ZASTOSOWANIE METOD GENOTYPOWYCH W DOCHODZENIU POKREWIEŃSTWA IZOLATÓW PAŁECZEK CAMPYLOBACTER COLI WYHODOWANYCH OD CHOREGO DZIECKA ORAZ OD PSA

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Sebastian Wardak 1, Urszula Duda 2, B. Wojsa 2 ZASTOSOWANIE METOD GENOTYPOWYCH W DOCHODZENIU POKREWIEŃSTWA IZOLATÓW PAŁECZEK CAMPYLOBACTER COLI WYHODOWANYCH OD CHOREGO DZIECKA ORAZ OD PSA 1 Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy Zakład Higieny Kierownik Zakładu Bakteriologii: prof. dr hab. M. Jagielski 2 Powiatowa Stacja Sanitarno-Epidemiologiczna w Bielsku-Białej, Kierownik: dr n. med. J. Rutkiewicz Kampylobakterioza jest odzwierzęcą chorobą zakaźną wywołaną przez pałeczki z rodzaju Campylobacter. Autorzy przedstawiają przypadek izolacji pałeczek Campylobacter coli od 5. miesięcznego pacjenta z klinicznymi objawami kampylobakteriozy oraz od zdrowego psa. Izolaty te charakteryzowały się tym samym profilem lekooporności oraz nierozróżnialnymi wzorami genomowego DNA uzyskanymi metodą REA-PFGE i ERIC-PCR. Pałeczki z rodzaju Campylobacter stanowią w krajach rozwiniętych jedną z najczęstszych przyczyn zakażeń pokarmowych u ludzi (4). Od osób z kampylobakteriozą najczęściej izoluję się pałeczki należące do gatunku C. jejuni oraz C. coli rzadziej pałeczki C. upsaliensis, C. lari, C. hyointestinalis oraz C. fetus. Najważniejszym rezerwuarem pałeczek C. jejuni jest drób (kury, indyki, gęsi, kaczki), natomiast pałeczek C. coli trzoda chlewna (5, 8). Ponadto nośnikiem pałeczek Campylobacter mogą być także inne zwierzęta hodowlane (trzoda chlewna, bydło, owce) i domowe (psy, koty) oraz dzikie zwierzęta. Do zakażeń człowieka dochodzi po spożyciu skażonych tymi pałeczkami produktów żywnościowych pochodzenia zwierzęcego (zwłaszcza drobiu), zanieczyszczonej bakteriami wody czy też niepasteryzowanego mleka. Do zakażenia może dojść także przez ścisły kontakt ze zwierzętami domowymi lub hodowlanymi (5). W dostępnym piśmiennictwie krajowym brak jest informacji o występowaniu pałeczek Campylobacter u psów i ewentualnych zakażeniach ludzi, którego źródłem byłyby te zwierzęta. Celem pracy była wykorzystanie metod genotypowych w dochodzeniu pokrewieństwa izolatów pałeczek Campylobacter coli wyhodowanych od chorego dziecka oraz od psa, z którym to dziecko miało bezpośredni kontakt. MATERIAŁ I METODY S zczepy bakteryjne. Przedmiotem badań były 2 izolaty pałeczek C. coli wyizolowane w kwietniu 2009 roku w laboratorium mikrobiologicznym Sekcji Badań Chorób

2 236 S. Wardak, U. Duda, B. Wojsa Nr 3 Zakaźnych i Zakażeń W PSSE Bielsko-Biała z próbek kału 5 miesięcznego chłopca z klinicznymi objawami kampylobakteriozy oraz dwuletniego psa rasy Yorkshire Terrier. Wyhodowane w laboratorium PSSE izolaty zostały następnie przesłane do Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH w celu reidentyfikacji i oznaczenia ich lekowrażliwości. Podstawą identyfikacji pałeczek Campylobacter było stwierdzenie wzrostu w warunkach mikroaerofilnych (Campy Gen OXOID), zdolność