK za pomocą klasycznego szlaku. Parametrami wskazującymi na klasyczny szlak aktywacji są, przykładowo, degradacja IkB, fosforylacja IκBα i translokacja p65. [0060] Zważywszy na doświadczalne ujawnienia, przeciwciało według wynalazku można stosować w sposobie identyfikowania liganda zdolnego do indukowania w komórce aktywacji NFκB za pośrednictwem NIK. W jednym wykonaniu według wynalazku, sposób taki obejmuje etap wprowadzenia do komórki przeciwciała, lub fragmentu przeciwciała według wynalazku, lub nie mającego związku IgG, jako kontroli, inkubowania komórki z poszczególnymi ligandami, monitorowania parametrów wskazujących na aktywację NFκB, korzystnie monitorowania parametrów wskazujących na aktywację za pomocą klasycznego szlaku, takich jak degradacja IkB, fosforylacja IκBα i translokacja p65 oraz wybrania liganda, za pomocą którego aktywacja NFκB jest specyficznie uszkodzona przez zablokowanie NIK za pomocą przeciwciała lub jego fragmentu. [0061] Hamowanie aktywacji NIK obserwowane z przeciwciałem według wynalazku, np. NIK-P , nie pojawia się z innymi przeciwciałami swoistymi wobec NIK, zdolnymi do wiązania domen w kinazie, które wyłączają region pętli aktywacyjnej NIK. [0062] Zasadniczo, przeciwciało według wynalazku, zdolne do wiązania antygenu docelowego z maksymalnym powinowactwem, będzie umożliwiało optymalne obniżenie poziomu regulacji aktywności biochemicznej, w której pośredniczy lub jest z nią związany antygen docelowy. Podobnie, niniejsze przeciwciało, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego z maksymalnym powinowactwem będzie zasadniczo umożliwiało wykrywanie antygenu docelowego z optymalną czułością. [0063] Ze względu na opisaną powyżej, zdolność przeciwciała do swoistego wiązania antygenu docelowego według wynalazku, w szczególności ze względu na unikatową zdolność przeciwciała do swoistego wiązania

13 antygenu docelowego, według wynalazku, leżącego w funkcjonalnym regionie NIK, przeciwciało można stosować do obniżania poziomu regulacji aktywności biochemicznej NIK. W szczególności, ze względu na opisaną powyżej unikatową zdolność przeciwciała do swoistego wiązania antygenu docelowego, według wynalazku, leżącego w regionie pętli aktywacyjnej NIK, przeciwciało można stosować do optymalnego obniżania poziomu regulacji aktywności NIK. Będzie docenione, że ponieważ taka aktywność kinazowa jest kluczowa dla aktywacji czynnika jądrowego (NF)-κB, jak opisano powyżej, przeciwciało według wynalazku, zdolne do optymalnego obniżania poziomu regulacji takiej aktywność kinazowej może być stosowane do optymalnego obniżania poziomu regulacji aktywności NF-κB. Białka NF-κB stanowią rodzinę białek niosących 300 aminokwasową domenę, domenę homologiczną z Rel. Domena homologiczna z Rel pośredniczy w wiązaniu DNA, dimeryzacji i transporcie jądrowym białek NF-κB. Dodatkowo, do domeny homologicznej z Rel, niektórzy przedstawiciele rodziny NF-κB zawierają także domenę transaktywującą (np. c-rel, RelB i p65). Przedstawiciele NF-κB, p50 i p52, są wytwarzani w warunkach aktywacji przez lizę nieaktywnych prekursorów, odpowiednio, p105 i p100. p50 i p52c posiadają właściwości wiązania DNA z dimeryzacją, lecz nie posiadają silnych domen transaktywujących. Jest to zróżnicowana generacja tych białek; ich zdolność do heterodimeryzacji z różnymi przedstawicielami rodziny i oddziaływanie tych białek z różnymi składnikami aparatu transkrypcyjnego, które przyczynia się do różnorodnego wpływu na aktywowanie szlaku NF-κB. NIK nie zaburza wszystkich rodzajów NF-κB w odpowiedzi na specyficzne induktory, np. limfotoksynę. Modulacja NIK, np. przy użyciu przeciwciał według wynalazku, ma zatem, prawdopodobnie wpływ na specyficzne aspekty patologicznej aktywacji NF-κB. Jest to zaletą, ponieważ ogólne niespecyficzne hamowanie NF-κB jest niebezpieczne, przykładowo, może prowadzić do rozległej apoptozy w wątrobie. [0064] W użytym tu znaczeniu fraza obniżenie poziomu regulacji, w powiązaniu z aktywnością biologiczną odnosi się do zapobiegania, redukcji lub hamowania takiej aktywności biologicznej. [0065] Przeciwciało wykorzystywane do hamowania aktywności biologicznej NIK, korzystnie jest zdolne do swoistego wiązania maksymalnej liczby antygenów docelowych w części NIK związanej z taką aktywnością biochemiczną. W szczególności, kiedy przeciwciało jest wykorzystywane do hamowania aktywności kinazowej NIK, korzystnie jest zdolne do swoistego wiązania maksymalnej liczby antygenów docelowych położonych w sekwencjach aminokwasowych regionu pętli aktywacyjnej NIK, przedstawionych w SEKW. NR ID.:3 i 4. Kiedy przeciwciało według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania tylko jednego antygenu docelowego, położonego w funkcjonalnym regionie NIK, takim jak region pętli aktywacyjnej, może być wykorzystane do wydajnego hamowania funkcji biochemicznej NIK, takiej jak aktywność kinazowa, związanej z takim funkcjonalnym regionem, przeciwciało zdolne do swoistego wiązania maksymalnej liczby antygenów docelowych, położonych w takim funkcjonalnym regionie, będzie skuteczniej obniżać poziom regulacji aktywność kinazowej, ze względu na oddziaływanie z maksymalną liczbą funkcjonalnych epitopów w funkcjonalnym regionie. [0066] Alternatywnie, w celu hamowania aktywności kinazowej NIK, przeciwciało może korzystnie być zdolne do swoistego wiązania maksymalnej liczby antygenów docelowych położonych w sekwencjach przedstawionych w SEKW. NR ID.: 3 i 4 i 6. [0067] Ze względu na opisaną powyżej zdolność przeciwciała do swoistego wiązania antygenu docelowego według wynalazku, przeciwciało może być zastosowane do specyficznego wykrywania NIK ufosforylowanej w T559, z optymalną czułością w odniesieniu do wcześniejszych metod z dziedziny i może wyjątkowo być

14 użyte do specyficznego wykrywania NIK ufosforylowanej w T559 i/lub antygenu docelowego według wynalazku. [0068] Przeciwciało może być użyte zasadniczo w dowolnym zastosowaniu czerpiącym korzyść z odczynnika zdolnego do wiązania antygenu docelowego według wynalazku, z optymalnym powinowactwem. Zastosowania takie obejmują, przykładowo, oczyszczanie za pomocą powinowactwa, a tym samym identyfikację i charakterystykę specyficznych ligandów NIK. Zatem, przeciwciało według wynalazku może być zastosowane do immunologicznego oczyszczania NIK lub jej części. W jednym korzystnym wykonaniu według wynalazku, przeciwciało można zastosować w etapie wychwytywania w celu oczyszczenia NIK lub jej części. [0069] Jak opisano i zilustrowano poniżej w części Przykłady, przeciwciało według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania ufosforylowanego polipeptydu obejmujące sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 3, 4, 5 i 6 można zastosować do specyficznego wykrywania, zgodnie z podanym tu zaleceniem, sekwencji aminokwasowej ufosforylowanych peptydów oraz białek, przedstawionej odpowiednio, w SEKW. NR ID.: 3, 4 i 5 oraz 6. [0070] Korzystnie, przeciwciało według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego według wynalazku pochodzi z surowic zwierząt immunizowanych takim antygenem docelowym (określanych dalej jako surowice odpornościowe lub antysurowice ). Jak opisano i zilustrowano poniżej w części Przykłady, surowicę odpornościową według wynalazku zdolną do swoistego wiązania sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 3 można wytworzyć przez immunizację ssaka antygenem docelowym według podanego niniejszym protokołu. Dalsze zalecenie do wytwarzania preparatu przez immunizację ssaka dostarczono poniżej. [0071] Wytyczne do otrzymywania polipeptydów takich jak antygen docelowy dostarczono poniżej. [0072] W zależności od zastosowania i celu, preparat może być korzystnie stosowany w formie nieoczyszczonej surowicy odpornościowej lub może być oczyszczony różnymi drogami stosowanymi wcześniej. Przykładowo, preparat może być korzystnie stosowany w formie oczyszczonej jako: (i) preparat przeciwciała swoistego izotypu lub zestawu izotypów; (ii) preparat przeciwciała lub fragmentu przeciwciała zdolnego do swoistego wiązania specyficznie fosforylowanych peptydów o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 3, 4, 5 i/lub 6 (ii) preparat przeciwciała lub fragmentu przeciwciała zdolnego do wiązania antygenu docelowego według wynalazku, z pożądanym powinowactwem. [0073] Preparat według wynalazku w formie nieoczyszczonej surowicy odpornościowej może być dogodny i zadowalający do użycia w różnych zastosowaniach. Przykładowo, jak opisano i zilustrowano poniżej w części Przykłady, nieoczyszczoną surowicę odpornościowa według wynalazku, w szczególności nieoczyszczoną surowicę odpornościową wytworzoną przez immunizację sekwencją aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 3, można zastosować do efektywnego wykrywania ufosforylowanej NIK za pomocą analizy ELISA. Zasadniczo, do zastosowań czerpiących korzyści z preparatu, według wynalazku, pożądana jest zdolność do wiązania antygenu docelowego według wynalazku w szerokim zakresie powinowactw/swoistości; korzystne będzie nieoczyszczone przeciwciało według wynalazku, takie jak surowica odpornościowa według wynalazku. Taki nieoczyszczony preparat może często być właściwy dla danego zastosowania, ponieważ zawarta w nim mieszanina heterogenna przeciwciała poliklonalnego lub fragmentu przeciwciała będzie często zawierać jedno lub większą liczbę przeciwciał lub fragmentów przeciwciała posiadających odpowiednie powinowactwo/swoistość wiązania z antygenem docelowym.

15 [0074] Alternatywnie, oczyszczone przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku można korzystnie wykorzystać w zastosowaniach takich jak te wymagające podawania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała osobnikowi i te, w których pożądane jest wykrywanie antygenu docelowego z optymalną czułością. [0075] W użytym tu znaczeniu termin osobnik odnosi się do człowieka. [0076] Przykładowo, preparat przeciwciała IgG według wynalazku można korzystnie oczyścić z surowicy odpornościowej według wynalazku przy użyciu oczyszczania za pomocą powinowactwa z białkiem G, korzystnie przez immunoprecypitację z białkiem G. Jak opisano i zilustrowano poniżej w części Przykłady, surowicę odpornościową według wynalazku, pochodzącą od zwierzęcia immunizowanego ufosforylowanym peptydem o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 3 i oczyszczoną przez immunoprecypitację z białkiem G, według podanego tu protokołu, można stosować do wykrywania z optymalną czułością, ufosforylowanych peptydów o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 3, 4, 5 i 6 za pomocą analizy typu Western immunoblotting, immunoprecypitacji i testu ELISA. [0077] Oczyszczone przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego można korzystnie stosować do regulacji z optymalną specyficznością aktywności biochemicznej NIK związanej z antygenem docelowym i wykrywania antygenu docelowego z optymalną specyficznością. W szczególności, oczyszczone przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego według wynalazku zawartego w sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 3, 4, 5 i 6 można korzystnie stosować do regulacji z optymalną specyficznością aktywności kinazowej NIK. Zasadniczo, do zastosowań czerpiących korzyści z optymalnej powtarzalności, standaryzacji lub dokładności, oczyszczone przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego będzie zasadniczo optymalnie odpowiadało nieoczyszczonemu preparatowi według wynalazku. [0078] Oczyszczone przeciwciało lub fragment przeciwciała, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego można uzyskać, przykładowo, przez oczyszczenie preparatu według wynalazku, takiego jak nieoczyszczona surowica odpornościowa według wynalazku, za pomocą chromatografii powinowactwa przy użyciu podłoża kowalencyjnie związanego z antygenem docelowym. Taki połączony z podłożem antygen docelowy można zastosować, zgodnie z metodyką standardowej chromatografii powinowactwa, do selektywnego wychwytywania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, zdolnego do swoistego wiązania antygenu docelowego. [0079] Korzystnie podłożem jest podłoże do chromatografii powinowactwa. Podłoże do chromatografii powinowactwa, będące zoptymalizowanym do prowadzenia chromatografii powinowactwa, korzystnie można stosować do osiągnięcia optymalnego oczyszczenia za pomocą powinowactwa. [0080] Do przeprowadzenia oczyszczania można użyć podłoża o różnych własnościach strukturalnych i chemicznych. [0081] Korzystnie, podłoże obejmuje węglowodan lub jego pochodną. Korzystnie, węglowodan jest agarozą, sefarozą lub celulozą. [0082] Korzystnie, podłoże jest kulką, żywicą lub powierzchnią tworzywa sztucznego. [0083] Podłoża takie jak kulki, żywice lub powierzchnie tworzywa sztucznego obejmujące węglowodany, takie jak agaroza, sefaroza lub celuloza są rutynowo stosowane w chromatografii powinowactwa stosowanej w dziedzinie.

16 [0084] Informacje dotyczące stosowania w praktyce chromatografii powinowactwa, takiej ja ta, która wykorzystuje omówione wyżej podłoża, sa dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: Wilchek M. i Chaiken I., Methods Mol Biol. 147:1-6; Jack GW. Immunoaffinity chromatography. Mol Biotechnol 1, 59-86; Narayanan SR, Journal of Chromatography A 658: ; Nisnevitch M. i Firer MA., J Biochem Biophys Methods 49:467-80; Janson JC. & Kristiansen T. w: Packings and Stationary Phases in Chromatography Techniques" (wyd. Unger, KK.) str. 747 (Marcel Dekker, New York, 1990); Clonis, Y. D. w: HPLC of Macromolecules: A Practical Approach", str. 157 (IRL Press, Oxford, 1989); Nilsson J. i wsp., Protein Expr Purif. 11:1-16). [0085] Alternatywnie, preparat według wynalazku można oczyścić przy użyciu różnych standardowych technik oczyszczania białka, takich jak chromatografia jonowymienna, filtracja, elektroforeza, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia żelowa, chromatografia odwróconej fazy, chromatografia na złożu z konkanawaliną A, chromatoogniskowanie i zróżnicowane rozpuszczanie. [0086] Przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego według wynalazku z pożądanym powinowactwem można korzystnie stosować do uzyskania pożądanego poziomu regulacji aktywności biochemicznej NIK związanej z antygenem docelowym i można korzystnie stosować do wykrywania antygenu docelowego z pożądaną czułością. W szczególności, przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania z maksymalnym powinowactwem antygenu docelowego według wynalazku, zawartego w regionie kinazowym NIK, można korzystnie użyć do optymalnego obniżenia poziomu regulacji aktywności kinazowej NIK. Podobnie, przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, zdolne do swoistego wiązania antygenu docelowego z maksymalnym powinowactwem, można korzystnie użyć do wykrywania antygenu docelowego z optymalną czułością. [0087] Oczyszczanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, zdolnego do swoistego wiązania antygenu docelowego z pożądanym powinowactwem, z preparatu według wynalazku, takiego jak nieoczyszczona surowica odpornościowa według wynalazku, można osiągnąć, przykładowo, przez oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa nieoczyszczonej, lub korzystniej, oczyszczonej białkiem G surowicy odpornościowej według wynalazku, przy użyciu antygenu docelowego jako liganda powinowactwa i przez selektywne wymywanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała związanego z podłożem, w warunkach kontrolowanej ostrości (przykładowo, w warunkach kontrolowanego ph i/lub stężenia soli). W szczególności, przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku zdolne do wiązania antygenu docelowego z maksymalnym powinowactwem można wygodnie uzyskać przez wymywania, w warunkach efektywnie maksymalnej ostrości (przykładowo, w warunkach efektywnie maksymalnego lub minimalnego ph i/lub maksymalnego stężenia soli). Zazwyczaj, przeciwciało lub fragment przeciwciała może być związane z dołączonym do podłoża jego antygenem pokrewnym w warunkach fizjologicznego ph i stężenia soli, tak, że przeciwciało lub fragment przeciwciała może zazwyczaj być wymywane z podłoża przez obniżenie ph do 2,5 lub niższego, lub przez podwyższenie ph do 11 lub wyższego. [0088] Będzie docenione przez zwykłych specjalistów w dziedzinie, że przy użyciu powszechnych technik w dziedzinie można uzyskać przeciwciało lub fragment przeciwciała posiadające powinowactwo charakteryzujące się stałą dysocjacji dla pokrewnego antygenu do [0089] Jak opisano powyżej, preparat może korzystnie obejmować przeciwciało lub fragment przeciwciała przyłączone do różnych rodzajów wykrywalnej cząsteczki.

17 [0090] Preparat według wynalazku, obejmujący przeciwciało lub fragment przeciwciała przyłączone do wykrywalnej cząsteczki, można stosować do wykrywania antygenu docelowego, swoiście związanego z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała. [0091] Preparat może obejmować przeciwciało lub fragment przeciwciała przyłączone do dowolnego z wielu rodzajów wykrywalnej cząsteczki, w zależności od zastosowania i celu. [0092] Przykładowo, w zależności od zastosowania i celu, wykrywalna cząsteczka może korzystnie być fluoroforem, enzymem, cząsteczką emitującą światło lub radioizotopem. [0093] Korzystnie, wykrywalną cząsteczką jest enzym. [0094] Enzym można korzystnie wykorzystać do umożliwienia wykrywania antygenu docelowego za pomocą dowolnych różnych metod wykrywania opartych na enzymach. Przykłady takich metod obejmują test enzymoimmunologiczny (ELISA; przykładowo, do wykrywania antygenu docelowego w roztworze), test enzymo-chemiluminescencyjny (przykładowo, do wykrywania kompleksu w mieszaninie białek rozdzielonych elektroforetycznie) oraz test enzymohistochemiczny (przykładowo, do wykrywania kompleksu w utrwalonej tkance). [0095] Jak opisano i zilustrowano poniżej w części Przykłady, preparat według wynalazku obejmujący przeciwciało przyłączone do enzymu można zastosować do efektywnego wykrywania NIK za pomocą analizy typu Western immunoblotting lub ELISA. [0096] Wiele rodzajów enzymów można wykorzystać do wykrywania antygenu docelowego, w zależności od zastosowania i celu. [0097] Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową (HPR), β-galaktozydazę i fosfatazę alkaliczną (AP). [0098] Obszerne wytyczne dotyczące stosowania w praktyce molekularnych metod wykrywania opartych na enzymach są dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: Khatkhatay MI. i Desai M., J Immunoassay 20:151-83; Wisdom GB., Methods Mol Biol. 32:433-40; Ishikawa E. i wsp., J Immunoassay 4: ; Oellerich M., J Clin Chem Clin Biochem. 18: ; Schuurs AH. i van Weemen BK., J Immunoassay 1:229-49). [0099] Preparat według wynalazku obejmujący przeciwciało lub fragment przeciwciała przyłączone do fluoroforu można korzystnie użyć do wykrywania antygenu docelowego, przez zastosowanie wielu molekularnych metod wykrywania opartych na fluorescencji. W zależności od zastosowania i celu, metody takie obejmują: fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS; przykładowo do charakteryzacji wytwarzania lub prezentacji antygenu docelowego w zawiesinie populacji komórek), fluorescencyjną mikroskopię konfokalną (przykładowo, do wykrywania w trzech wymiarach cząsteczki w martwej lub żywej komórce lub tkance), fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET; przykładowo, do wykrywania specyficznych połączeń międzycząsteczkowych, w które zaangażowany jest antygen docelowy), histochemię z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych (przykładowo, do wykrywania cząsteczki w utrwalonej próbce histologicznej) i im podobne. [0100] Do wykrywania docelowego antygenu można wykorzystać różne rodzaje fluoroforów, w zależności od zastosowania i celu. [0101] Przykłady odpowiednich fluoroforów obejmują: fikoerytrynę, izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), Cy- Chrome, rodaminę, białko zielonej fluorescencji (GFP), białko niebieskiej fluorescencji (BFP), Texas Red i im podobne.

