DIAGNOSTYKA POLSKICH SZCZEPÓW WIRUSA MOZAIKI PEPINO (PEPINO MOSAIC VIRUS)

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 DIAGNOSTYKA POLSKICH SZCZEPÓW WIRUSA MOZAIKI PEPINO (PEPINO MOSAIC VIRUS) HENRYK POSPIESZNY, BEATA HASIÓW, NATASZA BORODYNKO Instytut Ochrony Roślin Władysława Węgorka 20, Poznań H.Pospieszny@ior.poznan.pl I. WSTĘP Wirus mozaiki pepino Pepino mosaic virus (PepMV) został wykryty w Holandii i Wielkiej Brytanii w uprawach pomidora szklarniowego w 1999 roku. W krótkim czasie opanował Europę, USA, Kanadę i kraje Ameryki Południowej (French i wsp. 2001). Na podstawie zróżnicowania genetycznego do tej pory wyróżniono cztery szczepy tego wirusa: (1) peruwiański, (2) europejski pomidorowy, (3) amerykański US1 i (4) amerykański US2 (Ling 2006). W Polsce po raz pierwszy PepMV zidentyfikowano w 2002 (PepMV-SW) (Pospieszny i wsp. 2003) i zakwalifikowano do szczepu europejskiego. W końcu roku 2005 oraz w roku 2006 w wielu miejscach w Polsce stwierdzono występowanie odmiennego izolatu PepMV-PK, który należy do szczepu amerykańskiego US2 (Pospieszny i Borodynko 2006). Celem pracy było opracowanie skutecznych technik wykrywania polskich izolatów PepMV, uwzględniających ich zróżnicowanie biologiczne, serologiczne oraz genetyczne. II. MATERIAŁY I METODY Izolaty PepMV były utrzymywane w warunkach szklarniowych na zestawie roślin testowych z rodziny psiankowatych (Solanaceae). Do wykrywania PepMV stosowano test serologiczny ELISA pośrednia (Indirect enzyme-linked immunosorbent assay) (Pospieszny i wsp. 2007) z wykorzystaniem własnych surowice skierowanych przeciwko PepMV-SW i PepMV-PK. Jako kontrolę negatywną użyto zdrowe rośliny. Identyfikacja wirusa różnymi technikami serologicznymi potwierdzona została w teście odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR). Ponadto stosowano test IC/RT-PCR (Immunocapture Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) łączący metodę serologiczną i molekularną. Do reakcji RT-PCR użyto startery z literatury PepUSTGB-D1 i PepUSTGR-R (Pagan i wsp. 2006) amplifikujące cały region TGB (triple gene block) (około nt) amerykańskiego szczepu PepMV. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono z użyciem odwrotnej transkryptazy Superscript

2 Diagnostyka Pepino mosaic virus 267 II (Invitrogen) i startera oligodt 22. Reakcję PCR prowadzono przez 30 cykli (denaturacja 94 C 40 sekund, przyłączanie starterów 47 C 30 sekund, i elongacja 72 C 1 minuta 30 sekund). Reakcję kończono cyklem 10 minut w 72 C. Testy IC/RT-PCR przeprowadzono z surowicami skierowanymi przeciwko PepMV- -SW oraz PepMV-PK. Użyto własnych starterów F3 5 GAACTAAATGCCAGGTCT 3 i R3 5 GAATGAAGATAAGTATGAGG 3 zaprojektowanych w oparciu o konserwowany region genomu izolatów PepMV dostępnych w bazie NCBI. Probówki do reakcji PCR opłaszczano specyficznymi przeciwciałami rozcieńczonymi 50 razy w buforze węglanowym. Próbówki inkubowano 1 godzinę w 37 C po czym płukano 2 razy buforem PBS-T. Następnie dodawano sok z liści roztartych w buforze do ekstrakcji prób i inkubowano przez 1 godzinę w 37 C. Następnie płukano dwukrotnie PBS- T i raz wodą wolną od RNAz. Do probówek dodawano po 25 μl mieszaniny do reakcji RT-PCR. Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono przez 20 minut w 42 C, a reakcję PCR prowadzono przez 30 cykli (denaturacja 94 C 30 sekund, przyłączanie starterów 58 C 30 sekund i elongacja 72 C 30 sekund). Produkty RT-PCR i IC/RT-PCR rozdzielano na 1% żelu agarozowym (nanoszono po 3 μl każdej próby). III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W teście ELISA izolaty PepMV w różny sposób reagowały z surowicami skierowanymi przeciwko PepMV-SW i PepMV-PK. Surowica skierowana przeciwko PepMV-PK OD405 Próby Samples Rys. 1. Porównanie wartości absorbancji (OD 405 ) w teście ELISA przy zastosowaniu surowicy przeciwko PepMV-PK, kolumna pierwsza: oczyszczone preparaty wirusowe, kolumna druga próby roślinne Fig. 1. Comparison of absorbance value in the ELISA test using PepMV-PK antiserum, first column: purified viruses, the second: plant s samples