wytwarzania katalazy i oksydazy, zdolność ruchu oraz wynik testu na hydrolizę octanu indoksylu i hydrolizę hipuranu sodu. Przynależność szczepów do gatunku C. jejuni weryfikowano metodą PCR zgodnie z metodyką opracowaną przez Vandamme i wsp. (13). Jako kontrolę użyto referencyjnych szczepów C. jejuni ATCC oraz C. coli ATTC Dodatkowo w badaniach genotypowych użyto czterech szczepów C. coli wyosobnionych między marcem a majem 2009 roku od niezwiązanych z tym ogniskiem osób chorych z rejonu bielsko-bialskiego. Opis przypadku. Chory na kampylobakteriozę chłopiec przechodził biegunkę z dodatkiem krwi w kale. W wywiadzie epidemiologicznym zarejestrowano kontakt chorego z domowym psem Yorkshire Terrier. W wyniku przeprowadzonych badań psa, który nie wykazywał objawów chorobowych, stwierdzono obecność pałeczek C. coli w kale. Pies mieszka w domu, w którym przebywało dziecko. Matka dziecka stwierdziła w wywiadzie, pojedynczy przypadek bezpośredniego kontaktu dziecka z psem przed wystąpieniem objawów chorobowych u chłopca. Dom w którym mieszka zakażony chłopiec sąsiaduje z gospodarstwem w którym przebywają zwierzęta. Pies w okresie w którym zachorował chłopiec spożywał suchą karmę i kontaktował się z innymi zwierzętami. Izolacja chromosomalnego DNA. Hodowlę badanych szczepów prowadzono na podłożu Columbia z 5% krwi baraniej (OXOID) w warunkach mikroaerofinych w temp. 42ºC przez 24 godz. Izolację chromosomalnego DNA prowadzono wg. wcześniej opisanej procedury (16). O znaczenie lekowrażliwości. Oznaczenie wrażliwości badanych izolatów na ciprofloksacynę, gentamicynę, erytromycynę i tetracyklinę wykonano na podłożu agarowym Mueller-Hintona z 5% krwi baraniej (Oxoid, Wielka Brytania) metodą E-testu, zgodnie z zaleceniami Clinical and Laboratory Standards Institute (2) oraz firmy AB Biodisk (Szwecja). Analiza polimorfizmu genetycznego badanych izolatów pałeczek C. jejuni oraz C. coli metodą ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive I n terg enic C o n s e n s u s ). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zaproponowanymi przez Steinbrueckner i wsp. (11). Amplifikaty ERIC-PCR uzyskano w reakcji PCR z zastosowaniem jednej pary starterów: Eric1 i Eric2 opisanych przez Versalovic i wsp. (14). Mieszaninę reakcyjną przygotowano zgodnie z opisaną wcześniej metodyką dla wszystkich badanych izolatów jednocześnie ze względu na próbę uniknięcia wpływu nieznacznych zmian stężenia poszczególnych składników mieszaniny na produkt amplifikacji (15). Elekroforegram dokumentowano przy użyciu GelScan wersja v firmy Kucharczyk T.E. (Polska). Analiza polimorfizmu długości restrykcyjnych fragmentów genomowego DNA pałeczek C. jejuni oraz C. coli za pomocą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (REA-PFGE). Izolację całkowitego DNA do analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych przeprowadzono za pomocą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym zgodnie z wytycznymi CAMPYNET