18 [0102] Obszerne wytyczne dotyczące wyboru fluoroforu, metod łączenia fluoroforów z różnymi rodzajami cząsteczek, takimi jak przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku oraz metod stosowania takich immunokoniugatów fluorescencyjnych do wykrywania cząsteczek jest dostępne w specjalistycznej literaturze [przykładowo, odniesienie w: Richard P. Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals ", wyd. 5, Molecular Probes, Inc. (1994); patent USA nr Oncoimmunin Inc.; Hermanson, Bioconjugate Techniques", Academic Press New York, N.Y. (1995); Kay M. i wsp., Biochemistry 34:293; Stubbs i wsp., Biochemistry 35:937; Gakamsky D. i wsp., Evaluating Receptor Stoichiometry by Fluorescence Resonance Energy Transfer," w Receptors: A Practical Approach," wyd. 2, Stanford C. i Horton R. (red.), Oxford University Press, UK. (2001); patent USA nr Targesome, Inc.]. [0103] Przykłady odpowiednich cząsteczek emitujących światło obejmują luminol. [0104] Przykłady odpowiednich radioizotopów obejmują: jod [125], siarkę [35], wodór [3], fosfor [32], etc. [0105] Wykrywalna cząsteczka może być przyłączana do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała różnymi drogami, w zależności od zastosowania i celu oraz natury zaangażowanej cząsteczki. Obszerne zalecenie dotyczące przyłączania wykrywalnej cząsteczki do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała jest dostarczone w specjalistycznej literaturze [przykładowo, odniesienie w: Using Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow, David Lane (wyd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); także, odniesienie w: obszernych zaleceniach dostarczonych przez The American Chemical Society, przykładowo na stronie: Specjalista w dziedzinie, taki jak chemik, będzie posiadać wymagane doświadczenie do właściwego stosowania w praktyce takich technik syntezy chemicznej. [0106] Zatem, preparat według wynalazku obejmujący przeciwciało lub fragment przeciwciała przyłączony do wykrywalnej cząsteczki może być stosowany do efektywnego i unikatowego wykrywania antygenu docelowego zasadniczo w dowolnym kontekście. [0107] W zależności od zastosowania i celu, preparat może korzystnie być preparatem dowolnych, różnych rodzajów fragmentów przeciwciała. [0108] Fragment przeciwciała jest korzystnie jednołańcuchowym Fv (scfv) lub korzystniej Fab, Fab', F(ab') 2 lub CDR. [0109] Fragment przeciwciała ma przewagę, ponieważ jest mniejszy niż przeciwciało rodzicielskie od którego pochodzi, a zachowuje zasadniczo identyczną, jak przeciwciało rodzicielskie, swoistość wiązania antygenu docelowego, lub zarówno swoistość wiązania jak i powinowactwo wiązania. Zatem, fragment przeciwciała, ze względu na to, że jest mniejszy od przeciwciała rodzicielskiego, będzie tym samym miał zasadniczo lepsze własności biodystrybucji i dyfuzji (przykładowo, układowej in vivo lub w wyizolowanych tkankach) niż to ostatnie. Fragment przeciwciała z zasadniczo brakującym regionem Fc, taki jak jednołańcuchowy Fv, Fab', Fab F(ab') 2 lub CDR, jest korzystny w zastosowaniach wymagających eksponowania preparatu na cząsteczkę zdolną do swoistego wiązania takiego regionu Fc i, w których wiązanie takie jest niepożądane. Zazwyczaj może to dotyczyć niepożądanego wiązania regionu Fc eksponowanego na pokrewny receptor Fc lub składnik komplementu wiążący Fc (przykładowo, składnik komplementu C1q, obecny w surowicy). Receptory Fc są prezentowane na powierzchni wielu rodzajów komórek układu immunologicznego, w tym: na profesjonalnych komórkach prezentujących antygen (APC), takich jak komórki dendrytyczne; limfocyty B oraz granulocyty, takie jak neutrofile, bazofile, eozynofile, monocyty, makrofagi i komórki tuczne. Zatem, brak regionu Fc z fragmentu przeciwciała może być

19 szczególnie korzystny dla uniknięcia niepożądanej aktywacji komórek układu immunologicznego za pośrednictwem receptora Fc receptor lub kaskady dopełniacza za pośrednictwem składnika dopełniacza, w szczególności kiedy preparat jest podawany osobnikowi in vivo. [0110] F(ab') 2 jest fragmentem cząsteczki przeciwciała zawierającym dwuwartościową część cząsteczki przeciwciała wiążącą antygen. [0111] Preparat F(ab') 2 według wynalazku można wygodnie uzyskać przy użyciu standardowych metod z dziedziny, przez traktowanie preparatu przeciwciała według wynalazku, takiego jak surowica odpornościowa według wynalazku, pepsyną. Uzyskany produkt F(ab') 2 jest cząstką 5S. [0112] Fab lub Fab' jest fragmentem cząsteczki przeciwciała zawierającym jednowartościową część przeciwciała. CDR można wytwarzać np. jak opisano w EP lub jak opisano w Strandberg i wsp. (Protein Eng Jan; 14(1): 67-74). CDR według wynalazku może być zmodyfikowanym CDR, który posiada wzmocniony efekt modulowania NIK. Przykład metod modyfikujących aktywne peptydy opisano w Sawa i wsp (J. Med. Chem. 42, ). [0113] Preparat Fab' według wynalazku można wygodnie uzyskać przy użyciu standardowych metod z dziedziny, przez traktowanie preparatu przeciwciała według wynalazku, takiego jak surowica odpornościowa według wynalazku, pepsyną, a następnie redukcję uzyskanego F(ab') 2. Redukcję taką można przeprowadzić używając tiolowego czynnika redukującego i ewentualnie używając grupy blokującej grupy sulfhydrylowe, co prowadzi do przecięcia mostków dwusiarczkowych. Traktowanie takie wytwarza dwa jednowartościowe fragmenty Fab 3.5S fragmentu Fc. [0114] Preparat Fab można wygodnie uzyskać używając standardowych metod z dziedziny przez traktowanie preparatu przeciwciała według wynalazku, takiego jak surowica odpornościowa według wynalazku, papainą co daje cały łańcuch lekki i część łańcucha ciężkiego składającego się z domeny zmiennej i C H 1. [0115] Obszerne wytyczne dotyczące wytwarzania fragmentu przeciwciała za pomocą traktowania enzymatycznego przeciwciała są dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: Goldenberg, patent USA nr i ; Porter RR., Biochem J. 73: ). [0116] Jednołańcuchowy Fv (określany także w dziedzinie jako scfv") jest jednołańcuchową cząsteczką obejmującą region zmienny łańcucha lekkiego i region zmienny łańcucha ciężkiego, połączone odpowiednim łącznikiem polipeptydowym. [0117] Preparat F(ab') 2, Fab', Fab lub jednołańcuchowego Fv lub CDR według wynalazku można wygodnie uzyskać używając technik rekombinacji. [0118] Korzystnie, uzyskiwanie fragmentu zrekombinowanego przeciwciała można przeprowadzić przez izolowanie mrna z limfocytów B zwierząt immunizowanych docelowym antygenem, wytworzenie cdna z mrna przez RT-PCR i użycie cdna do konstrukcji biblioteki prezentowanej na fagu fragmentu przeciwciała. Limfocyty B można wygodnie izolować ze śledziony lub alternatywnie z krwi, szpiku kostnego lub węzłów chłonnych immunizowanego zwierzęcia. [0119] Zrekombinowane fagi, prezentujące fragment przeciwciała posiadający pożądaną właściwość wiązania antygenu docelowego, można wyselekcjonować z biblioteki przez seryjne wzbogacanie w fagi posiadające taką właściwość wiązania, spośród dużej liczby klonów bez zdolności wiązania. Selekcję taką można osiągnąć używając dowolnej z różnych technik, włączając panoramowanie na immobilizowaniem

20 antygenie docelowym; panoramowanie z użyciem specyficznego wymywania; używając antygenu biotynylowanego; oczyszczania powinowactwa na kolumnach lub bezpośredniego panelowania na komórkach. Po selekcji, fagi prezentujące fragmenty nieswoistych przeciwciał można usunąć przez płukanie i związane fagi, niosące scfv prezentujące pożądaną właściwość wiązania antygenu docelowego, są wymywane i namnażane przez zakażanie E. coli. Po wyizolowaniu faga prezentującego fragment przeciwciała posiadający pożądaną właściwość wiązania antygenu docelowego, na podstawie materiału zapakowanego w prezentującym fagu można ustalić sekwencję polinukleotydową kodującą regiony zmienne fragmentu przeciwciała i sklonować w zrekombinowanym prokariotycznym lub eukariotycznym wektorze ekspresyjnym, stosując standardową metodologię [przykładowo, odniesienie w: Current Protocols in Molecular Cloning", Ausubel i wsp. (wyd.), Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, N.Y. (1989); Sambrook i wsp., poniżej i w załączonych odnośnikach]. Prokariotyczne wektory ekspresyjne można stosować do wytwarzania oczyszczonego fragmentu zrekombinowanego przeciwciała w E. coli (przykładowo, odniesienie w: Studier i wsp., Methods in Enzymol. 185:60-89). Eukariotyczne wektory ekspresyjne można stosować do genetycznej transformacji komórki eukariotycznej do wytwarzania fragmentu zrekombinowanego przeciwciała. [0120] Obszerne wytyczne dotyczące uzyskiwania i wykorzystania biblioteki prezentowanej na fagu fragmentu przeciwciała z mrna limfocytu B są dostarczone w specjalistycznej literaturze [przykładowo, odniesienie w: Hoogenboom i wsp., Immunotechnology 4:1-20; Kand i wsp., Proc Natl Acad Sci USA. 88:4363; Barbas i wsp Proc Natl Acad Sci U S A. 88:7978; Garrard i wsp., Biotechnology 9: ; Hoogenboom i wsp., Nucleic Acids Res. 19: ; Sharon i wsp., Combinational Chemistry and High Throughput Screening 3: ; patent USA nr , , , , , , , , , , , , , i 5,969,108; publikacje PCT WO 92/01047, WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982 i WO 95/20401; Brinkman i wsp., J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames i wsp., J. Immunol. Methods 184: ; Kettleborough i wsp., Eur. J. Immunol. 24: ; Persic i wsp., Gene ; oraz Burton i wsp., Advances in Immunology 57: ; Pluckthun w: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", tom. 113, Rosenburg i Moors (wyd.), Springer-Verlag, New York, str (1994); Hoogenboom i wsp., Immunotechnology 4:1-20]. [0121] Będzie docenione, że opisaną powyżej metodologię można zastosować do uzyskania preparatu fragmentu monoklonalnego przeciwciała według wynalazku posiadającego zasadniczo dowolną z pożądanych cech, jak powinowactwo wiązania antygenu docelowego i/lub swoistość. Preparat taki można wykorzystać w wielu zgłoszeniach czerpiących korzyści z odczynnika zdolnego do wiązania antygenu docelowego z tak zdefiniowaną charakterystyką wiązania antygenu docelowego. [0122] Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciała monoklonalnego obejmujący hodowanie sklonowanej hybrydomy, obejmującej komórkę śledziony ze ssaka immunizowanego sekwencją aminokwasową obejmującą SEKW. NR ID.: 6, lub jej częścią np. tą przedstawioną w SEKW. NR ID.: 3, przy czym sekwencja aminokwasowa lub jej część obejmująca ufosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5, oraz homogenną lub heterogenną komórkę limfoidalną, w pożywce ciekłej lub brzuchu, w celu umożliwienia hybrydomie wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego i jego akumulowanie.

21 Przykładem hybrydomy do zastosowania w preparacie przeciwciał monoklonalnych jest klon hybrydomy Nik- P zdeponowany w CNCM pod nr I [0123] Ponieważ Fab' ma zasadniczo strukturę podobną do Fab, preparat według wynalazku obejmujący Fab' można wykorzystać zasadniczo wymiennie z preparatem obejmującym Fab, gdzie Fab' i Fab obejmuje zasadniczo te same regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego. Dla zgłoszeń mających korzyści, co zazwyczaj będzie miało miejsce, z preparatu według wynalazku, obejmującego fragment przeciwciała zdolny do wiązania antygenu docelowego z maksymalnym powinowactwem, preparat F(ab') 2 według wynalazku może być nadrzędny wobec preparatu Fab, Fab' lub scfv według wynalazku, ze względu na dwuwartościowe wiązanie F(ab') 2 z antygenem docelowym, w porównaniu z jednowartościowym wiązaniem jednowartościowego fragmentu przeciwciała. [0124] Jak wspomniano tu powyżej, w zależności od zgłoszenia i celu, preparat przeciwciała lub fragmentu przeciwciała może pochodzić z dowolnego gatunku ssaka. [0125] Preparat przeciwciała lub fragmentu przeciwciała według wynalazku pochodzący z pożądanego gatunku może pochodzić z surowicy zwierzęcia takiego gatunku, immunizowanego antygenem docelowym. [0126] Korzystnie, przeciwciało lub fragment przeciwciała pochodzą z myszy. [0127] Przeciwciało takie może być jednowartościowe, dwuwartościowe lub wielowartościowe, może mieć aktywność wiązania krzyżowego lub nie. Przeciwciała stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być przeciwciałami poliklonalnymi, takimi jak przeciwciała wytworzone w króliku, lub monoklonalnymi. [0128] Korzystnie, wynalazek dotyczy użycia preparatu przeciwciała wyselekcjonowanego z grupy składającej się z przeciwciał poliklonalnych, monoklonalnych, chimerycznych, humanizowanych, ludzkich lub anty-anty-idiotypowych lub ich fragmentów. Korzystnie, przeciwciało lub fragment przeciwciała pochodzą z myszy. Termin przeciwciało monoklonalne" (mab) ma na celu objęcie przeciwciał monoklonalnych, chimerycznych, przeciwciał humanizowanych, przeciwciał ludzkich, przeciwciał wobec przeciwciał anty-idiotypowych (przeciwciało anty-anty-ld), które można wyznakować w formie rozpuszczonej lub związanej, jak również jak ich fragmenty dostarczone dowolnymi znanymi technikami, takimi jak trawienie enzymatyczne, synteza peptydu lub techniki rekombinacyjne. [0129] Przeciwciało monoklonalne zawiera zasadniczo homogenną populację przeciwciał swoistych wobec antygenów, która to populacja zawiera zasadniczo podobne miejsca wiązania epitopu. mabs można uzyskiwać metodami znanymi specjalistom w dziedzinie. Patrz, przykładowo, Kohler i Milstein, Nature, 256: (1975). [0130] Mówi się, że przeciwciało monoklonalne jest zdolne do wiązania" cząsteczki, jeśli jest zdolne do swoistego oddziaływania z cząsteczką, skutkiem czego cząsteczka wiązana jest z przeciwciałem. Termin epitop" ma na celu odniesienie do tej części dowolnej cząsteczki zdolnej do wiązania się z przeciwciałem, która także może być rozpoznana przez przeciwciało. Epitopy lub determinanty antygenowe" zazwyczaj składają się z chemicznie aktywnych grup powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasowe lub cukrowe łańcuchy boczne i posiadają specyficzne, trójwymiarowe cechy strukturalne jak również charakterystyczny, specyficzny ładunek. [0131] Antygen" jest cząsteczką lub częścią cząsteczki zdolną do wiązania się z przeciwciałem, który to antygen jest dodatkowo zdolny do indukowania zwierzęcia do wytwarzania przeciwciała zdolnego do wiązania epitopu tego antygenu. Antygen może posiadać jeden lub większą liczbę epitopów. Swoista reakcja

22 zgodnie z powyższym ma na celu wskazanie, że antygen będzie reagować, w wysoce selektywny sposób, za pośrednictwem znajdującego się na nim epitopu, z odpowiadającym przeciwciałem, a nie z dużą liczbą innych przeciwciał, które mogą być wywoływane przez inne antygeny. [0132] ; Ausubel i wsp., wyd., Harlow i Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); oraz Colligan i wsp., wyd., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N. Y., ( ). Przeciwciała takie mogą być dowolną klasą immunoglobulin, w tym IgG, IgM. [0133] Przeciwciało anty-idiotypowe (anty-id) jest przeciwciałem, które rozpoznaje unikatowe determinanty, zasadniczo związane z miejscem wiązania antygenu przez przeciwciało. Przeciwciało Id można wytworzyć przez immunizację zwierzęcia tego samego gatunku i typu genetycznego (np. szczepu myszy), które było źródłem mab wobec którego wytworzono anty-ld. [0134] Immunizowane zwierzę będzie rozpoznawało i odpowiadało na determinanty idiotypowe przeciwciała immunizującego przez wytworzenie przeciwciała wobec tych determinant idiotypowych (przeciwciało anty- Id). Patrz, przykładowo, patent USA nr [0135] Przeciwciało anty-id może być także stosowane jako immunogen" do indukowania odpowiedzi immunologicznej w jeszcze innym zwierzęciu, wytwarzającym tak zwane przeciwciało anty-anty-ld. Antyanty-ld może być identyczne epitopowo z pierwotnym mab, które indukowało anty-id. Zatem, przy użyciu przeciwciał wobec determinant idiotypowych mab, możliwe jest identyfikowanie innych klonów wyrażających przeciwciała o identycznej swoistości. [0136] Zgodnie z tym, mab wytworzone wobec fragmentów NIK można stosować do indukowania przeciwciał anty-ld w odpowiednich zwierzętach, takich jak myszy BALB/c. Komórki śledziony z takich immunizowanych myszy stosowane są do wytwarzania hybrydom anty-ld wydzielających anty-ld mab. Dalej, anty-id mab można sprzęgać z nośnikiem, takim jak hemocyjanina skałoczepa (KLH) i stosować do immunizacji dodatkowych myszy BALB/c. Surowice z tych myszy będą zawierały przeciwciała anty-anty-ld o właściwościach wiązania pierwotnego mab swoistego wobec epitopu lub fragmentu NIK. [0137] Zatem, przeciwciała anty-id mab posiadają własne epitopy idiotypwe lub idiotopy" podobne strukturalnie do ocenianego epitopu. [0138] Preparat według wynalazku z przeciwciała ludzkiego lub humanizowanego lub fragmentu przeciwciała może korzystnie nadawać się do zastosowań wymagających podania preparatu osobnikowi. Przykładowo, przeciwciało ludzkie lub humanizowane lub fragment przeciwciała będzie zasadniczo wykazywać tendencję bycia optymalnie tolerowanym immunologicznie i zatem, będzie wykazywać optymalny okres półtrwania in vivo w organizmie człowieka, i będzie tym samym wykazywać optymalną skuteczność. Dalsze zalecenia dotyczące wytwarzania i wykorzystania ludzkich lub humanizowanych przeciwciał są dostarczone poniżej. [0139] Przeciwciała, w tym fragmenty przeciwciał, przydatne w niniejszym wynalazku można stosować do ilościowej i jakościowej detekcji w próbce NIK lub jej muteiny, funkcjonalnej pochodnej, frakcji aktywnej, permutowanej kołowo pochodnej, soli lub ich części, lub do detekcji obecności komórek, które wyrażają NIK lub jej muteinę, funkcjonalną pochodną, frakcję aktywną, permutowaną kołowo pochodną, sól lub ich część. Można to osiągnąć technikami immunofluorescencji stosującymi fluorescencyjnie wyznakowane przeciwciało w połączeniu z detekcją za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, cytometrii przepływowej lub fluorymetrii.