3 268 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 w przypadku oczyszczonych preparatów wirusowych (w tej samej koncentracji) z podobną czułością wykrywała obydwa izolaty wirusa, w przypadku prób z zainfekowanych roślin Nicotiana benthamiana, silniej reagowała z izolatem PepMV-SW (rys. 1). Surowica przeciwko PepMV-SW zarówno w przypadku oczyszczonych preparatów, jak i prób roślinnych, silniej reagowała z PepMV-SW (rys. 2). PepMV-PK PepMV-SW OD405 Próby Samples Rys. 2. Porównanie wartości absorbancji (OD 405 ) w teście ELISA przy zastosowaniu surowicy przeciwko PepMV-SW; kolumna pierwsza: oczyszczone preparaty wirusowe, kolumna druga: próby roślin Fig. 2. Comparison of absorbance value in the ELISA test using PepMV-SW antiserum; first column: purified viruses, the second one: plant s samples Różnice w wykrywaniu izolatów PepMV-SW i PepMV-PK surowicą homologiczną i/lub heterologiczną wynikają z ich zróżnicowania biologicznego (różna koncentracja wirusów w roślinach) i serologicznego. W reakcji RT-PCR startery amplifikujące region TGB szczepu amerykańskiego nie wykrywały izolatu PepMV-SW (rys. 3), stąd też dobór starterów do reakcji RT-PCR nie może być przypadkowy. Wynika to z dużych różnic w sekwencji obu izolatów, które wpływają na sposób ich wykrywania. W teście IC/RT PCR z surowicą skierowaną przeciwko PepMV-SW otrzymywano mniej produktu amplifikacji w przypadku prób zainfekowanych wirusem PepMV-PK (rys. 4). Technika IC/RT-PCR przy odpowiednim dopracowaniu warunków wykrywania, ze względu na niższą praco- i kosztochłonność (nie potrzeba izolować matrycy), bardziej się nadaje do masowej diagnostyki niż RT-PCR. Przy stosowaniu testu ELISA do masowego wykrywania wirusa w materiale roślinnym, IC/RT-PCR może być techniką rozstrzygającą w przypadku wątpliwych wyników.

4 Diagnostyka Pepino mosaic virus 269 Rys. 3. Rozdział elektroforetyczny produktów RT-PCR K kontrola negatywna, 1 PepMV-PK, 2 PepMV-SW, M marker HyperLadder III (Bioline) Fig. 3. Electrophoresis mobility of RT-PCR products in 1% agarose gel K negative control, 1 PepMV-PK, 2 PepMV-SW, M marker HyperLadder III (Bioline) Rys. 4. Rozdział elektroforetyczny produktów IC/RT-PCR M marker HyperLadder IV (Bioline), K kontrola negatywna, 1 próba PepMV-PK, surowica PepMV-PK, 2 próba PepMV-SW, surowica PepMV-SW, 3 próba PepMV- -SW, surowica PepMV-PK, 4 próba PepMV-PK, surowica PepMV-SW Fig. 4. Electrophoresis mobility of IC/RT-PCR products M-marker HyperLadder IV(Bioline), K negative control, 1 sample PepMV-PK, antiserum PepMV-PK, 2 sample PepMV-SW, antiserum PepMV-SW, 3 sample PepMV- -SW, antiserum PepMV-PK, 4 sample PepMV-PK, antiserum PepMV-SW

5 270 Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 47 (2) 2007 IV. LITERATURA French C.J., Bouthillier M., Bernardy M., Ferguson G., Sauborin M., Johnson R.C., Masters C., Godkin S., Mumford R First report of Pepino mosaic virus in Canada and the United States. Plant Dis. 85, s Ling K.S Molecular characterization of two Pepino mosaic virus variants from imported tomato seed reveals high levels of sequence identity between Chilean and US isolates. Virus Genes 34 (1): 1 8. Pagan I., Cordoba-Selles del Carmen M., Martinez-Priego L., Fraile A., Malpica J.M., Jorda C., Garcia-Arenal F Genetic Structure of the population of Pepino mosaic virus infecting tomato crops in Spain. Phytopathology 96: Pospieszny H., Borodynko N New Polish Isolate of Pepino mosaic virus Highly Distinct from European Tomato, Peruvian, and US2 Strains. Plant Dis. 90, s Pospieszny H., Borodynko N., Palczewska M First record of Pepino mosaic virus in Poland. J. Plant Dis. Prot. 100, s. 97. Pospieszny H., Hasiów B., Borodynko N Nowy szczep wirusa mozaiki pepino (Pepino mosaic virus) na pomidorze szklarniowym. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 47(2): HENRYK POSPIESZNY, BEATA HASIÓW, NATASZA BORODYNKO DETECTION OF POLISH STRAINS OF PEPINO MOSAIC VIRUS SUMMARY In Poland, in 2002 and 2005, two different isolates of Pepino mosaic virus signed PepMV- -SW and PepMV-PK were isolated. Between isolates significant biological, serological and genetics differences were found which allowed to divide them into two strains. This work describes different methods for Polish PepMV isolates detection. Antiserum against PepMV-PK detected both isolates in ELISA test very well and we obtained better results using it in IC/RT-PCR test. Antiserum against PepMV-SW reacted better with samples infected with PepMV-SW then with PepMV-PK ones. The differences between Polish isolates in serological reactions are connected with their biological and serological variability. Specific RT-PCR primers were designed to amplify both isolates as well. On the other hand primers designed for US2 strain did not allow detection of PepMV-SW isolate. The above indicates that proper primers are important for different PepMV strains detection. Key words: ELISA, IC/RT-PCR, detection, PepMV