Wykorzystanie techniki FilmArray w diagnostyce zakażeń dróg oddechowych u osób z niedoborami odporności

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: Wykorzystanie techniki FilmArray w diagnostyce zakażeń dróg oddechowych u osób z niedoborami odporności Application of FilmArray assay for detection of respiratory tract infections in immunocompromised persons Tomasz Dzieciątkowski 1,2, Maciej Przybylski 1,2, Agata Sulowska 1, Sylwia Rynans 2, Grażyna Młynarczyk 2, Ewa Swoboda-Kopeć 1,2 1 Zakład Mikrobiologii SP CSK w Warszawie 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Wirusowe zakażenia dróg oddechowych są jednymi z najczęstszych schorzeń człowieka i wciąż powodują problemy w prawidłowej diagnostyce mikrobiologicznej oraz pociągają za sobą znaczące ekonomiczne koszty w systemie opieki zdrowotnej. Celem pracy było zastosowanie testu FilmArray Respiratory Panel do poszukiwania w próbkach materiału klinicznego etiologicznych czynników wywołujących zakażenie dróg oddechowych u osób z niedoborami odporności. Słowa kluczowe: wirusy oddechowe, diagnostyka molekularna, real-time PCR, multiplex PCR ABSTRACT Introduction: A variety of viruses and bacteria are responsible for acute upper and lower respiratory tract infections worldwide. Severe and even fatal disease can occur especially in group of immunocompromised individuals. Accurate pathogen identification allows clinicians to determine the need for ancillary diagnostic testing, antibacterial and/or antiviral therapy and can motivate decisions regarding hospitalization and infection control measures. Methods: We compared the diagnostic performance of FilmArray Respiratory Panel highly multiplexed nucleic acid amplification test with previous used direct immunofluorescence assay. Both assays were performed on a panel of 6 nasopharyngeal-secretion specimens and 6 BALF samples, collected from 12 patients, subjected to allogeneic haematological stem cells transplantation, with lower respiratory tract symptoms. Results and conclusions: Among viruses detectable by both assays were especially influenza A virus, parainfluenza viruses type 3 and respiratory syncytial virus. In conclusion, the FilmArray assay is rapid and extremely user-friendly system, with results available in just

2 182 T. Dzieciątkowski i inni Nr 3 over one hour with almost no labor involved. In few laboratories its low throughput and qualitative results may be a disadvantage in some clinical settings. Keywords: respiratory viruses, molecular diagnostics, real-time PCR, multiplex PCR WSTĘP Wirusowe zakażenia dróg oddechowych są jednymi z najczęstszych schorzeń człowieka i wciąż pociągają za sobą znaczące koszty eko nomiczne w systemie opieki zdrowotnej. Lista wirusów wywołujących zakażenia oddechowe i ich udział w chorobotwórczości pozostają praktycznie niezmienne od 50 lat. Do najpowszechniejszych należą wirusy grypy A i B, wirusy syncytialnego oddechowego typu A i B (RSV A i B), wirusy paragrypy 1-3 (PIV-1, -2, -3), adenowirusy (HAdV), rinowirusy (hrv), metapneumowirusy (hmpv) oraz koronawirusy OC43 i 229E. Do rzadziej wykrywanych wirusów oddechowych należy wirus paragrypy typu 4 (PIV-4) oraz niektóre typy enterowirusów (hev), natomiast kliniczne znaczenie nowoodkrytych bokawirusów (hbov) czy koronawirusów NL63 oraz HKU1 nie zostało jeszcze w pełni wyjaśnione (2,7). Pomimo, że wszystkie wymienione powyżej wirusy wywołują objawy chorobowe u ludzi i skutecznie rozprzestrzeniają się w populacji, obserwuje się jednak znaczne różnice w etiologii, przebiegu i następstwach zakażeń dróg oddechowych występujących u pacjentów szpitalnych (ze szczególnym wskazaniem na pacjentów z grup ryzyka) i pozaszpitalnych oraz dzieci i osób dorosłych (2,5). Prawidłowe określenie czynnika etiologicznego wywołującego zakażenia dróg oddechowych nie jest możliwe wyłącznie na podstawie objawów klinicznych, co w praktyce prowadzi do niedodiagnozowania wirusowych zakażeń dróg oddechowych, a w konsekwencji do braku prawidłowego leczenia i/lub nieuzasadnionego stosowania antybiotyków. Dlatego istotne jest wykorzystanie metod diagnostycznych, które umożliwią precyzyjną identyfikację patogenu oraz ułatwią podjęcie właściwej strategii terapeutycznej (7). Typowo używane metody wirusologiczne opierały się na czasochłonnym namnażaniu wirusów w hodowlach komórkowych, albo na szybszych, choć mniej czułych metodach immunofluorescencyjnych (2,7). Stopniowo ulegają one jednak zastępowaniu przez testy oparte na technice PCR, zarówno wykrywające kilka wariantów wirusa (1), jak i wiele patogenów w jednej próbce (8). Kolejnym krokiem jest automatyzacja metod, która ma na celu ograniczenie ryzyka wystąpienia błędów laboratoryjnych oraz ułatwienie procedur diagnostycznych (4) jej przykładem jest opisywany test FilmArray Respiratory Panel. MATERIAŁ I METODY Do badań mikrobiologicznych przeprowadzonych w Zakładzie Mikrobiologii SP CSK w Warszawie wykorzystano 12 próbek klinicznych, pochodzących od pacjentów z Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Ogółem przebadano 6 prospektywnych wymazów pobranych z tylnej osób z objawami ostrego zapalenia górnych dróg oddechowych oraz 6 retrospektywnych próbek popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych (BALF) pobranych od chorych z objawa-