23 [0140] Przeciwciała (lub ich fragmenty) według wynalazku można stosować w histologii, jak w mikroskopii immunofluorescencyjnej lub immunoelektronowej, do detekcji NIK in situ lub jej części według wynalazku. Detekcję in situ można osiągnąć przez pobranie od pacjenta próbki histologicznej i dostarczenie wyznakowanego przeciwciała według wynalazku do takiej próbki. Przeciwciało (lub fragment) jest korzystnie dostarczane przez naniesienie lub nawarstwienie wyznakowanego przeciwciała (lub fragmentu) na próbkę biologiczną. Przez zastosowanie takiej procedury możliwe jest określenie nie tylko obecności NIK lub jej części, lecz także rozmieszczenia w badanej tkance. Stosując niniejszy wynalazek, zwykły specjalista, z łatwością zauważy, że w celu osiągnięcia takiej detekcji in situ można zmodyfikować dowolną z gamy różnorodnych metod histologicznych (takich jak procedury barwienia). [0141] Próbkę biologiczną można sprzęgać do podłoża stałego lub nośnika, takiego jak nitroceluloza lub innego stałego nośnika lub podłoża, zdolnego do unieruchamiania komórek, cząstek komórkowych lub rozpuszczalnych białek. Nośnik lub podłoże można następnie płukać odpowiednimi buforami, a następnie traktować wyznakowanym przeciwciałem według wynalazku, jak opisano powyżej. Nośnik lub podłoże fazy stałej można następnie powtórnie płukać buforem w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Ilość związanego znacznika na wskazanym stałym nośniku lub podłozu można następnie wykrywać standardowymi sposobami. [0142] Przez podłoże fazy stałej, nośnik fazy stałej, podłoże stałe, nośnik stały, położe lub nośnik rozumiany jest nośnik lub podłoże zdolne do wiązania antygenu lub przeciwciał. Dobrze znane nośniki lub podłoża obejmują: szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, nylon, amylaza, celulozy naturalne i zmodyfikowane, poliakryloamidy, gabro i magnetyt. Dla celów niniejszego wynalazku nośnik może być rozpuszczalny lub nierozpuszczalny. Materiał podłoża może mieć praktycznie dowolne możliwe ukształtowanie, tak długo jak podłączona cząsteczka jest zdolna do wiązania antygenu lub przeciwciała. Zatem, nośnik lub podłoże może mieć kształt kulisty, jak w kulce/koraliku, cylindryczny, jak w wewnętrznej powierzchni probówki do testowania lub zewnętrznej powierzchni pręta. Alternatywnie, powierzchnia może być taka jak kartka, pasek do testowania, etc. Korzystne nośniki lub podłoża obejmują kulki polistyrenowe. Specjaliści w dziedzinie będą znali inne odpowiednie nośniki do wiązania przeciwciała lub antygenu lub będą zdolni do dobrania ich przez zastosowanie rutynowej drogi doświadczalnej. [0143] Aktywność wiązania danej partii przeciwciała, według wynalazku jak opisano powyżej, można oznaczyć za pomocą dobrze znanych metod. Specjaliści w dziedzinie będą zdolni do określenia skutecznych i optymalnych warunków testu dla każdego oznaczenia przez wykorzystanie rutynowej drogi doświadczalnej. [0144] Do testów można dodać inne etapy takie jak płukanie, mieszanie, wytrząsanie, filtrowanie i im podobne, jeśli jest to w zwyczaju lub konieczne w konkretnej sytuacji. [0145] Jedną z dróg, którą można wyznakować przeciwciało według wynalazku, jest połączenie go z enzymem i użycie w teście immunoenzymatycznym (EIA). Enzym ten z kolei, kiedy jest później eksponowany na odpowiedni substrat, będzie z tym substratem reagować w taki sposób, że wytwarza cząstkę chemiczną, którą można wykryć, przykładowo, spektrofotometrycznie, fluorymetrycznie lub wzrokowo. Enzymy, które można użyć do wyznakowania przeciwciała w celu jego wykrywalności obejmują: dehydrogenazę jabłczanową, nukleazę gronkowcową, izomerazę delta-5-sterydową, dehydrogenazę alkoholową z drożdży, dehydrogenazę alfa-glicerofosforanową, izomerazę triozofosforanową, peroksydazę z chrzanu, fosfatazę alkaliczną, asparaginazę, oksydazę glukozową, beta-galaktozydazę, rybonucleazę, ureazę, katalazę, dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, glukoamylazę i esterazę acetylocholinową.

24 Detekcję można uzyskać metodami kolorymetrycznymi, które wykorzystują chromogenny substrat dla enzymu. Detekcję można także uzyskać przez wzrokowe porównanie stopnia reakcji enzymatycznej z substratem z podobnie przygotowanymi standardami. [0146] Detekcję można uzyskać stosując dowolny rodzaj innych testów immunologicznych. Przykładowo, dzięki radioaktywnemu wyznakowaniu przeciwciał lub fragmentów przeciwciała, możliwe jest wykrycie R- PTPazy przy użyciu radioimmunotestu (RIA). Dobry opis RIA można znaleźć w Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. i wsp., North Holland Publishing Company, NY (1978), ze szczególnym odwołaniem do rozdziału zatytułowanego An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" napisanego przez Chard, T. [0147] Izotop radioaktywny można wykryć za pomocą licznika g lub licznika scyntylacyjnego lub za pomocą autoradiografii. [0148] Możliwe jest także wyznakowanie przeciwciała według wynalazku związkiem fluorescencyjnym. Po ekspozycji przeciwciała wyznakowanego fluorescencyjnie na światło o odpowiedniej długości fali, jego obecność będzie wykrywana dzięki fluorescencji. Wśród najczęściej stosowanych jako znaczniki związków fluorescencyjnych znajdują się izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina, fikoerytryna, fikocyjanina, allofikocyjanina, o-ftalaldehyd i fluoreskamina. [0149] Przeciwciało można także wyznakować w sposób umożliwiający wykrywanie stosując metale emitujące fluorescencję, takie jak 152 E, lub inne z grupy lantanowców. Metale te można przyłączać do przeciwciała stosując takie grupy chelatujące metale jak kwas dietylenotriaminopentaoctowy (ETPA). [0150] Przeciwciało można także wyznakować w sposób umożliwiający wykrywanie przez sprzęgnięcie go ze związkiem chemiluminescencyjnym. Obecność wyznakowanego chemiluminescencyjnie przeciwciała jest następnie określana przez wykrycie obecności luminescencji, która pojawia się w czasie przebiegu reakcji chemicznej. Przykładami szczególnie przydatnych chemiluminescencyjnych związków do znakowania są luminol, izoluminol, teromatyczny ester akrydynowy, imidazol, sól akrydynowa i ester szczawianowy. [0151] Podobnie, do wyznakowania przeciwciała według wynalazku, można użyć związek bioluminescencyjny. Bioluminescencja jest rodzajem chemiluminescencji znajdowanej w układach biologicznych, w których białko katalityczne wzmacnia wydajność reakcji chemiluminescencyjnej. Obecność białka bioluminescencyjnego jest określana przez detekcję obecności luminescencji. Ważnymi związkami bioluminescencyjnymi do celów znakowania są lucyferyna, lucyferaza i ekworyna. [0152] Preparat przeciwciała według wynalazku może być przystosowany do wykorzystania w teście immunometrycznym, znanym także jako test dwu-miejscowy lub kanapkowy. W typowym teście immunometrycznym, konkretna ilość niewyznakowanego przeciwciała (lub fragmentu przeciwciała) jest związana ze stałym nośnikiem lub podłożem i dodawana jest konkretna ilość rozpuszczalnego przeciwciała wyznakowanego w sposób wykrywalny w celu umożliwienia detekcji i/lub określenia ilościowego trójskładnikowego kompleksu utworzonego pomiędzy przeciwciałem fazy stałej, antygenem i wyznakowanym przeciwciałem. [0153] Typowo i korzystnie, testy immunometryczne obejmują testy zgodne" (ang. forward ), w których przeciwciało związane ze stałym nośnikiem jest najpierw kontaktowane z badaną próbką w celu wydzielenia antygenu z próbki przez utworzenie dwuskładnikowego kompleksu przeciwciało na stałym nośniku antygen. Po odpowiednim okresie inkubacji, stały nośnik lub podłoże jest płukany w celu usunięcia resztek płynnej próbki, w tym antygenu, który nie przereagował, jeśli taki pozostał, a następnie kontaktowany z

25 roztworem zawierającym nieznaną ilość wyznakowanego przeciwciała (które działa jako cząsteczka reporterowa ). Po okresie drugiej inkubacji, która pozwala na powstanie kompleksu pomiędzy wyznakowanym przeciwciałem i antygenem związanym ze stałym nośnikiem lub podłożem za pomocą niewyznakowanego przeciwciała, stały nośnik lub podłoże jest płukane po raz drugi w celu usunięcia wyznakowanego przeciwciała, które nie przereagowało. [0154] W innym typie testu kanapkowego (ang. sandwich), który może być także przydatny z antygenami według wynalazku, stosowane są tak zwane testy równoczesne" (ang. simultaneous) lub typu odwróconego (ang. reverse). Test równoczesny wymaga etapu pojedynczej inkubacji, ponieważ przeciwciało związane ze stałym nośnikiem lub podłożem i wyznakowane przeciwciało są dodawane do badanej próbki w tym samym czasie. Po zakończeniu inkubacji stały nośnik lub podłoże jest płukane w celu usunięcia resztek płynnej próbki i wyznakowanego przeciwciała, które nie utworzyło kompleksu. Obecność wyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym nośnikiem lub podłozem jest następnie określana, tak jak to ma miejsce w typowym teście kanapkowym typu zgodnego. [0155] W teście typu odwróconego, następuje stopniowe dodawanie do płynnej próbki najpierw roztworu z wyznakowanym przeciwciałem, a następnie niewyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym nośnikiem lub podłożem po odpowiednim okresie inkubacji. Po drugiej inkubacji, faza stała jest płukana w tradycyjny sposób, aby uwolnić ją od resztek badanej próbki i roztworu wyznakowanego przeciwciała, które nie przereagowało. Określanie wyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym nośnikiem lub podłożem jest następnie przeprowadzane jak w testach równoczesnym i zgodnym. [0156] Preparat można stosować per se lub można przygotować jako aktywny składnik w kompozycji farmaceutycznej. [0157] Zatem, według wynalazku dostarczana jest tu kompozycja farmaceutyczna obejmująca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, jako aktywny składnik. [0158] Metody przygotowania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała według wynalazku jako aktywnego składnika kompozycji farmaceutycznej i metody wykorzystywania takiej kompozycji farmaceutycznej opisano poniżej. [0159] Jak opisano powyżej, przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, ze względu na jego zdolności do swoistego wiązania regionu NIK, takiego jak region funkcjonalny, można użyć do regulacji aktywności biochemicznej cząsteczki NIK związanej z takim funkcjonalnym regionem. [0160] Zatem, zgodnie z jeszcze innym aspektem według wynalazku dostarczana jest metoda regulowania aktywności biochemicznej cząsteczki NIK. Metoda jest opiera się na kontaktowaniu cząsteczki NIK z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała według wynalazku. [0161] Korzystnie, metoda jest stosowana do regulowania aktywności biochemicznej cząsteczki NIK człowieka. [0162] Jak opisano powyżej, ponieważ przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku jest zdolne do swoistego wiązania ufosforylowanej NIK w taki sposób, że obniża poziom regulacji aktywności kinazowej NIK i ponieważ aktywność taka jest wymagana do aktywacji NF-κB, jak szeroko omówiono w sekcji Dziedzina i podstawa wynalazku, powyżej, metodę można użyć do optymalnego obniżenia poziomu regulacji aktywności NF-κB.

26 [0163] Zatem, ze względu jej zdolność do optymalnego obniżenia poziomu regulacji aktywności NF-κB, metodę można użyć do optymalnego leczenia osobnika z chorobą związaną z deregulacją aktywności NFκB, przy szczególnie wysokiej i konstytutywnej aktywności NF-κB. [0164] Przy stosowaniu metody, zgodnie z tym aspektem według wynalazku, do leczenia osobnika z chorobą, kontaktowanie cząsteczki NIK z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała można korzystnie przeprowadzić przez podanie osobnikowi przeciwciała lub fragmentu przeciwciała. [0165] Korzystnie, podawanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała jest przeprowadzane przez podanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku obejmującej, jako aktywny składnik, przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku. [0166] Przeciwciało lub fragment przeciwciała jest korzystnie podawane tak, aby osiągnąć wystarczający poziom fragmentu przeciwciała związanego z antygenem docelowym tak, aby osiągnąć regulację aktywności biochemicznej. [0167] Zwykły specjalista, taki jak lekarz, korzystniej lekarz specjalista w zakresie danej choroby, będzie posiadał wymagane doświadczenie do wyznaczenia odpowiedniego protokołu terapeutycznego, włączając odpowiednią drogę podawania i odpowiednie dawkowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała dla skutecznego leczenia choroby zgodnie z naukami według wynalazku. [0168] NIK jest normalnie cząsteczką wewnątrzkomórkową i ze względu na to, w celu optymalnego kontaktowania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z cząsteczką NIK w komórce, takiej jak komórka charakteryzująca się deregulacją aktywności NF-κB, metoda jest korzystnie praktykowana taką drogą, która ułatwia kontakt przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z cząsteczką NIK w komórce. [0169] Takie wewnątrzkomórkowe kontaktowanie można ułatwić różnymi drogami, w zależności od zastosowania i celu. [0170] Przykładowo, takie wewnątrzkomórkowe kontaktowanie można przeprowadzić przez kontaktowanie komórki z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała związanym z nośnikiem bazującym na lipidzie, zdolnym do ułatwiania przenikania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do wnętrza komórki. [0171] Alternatywnie, takie wewnątrzkomórkowe kontaktowanie można przeprowadzić za pomocą genetycznej transformacji komórek wektorem ekspresyjnym pozwalającym na wyrażenie fragmentu przeciwciała według wynalazku wewnątrz komórki. [0172] Odpowiednie rodzaje nośników lipidowych ułatwiających wejście przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do komórki obejmują liposomy i immunoliposomy. Immunoliposomy, ze względu na ich zdolność umożliwiającą, specyficzne wobec rodzaju komórki, dostarczanie cząsteczek mogą być korzystnie stosowane do selektywnego dostarczania przeciwciała lub fragmentu przeciwciała do komórek dotkniętych chorobą, przy czym komórki takie wyrażają charakterystyczne antygeny powierzchniowe, takie jak markery zapalenia w komórkach wykazujących patologiczną odpowiedź immunologiczną (przykładowo, CD25 lub CD69 w aktywowanych limfocytach T) lub antygeny w komórkach inwazyjnych związanych z nowotworem (przykładowo, HER-2 w komórkach gruczolakoraka, MAGE-1 w komórkach czerniaka i im podobne). [0173] Znaczące wytyczne do stosowania takich nosników na bazie lipidów do dostarczania wewnątrzkomórkowego cząsteczek terapeutycznych, takich jak przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku, do komórek objętych chorobą jest dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: Abra RM. i wsp., J Liposome Res. 12:1-3; Park JW., Breast Cancer Res.;4(3):95-9; Bendas G., BioDrugs 15:215-24; Maruyama K., Biol Pharm Bull. 23:791-