3 Nr 3 Genotypowanie C. coli 237 ( z modyfikacją własną opisaną wcześniej (15). Elekroforegram dokumentowano przy użyciu GelScan wersja v firmy Kucharczyk T.E. (Polska), a następnie analizowano przy użyciu oprogramowania komputerowego Gel Compar II Software v. 5.0 firmy Applied Maths, (Belgia). Zgodnie z kryteriami zaproponowanymi przez Tenovera i wsp. (12), izolaty bakteryjne zaliczano do określonego profilu REA-PFGE, jeżeli nie obserwowano różnic w ich wzorach restrykcyjnych. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Pałeczki Campylobacter należą do bakterii szeroko rozpowszechnionych w środowisku, co niewątpliwie stwarza zagrożenie dla zdrowia ludzi. Dane piśmiennictwa wskazują, że drobnoustroje te mogą powodować zakażenia u zwierząt domowych zwłaszcza u psów (1, 5, 6, 10, 12, 19). Jednakże pozostaje kwestią sporną czy pałeczki Campylobacter stanowią czynnik chorobotwórczy dla psów, czy też mogą stanowić naturalną mikroflorę przewodu pokarmowego tych zwierząt. W badaniach przeprowadzonych przez różnych autorów odsetek izolacji pałeczek Campylobacter z próbek kału psów sięga ponad 40% (6, 19). Autorzy zaobserwowali, że pałeczki Campylobacter są częściej izolowane od chorych i/lub młodych psów niż zdrowych i/lub starszych osobników. Najczęściej izoluję się pałeczki C. upsaliensis oraz C. jejuni, sporadycznie C. coli, C. lari oraz pałeczki innych gatunków (6, 19). W prezentowanej pracy opisano przypadek izolacji pałeczek C. coli od chorego dziecka oraz od psa nie wykazującego objawów chorobowych. Badanie kału psa zostało przeprowadzone ze względu na badanie otoczenia chorego na kampylobakteriozę dziecka. W celu potwierdzenia pokrewieństwa badanych izolatów w obecnych badaniach przeprowadzono ich typowanie. Typowanie drobnoustrojów na potrzeby dochodzenia epidemiologicznego opiera się na założeniu, że izolaty danego organizmu pochodzące z zakażenia oraz ze źródła zakażenia są najczęściej blisko spokrewnione, gdyż są potomstwem tej samej komórki rodzicielskiej. Stwierdzenie podobieństwa pomiędzy izolatami pochodzącymi od zakażonych ludzi a pałeczkami izolowanymi z podejrzanego nośnika z zastosowaniem metod typowania, może w niektórych przypadkach umożliwić, a w większości przypadków ułatwić identyfikację źródła zakażenia. Do typowania pałeczek Campylobacter wykorzystywane są różne metody zarówno fenotypowe np. oznaczanie profilu lekooporności i biotypowanie jak i genotypowe np. REA-PFGE (Restriction Enzyme Analysis - Pulsed Field Gel Elektrophoresis), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), REP (Repetitive Chromosomal Elements) oraz analiza profilu plazmidowego (7, 15, 17). Wolfs i wsp. (18) wykorzystali metodę genotypową (AFLP) w dochodzeniu pokrewieństwa izolatów Campylobacter jejuni wyhodowanych od 3-tygodniowego dziecka oraz przebywającego w tym samym domu co dziecko wykazującego objawy chorobowe (luźne stolce, brak apetytu) szczeniaka rasy Labrador. Autorzy ci stwierdzili, że izolaty pochodzące od dziecka oraz od szczeniaka wykazywały niemal nierozróżnialne wzory AFLP, co według nich świadczy o pierwszej dostępnej w piśmiennictwie genetycznie udowodnionej transmisji pałeczek C. jejuni od psa do człowieka. W obecnych badaniach typowano wyhodowane izolaty pałeczek C. coli z zastosowaniem metod genotypowych takich jak REA-PFGE i ERIC-PCR, ze względu na ich wysoki potencjał różnicowania pałeczek Campylobacter (15). Porównano profile otrzymane w wyniku