3 Nr 3 Technika FilmArray w diagnostyce zakażeń dróg oddechowych 183 mi zakażenia dolnych dróg oddechowych, w których uzyskano uprzednio wyniki dodatnie z użyciem testu immunofluorescencji bezpośredniej (DIF) Light Diagnostics Respiratory Panel 1 (Chemicon). Próbki badano testem FilmArray Respiratory Panel (Biofire Diagnostics Inc.), opartym na zasadzie multipleksowanego zagnieżdżonego PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala on na wykrycie oraz rozróżnienie 21 wirusowych i bakteryjnych patogenów, wywołujących zakażenia dróg oddechowych u ludzi (Tab.I). Próbki materiału klinicznego oraz test przygotowywano według zaleceń producenta. Procedura ta zajmuje około 5 minut i ulega wydłużeniu o 20 minut tylko w przypadku wykorzystania popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych, w związku z koniecznością upłynnienia próbki. W aparacie następuje zintegrowany proces lizy komórek, izolacji kwasów nukleinowych, odwrotnej transkrypcji, amplifikacji oraz detekcji. Oprogramowanie systemu FilmArray wykorzystując badanie krzywych topnienia produktu reakcji (ang. melting-curve analysis) samodzielnie przeprowadza analizę uzyskanych wyników oraz rozróżnienia patogenów obecnych w badanym materiale. Każda próbka zawiera dodatkowo kontrolę izolacji RNA i DNA oraz poszczególnych etapów PCR. Czas trwania badania wynosi około 70 minut. Tabela I. Patogeny wykrywane przez test FilmArray Respiratory Panel Bakterie Bordetella pertussis Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Wirusy adenowirusy (HAdV) bokawirusy (hbov) koronawirusy (HKU1/NL63/229E/OC43) wirusy grypy (A/B/H1N1/H1N1-2009/H3N2) metapneumowirusy (hmpv) wirusy paragrypy 1-4 (PIV 1-4) RSV rino-/enterowirusy WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Podczas badania testem FilmArray Respiratory Panel 12 próbek materiału klinicznego wyniki dodatnie uzyskano w 11 przypadkach (92%) (Tabela II). W wymazach pobranych z tylnej przeważały rino- i/lub koronawirusy, co jest zjawiskiem typowym dla zakażeń gardła oraz krtani. Odmiennie prezentowały się natomiast wyniki uzyskane podczas badania popłuczyn oskrzelikowo-pęcherzykowych, gdzie stwierdzono duże zróżnicowanie patogenów, z wyraźnymi cechami koinfekcji (Tabela II). Różnice występowały także pomiędzy wynikami uzyskanymi przy użyciu techniki molekularnej oraz techniki immunofluorescencji. Mogło to być spowodowane przez stosunkowo niską czułość immunofluorescencji bezpośredniej, jak i przez ograniczony zakres patogenów wykrywanych testem Light Diagnostics Respiratory Panel 1. Wynik dodatni w kierunku antygenów adenowirusów (HAdV) w próbce oznaczonej numerem 6, który nie został potwierdzony testem FilmArray (Tabela II), można natomiast tłumaczyć trudnością w jednoznacznym odczycie prowadzonym w mikroskopie fluorescencyjnym lub też zmniejszoną czułością metody w odniesieniu do DNA adenowirusów (3).