27 9; Hong K. i wsp., Ann N Y Acad Sci. 886:293-6; Margalit R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 12:233-61; Storm G. and Crommelin DJ., Hybridoma 16:119-25; Park JW. i wsp., Adv Pharmacol. 40: ). [0174] Wytwarzanie wewnątrzkomórkowo fragmentu zrekombinowanego przeciwciała, takiego jak fragment zrekombinowanego przeciwciała według wynalazku, jest rutynowo praktykowane w dziedzinie. Fragment zrekombinowanego przeciwciała wyrażany wewnątrzkomórkowo może być w dziedzinie określony jako przeciwciało wewnątrzkomórkowe. Obszerne wytyczne do stosowania ekspresji wewnątrzkomórkowej fragmentu zrekombinowanego przeciwciała zdolnego do swoistego wiązania biocząsteczki do regulacji aktywności biologicznej, takiej jak aktywność enzymatyczna, biocząsteczki w komórce, są dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: Mhashilkar AM. i wsp., Gene Ther. 9:307-19; Arafat W. i wsp., Cancer Gene Ther. 7:1250-6; Cohen PA. i wsp., Oncogene 17: ; Hassanzadeh Gh G. i wsp., FEBS Lett. 437:81-6; Richardson JH. i wsp., Gene Ther. 5:635-44; ogólne zalecenie do wyrażania fragmentu zrekombinowanego przeciwciała w komórce, przykładowo, odniesienie w: der Maur AA. i wsp., J Biol Chem. 277: ; Zhu Q. i wsp., J Immunol Methods. 231:207-22; Wirtz P. i Steipe B., Protein Sci. 8: ; Ohage E. i Steipe B., J Mol Biol. 291: ). [0175] Komórkę ssaka genetycznie stransformowaną wektorem ekspresyjnym można wykonać przy użyciu dowolnej z różnych metod powszechnie stosowanych w dziedzinie, takiej jak transfekcja stabilna lub przejściowa, lipofekcja, elektroporacja i infekcja zrekombinowanymi wektorami wirusowymi. Obszerne zalecenie do stosowania takich metod jest dostarczone w specjalistycznej literaturze [przykładowo, odniesienie w: Sambrook i wsp., poniżej i w załączonych odnośnikach; Chang i wsp. w: Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995); Vega i wsp. w: Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor MI. (1995); Vectors, A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988); Gilboa i wsp., Biotechniques 4: ; wektory wykorzystywane w centralnym układzie nerwowym, przykładowo, odniesienie w: patencie USA nr ; metody selekcji pozytywnej i negatywnej do indukowania rekombinacji homologicznej, przykładowo, odniesienie w: patentach USA nr i ]. [0176] Dalsze zalecenie dotyczące wytwarzania i wykorzystania wektorów ekspresyjnych do wyrażania fragmentu przeciwciała według wynalazku w komórce jest dostarczone poniżej. [0177] Jak opisano powyżej, sposób zgodny z tym aspektem według wynalazku można stosować do optymalnego leczenia choroby związanej ze zderegulowaną aktywnością NF-κB. Aktywność NF-κB jest zasadniczo zaangażowana w aktywację bardzo szerokiego zakresu odpowiedzi immunologicznych, w tym tych wyzwalanych przez: limfocytowe receptory antygenów, limfocytowe receptory kostymulujące, receptory TNF, receptory interleukin, LMP1, RANK, ludzki receptor Toll oraz lipopolisacharyd (LPS). Ponieważ receptory takie są zaangażowane w pośredniczenie w szerokim zakresie typów odpowiedzi immunologicznych, sposób zgodny z tym aspektem według wynalazku można stosować do leczenia licznych chorób, których patogeneza jest związana z takimi odpowiedziami immunologicznymi. Choroby takie obejmują choroby autoimmunologiczne, choroby zapalne, choroby towarzyszące przeszczepom i alergiczne. Przykładowo wykazano, że NF-κB jest zaangażowany w patogenezę różnorodnych przykładów takich chorób, w tym chorób alergicznych, takich jak astma, chorób autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, choroby zapalnej, takiej jak nieswoiste zapalenie jelit, miażdżyca tętnic i

28 choroba Alzheimera oraz chorób towarzyszących przeszczepom, takich jak odrzucenie przeszczepu. Ponadto, pokazano, że deregulacja przekazywania sygnału za pośrednictwem NF-κB jest związana z różnymi chorobami złośliwymi. [0178] Jako taki, sposób zgodny z tym aspektem według wynalazku można stosować do skutecznego leczenia chorób, takich jak choroby autoimmunologiczne, zapalne, towarzyszące przeszczepom, alergiczne i złośliwe. [0179] Konkretne przykłady chorób, które można leczyć zgodnie z tym aspektem według wynalazku są podane poniżej. [0180] Jak opisano powyżej, antygen docelowy, który jest polipeptydem można uzyskać różnymi drogami. [0181] Korzystnie, antygen docelowy jest uzyskiwany za pomocą standardowej metodologii syntezy chemicznej. [0182] Alternatywnie, docelowy antygen można uzyskać przez proteolityczne cięcie naturalnie wytwarzanej NIK lub można uzyskać za pomocą standardowych technik rekombinacji przy użyciu systemów ekspresji invitro (przykładowo, odniesienie w: Sambrook i wsp. poniżej i w załączonych odnośnikach). [0183] Antygen docelowy można zsyntetyzować chemicznie stosując, przykładowo, standardowe techniki fazy stałej. Techniki takie obejmują metody wykluczającej syntezy na fazie stałej, częściowej syntezy na fazie stałej, kondensację fragmentów, klasyczną syntezę w roztworze. Procedury syntezy peptydów na fazie stałej są dobrze znane w dziedzinie [przykładowo, sprawdzić u: Stewart i wsp., w Solid Phase Peptide Synthesis, wyd. 2, Pierce Chemical Company, (1984)]. [0184] Peptyd syntetyczny można oczyszczać przy użyciu procedury preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej, takiej jak opisana przez Creighton T. [Proteins, structures and molecular principles, W. H. Freeman i Co. N.Y. (1983)] i jego sekwencję aminokwasową można potwierdzić za pomocą standardowych procedur sekwencjonowania aminokwasów. [0185] Jak opisano powyżej, preparat jest korzystnie uzyskiwany przez immunizację ssaka antygenem docelowym. [0186] Wytwarzanie preparatu in vivo można korzystnie przeprowadzić przez powtarzanie wstrzyknięcia antygenu docelowego ssakowi w obecności adiuwanta zgodnie z harmonogramem, który wzmacnia wytwarzanie przeciwciał w surowicy. W przypadkach, w których antygen docelowy jest zbyt mały, aby wywołać odpowiednią odpowiedź immunogenną (określany w dziedzinie jako hapten ), hapten można sprzęgać z neutralnym antygenowo nośnikiem, takim jak hemocyjanina skałoczepa (KLH, ang. keyhole limpet hemocyanin) lub albumina surowicza [np., bydlęca albumina surowicza (BSA)] (przykłady opisano patentach USA nr i ). Sprzęganie haptenu z nośnikiem można przeprowadzić stosując różne metody dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, można przeprowadzić bezpośrednie sprzęganie grup aminowych a następnie, ewentualnie, redukcję utworzonych wiązań iminowych. Alternatywnie, nośnik można sprzęgnąć przy użyciu czynników kondensujących, takich jak karboimid dicykloheksylowy lub innych karboimidowych czynników odwadniających. W celu uzyskania połaczenia można także stosować cząsteczki łącznika (ang. linker); w Pierce Chemical Company, Rockford, Ill dostępne są zarówno łączniki homobifuncjonalne i heterobifunkcjonalne. Uzyskany kompleks immunogenny można następnie wstrzyknąć odpowiednim ssakom, takim jak myszy, króliki i im podobnym. Po wytworzeniu przeciwciała in vivo, można z łatwością zmierzyć jego miano w surowicy przy użyciu procedur testów immunologicznych, dobrze znanych specjalistom w dziedzinie.

29 [0187] Jak opisano powyżej, preparat może korzystnie zawierać przeciwciało humanizowane lub fragment przeciwciała. [0188] Przeciwciała chimeryczne i metody ich wytwarzania są znane w dziedzinie (Cabilly i wsp., zgłoszenie patentu europejskiego nr (opublikowane 14 listopada 1984); Taniguchi i wsp., zgłoszenie patentu europejskiego nr (opublikowane 19 lutego 1985); Morrison i wsp., zgłoszenie patentu europejskiego nr (opublikowane 5 marca 1986); Neuberger i wsp., zgłoszenie PCT WO , (opublikowane 13 marca 1986); Kudo i wsp., zgłoszenie patentu europejskiego nr (opublikowane 11 czerwca 1986); Robinson i wsp., zgłoszenie patentu międzynarodowego nr [0189] W (opublikowane 7 maja 1987); Riechmann i wsp. oraz Harlow i Lane, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, powyżej. [0190] Przeciwciała ludzkie są cząsteczkami zawierającymi zarówno region zmienny jak i stały ludzkiej immunoglobuliny. Przeciwciała w pełni ludzkie są szczególnie przydatne do zastosowania terapeutycznego, ze względu na to, że powinna być znacząco zredukowana immunogenność anty-idiotypowa, lub w sytuacji idealnej powinna być nieobecna. Jedna metoda wytwarzania przeciwciał w pełni ludzkich składa się z humanizacji humoralnego układu odpornościowego myszy, np. wytworzenia szczepów myszy zdolnych do wytwarzania ludzkich Ig (ksenomyszy), przez wprowadzenie loci ludzkiej immunoglobuliny (Ig) do myszy, w których inaktywowano endogenne geny Ig. Loci Ig są niezmiernie złożone, zarówno pod względem ich struktury fizycznej i rearanżacji genów jak i procesów ekspresji wymaganych do ostatecznego wytwarzania szerokiej odpowiedzi immunologicznej. Różnorodność przeciwciał powstaje głównie dzięki kombinatorycznym rearanżacjom pomiędzy różnymi genami V, D, i J, obecnymi w loci Ig. Loci te zwierają także rozrzucone elementy regulacyjne, które kontrolują ekspresję przeciwciał, wykluczanie alleliczne, przełączanie klas i dojrzewanie powinowactwa. Wprowadzenie transgenów nieprzerearanżowanych ludzkich Ig do myszy pokazało, że maszyneria rekombinacyjna myszy jest zgodna dla genów ludzkich. Ponadto, przez immunizację antygenem ksenomyszy można uzyskać przeszukiwane hybrydom pod kątem antygenowo swoistych ludzkich mab wielu izotypów. [0191] Przeciwciała w pełni ludzkie i metody ich wytwarzania są znane w dziedzinie (Mendez i wsp. (1997); Buggemann i wsp. (1991); Tomizuka i wsp., (2000) Patent WO98/24893). [0192] W użytym tu znaczeniu termin muteiny odnosi się do analogów NIK, w których jedna lub większa liczba reszt aminokwasowych naturalnie występujących składników NIK jest wymieniona przez różniące się reszty aminokwasowe lub jest wydelegowana, lub jedna lub większa liczba reszt aminokwasowych jest dodana do pierwotnej sekwencji NIK, bez istotnej zmiany aktywności uzyskanych produktów w porównaniu z oryginalną NIK. Muteiny te są wytwarzane znanymi technikami syntezy i/lub ukierunkowanej mutagenezy, lub dowolną, inną, dogodną techniką. [0193] Muteiny według wynalazku obejmują białka kodowane przez kwas nukleinowy, taki jak DNA lub RNA, który hybrydyzuje z DNA lub RNA, kodującym NIK, według wynalazku, w ostrych warunkach. Termin ostre warunki odnosi się do warunków hybrydyzacji i następującego po niej płukania, które specjaliści w dziedzinie typowo określają jako ostre. Patrz, Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, powyżej, Interscience, N.Y., 6.3 i 6.4 (1987, 1992) oraz Sambrook i wsp. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

30 [0194] Bez ograniczania, przykłady ostrych warunków obejmują warunki płukania C poniżej obliczonej Tm badanej hybrydy w, np., 2 x SSC i 0,5% SDS przez 5 min., 2 x SSC i 0,1% SDS przez 15 min.; 0,1 x SSC i 0,5% SDS w 37 C przez min. a następnie, 0,1 x SSC i 0,.5% SDS w 68 C przez min. Specjaliści w tej dziedzinie rozumieją, że warunki ostrości zależą także od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (takich jak zasad) lub mieszanych sond oligonukleotydowych. Jeśli stosowane są mieszane sondy oligonukleotydowe, korzystne jest użycie chlorku tetrametyloamonowego (TMAC) zamiast SSC. Patrz Ausubel, powyżej. [0195] Dowolna taka muteina korzystnie posiada sekwencję aminokwasową wystarczająco powielającą sekwencję NIK, tak, że posiada zasadniczo podobną lub nawet lepszą aktywność w porównaniu z NIK. [0196] W korzystnym wykonaniu, dowolna taka muteina posiada co najmniej 40% identyczności lub homologii z sekwencją aminokwasową NIK. Korzystniej, posiada co najmniej 50%, co najmniej 60%, co najmniej 70%, co najmniej 80% lub, najkorzystniej, co najmniej 90% identyczności lub homologii. [0197] Identyczność odzwierciedla relację pomiędzy dwiema lub większą liczbą sekwencji polipeptydowych lub dwiema lub większą liczbą sekwencji polinukleotydowych, określoną na podstawie porównania sekwencji. Zasadniczo, identyczność odnosi się do dokładnej zgodności nukleotydu do nukleotydu lub aminokwasu do aminokwasu, odpowiednio, w dwóch polinukleotydach lub sekwencjach polipeptydowych na całej długości porównywanych sekwencji. [0198] Dla sekwencji, w których nie ma dokładnej zgodności można określić procent identyczności. Zasadniczo, dwie porównywane sekwencje są przyrównywane, tak aby dały maksymalną zgodność pomiędzy sekwencjami. Może to obejmować wprowadzenie przerw w jednej lub w drugiej sekwencji, w celu wzmocnienia stopnia przyrównania. Procent identyczności można określić na całej długości każdej z porównywanych sekwencji (tak zwane przyrównanie globalne), które jest szczególnie dogodne dla sekwencji o tej samej lub bardzo podobnej długości, lub na krótszych, określonych długościach (tak zwane przyrównanie miejscowe), które jest dogodniejsze dla sekwencji o nierównej długości [0199] Metody porównywania identyczności i homologii dwóch lub większej liczby sekwencji są dobrze znane w dziedzinie. Zatem, na przykład, do określenia % identyczności pomiędzy dwoma polinukleotydami oraz % identyczności i % homologii pomiędzy dwiema sekwencjami polipeptydowymi można stosować programy dostępne w Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J i wsp. 1984, Nucleic Acids Res Jan 11;12(1 Pt 1): ), przykładowo programy BESTFIT i GAP. BESTFIT wykorzystuje algorytm homologii miejscowej według Smith i Waterman (J Theor Biol Jul 21;91(2): i J Mol Biol Mar 25;147(1): ) i znajduje najlepsze pojedyncze regiony podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami. Inne programy do określania identyczności i/lub podobieństwa pomiędzy sekwencjami są także znane w dziedzinie, na przykład rodzina programów BLAST (Altschul S F i wsp., 1990 J Mol Biol Oct 5;215(3):403-10, Proc Natl Acad Sci U S A Jul;87(14): , Altschul S F i wsp., Nucleic Acids Res Sep 1;25(17): , dostępny przez stronę główną NCBI w i FASTA (Pearson W R, Methods Enzymol. 1990;183:63-98., Pearson J Mol Biol Feb 13;276(1):71-84). [0200] Muteiny NIK, które można stosować według wynalazku, lub kodujący je kwas nukleinowy, obejmują zdefiniowany zestaw zasadniczo zgodnych sekwencji, jak peptydy lub polinukleotydy z podstawieniami, które mogą być rutynowo uzyskiwane przez specjalistę w dziedzinie, bez zbytniego szukania drogi doświadczalnej, w oparciu o prezentowane tu nauki i zalecenie.

31 [0201] Korzystne zmiany w muteinach według wynalazku, są tymi, które są znane jako podstawienia konserwatywne. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe w NIK mogą obejmować aminokwasy synonimiczne, będące w grupie która posiada wystarczająco podobne własności fizykochemiczne, że podstawienie pomiędzy przedstawicielami tej grupy będą zachowywały funkcję biologiczną cząsteczki. Jest oczywiste, że można także wykonać insercje i delecje aminokwasów w określonych powyżej sekwencjach bez zmiany ich funkcji, w szczególności jeśli insercje lub delecje obejmują jedynie kilka aminokwasów, np. poniżej trzydziestu, i korzystnie poniżej dziesięciu, i nie usuwają lub wypierają aminokwasów, które są istotne dla funkcjonalnej konformacji, np. reszt cysteinowych. Białka i muteiny wytworzone za pomocą takich delecji i/lub insercji są objęte zakresem niniejszego wynalazku. [0202] Korzystnie, grupami aminokwasów synonimicznych są te zdefiniowane w Tabeli A. Korzystniej, grupami aminokwasów synonimicznych są te zdefiniowane w Tabeli B; i najkorzystniej grupami aminokwasów synonimicznych są te zdefiniowane w Tabeli C. Tabela A Korzystne grupy aminokwasów synonimicznych Aminokwas Grupa synonimiczna Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp Trp

32 Tabela B Bardziej korzystne grupy aminokwasów synonimicznych Aminokwas Grupa synonimiczna Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, Ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, Ile Gly Gly Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Trp Tabela C Najkorzystniejsze grupy aminokwasów synonimicznych Aminokwas Grupa synonimiczna Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly Ile Ile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp

33 Najkorzystniejsze grupy aminokwasów synonimicznych Aminokwas Grupa synonimiczna Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Met [0203] Przykłady wytworzenia podstawień aminokwasowych w białkach, które można zastosować do uzyskania mutein NIK, do użycia według wynalazku obejmują etapy dowolnych znanych metod, takich jak zaprezentowane w patentach USA , i , według Mark i wsp.; według Koths i wsp., według Namen i wsp.; według Chong i wsp.; oraz według Lee i wsp.; oraz dla białek z podstawioną lizyną zaprezentowane w patencie USA nr (Shaw i wsp.). [0204] Funkcjonalne pochodne, w użytym tu znaczeniu, pokrywają pochodne NIK i ich muteiny, które można wytworzyć z funkcjonalnych grup występujących jako łańcuchy boczne na resztach lub są przyłączeniami na grupach końców N lub C, w sposób znany w dziedzinie, i są włączone do wynalazku tak długo jak pozostają farmaceutycznie dopuszczalne, tzn. nie niszczą aktywności białka, która jest zasadniczo podobna do aktywności NIK i nie nadają właściwości toksycznych zawierającym je kompozycjom. [0205] Frakcją aktywną według wynalazku może być np. fragment NIK. Termin fragment odnosi się do dowolnego podzbioru cząsteczki, to znaczy, krótszego peptydu, który zachowuje pożądaną aktywność biologiczną. Fragmenty można z łatwością wytwarzać przez usuwanie aminokwasów z dowolnego końca cząsteczki NIK i badanie aktywności uzyskanego fragmentu. Znane są proteazy do usuwania po jednym aminokwasie w czasie z końca N lub końca C polipeptydu i dlatego określenie fragmentów, które zachowują pożądaną aktywność biologiczną, wymaga jedynie zastosowania rutynowej drogi doświadczalnej. [0206] Tak jak aktywne frakcje NIK, muteiny i ich fuzje białkowe, niniejszy wynalazek dalej obejmuje dowolny fragment lub prekursory łańcucha polipeptydowego cząsteczki białka, samej lub wraz z towarzyszącymi cząsteczkami lub resztami przyłączonymi do niej, np. resztami cukru lub fosforanowymi, lub agregatami cząsteczki białka lub reszt cukru, pod warunkiem, że omawiana frakcja posiada zasadniczo aktywność podobną do NIK. [0207] Termin sole odnosi się tu zarówno do soli grup karboksylowych i do soli addycyjnych z kwasami grup aminowych cząsteczki NIK lub jej analogów. Sole grupy karboksylowej można wytworzyć sposobami znanymi w dziedzinie i obejmują sole nieorganiczne, przykładowo, sole sodowe, wapniowe, amonowe, żelaza, cynku i im podobne oraz sole z zasadami organicznymi, jak te przygotowane, przykładowo, z aminami, takimi jak trietanoloamina, arginina lub lizyna, piperydyna, prokaina i im podobne. Sole addycyjne z kwasami obejmują, przykładowo, sole z kwasami mineralnymi, takie jak, przykładowo, kwas hydrochlorowy lub kwas siarkowy oraz sole z kwasami organicznymi, takie jak, przykładowo, kwas octowy lub kwas szczawiowy. Oczywiście, dowolne takie sole muszą zachowywać aktywność biologiczną NIK. [0208] Termin permutowana kołowo w użytym tu znaczeniu odnosi się do liniowej cząsteczki, w której końce połączono ze sobą, bezpośrednio lub za pomocą łącznika, w celu wytworzenia kolistej cząsteczki, a następnie kolistą cząsteczkę otworzono w innym miejscu w celu wytworzenia nowej cząsteczki liniowej z końcami innymi niż końce w cząsteczce wyjściowej. Permutacje kołowe obejmują te cząsteczki, których struktura jest równoważna cząsteczce, która została zcyrkularyzowana a następnie otwarta. Zatem, cząsteczka permutowana kołowo może być syntetyzowana de novo jako cząsteczka liniowa i nigdy nie przechodzić przez etap cyrkularyzacji i otwarcia. Konkretna permutacja kołowa cząsteczki jest wyznaczona