4 238 S. Wardak, U. Duda, B. Wojsa Nr 3 analizy badanych izolatów z profilami uzyskanymi w wyniku genotypowania izolatów pałeczek C. coli wyosobnionych od niezwiązanych z omawianym chłopcem i psem osób chorych z rejonu bielsko-bialskiego. W wyniku przeprowadzonych badań, stwierdzono, że izolaty pałeczek C. coli pochodzące od chorego i psa wykazywały nierozróżnialne wzory w zastosowanych metodach genotypowania, inne od wzorów uzyskanych dla kilku szczepów izolowanych w podobnym czasie od ludzi zamieszkujących ten sam rejon (Ryc. 1, Ryc. 2). Wskazuje to na przydatność zastosowanych metod do analizy genetycznego pokrewieństwa izolatów pałeczek C. coli. Ponadto izolaty te wykazywały ten sam profil lekooporności, były oporne na ciprofloksacynę (MIC=16mg/l) oraz wrażliwe na erytromycynę (MIC=0,19mg/l), tetracyklinę (MIC=0,19 mg/l) oraz gentamicynę (MIC=0,75mg/l). Tak więc uzyskane wyniki badań omawianych izolatów upoważniają do stwierdzenia, że pałeczki te mogły pochodzić z jednego źródła zakażenia wspólnego dla zakażonego chłopca i psa, bądź też dziecko lub pies stanowiło źródło zakażenia dla drugiego. Ze względu na to, iż zakażenie dotyczyło 5 miesięcznego dziecka nie spożywającego pokarmów mięsnych, mającego bliski kontakt z zakażonym psem, można założyć że najprawdopodobniej chłopiec kampylobakteriozę nabył od psa. Zakażeniu pałeczkami Campylobacter sprzyja dość niska dawka zakażająca określona na około żywych komórek bakteryjnych. Z przeprowadzonego przez pracowników PSSE wywiadu epidemiologicznego wynikało, że omawiany pies nie spoży- M kpz 291 kpz 242 kpz 194 kpz 145 kpz 97 kpz 48 kpz Ryc.1. Elektroforetyczny rozdział genomowego DNA izolatów pałeczek C. coli po trawienia enzymem restrykcyjnym SmaI. Objaśnienia: M-wzorzec wielkości fragmentów DNA (Pulse Marker kbp, Sigma), ścieżki 1-6 przedstawiają wzory REA-PFGE Ryc.1. Elektroforetyczny rozdział genomowego DNA izolatów pałeczek C. coli genomowego DNA wyosobnionego z komórek pałeczek C. coli odpowiednio izolatów: 69/09 po trawienia izolat wyhodowany enzymem restrykcyjnym od chorego chłopca, SmaI. 76/09 Objaśnienia: izolat wyhodowany M-wzorzec wielkości od psa, 57/09, 70/09, 71/09, 72/09 izolaty wyhodowane od chorych osób niezwiązanych z fragmentów badanym chłopcem DNA (Pulse i psem. Marker kbp, Sigma), ścieżki 1-6 przedstawiają wzory REA-PFGE genomowego DNA wyosobnionego z komórek pałeczek C. coli odpowiednio izolatów: 69/09 izolat wyhodowany od chorego chłopca, 76/09 izolat wyhodowany od psa, 57/09, 70/09, 71/09, 72/09 izolaty wyhodowane od chorych osób niezwiązanych z badanym chłopcem i psem.