4 184 T. Dzieciątkowski i inni Nr 3 Tabela II. Porównanie wyników uzyskanych z wykorzystaniem testu FilmArray Respiratory Panel oraz Light Diagnostics Respiratory Panel 1. Pacjent Materiał kliniczny Wynik testu immunofluorescencyjnego (DIF) Light Diagnostics Wynik FilmArray Respiratory Panel 1 BALF* PIV 3 / grypa A (?) PIV 3 2 BALF PIV 3 PIV 3 / PIV 4 / RSV 3 BALF PIV 1 koronawirus 229E / grypa A H3N2 / RSV / M. pneumoniae 4 BALF PIV 1 /grypa A (?) HAdV / koronawirus 229E / grypa H3N2 / RSV 5 BALF grypa A grypa A H1N1 6 BALF HAdV (-) 7 rinowirus / grypa A H1N rinowirus / koronawirus 229E 9 rinowirus / koronawirus 229E 10 koronawirus 229E 11 rinowirus 12 rinowirus *) BALF: popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelikowe PODSUMOWANIE Uzyskane wyniki wskazują na możliwość wykorzystania testu FilmArray Respiratory Panel w praktyce diagnostycznej. Warta podkreślenia jest zwłaszcza prostota obsługi sprzętu oraz mała czasochłonność przygotowywania próbki do badania. Wraz z krótkim czasem trwania samego testu może mieć to istotne znaczenie, zwłaszcza przy wykonywaniu badań na potrzeby oddziałów intensywnej terapii czy dla pacjentów po transplantacjach, gdzie faktyczną wartość kliniczną mają przede wszystkim testy identyfikujące patogen w czasie nie dłuższym niż 24 godziny (2,4). Podstawowym ograniczeniem opisywanej metody jest stosunkowo wysoki koszt jednostkowego badania. Jednakże test ten w założeniu nie jest przeznaczony do diagnostyki błahych zakażeń górnych dróg oddechowych czy gardła, a jako pomoc w wykrywaniu czynników etiologicznych zagrażających życiu pacjentów pediatrycznych lub osób z zaburzeniami odporności (4). Do mniejszych mankamentów zaliczyć też można wzmiankowaną przez Pierce i wsp. (3) zmniejszoną czułość wykrywania DNA adenowirusów w porównaniu z tradycyjnym testem real-time PCR, czy zanotowanym przez Renaud i wsp. (6) brakiem zdolności do rozróżniania poszczególnych typów rino- i enterowirusów. Ma to jednak wyłącz-

5 Nr 3 Technika FilmArray w diagnostyce zakażeń dróg oddechowych 185 nie znaczenie z epidemiologicznego punktu widzenia, co nie powinno umniejszać wartości diagnostycznej testu FilmArray Respiratory Panel dla współczesnej wirusologii klinicznej. Autorzy pragną wyrazić podziękowania Pani Annie Sokół i firmie Biomedica Poland Sp. z o.o. za udostępnienie sprzętu FilmArray do testów laboratoryjnych. PIŚMIENNICTWO 1. Brittain-Long R, Nord S, Olofsson S i inni. Multiplex real-time PCR for detection of respiratory tract infections. J Clin Virol 2008; 41: Murdoch DR, Jennings LC, Bhat N i inni. Emerging advances in rapid diagnostics of respiratory infections. Infect Dis Clin North Am 2010; 24: Pierce VM, Elkan M, Leet M i inni. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol 2012; 50: Poritz MA, Blaschke AJ, Byington CL i inni. FilmArray, an automated nested multiplex PCR system for multi-pathogen detection: development and application to respiratory tract infection. PLoS One 2011; 6: e Ren L, Xiang Z, Guo L i inni. Viral infections of the lower respiratory tract. Curr Infect Dis Rep 2012; 14: Renaud C, Crowley J, Jerome KR i inni. Comparison of FilmArray Respiratory Panel and laboratory-developed real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assays for respiratory virus detection. Diagn Microbiol Infect Dis 2012; 74: Stefańska I, Romanowska M, Brydak LB. Metody wykrywania wybranych wirusów wywołujących zakażenia układu oddechowego. Postępy Hig Med Dośw 2012; 66: Stefańska I, Dzieciątkowski T, Brydak LB i inni. Application of three duplex real-time PCR assays for simultaneous detection of human seasonal and avian influenza viruses. Arch Virol 2013; 158: Otrzymano: 17 VII 2013 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Banacha 1A, Zakład Mikrobiologii SP CSK w Warszawie

6