34 przez nawiasy obejmujące reszty aminokwasowe, pomiędzy którymi jest wyeliminowane wiązanie peptydowe. Cząsteczki permutowane kołowo, które mogą obejmować DNA, RNA i białko, są cząsteczkami jednołańcuchowymi, których normalne końce są w fuzji, często przez łącznik, i zawierają nowe końce w innej pozycji. Patrz Goldenberg, i wsp. J. Mol. Biol., 165: (1983) oraz Pan i wsp. Gene 125: (1993). [0209] Permutacja kołowa jest funkcjonalnym odpowiednikiem cząsteczki o prostym łańcuchu, poddanej fuzji końców, w celu wytworzenia cząsteczki kolistej, i następnie przeciętej w różnych miejscach, w celu wytworzenia nowej cząsteczki o prostym łańcuchu z innymi końcami. Permutacja kołowa, zatem, ma wpływ w gruncie rzeczy na konserwację sekwencji i zachowanie identyczności aminokwasów białka przy wytwarzaniu nowych końców w innych miejscach. [0210] Przeciwciała humanizowane lub fragmenty przeciwciał są genetycznie zmienionymi przeciwciałami chimerycznymi lub fragmentami przeciwciał posiadającymi, korzystnie jak najmniejsze, części pochodzące z przeciwciał innych niż od człowieka. Przeciwciała humanizowane obejmują przeciwciała, w których regiony determinujące dopasowanie przeciwciała ludzkiego (przeciwciała biorcy) są wymienione przez reszty z regionu determinującego dopasowanie, posiadającego pożądaną funkcjonalność, z gatunków innych niż człowiek (przeciwciała dawcy), takich jak mysz, szczur lub królik. W niektórych przypadkach, reszty zrębowe z Fv przeciwciała ludzkiego są wymienione przez odpowiadające reszty inne niż od człowieka. Przeciwciała humanizowane mogą także obejmować reszty nie znalezione ani w przeciwciele biorcy ani w importowanych sekwencjach regionu determinującego dopasowanie lub zrębowych. Ogólnie, przeciwciało humanizowane będzie obejmowało zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej i typowo dwie domeny zmienne, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony determinujące dopasowanie odpowiadają tym z przeciwciała innego niż od człowieka i wszystkie, lub zasadniczo wszystkie, regiony zrębowe odpowiadają tym z odpowiedniej sekwencji najwyższej zgodności człowieka. Przeciwciała humanizowane optymalnie zawierają także co najmniej część regionu stałego przeciwciała, takiego jak region Fc, zazwyczaj pochodzący z przeciwciała ludzkiego (patrz, przykładowo, Jones i wsp., Nature 321: ; Riechmann i wsp., Nature 332: ; oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: ). Metody humanizowania przeciwciał innych niż od człowieka lub fragmentów przeciwciał są dobrze znane w dziedzinie. Zazwyczaj, przeciwciało humanizowane posiada jeden lub większą liczbę reszt aminokwasowych wprowadzonych do niego ze źródła nie będącego człowiekiem. Te reszty aminokwasowe nie pochodzące od człowieka są często określane jako reszty importowane, które są zazwyczaj wzięte z importowanej domeny zmiennej. Humanizacja może być zasadniczo przeprowadzona jak opisano (patrz, przykładowo: Jones i wsp., Nature 321: ; Riechmann i wsp., Nature 332: ; Verhoeyen i wsp., Science 239: ; patent USA nr ) przez podstawienie ludzkich regionów determinujących dopasowanie odpowiadającymi regionami determinującymi dopasowanie z gryzonia. Dlatego też, takie humanizowane przeciwciała są przeciwciałami chimerycznymi, gdzie zasadniczo mniej niż cała ludzka domena zmienna jest podstawiona przez odpowiadającą sekwencję z gatunku innego niż człowiek. W praktyce, przeciwciała humanizowane mogą być zazwyczaj przeciwciałami ludzkimi, w których niektóre reszty regionu determinującego dopasowanie i możliwie niektóre reszty zrębowe są podstawione przez reszty z analogicznych miejsc w przeciwciałach gryzonia. Przeciwciała ludzkie lub fragmenty przeciwciała można także wytwarzać przy użyciu różnych technik znanych w dziedzinie, włączając biblioteki prezentowane na fagu [patrz, przykładowo, Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol. 227:381; Marks i wsp.,

35 1991. J. Mol. Biol. 222:581; Cole i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner i wsp., J. Immunol. 147:86-95). Przeciwciała humanizowane można także wytworzyć przez wprowadzenie sekwencji kodujących loci ludzkich immunoglobulin do zwierząt transgenicznych, np. do myszy, u których inaktywowano częściowo lub całkowicie endogenne geny immunoglobulin. Po prowokacji antygenem, u takich zwierząt obserwowane jest wytwarzanie przeciwciała ludzkiego, które pod wszystkimi względami bardzo przypomina to obserwowane u ludzi, włączając rearanżację genów, składanie łańcuchów i zestaw przeciwciał. Obszerne zalecenie do stosowania w praktyce takiego podejścia jest dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: patentach USA nr , , , , i ; Marks i wsp., Bio/Technology 10: ; Lonberg i wsp., Nature 368: ; Morrison, Nature 368:812-13; Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14:845-51; Neuberger, Nature Biotechnology 14:826; Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93). [0211] Jak opisano powyżej, fragment przeciwciała według wynalazku może być korzystnie wyrażany wewnątrzkomórkowo przy użyciu wektora ekspresyjnego. [0212] W korzystnym podejściu do genetycznej modyfikacji komórki osobnika wektorem ekspresyjnym, stosowany jest wektor wirusowy. Wektory wirusowe dają wiele korzyści, w tym wyższą wydajność transformacji oraz trafiania do celu i rozprzestrzeniania w specyficznych rodzajach komórek. Wektory wirusowe można także modyfikować specyficznymi receptorami lub ligandami aby zmienić specyficzność docelową za pomocą specyficznych receptorów komórkowych, takich jak komórkowe receptory nowotworowe. Taką zdolność docelową można użyć do bezpośredniego wyrażenia przeciwciała lub fragmentu przeciwciała według wynalazku w komórce charakteryzującej się zderegulowaną aktywnością NF-κB. [0213] Wektory retrowirusowe reprezentują jedną klasę wektorów odpowiednich do użycia według wynalazku. Retrowirusy defektywne są rutynowo stosowanymi wektorami do modyfikacji genetycznej komórek ssaczych, takich jak komórki nabłonkowe, komórki śródbłonkowe, limfocyty, mioblasty, hepatocyty i komórki szpiku, w celu wytwarzania zrekombinowanych białek. Części genomu retrowirusowego można usunąć zachowując defektywną replikację retrowirusa i retrowirusy z defektywną replikacją można następnie pakować do wirionów, które można użyć do infekowania komórek docelowych przy użyciu wirusa pomocniczego i przy wykorzystaniu standardowych technik. Obszerne zalecenie do wytwarzania wektora retrowirusowego zdolnego do wyrażania zrekombinowanego białka w komórce ssaczej jest dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: Miller, A.D., Blood 76: 271; Sambrook i wsp., poniżej i w towarzyszących odnośnikach). [0214] Innym odpowiednim wektorem może być wektor adenowirusowy. Wektory adenowirusowi są szeroko badanymi i rutynowo stosowanymi wektorami do przenoszenia genów. Kluczowa zaleta wektorów adenowirusowych obejmuje stosunkowo wysoką wydajność transformacji dzielących się i spoczynkowych komórek, naturalny tropizm w kierunku szerokiego zakresu tkanek nabłonkowych i ułatwione wytwarzanie wysokich mian. DNA adenowirusa jest transportowany do jądra lecz nie integruje do genomu. Zatem, zminimalizowane jest ryzyko mutagenizacji wektorami adenowirusowymi. Obszerne zalecenie do wytwarzania i wykorzystywania wektorów adenowirusowych do leczenia chorób jest dostarczone w specjalistycznej literaturze [przykładowo, odniesienie w: Russel, W.C., J. Gen. Virol. 81:57-63; do zalecenia dotyczącego zastosowania leczenia nowotworów wektorami adenowirusowymi, przykładowo,

36 odniesienie w: Seth i wsp., Adenoviral vectors for cancer gene therapy. W: P. Seth (wyd.) Adenoviruses: Basic biology to Gene Therapy, Landes, Austin, TX, str (1999)]. [0215] Konkretnym przykładem odpowiedniego wektora adenowirusowego jest wektor pochodzący od adenowirusa Ad-TK. Wektor ten umożliwia ekspresję genu kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (TK) dla pozytywnej lub negatywnej selekcji i obejmuje kasetę ekspresyjną dla pożądanych zrekombinowanych sekwencji. Wektor ten można stosować do infekcji komórek posiadających receptor adenowirusa, które obejmują większość komórek rakowych pochodzenia nabłonkowego (Sandmair i wsp., Hum. Gene. Ther. 11: ). [0216] Odpowiednim wektorem ekspresyjnym może też być chimeryczny wektor adenowirus/retrowirus, który łączy składniki retrowirusowe i adenowirusowe i dla którego wykazano, że jest wydajniejszy niż tradycyjne wektory ekspresyjne. Obszerne zalecenie do wytwarzania i wykorzystywania takich wektorów jest dostarczone w specjalistycznej literaturze (przykładowo, odniesienie w: Pan i wsp., Cancer Letters 184: ). [0217] Wektor ekspresyjny można podawać różnymi drogami. Jeśli stosowane są wektory wirusowe procedura może mieć przewagę dzięki specyficzności wobec miejsca docelowego i w konsekwencji, takie wektory nie muszą być podawane miejscowo, w anatomicznym miejscu objętym chorobą. Jednakże, podawanie miejscowe może dostarczać szybsze i skuteczniejsze leczenie. Podawanie wektorów wirusowych można prowadzić, przykładowo, przez wstrzyknięcie osobnikowi dożylnie lub podskórnie. Po wstrzyknięciu, wektory wirusowe będą krążyć dopóki nie rozpoznają komórek gospodarza z odpowiednim miejscem docelowym specyficznym dla infekcji. [0218] Jak opisano powyżej, niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną obejmującą przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku jako aktywny składnik. [0219] W użytym tu znaczeniu fraza kompozycja farmaceutyczna odnosi się do preparatu jednego lub większej liczby opisanych tu aktywnych składników z innymi składnikami chemicznymi, takimi jak fizjologicznie stosowne nośniki i zaróbki. Zadaniem kompozycji farmaceutycznej jest ułatwienie podawania aktywnych składników do organizmu. [0220] Użyty tu termin aktywny składnik odnosi się to przeciwciała lub fragmentu przeciwciała według wynalazku, odpowiedzialnego za efekt biologiczny. [0221] Poniżej, frazy fizjologicznie dopuszczalny nośnik i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik można stosować wymiennie w odniesieniu do nośnika lub rozcieńczalnika, który nie powoduje znaczącego podrażnienia organizmu i nie znosi aktywności i własności biologicznych podawanych aktywnych składników. Frazy te obejmują również adiuwant. [0222] Użyty tu termin zaróbka odnosi się do obojętnej substancji dodanej do kompozycji farmaceutycznej dla dalszego ułatwienia podawania aktywnego składnika. Przykłady, zaróbek, obejmują między innymi: węglan wapnia, fosforan wapnia, różne cukry i rodzaje skrobi, pochodnych celulozy, żelatynę, oleje roślinne i glikole polietylenowe. [0223] Techniki wytwarzania i podawania leków można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, najnowsze wydanie. [0224] Dogodne drogi podawania kompozycji farmaceutycznej mogą, przykładowo, obejmować podawanie doustne, doodbytnicze, przez śluzówkowe, zwłaszcza donosowe, podawanie jelitowe lub pozajelitowe, w

37 tym wstrzyknięcie domięśniowe, podskórne lub śródrdzeniowe jak również wstrzyknięcie wewnątrzmózgowe, bezpośrednie wewnątrzkomorowe, dożylne, dootrzewnowe, donosowe lub wewnątrzgałkowe. [0225] Alternatywnie, kompozycję farmaceutyczną można podawać domiejscowo a nie układowo, przykładowo, przez wstrzyknięcie kompozycji farmaceutycznej bezpośrednio do regionu tkanki osobnika. [0226] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można wytwarzać za pomocą procesów dobrze znanych w dziedzinie, np. sposobami typowych procesów mieszania, rozpuszczania, granulowania, tworzenia drażetek, proszkowania, emulgacji, kapsułkowania, zamykania i liofilizacji. [0227] Kompozycje farmaceutyczne do zastosowania według wynalazku mogą zatem być wytwarzane w sposób tradycyjny, przy użyciu jednego lub większej liczby fizjologicznie dopuszczalnych nośników obejmujących zaróbki i środki pomocnicze, ułatwiające przetworzenie aktywnych składników w preparaty, które można zastosować farmaceutycznie. Odpowiednia receptura zależy od wybranej drogi podania. [0228] Aktywne składniki kompozycji farmaceutycznej do wstrzyknięcia, można przygotowywać w roztworach wodnych, korzystnie fizjologicznie zgodnych buforach, takich jak roztwór Hanka, roztwór Ringera lub bufor soli fizjologicznej. W preparatach do podawania przez śluzówkę, stosowane są penetranty odpowiednie do przenikania bariery. Penetranty takie są zasadniczo znane w dziedzinie. [0229] Kompozycję farmaceutyczną do podawania doustnego można z łatwością przygotować przez połączenie aktywnych składników z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami dobrze znanymi w dziedzinie. Nośniki takie umożliwiają przygotowanie kompozycji farmaceutycznej w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, cieczy, żeli, syropów, gęstych zawiesin, zawiesin i im podobnych, do przyjęcia doustnego przez pacjenta. Preparaty farmakologiczne do użycia doustnego można wytworzyć stosując stałą zaróbkę, ewentualnie mieląc uzyskaną mieszaninę i przetwarzać mieszaninę granulek, po dodaniu odpowiednich środków pomocniczych jeśli to pożądane, tak aby uzyskać tabletki lub rdzenie drażetek. Odpowiednimi zaróbkami są, w szczególności, wypełniacze, takie jak cukry, w tym laktoza, sacharoza, mannitol lub sorbitol; preparaty celulozy takie jak, przykładowo, skrobia kukurydziana, skrobia z pszenna, skrobia ryżowa, skrobia ziemniaczana, żelatyna, guma tragantowa, celuloza metylowana, hydroksypropylometyloceluloza, karboksymetylocelulozy sodowa, i/lub fizjologicznie dopuszczalne polimery, takie jak poliwinylopirrolidon (PVP). Jeśli pożądane, można użyć środki rozsadzające, takie jak usieciowany poliwinylopirrolidon, agar lub kwas alginowy lub jego sól, taka jak alginian sodowy. [0230] Rdzenie drażetek są dostarczane w odpowiednich polewach. W tym celu, można stosować stężone roztwory cukru, które mogą ewentualnie zawierać gumę arabską, talk, poliwinylopirrolidon, żel karbopolowy, glikol polietylenowy, dwutlenek tytanowy, roztwory lakieru oraz odpowiednie rozpuszczalniki organiczne lub mieszaniny rozpuszczalników. Do tabletek lub polew drażetek można dodawać barwniki lub pigmenty dla identyfikowania lub charakteryzowania różnych kombinacji dawek aktywnych składników. [0231] Kompozycje farmaceutyczne do podawania doustnego obejmują kapsułki wyciskane, wykonane z żelatyny, jak również miękkie, zamknięte kapsułki wykonane z żelatyny i plastyfikatora, takiego jak glicerol lub sorbitol. Kapsułki wyciskane mogą zawierać aktywne składniki z domieszką wypełniacza, takiego jak laktoza, spoiw, takich jak skrobie, środków smarujących, takich jak talk lub stearynian magnezowy i, ewentualnie, środki stabilizujące. W miękkich kapsułkach, aktywne składniki mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich cieczach, takich jak oleje, ciekłe tłuszcze, ciekła parafina lub glikole polietylenowe. Ponadto, można dodać środki stabilizujące. Wszystkie preparaty do podawania doustnego powinny być w dawkach odpowiednich do wybranej drogi podawania.