5 Nr 3 Genotypowanie C. coli 239 M pz 2000 pz 1500 pz 1000 pz 750 pz 500 pz 250 pz Ryc.2. Elektroforegram przedstawiający wzory amplifikatów uzyskanych metodą ERIC-PCR dla izolatów pałeczek C. coli. Objaśnienia: M-wzorzec wielkości fragmentów DNA 1 Ryc.2. Elektroforegram przedstawiający wzory amplifikatów uzyskanych metodą kb DNA Ladder, (Fermentas), ścieżki 1-6 przedstawiają wzory ERIC-PCR uzyskane ERIC-PCR w wyniku amplifikacji dla izolatów fragmentów pałeczek C. genomowego coli. Objaśnienia: DNA wyosobnionego M-wzorzec wielkości z komórek C. coli odpowiednio izolatów: 69/09 izolat wyhodowany od chorego chłopca, 76/09 fragmentów DNA 1 kb DNA Ladder, (Fermentas), ścieżki 1-6 przedstawiają wzory izolat wyhodowany od psa, 57/09, 70/09, 71/09, 72/09 izolaty wyhodowane od ERIC-PCR chorych osób uzyskane niezwiązanych w wyniku z badanym amplifikacji chłopcem fragmentów i psem. genomowego DNA wyosobnionego z komórek C. coli odpowiednio izolatów: 69/09 izolat wyhodowany wał pokarmów przyrządzanych w domu, lecz karmę stosowna dla osobnika rasy Yorkshire od chorego chłopca, 76/09 izolat wyhodowany od psa, 57/09, 70/09, 71/09, 72/09 Terrier. Pies miał kontakt z innymi zwierzętami, które również mogły być dla niego źródłem zakażenia izolaty pałeczkami wyhodowane C. coli. od chorych Należy osób wziąć niezwiązanych pod uwagę, z że badanym pałeczki chłopcem Campylobacter i psem. mogą przetrwać w optymalnych warunkach w wilgotnej glebie lub w wodzie nawet do kilku tygodni, gdzie trafiają wraz z odchodami zwierząt. Tak skażona woda lub gleba może także być źródłem zakażenia dla zwierząt towarzyszących człowiekowi (5). Drzewiecka i Sinkiewicz (3) wykryły obecność pałeczek Campylobacter w około 33% próbek pobranych ze zbiorników wodnych byłego województwa bydgoskiego. Natomiast przeprowadzone badania wód, jezior i rzek okolic Warszawy potwierdziły obecność tych bakterii w ponad 67% próbek wody (9). Podsumowując, w obecnych badaniach opisano przypadek izolacji pałeczek C. coli od chorego na kampylobakteriozę dziecka oraz od psa z bezpośredniego otoczenia chorego. Wyniki przeprowadzonych przez nas badań, jak i sugestie innych autorów, wskazują na potencjalny charakter zagrożenia zakażenia pałeczkami Campylobacter od zwierząt domowych, z którymi człowiek pozostaje w bliskim kontakcie. Uzyskane w obecnej pracy wyniki pozwalają także stwierdzić, że zastosowane metody typowania takie jak REA-PFGE oraz ERIC-PCR mogą dostarczyć informacji przydatnych w analizie epidemiologicznej przypadków kampylobakteriozy. Jest to niezmiernie ważne w przypadkach gdy istnieje pilna potrzeba

6 240 S. Wardak, U. Duda, B. Wojsa Nr 3 udzielenia odpowiedzi o ewentualnym pokrewieństwie izolatów pałeczek Campylobacter pochodzących od zakażonych ludzi oraz z podejrzanego nośnika tych bakterii. S. Wardak, U. Duda, B. Wojsa. MOLECULAR INVESTIGATION OF RELATEDNESS OF CAMPYLOBACTER COLI ISOLATED FROM CHILD WITH CAMPYLOBACTERIOSIS AND HEALTHY, HOUSEHOLD DOG. SUMMARY Thermotolerant species of Campylobacter (mainly C. jejuni and C. coli) are among the most frequently isolated bacterial agents of gastroenteritis in many developed countries. C. coli is less prevalent than C. jejuni. The main reservoir of C. coli is swine, however this pathogen may also be found in poultry, cattle and pets. Genotypic methods have successfully been applied to the subtyping of Campylobacter species in epidemiological investigation. In the present study we report a case of isolation of C. coli from 5 month old child and 2-year old heathy dog (Yorkshire Terrier). C. coli isolates were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) with SmaI and enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR (ERIC-PCR) for establishing genetic relationships of the strains. The molecular fingerprints of these isolates were compared with the patterns of four C. coli epidemiologically unrelated isolates obtained from humans with diarrhea from the same region. The child and the dog shared the same strain, which were indistinguishable by PFGE and ERIC-PCR. This may argue for the transmission of C. coli between household dog and human. Our results may also support previous findings that direct contact with infected pets may play an important role in the development of campylobacteriosis in humans. PIŚMIENNICTWO 1. Acke E, McGill K, Golden O i wsp. Prevalence of thermophilic Campylobacter species in household cats and dogs in Ireland. Veterinary Record 2009;164: Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; Approved Guideline M45-A. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pa; Drzewiecka B, Sinkiewicz J. Występowanie bakterii z rodzaju Campylobacter w wodach powierzchniowych, wykorzystywanych na potrzeby komunalne na terenie województwa bydgoskiego. Roczn PZH. 2000;51: Friedman C R, Nejmann J, Wegener HC, Tauxe RV. Epidemiology of Campylobacter jejuni infections in the United States and other industrialized nations, [W:] Nachamkin I, Blaser M J. Campylobacter, wydanie II, Washington, DC, ASM Press 2000: Miller WG, Mandrell RE. Prevalence of Campylobacter in the food and water supply: Incidence, outbreaks, isolation and detection, [W] Ketley JM i Konkel ME. Campylobacter. Molecular and cellular biology, Norfolk, UK, Horizon Bioscience 2005: Moreno GS, Griffiths PL, Connerton IF, Park RW. Occurrence of campylobacters in small domestic and laboratory animals. J Appl Microbiol. 1993;75: Newell DG, Frost A, Duim B, i wsp. New developments in the subtyping of Campylobacter species. [W:] Nachamkin I i Blaser M J. Campylobacter, wydanie II, Washington, DC, ASM Press 2000:

7 Nr 3 Genotypowanie C. coli Perez-Perez GI, Blaser MJ. Campylobacter and Helicobacter, [W] Baron S. Medical Microbiology, wydanie IV, Galveston, Texas, The University of Texas Medical Branch at Galveston, Popowski J, Łękowska-Kochaniak A, Korsak D. Występowanie termotolerancyjnych bakterii rodzaju Campylobacter w rzekach i jeziorach okolic Warszawy. Roczn. PZH, 1997;48: Sandberg M, Bergsjø B, Hofshagen M i wsp. Risk factors for Campylobacter infection in Norvegian cats and dogs. Prev Vet Med 2002;55: Steinbrueckner B, Ruberg F, Kist M. Bacterial genetic fingerprint: a reliable factor in the study of the epidemiology of human campylobacter enteritis? J Clin Microbiol. 2001;39: Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV i wsp. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol. 1995;33: Vandamme P, van Doorn LJ, al Rashid ST i wsp and Campylobacter coli Véron and Chatelain 1973 are subjective synonyms. Int J Syst Bact 1997;47: Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 1991;19: Wardak S, Jagielski M. Ocena przydatności wybranych metod genotypowych i fenotypowych do wewnątrzgatunkowego różnicowania pałeczek Campylobacter jejuni oraz Campylobacter coli izolowanych od ludzi. II. Przydatność metod PFGE, ERIC-PCR, PCR-flaA-RFLP i MLST. Med Dośw Mikrobiol 2009;61: Wardak S, Szych J, Cieślik A. Wykorzystanie techniki PCR-RFLP do wykrywania mutacji w kodonie 86 genu gyra związanej z opornością na fluorochinolony pałeczek Campylobacter jejuni. Med Dośw Mikrobiol. 2005;57: Wassenaar TM, Newell DG. Genotyping of Campylobacter spp. Appl Environ Microbiol 2000;66: Wolfs TFW, Duim B, Sibyl P i wsp. Neonatal sepsis by Campylobacter jejuni: genetically propen transmission from a household puppy. Clin Infect Dis, 2001;32: Workman SN, Mathison GE, Lavoie MC. Pet dogs and chicken meat as reservoirs of Campylobacter spp. in Barbados. J Clin Microbiol 2005;43: Otrzymano: 21 VII 2009 Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie, swardak@pzh.gov.pl

8