38 [0232] Kompozycje do podawania przez policzek może mieć formę tabletek lub pastylek wytworzonych w tradycyjny sposób. [0233] Do podawania jako inhalacja przez nos, aktywne składniki zastosowane według wynalazku są wygodnie dostarczane w formie sprayu aerozolowego z opakowania ciśnieniowego lub nebulizatora z użyciem odpowiedniego propelenta, np. dichlorodifluorometanu, trichlorofluorometanu, dichlorotetrafluoroetanu lub dwutlenku węgla. W przypadku aerozolu pod ciśnieniem, jednostka dawkowania może być określona przez dostarczenie zaworu do dostarczania odmierzonej ilości. Można wytwarzać pojemniki i wkłady do użycia w dozowniku, np. z żelatyny, zawierające sproszkowaną mieszaninę aktywnych składników i odpowiednie sproszkowane podłoże, takie jak laktoza lub skrobia. [0234] Opisywana tu kompozycja farmaceutyczna może być wytworzona do podawania pozajelitowego, np. przez wstrzyknięcie bolusa lub stałą infuzję. Preparaty do wstrzyknięcia mogą być oferowane w formie jednostki dawkowania, np. w ampułce lub pojemniku przeznaczonym dla wielu dawek, z dodanym ewentualnie środkiem konserwującym. Kompozycje mogą być zawiesinami, roztworami lub emulsjami w nośnikach oleistych lub wodnych i mogą zawierać środki tworzące, takie jak środki zawieszające, stabilizujące i/lub rozpraszające. [0235] Kompozycje farmaceutyczne do podawania pozajelitowego obejmują roztwory wodne aktywnego preparatu w formie rozpuszczalnej w wodzie. Dodatkowo, zawiesiny aktywnych składników można przygotowywać jako odpowiednie do wstrzyknięcia zawiesiny oleiste lub wodne. Dogodne rozpuszczalniki lub nośniki lipofilowe obejmują ciekłe tłuszcze, takie jak olej sezamowy lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, takie jak oleinian etylowy, trójglicerydy lub liposomy. Wodne zawiesiny do wstrzyknięcia mogą zawierać substancje, które polepszają lepkość zawiesiny, takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, sorbitol lub dekstran. Ewentualnie, zawiesina może także zawierać odpowiednie środki stabilizujące lub czynniki polepszające rozpuszczalność aktywnych składników umożliwiające uzyskiwanie preparatu o wyższym stężeniu. [0236] Alternatywnie, aktywne składniki mogą być w formie proszku do odtworzenia z odpowiednim nośnikiem przed użyciem, np. roztworu opartego na sterylnej wodzie wolnej od pirogenu. [0237] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być także przygotowana w kompozycjach doodbytniczych, takich jak czopki lub wlewy retencyjne, przy użyciu np. tradycyjnych podłoży do czopków, takich jak masło kakaowe lub inne glicerydy. [0238] Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do użycia w kontekście według wynalazku obejmują kompozycje, w których aktywne składniki zawarte są w ilości skutecznej dla osiągnięcia zamierzonego celu. Konkretniej, terapeutycznie skuteczna ilość oznacza ilość aktywnych składników (przeciwciała lub fragmentu przeciwciała według wynalazku) zdolną do zapobiegania, łagodzenia lub zmniejszania objawów choroby lub przedłużania życia leczonego osobnika. [0239] Określenie ilości skutecznej terapeutycznie mieści się dobrze w możliwościach specjalistów w dziedzinie, zwłaszcza w świetle dostarczonego tu szczegółowego ujawnienia. [0240] Dla dowolnego preparatu stosowanego w sposobach według wynalazku, terapeutycznie skuteczną ilość lub dawkę można oszacować wstępnie na podstawie testów in vitro i na hodowlach komórkowych. Przykładowo, dawkę można opracować dla modeli zwierzęcych dla osiągnięcia pożądanego stężenia i miana. Informacje takie można zastosować do dokładniejszego określenia dawek przydatnych u ludzi.

39 [0241] Toksyczność i skuteczność terapeutyczną opisanych tu aktywnych składników można określić za pomocą standardowych procedur farmaceutycznych in vitro, w hodowlach komórkowych lub na zwierzętach doświadczalnych. Dane uzyskane z testów in vitro i na hodowlach komórkowych oraz z badań na zwierzętach można stosować do opracowania zakresu dawkowania stosowanego u ludzi. Dawkowanie może być różne w zależności od wykorzystanej formy dawkowania i użytej drogi podawania. Dokłada postać, droga podawania i dawkowanie mogą być wybrane przez lekarza osobnika po uwzględnieniu stanu pacjenta. (przykładowo, odniesienie w: Fingl, i wsp., 1975, w The Pharmacological Basis of Therapeutics, rozdz. 1 str.1). [0242] Ilość dawek i odstępy można dopasować indywidualnie, tak aby dostarczyć poziomy aktywnych składników w osoczu lub mózgu wystarczające do uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego (minimalne skuteczne stężenie, ang. minimal effective concentration, MEC). MEC będzie się różnił dla każdego preparatu, lecz będzie oszacowany z danych in vitro. Dawkowania konieczne do osiągnięcia MEC będzie zależne od cech osobniczych i drogi podawania. Można stosować testy wykrywające do określania stężeń w osoczu. [0243] W zależności od stopnia zaawansowania i reaktywności stanu pacjenta poddawanego leczeniu, dawkowanie może być w formie pojedynczego lub wielokrotnego podawania, z przebiegiem leczenia trwającym od kilku dni do kilku tygodni lub dopóki kuracja jest skuteczna lub osiągnięty jest stan zmniejszenia objawów choroby. [0244] Ilość kompozycji do podania będzie oczywiście zależna od leczonego osobnika, stopnia zaawansowania dolegliwości, sposobu podawania, decyzji lekarza przepisującego lek, etc. [0245] Kompozycje według wynalazku mogą, jeśli pożądane, być w opakowaniu lub urządzeniu dozującym, takim jak zestaw zatwierdzony przez FDA, który może zawierać jedną lub więcej jednostkowych postaci dawkowania zawierających aktywne składniki. Opakowanie może, przykładowo, obejmować metalową folię lub folię z tworzywa sztucznego, jak w przypadku opakowania typu blister. Do opakowania lub urządzenia dozującego mogą być załączone instrukcje dotyczące podawania. Opakowanie lub dozownik mogą być także zaopatrzone w towarzyszącą informację na pojemniku, w formie zaleceń rządowej agencji regulującej wytwarzanie, stosowanie lub sprzedaż leków, która to informacja odzwierciedla rejestrację przez agencję postaci kompozycji do podawania ludziom lub zastosowania w weterynarii. Informacja taka, przykładowo, może stanowić oznakowanie opakowania zatwierdzone przez Agencję do spraw Żywności i Leków (FDA) USA dla leków na receptę lub może być zatwierdzoną dla produktu ulotką. Kompozycje obejmujące przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku przygotowane w farmaceutycznie zgodnym nośniku mogą być także wytwarzane, umieszczane w odpowiednim pojemniku i oznaczane jako przeznaczone do leczenia pacjenta we wskazanym stanie, jak szczegółowo omówiono powyżej. [0246] Jak opisano powyżej, niniejszy wynalazek można stosować w leczeniu choroby związanej z patologiczną odpowiedzią immunologiczną. [0247] Przykłady takich chorób obejmują choroby związane z nadwrażliwością typu I (bezpośrednią lub z udziałem IgE), choroby związane z nadwrażliwością typu II (z udziałem przeciwciał), choroby związane z nadwrażliwością typu IV (z udziałem limfocytów T), choroby związane z nadwrażliwością typu opóźnionego (DTH), choroby autoimmunologiczne i choroby związane z przeszczepami.

40 [0248] Dalsze przykłady chorób związanych z nadwrażliwością obejmują, przykładowo, choroby związane z nadwrażliwością typu III (z udziałem kompleksów immunologicznych), choroby związane z zapaleniem, choroby związane z zakażeniem i choroby związane z nadwrażliwością idiopatyczną. [0249] Przykłady nadwrażliwości typu I obejmują choroby alergiczne takie jak astma, pokrzywka (ang. hives), pokrzywka (ang. urticaria), alergia pyłkowa, alergia na kurz, alergia na jad, alergia kosmetyczna, alergia leteksowa, alergia chemiczna, alergia lekowa, alergia związana z ukąszeniem owadów, alergia na łupież zwierzęcy, alergia na parzące rośliny, alergia na trujące bluszcze i alergia pokarmowa. [0250] Przykłady nadwrażliwości typu II obejmują choroby reumatoidalne, reumatoidalne choroby autoimmunologiczne, reumatoidalne zapalenia stawów (Krenn V. i wsp., Histol Histopathol. 15:791), zapalenie kręgosłupa, zesztywniające zapalenie stawów kregosłupa (Jan Voswinkel i wsp., Arthritis Res. 3:189), choroby układowe, autoimmunologiczne choroby układowe, toczeń rumieniowaty narządowy (Erikson J. i wsp., Immunol Res. 17:49), stwardnienie, stwardnienie narządowe (Renaudineau Y., i wsp., Clin Diagn Lab Immunol. 6:156); Chan OT. i wsp., Immunol Rev. 169:107), choroby gruczołowe, autoimmunologiczne choroby gruczołowe, autoimmunologiczne choroby trzustki, cukrzycę, cukrzycę typu I (Zimmet P Diabetes Res Clin Pract. 34 Suppl:S125), choroby tarczycy, autoimmunologiczne choroby tarczycy, chorobę Gravesa-Basedowa (Orgiazzi J Endocrinol Metab Clin North Am. 29:339), zapalenie tarczycy, samoistne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (Braley- Mullen H. i Yu S J Immunol. 165(12):7262), zapalenie tarczycy Hashimoto (Toyoda N. i wsp., Nippon Rinsho (8): 1810), obrzęk śluzowaty, idiopatyczny obrzęk śluzowaty (Mitsuma T. Nippon Rinsho (8):1759); autoimmunologiczne choroby reprodukcyjne, choroby jajników, wytwarzanie przeciwciał przeciw własnym antygenom jajnikowym (Garza KM. i wsp., J Reprod Immunol (2):87), niepłodność związaną z wytwarzaniem przeciwciał przeciw własnej spermie (Diekman AB. i wsp., Am J Reprod Immunol (3):134), nawracającą utratę płodu (Tincani A. i wsp., Lupus Suppl 2:S107-9), choroby neurodegenaracyjne, choroby neurologiczne, autoimmunologiczne choroby neurologiczne, stwardnienie rozsiane (Cross AH. i wsp., J Neuroimmunol (1-2):1), chorobę Alzheimera (Oron L. i wsp., J Neural Transm Suppl :77), miastenię rzekomoporaźną (Infante AJ. and Kraig E. Int Rev Immunol (1-2):83), neuropatie ruchowe (Kornberg AJ. J Clin Neurosci (3):191), zespół Guillain-Barre, neuropatie i neuropatie autoimmunologiczne (Kusunoki S. Am J Med Sci (4):234), choroby związane z zanikiem mięśni, zespół Lamberta-Eatona (Takamori M. Am J Med Sci (4):204), paranowotworowe choroby neurologiczne, atrofię móżdżkową, paranowotworową atrofię móżdżkową, nieparanowotworowy zespół sztywności uogólnionej, atrofie móżdżkowe, postępujące atrofie móżdżkowe, zapalenie mózgu, zapalenie mózgu Rasmussena, stwardnienie zanikowe boczne, pląsawicę Sydenhama, zespół Gilles de la Touretta, poliendokrynopatie, poliendokrynopatie autoimmunologiczne (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) (1):23); neuropatie, neuropatie autoimmunologiczne (Nobile-Orazio E. i wsp., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl :419); neuromiotonię, neuromiotonię nabytą, sztywność wrodzoną stawów (Vincent A. i wsp., Ann N Y Acad Sci :482), choroby sercowonaczyniowe, autoimmunologiczne choroby sercowo-naczyniowe, miażdżycę tętnic (Matsuura E. i wsp., Lupus Suppl 2:S135), zawał mięśnia sercowego (Vaarala O. Lupus Suppl 2:S132), zakrzepicę (Tincani A. i wsp., Lupus Suppl 2:S107-9), ziarniniakowatość, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie tętnic, zapalenie tętnic Takayasu i zespół Kawasaki (Praprotnik S. i wsp., Wien Klin Wochenschr (15-16):660); chorobę autoimmunologiczną skierowaną przeciw czynnikowi VIII

41 (Lacroix-Desmazes S. i wsp., Semin Thromb Hemost (2):157); układowe zapalenia naczyń, martwicze zapalenie małych naczyń, mikroskopowe zapalenie naczyń, zespół Churga i Strauss, kłębuszkowe zapalenie nerek, glomerulopatie typu pauci-immune focal necrotizing i crescentic (Noel LH. Ann Med Interne (Paris) (3):178); zespół antyfosfolipidowy (Flamholz R i wsp., J Clin Apheresis (4):171); niewydolność serca, wytwarzanie przeciwciał podobnych do agonistów beta-receptorów adrenergicznych w niewydolności serca (Wallukat G. i wsp., Am J Cardiol (12A):75H), małopłytkową skazę krwotoczną (Moccia F. Ann Ital Med Int (2):114); anemię hemolityczną, autoimmunologiczną anemię hemolityczną (Efremov DG. i wsp., Leuk Lymphoma (3-4):285), choroby układu pokarmowego, choroby autoimmunologiczne układu pokarmowego, choroby jelit, chroniczne zapalenia jelit (Garcia Herola A. i wsp., Gastroenterol Hepatol Jan; 23 (1):16), celiakię (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah (2):122), choroby autoimmunologiczne układu mięśniowego; zapalenie mięśni, autoimmunologiczne zapalenie mięśni, zespól Sjogrena (Feist E. i wsp., Int Arch Allergy Immunol (1):92); chorobę autoimmunologiczną mięśni gładkich (Zauli D. i wsp., Biomed Pharmacother (5-6):234), choroby wątroby, autoimmunologiczne choroby wątroby, autoimmunologiczne zapalenie wątroby (Manns MP. J Hepatol (2):326) i pierwotną marskość żółciową wątroby (Strassburg CP. i wsp., Eur J Gastroenterol Hepatol (6):595). [0251] Przykłady nadwrażliwości typu III obejmują choroby wywoływane za pośrednictwem immunologicznych komórek efektorowych, przykładowo takich jak neutrofile lub makrofagi, aktywowane przykładowo przez kompleksy immunologiczne poprzez receptory Fc takie jak, przykładowo, receptory Fcγ. [0252] Przykłady nadwrażliwości typu IV obejmują choroby reumatoidalne, reumatoidalne zapalenie stawów (Tisch R and McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci U S A (2):437), choroby układowe, autoimmunologiczne choroby układowe, toczeń rumieniowaty narządowy (Datta SK., Lupus (9):591), choroby gruczołowe, autoimmunologiczne choroby gruczołowe, choroby trzustki, autoimmunologiczne choroby trzustki, cukrzycę typu I (Castano L. i Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647); choroby tarczycy, autoimmunologiczne choroby tarczycy, chorobę Gravesa-Basedowa (Sakata S. i wsp., Mol Cell Endocrinol (1):77); choroby jajników (Garza KM. i wsp., J Reprod Immunol (2):87), zapalenie gruczołu krokowego, autoimmunologiczne zapalenie gruczołu krokowego (Alexander RB. i wsp., Urology (6):893), zespół wielogruczołowy, autoimmunologiczny zespół wielogruczołowy, autoimmunologiczny zespół wielogruczołowy typu I (Hara T. i wsp., Blood (5):1127), choroby neurologiczne, autoimmunologiczne choroby neurologiczne, stwardnienie rozsiane, zapalenie nerwu, zapalenie nerwu wzrokowego (Soderstrom M. i wsp., J Neurol Neurosurg Psychiatry (5):544), miastenię rzekomoporaźną (Oshima M. i wsp., Eur J Immunol (12):2563), zespół sztywności uogólnionej (Hiemstra HS. i wsp., Proc Natl Acad Sci U S A (7):3988), choroby sercowo-naczyniowe, autoimmunologiczną kardiomiopatię w chorobie Chagasa (Cunha-Neto E. i wsp., J Clin Invest (8):1709), autoimmunologiczną małopłytkową skazę krwotoczną (Semple JW. i wsp., Blood (10):4245), wytwarzanie przeciwciał przeciw własnym pomocniczym limfocytom T (Caporossi AP. i wsp., Viral Immunol (1):9), anemię hemolityczną (Sallah S. i wsp., Ann Hematol (3):139), choroby wątroby, autoimmunologiczne choroby wątroby, zapalenie wątroby, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby (Franco A. i wsp., Clin Immunol Immunopathol (3):382), żółciową marskość wątroby, pierwotną żółciową marskość wątroby (Jones DE. Clin Sci (Colch) (5):551), choroby nerek, autoimmunologiczne choroby nerek, zapalenie nerek, śródmiąższowe zapalenie nerek (Kelly CJ. J Am Soc

42 Nephrol (2):140), choroby tkanki łącznej, choroby uszu, autoimmunologiczne choroby tkanki łącznej, autoimmunologiczne choroby uszu (Yoo TJ. i wsp., Cell Immunol (1):249), chorobę ucha wewnętrznego (Gloddek B. i wsp., Ann N Y Acad Sci :266), choroby skóry, choroby skórne, choroby skóry właściwej, pęcherzowe choroby skóry, pęcherzycę zwykłą, pemfigoid pęcherzowy i pęcherzycę liściastą. Przykłady chorób związanych z nadwrażliwością typu opóźnionego obejmują kontaktowe zapalenie skóry i wysypkę polekową. [0253] Przykłady chorób autoimmunologicznych obejmują choroby sercowo-naczyniowe, choroby reumatoidalne, choroby gruczołowe, choroby żołądkowo-jelitowe, choroby skórne, choroby wątroby, choroby neurologiczne, choroby mięśni, choroby nerek, choroby związane z rozmnażaniem, choroby tkanki łącznej i choroby układowe. [0254] Przykłady autoimmunologicznych chorób sercowo-naczyniowych obejmują miażdżycę tętnic (Matsuura E. i wsp., Lupus Suppl 2:S135), zawał mięśnia sercowego (Vaarala O. Lupus Suppl 2:S132), zakrzepicę (Tincani A. i wsp., Lupus Suppl 2:S107-9), ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie tętnic Takayasu, zespół Kawasaki (Praprotnik, S. i wsp., Wien Klin Wochenschr (15-16):660), chorobę autoimmunologiczną skierowaną przeciw czynnikowi VIII (Lacroix-Desmazes S. i wsp., Semin Thromb Hemost (2):157), martwicze zapalenie małych naczyń, mikroskopowe zapalenie naczyń, zespół Churga i Strauss, glomerulopatie typu pauci-immune focal necrotizing i crescentic (Noel LH. Ann Med Interne (Paris) (3):178), zespól antyfosfolipidowy (Flamholz R. i wsp., J Clin Apheresis (4):171), niewydolność serca wywołaną przeciwciałami (Wallukat G. i wsp., (1999) Am J Cardiol. 83(12A):75H), plamicę małopłytkową (Moccia F. Ann Ital Med Int (2):114; Semple JW. i wsp., Blood (10):4245), autoimmunologiczną anemię hemolityczną (Efremov DG. i wsp., Leuk Lymphoma (3-4):285; Sallah S. i wsp., Ann HematoL (3):139), autoimmunologiczną kardiomiopatię w chorobie Chagasa (Cunha-Neto E. i wsp., J Clin Invest (8):1709) i wytwarzanie przeciwciał przeciw własnym pomocniczym limfocytom T (Caporossi AP. i wsp., Viral Immunol (1):9). [0255] Przykłady autoimmunologicznych chorób reumatoidalnych obejmują reumatoidalne zapalenie stawów (Krenn V. i wsp., (2000) Histol Histopathol. 15(3):791; Tisch R, McDevitt HO. (1994) Proc Natl Acad Sci USA. 91(2):437) i zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (Jan Voswinkel i wsp., (2001) Arthritis Res. 3(3):189). [0256] Przykłady autoimmunologicznych chorób gruczołowych obejmują chorobę trzustki, cukrzycę typu I, chorobę tarczycy, chorobę Gravesa-Basedowa, zapalenie tarczycy, samoistne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, zapalenie tarczycy Hashimoto, idiopatyczy obrzęk śluzowaty, wytwarzanie przeciwciał przeciw własnym antygenom jajnikowym, niepłodność związaną z wytwarzaniem przeciwciał przeciw własnej spermie, autoimmunologiczne zapalenie gruczołu krokowego i choroby autoimmunologiczne zespołu wielogruczołowego typu I obejmujące choroby autoimmunologiczne trzustki, cukrzycę typu I (Castano L. and Eisenbarth GS Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract Suppl:S125), autoimmunoloiczne choroby tarczycy, chorobę Gravesa-Basedowa (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am (2):339; Sakata S. i wsp., Mol Cell Endocrinol (1):77), samoistne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, (Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol (12):7262), zapalenie tarczycy Hashimoto (Toyoda N. i wsp., Nippon Rinsho (8):1810), idiopatyczy obrzęk śluzowaty (Mitsuma T. Nippon Rinsho (8):1759), wytwarzanie przeciwciał przeciw własnym antygenom jajnikowym (Garza KM. i wsp., J Reprod Immunol (2):87), niepłodność związaną z wytwarzaniem przeciwciał przeciw

43 własnej spermie (Diekman AB. i wsp., Am J Reprod Immunol (3):134), autoimmunologiczne zapalenie gruczołu krokowego (Alexander RB. i wsp., Urology 1997, 50(6):893) i autoimmunologiczny zespół wielogruczołowy typu I (Hara T. i wsp., Blood (5):1127). [0257] Przykłady autoimmunologicznych chorób żołądkowo-jelitowych obejmują przewlekłe choroby zapalne jelit (Garcia Herola A. i wsp., Gastroenterol Hepatol (1):16), celiakię (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah (2):122), zapalenie okrężnicy, zapalenie jelita krętego i chorobę Crohna. [0258] Przykłady autoimmunologicznych chorób skórnych obejmują autoimmunologiczne pęcherzowe choroby skóry, takie jak pęcherzyca zwykła, pemfigoid pęcherzowy i pęcherzyca liściasta. [0259] Przykłady autoimmunologicznych chorób wątroby obejmują zapalenie wątroby, autoimmunologiczne przewlekłe aktywne zapalenie wątroby (Franco A. i wsp., Clin Immunol Immunopathol (3):382), pierwotną żółciową marskość wątroby (Jones DE. Clin Sci (Colch) (5):551; Strassburg CP. i wsp., Eur J Gastroenterol Hepatol (6):595) i autoimmunologiczne zapalenie wątroby (Manns MP. J Hepatol (2):326). [0260] Przykłady autoimmunologicznych chorób neurologicznych obejmują stwardnienie rozsiane (Cross AH. i wsp., J Neuroimmunol (1-2):1), chorobę Alzheimera (Oron L. i wsp., J Neural Transm Suppl :77), miastenię rzekomoporaźną (Infante AJ. and Kraig E, Int Rev Immunol (1-2):83; Oshima M. i wsp., Eur J Immunol :2563), neropatie, neropatie ruchowe (Kornberg AJ. J Clin Neurosci :191); zespół Guillain-Barre i neuropatie autoimmunologiczne (Kusunoki S. Am J Med Sci (4):234), miastenię, zespół Lamberta-Eatona (Takamori M. Am J Med Sci (4):204); paranowotworowe choroby neurologiczne, atrofię móżdżkową, paranowotworową atrofię móżdżkową i zespół sztywności uogólnionej (Hiemstra HS. i wsp., Proc Natl Acad Sci U S A (7):3988); nieparanowotworowy zespół sztywności uogólnionej, postępujące atrofie móżdżkowe, zapalenie mózgu, zapalenie mózgu Rasmussena, stwardnienie zanikowe boczne, pląsawicę Sydenhama, zespół Gilles de la Touretta i poliendokrynopatie autoimmunologiczne (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol. (Paris) (1):23); neuropatie autoimmunologiczne (Nobile-Orazio E. i wsp., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl :419); neuromiotonię nabytą, sztywność wrodzoną stawów (Vincent A. i wsp., Ann N Y Acad Sci :482), zapalenie nerwów, zapalenie nerwu wzrokowego (Soderstrom M. i wsp., J Neurol Neurosurg Psychiatry (5):544) i choroby neurodegeneracyjne. [0261] Przykłady autoimmunologicznych chorób mięśni obejmują zapalenie mięśni, autoimmunologiczne zapalenie mięśni i pierwotny zespół Sjogrena (Feist E. i wsp., Int Arch Allergy Immunol (1):92) i autoimunologiczną chorobę mięśni gładkich (Zauli D. i wsp., Biomed Pharmacother (5-6):234). [0262] Przykłady autoimmunologicznych chorób nerek obejmują zapalenie nerek i autoimmunologiczne śródmiąższowe zapalenie nerek (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol (2):140). [0263] Przykłady autoimmunologicznych chorób reprodukcyjnych obejmują nawracającą utratę płodu (Tincani A. i wsp., Lupus Suppl 2:S107-9). [0264] Przykłady autoimmunologicznych chorób tkanki łącznej obejmują choroby ucha, autoimmunologiczne choroby ucha (Yoo TJ. i wsp., Cell Immunol (1):249) i autoimmunologiczne choroby ucha wewnętrznego (Gloddek B. i wsp., Ann N Y Acad Sci :266). [0265] Przykłady autoimmunologicznych chorób układowych obejmują toczeń rumieniowaty narządowy (Erikson J. i wsp., Immunol Res (1-2):49) i stwardnienie narządowe (Renaudineau Y. i wsp., Clin Diagn Lab Immunol (2):156); Chan OT. i wsp., Immunol Rev :107).

44 [0266] Przykłady chorób zakaźnych obejmują przewlekłe choroby zakaźne, podostre choroby zakaźne, choroby zakaźne w fazie ostrej, choroby wirusowe, choroby bakteryjne, choroby pierwotniakowe, choroby pasożytnicze, grzybice, choroby wywoływane przez mycoplasmy i choroby prionowe. [0267] Przykłady chorób związanych z przeszczepami obejmują odrzucenie przeszczepu, przewlekłe odrzucenie przeszczepu, podostre odrzucenie przeszczepu, hiperostre odrzucenie przeszczepu, ostre odrzucenie przeszczepu i chorobę związaną z reakcją przeszczepu przeciw gospodarzowi. [0268] Przykłady przeszczepów obejmują przeszczepy izogeniczne, aloprzeszczepy, heteroprzeszczepy, przeszczepy komórkowe, przeszczepy tkanek, przeszczepy narządów i przeszczepy wyrostków i przydatków. [0269] Przykłady przeszczepów komkórkowych obejmują przeszczepy komórek macierzystych, przeszczepy komórek rodzicielskich, przeszczepy komórek krwiotwórczych, przeszczepy komórek embrionalnych i przeszczepy komórek nerwowych. [0270] Przykłady przeszczepów tkanek obejmują przeszczepy skóry, przeszczepy kości, przeszczepy nerwu, przeszczepy jelita, przeszczepy rogówki, przeszczepy chrząstki, przeszczepy tkanki sercowej, przeszczepy zastawek sercowych, przeszczepy zębowe, przeszczepy mieszków włosowych i przeszczepy mięśniowe. [0271] Przykłady przeszczepów narządów obejmują przeszczepy nerki, przeszczepy serca, przeszczepy skóry, przeszczepy wątroby, przeszczepy trzustki, przeszczepy płuca i przeszczepy jelita. [0272] Przykłady przeszczepów wyrostków i przydatków obejmują przeszczepy ramienia, przeszczepy nogi, przeszczepy ręki, przeszczepy stopy, przeszczepy palca, przeszczepy palca nogi i przeszczepy narządu płciowego. [0273] Przykłady chorób zapalnych obejmują urazy, choroby neurodegeneracyjne, owrzodzenia, zapalenia związane z implantami protezowymi, menstruację, wstrząs septyczny, wstrząs anafilaktyczny, zespół wstrząsu toksycznego, charłactwo, martwicę, zgorzel, zapalenie mięśniowo-szkieletowe i zapalenie idiopatyczne. [0274] Przykłady implantów protezowych obejmują implanty piersi, implanty silikonowe, implanty zębowe, implanty prąciowe, implanty sercowe, sztuczne stawy, przyrządy naprawiające złamaną kość, implanty zastępujące kość, implanty dostarczające leki, cewniki, rozruszniki, rurki respiratora i stenty. [0275] Przykłady owrzodzeń obejmują owrzodzenia skóry, odleżyny, wrzody żołądka, wrzody trawienne, wrzody policzkowe, owrzodzenia nosogardzieli, owrzodzenia przełyku, wrzody dwunastnicy, wrzodziejące zapalenie okrężnicy i wrzody żołądkowo-jelitowe. [0276] Przykłady urazów obejmują otarcia, siniaki, cięcia, rany kłute, rany szarpane, rany powstałe w wyniku uderzenia, wstrząśnienia, stłuczenia, oparzenia termiczne, odmrożenia, oparzenia chemiczne, oparzenia słoneczne, wysuszenia, oparzenia radiacyjne, oparzenia radioaktywne, inhalację dymu, naderwanie mięśni, zerwanie mięśni, zerwanie ścięgien, zerwanie więzadeł, przeprosty, zerwanie chrząstki, złamania kości, uciśnięte nerwy i rany postrzałowe. [0277] Przykłady zapaleń mięśniowo-szkieletowych obejmują zapalenia mięśni, zapalenie mięśni, zapalenia ścięgna, zapalenie ścięgien, zapalenia więzadła, zapalenie chrząstki, zapalenia stawów, zapalenia mazi stawowej, zespół kanału nadgarstka i zapalenia kości. [0278] W użytym tu znaczeniu termin około odnosi się do ± 10 procent.

45 [0279] Dodatkowe korzyści według wynalazku staną się oczywiste dla specjalistów w dziedzinie po zapoznaniu się z poniższymi przykładami. Dodatkowo, każde z różnych wykonań i aspektów według wynalazku jak zastrzeżono w zastrzeżeniach patentowych, odnajduje poparcie doświadczalne w poniższych przykładach. Przykłady [0280] Odniesienia wobec poniższych przykładów, wraz z powyższymi opisami ilustrują wynalazek i nie ograniczają jego w żaden sposób. [0281] Zasadniczo, stosowana tu nomenklatura i wykorzystywane procedury laboratoryjne w niniejszym wynalazku obejmują techniki molekularne, biochemiczne, mikrobiologiczne lub rekombinacji DNA. Techniki takie są dokładnie wytłumaczone w literaturze. Patrz, przykładowo, Molecular Cloning: A laboratory Manual Sambrook i wsp., (1989); Current Protocols in Molecular Biology, tomy I-III Ausubel, R. M., wyd. (1994); Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson i wsp., Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren i wsp., (wyd.) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, tomy 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologie podane w patentach USA nr , , , i ; Cell Biology: A Laboratory Handbook, tomy I-III Cellis, J. E., wyd. (1994); Current Protocols in Immunology, tomy I-III Coligan J. E., wyd. (1994); Stites i wsp., (wyd.), Basic and Clinical Immunology (wyd. 8), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (wyd.), Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., New York (1980); dostępne testy immunologiczne są szeroko opisane w literaturze patentowej i naukowej, patrz przykładowo, patenty USA nr , , , , , 3,867517, , , , , , , , , oraz ; Oligonucleotide Synthesis Gait, M. J., wyd. (1984); Nucleic Acid Hybridization Hames, B. D., and Higgins S. J., wyd. (1985); Transcription and Translation Hames; B. D. and Higgins S. J., wyd. (1984); Animal Cell Culture Freshney, R. I., wyd. (1986); Immobilized Cells and Enzymes IRL Press, (1986); A Practical Guide to Molecular Cloning Perbal, B., (1984) i Methods in Enzymology, tomy 1-317, Academic Press; PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak i wsp., Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual CSHL Press (1996). [0282] Dokumenty te dostarczają inne ogólne odniesienia. Procedury zawarte w nich są znane w dziedzinie i zostały wprowadzone dla wygody czytającego. [0283] O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie stosowane tu terminy techniczne i naukowe posiadają to samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez specjalistów w dziedzinie do której należy ten wynalazek. Chociaż w praktyce i testowaniu można stosować metody i materiał podobne lub równoważne tu opisanym według wynalazku, poniżej opisano dogodne metody i materiał. Przykład 1 Wytwarzanie przeciwciał zdolnych do wiązania NIK ufosforylowanej w aminokwasie T559 [0284] Jak opisano powyżej, nie istnieje sposób leczenia lub nie dostępne jest zadowalające leczenie wielu chorób związanych z deregulacją aktywności NF-κB, włączając choroby złośliwe i choroby związane z

46 patologicznymi odpowiedziami immunologicznymi, takimi jak autoimmunologiczne, alergiczne, zapalne lub związane z przeszczepami. Ponieważ NIK jest kluczowym aktywatorem NF-κB, jedna z teoretycznie skutecznych strategii leczenia takich chorób wymaga zidentyfikowania przeciwciał zdolnych do swoistego wiązania NIK, które tym samym zapobiegają lub hamują aktywację NF-κB przez NIK. Przeciwciała takie mogły by także mieć zastosowanie jako odczynniki do wykrywania, umożliwiające charakterystykę prawidłowych i patologicznych aspektów procesów biologicznych i biochemicznych, w które zaangażowana jest NIK. Stan techniki, jednakże, nie podołał dostarczeniu przeciwciał odpowiednich lub optymalnie odpowiednich do tych celów. Donoszono, że fosforylacja aminokwasu T559 leżącego w pętli aktywacyjnej NIK jest istotna dla jej aktywności. Nie opisano odpowiedniego przeciwciała o takiej swoistości. Zatem, przeciwciałem wytypowanym do hamowania NIK jest takie, które rozpoznaje NIK ufosforylowaną w reszcie aminokwasowej T559 lub jej fragmenty. W celu wytworzenia przeciwciał poliklonalnych, swoistych wobec ufosforylowanej NIK, każdy z zachodzących na siebie zestawów peptydów, będących pochodnymi pętli aktywacyjnej NIK, przedstawionych w Tabeli 1, każdy zawierający ufosforylowaną treoninę w pozycji 559 (Fig 1) zastosowano do immunizacji grup królików. Tabela 1. Pętla aktywacyjna i peptydy zastosowane do immunizacji. Opis peptydu* Sekwencja aminokwasowa CGDYI PG T(p)E THMAPE K G D Y I P G T(p) E T H CSLLTGDYI P G T(p)E pętla aktywacyjna DFGHAVCLQPDGLG K S L L T G D Y I P G T E THMAPE liczby odpowiadające współrzędnym aminokwasów peptydu w sekwencji NIK. Należy zwrócić uwagę, że do peptydu i dodano cysteinę na końcu N, a do peptydu dodano lizynę na końcu N. [0285] Jak zaobserwowano za pomocą testu ELISA (Przykład 3), przy użyciu płytek mikrotitracyjnych opłaszczonych ufosforylowanymi i nieufosforylowanymi peptydami, w których peptyd opłaszczający ufosforylowany przedstawiono w SEKW. NR ID.: 3, z trzech testowanych peptydów pochodzących z pętli aktywacyjnej, peptyd przedstawiony w SEKW. NR ID.: 3, w którym ufosforylowana treonina jest przedostatnim aminokwasem, był jedynym peptydem skutecznym w wywoływaniu przeciwciał swoistych wobec ufosforylowanej wersji peptydu. [0286] Zważywszy na wyniki, uzyskane z przeciwciałami poliklonalnymi, przygotowano przeciwciała monoklonalne, przy użyciu fosforylowanego peptydu przedstawionego w SEKW. NR ID.: 3 ( ) do immunizacji myszy Balb/C. Przeprowadzono trzy fuzje przy użyciu śledziony i węzłów chłonnych immunizowanych myszy Balb/C, jednak uzyskane przeciwciała nie były swoiste i miały niskie miano (badanie testem ELISA). Kiedy zamiast myszy Balb/C, do fuzji zastosowano immunizowane myszy SJL, wytworzono około 24 klonów wytwarzających przeciwciała wysoce swoiste wobec peptydu T(p) 559 NIK (badanie testem ELISA lub analiza typu Western immunoblotting).

47 Przykład 2 Monitorowanie swoistości przeciwciał za pomocą immunoprecypitacji. [0287] Przeprowadzono dalsze doświadczenia dla sprawdzenia, czy przeciwciała wytworzone wobec ufosforylowanego peptydu są zdolne do rozpoznawania całego białka NIK oraz czy są zdolne do odróżnienia ufosforylowanego stanu białka. Zastosowany układ doświadczalny obejmował nadekspresję NIK wyznakowanej myc (Przykład 11) lub mutanta NIK wyznakowanego myc, posiadającego treoninę w pozycji 559 podstawioną alaniną w komórkach 293T. Po nadekspresji NIK komórki lizowano i NIK lub mutanta NIK, niezdolnego do ufosforylowania, poddawano immunoprecypitacji (IP) z przeciwciałami monoklonalnymi klonów: 869, 815, 521, 254, 91, 62, 32, 30 lub 3, wytworzonymi wobec ufosforylowanego peptydu Wytrąconą za pomocą immunoprecypitacji NIK wykrywano analizą typu Western immunoblotting, wykorzystując przeciwciało anty-myc. [0288] Bardziej szczegółowo, w celu nadekspresji NIK, 3 x 10 6 komórek 293T umieszczano w 15 cm płytce i komórki transfekowano przejściowo przy użyciu pcs3mtnik lub pcs3mtnikt559a. 24 godz. później, komórki zbierano i lizowano w 2 ml buforu z 1% NP-40. do każdej stosowano IP 100ul lizatu. IP przeprowadzano przez kontaktowanie lizatu komórkowego z 30 µl kulek z białkiem G absorbowanym z odpowiednimi przeciwciałami przez 4 godz. w 4 C. Analizę typu Western immunoblotting i kontrolę pozytywną IP prowadzono z przeciwciałem anty-myc. [0289] Przeciwciało anty-myc wykrywa zarówno, ufosforylowane jak i nieufosforylowane formy immunoprecypitowane powyższymi przeciwciałami. Wyniki na Fig 4 pokazują, że wszystkie testowane przeciwciała były zdolne do immunoprecypitacji NIK. Klony 869, 815, 521, 254, 91, 62, 32, 30 i 3 były swoiste wobec ufosforylowanej formy NIK. Wyniki te wskazują zatem, że w wyniku zastosowanej procedury możliwe jest wytworzenie przeciwciał swoistych wobec ufosforylowanych rodzajów NIK. Przykład 3 Monitorowanie swoistości przeciwciała of NIK-P za pomocą testu ELISA [0290] Kontrolny, nieufosforylowany peptyd lub typu ufosforylowanego, w stężeniu 10ug/ml, zastosowano do opłaszczenia studzienek płytki mikrotitracyjnej. Do każdej opłaszczonej studzienki, naniesiono nierozcieńczony nadsącz hodowli hybrydomy klonu NIK-P na 1 godz. w 37 C. Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano anty mysie HRP (Jackson), w rozcieńczeniu 1:10K i zmierzono OD 405, stosując jako substrat ABTS. Zaobserwowane wyniki (Fig 5) pokazują, że przeciwciała NIK-P rozpoznają tylko ufosforylowana formę peptydu w teście ELISA. Przykład 4 Wykazanie hamującej aktywności przeciwciała NIK-P w przekazywaniu sygnału przez CD40 i CD70 [0291] Ligandy receptora TNF, CD70, CD40 i TNF, indukują degradację IkB i w konsekwencji indukują aktywację NFκ-B. Dla sprawdzenia czy NIK-P jest zdolne do hamowania aktywności NIK, badano wpływ przeciwciała NIK-P na indukowaną ligandem degradację IkB. Około 0,5 x 10 6 komórek Ramos umieszczano w 6-studzienkowych płytkach i transfekowano NIK-P (α-pnik) lub kontrolnym niepowiązanym IgG (patrz transfekcja białkiem w Przykładzie 12) i po transfekcji

48 indukowano pożywką rozcieńczoną 1:4, zawierającą ligand CD70 lub CD40 (patrz preparat pożywki zawierającej ligand w Przykładzie 13) przez 20 min. i 30 min., odpowiednio, albo z TNF stosowanym w stężeniu 50 ng/ml przez 20 min. albo pozostawiano bez traktowania. Po indukcji ligandem, komórki lizowano w 45 µl buforu z 1% NP µl buforu do nanoszenia próbek i 30 µl lizatu nanoszono na 10% SDS-PAGE i poddawano analizie typu Western immunoblotting, wykorzystując do wykrywania IkB, przeciwciało anty IkB (otrzymane z Transduction laboratories). [0292] Zaobserwowano (Fig. 6), że w komórkach nie traktowanych (kontrolnych) IkB był obecny zarówno w komórkach transfekowanych IgG lub anty-pnik. Chociaż, we wszystkich komórkach traktowanych ligandem, IkB był degradowany wykazując aktywację NFκ-B. Degradacja IkB i w konsekwencji aktywacja NFκ-B nie pojawiała się w komórkach transfekowanych przeciwciałami NIK-P , z wyjątkiem kiedy wykorzystywanym ligandem jest TNF. Wyniki te wykazują, że NIK ufosforylowana w reszcie T559 jest ważna dla aktywacji NFκ-B przez CD70 i CD40, a zatem przeciwciało NIK-P można stosować w terapii chorób, w których przekazywanie sygnału przez CD70 i CD40 jest zaangażowane w patogenezę choroby. Przykład 5 Przeciwciało anty- NIK ufosforylowana w Thr559 blokuje degradację IkB indukowaną CD40 [0293] Następujące doświadczenie przeprowadzono w celu potwierdzenia, że hamowanie aktywacji NIK, obserwowane z NIK-P , nie występuje z przeciwciałami wywołanymi wobec innych domen kinazy. [0294] Około 0,5 X 10 6 komórek BJAB transfekowano nieswoistym IgG, przeciwciałem swoistym wobec regionu końca N domeny kinazowej NIK (swoistym wobec reszt ) (81) lub NIK-P Wszystkie transfekowane komórki traktowano CD40L, jak w poprzednim przykładzie przez 30 min. lub pozostawiano bez traktowania. Po traktowaniu, komórki lizowano buforem z 1% NP40 i monitorowano IκBa w komórce za pomocą analizy typu Western immunoblotting, jak w poprzednim przykładzie. [0295] Zaobserwowano (Fig 7), że CD40 indukuje degradację IκBa w komórkach traktowanych CD40. Nie obserwowano hamowania degradacji IkBa przy użyciu bardzo wydajnych przeciwciał do regionu domeny kinazowej (81), różnego od regionu stosowanego do wywołania przeciwciała NIK-P i jedynym przeciwciałem, które hamowało degradację IκBa było NIK-P Wynik ten wykazuje, że przeciwciała NIK-P wywoływane wobec ufosforylowanej w T559 pętli aktywacyjnej NIK hamuje degradację IkB i w konsekwencji hamuje aktywację NFκ-B przez traktowanie CD40L. [0296] Ujawnienia z Przykładów 4 i 5, pokazują, że NIK nie uczestniczy w aktywacji klasycznej drogi przez TNF w linii komórek limfoblastycznych, takich jak BJAB i Ramos. [0297] Chociaż, ujawnienia te pokazują, że funkcja NIK jest krytyczna dla aktywacji klasycznej drogi przez inne ligandy, takie jak np. CD40L i CD70. Zatem, ujawnienia te także pokazują, że przeciwciała NIK-P można wykorzystywać do identyfikowania ligandów indukujących aktywację klasycznej drogi za pośrednictwem NIK. Przykład 6 Preparat przeciwciała poliklonalnego [0298] W celu wytworzenia swoistych przeciwciał poliklonalnych immunizowano króliki peptydami przedstawionymi w SEKW. NR ID.:1, 2 lub 3.

49 Pierwszą immunizację przeprowadzono ze 100 µg peptydu-klh, rozpuszczonego w stosunku 1:1 w kompletnym adiuwancie Freunda i wstrzyknięcie podskórnie. Drugą immunizację przeprowadzono trzy tygodnie później z taką samą ilością peptydu-klh i wstrzyknięcie domięśniowe trzy tygodnie później z niekompletnym adiuwantem Freunda. Po obu tych immunizacjach podawano dawkę przypominającą o tej samej ilości peptydu-klh, rozpuszczonego w PBS i podawaną podskórnie w trzytygodniowym przedziale. Przykład 7 Preparat przeciwciał monoklonalnych [0299] Przeciwciała monoklonalne przygotowano jak opisano w Eshhar Z. w: Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine, rozdz. 1, Springer TA. (wyd.) Timothy A., Plenum Publishing Corp., New York (1985), stosując, do fuzji śledziony z węzłami chłonnymi, śledziony pozytywnych myszy SJL prowokowanych peptydem z SEKW. NR ID.: 7, 11 i 12, z końców N i C kinazy,. [0300] Nadsącze hodowlane hybrydom testowano za pomocą analizy typu Western immunoblotting w celu wykrycia NIK wyznakowanej myc. 1,5 X 10 6 komórek 293-T nanoszono na 10 cm płytki i transfekowano po 24 godz. pcs3mtnik. 24 godz. później transfekowane komórki zbierano i lizowano w 1 ml buforu z 1% NP µl lizatu nanoszono na ścieżkę wraz z lizatem komórek transfekowanych pcdna3 jako kontrolą (C). Jako sondę w analizie typu Western blot stosowano nadsącz hodowli odpowiedniej hybrydomy. Przykład 8 Immunoprecypitacja z surowicą odpornościową [0301] Do immunoprecypitacji fuzji białkowej zrekombinowanej NIK z lizatu białkowego transfektanta przy użyciu surowicy odpornościowej, 1.5 µl surowicy odpornościowej mieszano z 25 µl kulek ze skoniugowanym białkiem G oraz 50 µl lizatu, i objętość uzupełniano do 750 µl buforem lizującym. Mieszaninę inkubowano w 4 C przez 2 godz. Po inkubacji, kulki płukano trzykrotnie buforem lizującym, gotowano w 30 µl buforu do próbek i zwirowywano w mikrowirówce przy rpm przez 2 min. Nadsącz (immunoprecypitat) zbierano i analizowano pod kątem obecności ludzkiej NIK za pomocą 10 % SDS-PAGE. Immunoprecypitacja z nadsączem z hybrydomy [0302] Lizat komórek 293-T wytwarzających białko NIK znakowane myc stosowano jako substrat do badania zdolności immunoprecypitacyjnych przeciwciał monoklonalnych anty-nik. 50 µl kulek z białkiem G mieszano z 500 µl nadsączu hodowlanego hybrydomy i inkubowano w około 22 C przez 1 godz. Kulki płukano trzykrotnie buforem lizującym z 1% NP-40 i stosowano w immunoprecypitacji. Immunoprecypitację (IP) przeprowadzano przez 2 godz. w +4 C. Po IP, kulki płukano trzykrotnie i gotowano z 50 µl buforu Laemliego i 25 µl nadsącz nanoszono na 10% SDS-PAGE. Przykład 9 Analiza typu Western immunoblotting [0303] Porcje 180 µl lizatu z komórek 293-T transfekowanych PCS3MTNIK analizowano techniką slot blot w 20-studzienkowym urządzeniu multi-screen, firmy Biorad, w preparatywnym żelu SDS-PAGE. Jako kontrolę pozytywną stosowano przeciwciało anty-myc w rozcieńczeniu 1:1000.

50 Przykład 10 ELISA [0304] Lizaty z transfekowanych komórek pchis-nik rozcieńczano 25 krotnie w buforze wiążącym i stosowano do opłaszczania studzienek do testu ELISA w ilości 50 µl/studzienkę. Wykrywanie opłaszczonej NIK lub BSA sprzęgniętego z peptydem prowadzono przy użyciu surowicy odpornościowej anty-nik rozcieńczonej w stosunku 1:100 i test rozwijano przy użyciu skoniugowanego z HRP anty-mysiego przeciwciała owczego z ABTS, jako substratem dla enzymu. OD 405 próbek określano po 20 min. czasie reakcji. Przykład 11 Wytwarzanie zrekombinowanej ludzkiej NIK: [0305] W celu wytworzenia zrekombinowanej ludzkiej NIK w fuzji z myc (myc-nik) lub polihistydynowym znacznikiem powinowactwa (His-NIK), odpowiednio, 3 x 10 6 lub 1,5 x 10 6 komórek 293-T, transfekowano, odpowiednio, wektorem ekspresyjnym PCS3MTNIK, kodującym NIK wyznakowaną myc (sekwencja nukleotydowa NIK, jak w WO ) lub pchis-nik, kodującym NIK wyznakowaną His. Komórki transfekowano za pomocą metody z fosforanem wapnia [Ca 3 (PO 4 ) 2 ] w płytkach do hodowli o średnicy 10 cm, przy użyciu 20 µg lub 10 µg DNA wektora ekspresyjnego. 24 godz. po transfekcji, komórki transfekowane PCS3MTNIK lub pchis-nik zbierano, osadzano i lizowano, odpowiednio, w 1.5 ml lub 1 ml buforu lizującego białko z 1 % NP-40. Przykład 12 Transfekcja przeciwciała do komórki [0306] W celu zbadania wpływu przeciwciał znajdujących się wewnątrz komórek, przeciwciało wprowadzano do komórek wykorzystując odczynnik Pro-Ject TM Reagent z Pierce, przy użyciu następującego protokołu. 2 x 10 5 komórek wysiewano na 6-studzienkowe płytki i hodowano przez noc. Zastosowano 10 µl odczynnika Pro-Ject TM Reagent (rozpuszczonego w 250 µl metanolu lub chloroformu) i odparowano w przepływie wyciągu laminarnego przez 2 godz µg białka, kontrolnego FITC-Ab lub testowanego przeciwciała monoklonalnego rozcieńczono w µl. [0307] Wysuszony film Pro-Ject TM uwadniano µl roztworu rozpuszczonego białka przez pipetowanie do góry i na dół około 3 do 5 razy i inkubowano w temp. pokojowej przez 5 min. i wytrząsano przez kilka sek. przy szybkości niskiej do średniej. Końcową objętość mieszaniny Pro-Ject TM Reagent/białko doprowadzano do 1000 µl pożywką wolną od surowicy. Pożywkę z komórek do testowania usuwano przez wirowanie, komórki płukano jednokrotnie pożywką wolną od surowicy i mieszaniną Pro-Ject TM Reagent/białko transfekowano bezpośrednio komórki. Przykład 13 Preparat pożywki zawierającej CD70 lub CD40 stosowanej do indukcji: [0308] Komórki 293T transfekowano konstruktem cząsteczki CD40/CD70 oznakowanej Flag z suwakiem leucytowym (Walczak i wsp. 1999, Fanslow i wsp. 1994). W cząsteczce tej ligand jest już zmultimeryzowany

51 ze względu na fuzję z suwakiem leucynowym. DNA kodujący ligand oznakowany Flag z suwakiem leucytowym sklonowano w ssaczym wektorze ekspresyjnym pcdna (Invitrogen) i wyrażano przejściowo w komórkach HEK-293. Nadsącz tych komórek zbierano trzy dni po transfekcji, sterylizowano na filtrze i stosowano. [0309] Cytowanie lub identyfikacja odniesień w tym zgłoszeniu nie powinny być interpretowane jako uznanie, że takie odniesienie jest dostępne jako stan techniki w niniejszym wynalazku. [0310] Klon hybrydomy Nik-P zdeponowano w Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Instytut Pasteura, Paryż, za traktatem budapeszteńskim i przyznano mu depozytowy nr I Hybrydomy zostały zarejestrowane w CNCM 2 października Lista sekwencji. [0311] <110> Yeda Research and Development Co Ltd. WALLACH, David RAMAKRISHNAN, Parameswaran <120> Przeciwciała skierowane wobec NIK, ich wytwarzanie i zastosowanie <130> 924 <160> 7 <170> PatentIn wersja 3.1 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

52 <210> 5 <211> 947 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

53

54

55

56 210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Zastrzeżenia patentowe 1. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, swoiście wykrywający endogennie fosforylowaną kinazę indukującą NF-kappaB, NIK, znamienne tym, że jest zdolne do swoistego wiązania części sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 5, która obejmuje fosforylowaną treoninę w pozycji aminokwasowej Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym, monoklonalnym, chimerycznym, humanizowanym, ludzkim lub anty-anty-idiotypowym. 3. Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że część SEKW. NR ID.: 5 obejmuje: (a) SEKW. NR ID.: 6; lub (b) SEKW. NR ID.: Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem IgG. 5. Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że fragment przeciwciała jest wybrany z grupy składającej się z jednołańcuchowego Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 i CDR. 6. Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że przeciwciało lub fragment przeciwciała jest dalej zdolne do regulowania biochemicznej aktywności cząsteczki NIK. 7. Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 6 zdolne do swoistego wykrywania fosforylowanej NIK przez: (a) analizę typu Western immunoblotting; (b) test ELISA; lub (c) immunoprecypitację. 8. Przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę NIK-P zdeponowaną w CNCM pod nr I-3095 lub fragmenty tego przeciwciała wiążące antygen. 9. Klon hybrydomy zdeponowanej w CNCM pod nr I-3095.

57 10. Kompozycja farmaceutyczna obejmująca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz, jako aktywny składnik, przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do Kompozycja farmaceutyczna obejmująca przeciwciało lub fragmenty przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 8 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do traktowania chorób autoimmunologicznych, alergicznych, zapalnych, zakaźnych lub związanych z przeszczepami. 12. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentów przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 8 oraz farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chorób autoimmunologicznych, alergicznych, zapalnych, zakaźnych lub związanych z przeszczepami. 13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11 do leczenia astmy, reumatoidalnego zapalenia stawów, nieswoistego zapalenia jelit, miażdżycy tętnic i choroby Alzheimera. 14. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że choroba jest wybrana spośród astmy, reumatoidalnego zapalenia stawów, nieswoistego zapalenia jelit, miażdżycy tętnic i choroby Alzheimera. 15. Kompozycja obejmująca podłoże kowalencyjnie przyłączone do peptydu o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEKW. NR ID.: 3, przy czym sekwencja aminokwasowa obejmuje ufosforylowaną treoninę w pozycji odpowiadającej pozycji aminokwasowej 559 SEKW. NR ID.: 5, do selektywnego wychwytywania przeciwciała lub fragmentu tego przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 8, zdolnego do swoistego wiązania antygenu docelowego. 16. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że podłoże jest matrycą do chromatografii powinowactwa. 17. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że podłoże obejmuje węglowodan lub pochodną węglowodanu. 18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że węglowodan jest wybrany z grupy składającej się z agarozy, sefarozy lub celulozy. 19. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że podłoże jest wybrane z grupy składającej się z kulki, żywicy lub powierzchni tworzywa sztucznego. 20. Sposób wytwarzania przeciwciała według zastrz. 8 obejmujący hodowanie klonu hybrydomy według zastrz. 9 w celu umożliwienia wytworzenia przez hybrydomę i nagromadzenia przeciwciała według zastrz Sposób identyfikowania in vitro liganda zdolnego do indukowania aktywacji NFκB w komórce za pośrednictwem NIK, obejmujący wprowadzenie przeciwciała lub fragmentu tego przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 8 do komórki, inkubowanie komórki z poszczególnymi ligandami, monitorowanie aktywacji NFκB i selekcjonowanie liganda, którego aktywacja NFκB jest zaburzona przez swoiste zablokowanie aktywności NIK przez przeciwciało lub fragment przeciwciała. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że aktywacja NFκB jest określana za pomocą monitorowania degradacji IκBalfa. 23. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że komórki są komórkami typu limfoblastycznego. 24. Sposób według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że komórki są wybrane spośród komórek Ramos, BJAB i Jurkat. 25. Sposób oczyszczania białka wiążącego NIK, który obejmuje kontaktowanie próbki zawierającej NIK i białka wiążącego NIK z przeciwciałem lub fragmentem tego przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 8, ko-immunoprecypitację NIK i białka wiążącego NIK, płukanie wytworzonego kompleksu immunologicznego i

58 odzyskiwanie białka wiążącego NIK z kompleksu immunologicznego przy użyciu współzawodniczącego peptydu otrzymanego z NIK. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że próbka jest wybrana spośród płynów ustrojowych, ekstraktów komórkowych i bibliotek ekspresyjnych DNA. 27. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 8 do opracowania testu ELISA. 28. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentów przeciwciała według dowolnego z zastrz. 1 do 8 do immunologicznego oczyszczania NIK lub muteiny, funkcjonalnej pochodnej, aktywnej frakcji, permutowanej kołowo pochodnej lub ich soli.

59 Fig. 1 region wiążący IKK1 REGION KOŃCA N KINAZA REGION KOŃCA C aktywacja bogaty w prolinę Fig. 2

60 Fig. 3 Fig. 4 nr klonu Anty-p559 Anty-myc Fig. 5 Anty-p akt pętla Anty-akt pętla peptyd P peptyd C

61 Fig. 6 KONTROLA Fig. 7 Czas

62 Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura nie patentowa, cytowana w opisie

63

64

65

66