Wykorzystanie analizy DNA w diagnostyce izolowanej postaci głuchoty. Identyfikacja mutacji del35g w genie GJB2.

Transkrypt

1 INSTYTUT MATKI I DZIECKA ZAKŁAD GENETYKI MEDYCZNEJ Kierownik Zakładu Prof. dr hab. med. Tadeusz Mazurczak TADEUSZ MAZURCZAK, WOJCIECH WISZNIEWSKI, EWA NOWAKOWSKA- SZYRWIŃSKA, ŁUCJA SOBIESZCZAŃSKA-RADZISZEWSKA, EWA OBERSZTYN, JERZY BAL Wykorzystanie analizy DNA w diagnostyce izolowanej postaci głuchoty. Identyfikacja mutacji del35g w genie GJB2. EKSPERTYZA NAUKOWA Wykonana na zlecenie Ministerstwa Zdrowia Warszawa 2002

2 SPIS TREŚCI 1. USZKODZENIE SŁUCHU JEST NAJCZĘSTSZYM DEFEKTEM NARZĄDÓW ZMYSŁU U LUDZI 2. PODŁOŻE UTRATY SŁUCHU 3. GENETYKA NIEDOSŁUCHU 3.1. UTRATA SŁUCHU ZWIĄZANA Z ZESPOŁAMI WAD 3.2. SAMOISTNE POSTACI NIEDOSŁUCHU 4. GŁUCHOTA typu DFNB GEN GJB MUTACJE GENU GJB2 5. GRUPA BADANA 6. WYNIKI 7. PODSUMOWANIE I WNIOSKI 7.1. PATOLOGIA MOLEKULARNA 7.2. KWALIFIKACJA CHORYCH DO BADAŃ MOLEKULARNYCH 7.3. TEST MOLEKULARNY 7.4. POSTĘPOWANIE DIAGNOSTYCZNE 7.5 PERSPEKTYWY TERAPEUTYCZNE 8. METODY 8.1. IZOLACJA DNA 8.2. POWIELANIE DNA METODĄ PCR 8.3. SEKWENCJONOWANIE PROPODUKTÓW PCR 8.4. BADANIE PRZESIEWOWE MUTACJI 35DELG METODA ASO PRZYGOTOWANIE FILTRÓW PRZYGOTOWANIE SONDY HYBRYDYZACJA METODA AS-PCR 9.5 BADANIE PRZESIWOWE MUTACJI 314DEL14 9. PISMIENNICTWO 10. BAZY DANYCH 11. PISMIENNICTWO PRACOWNIKÓW IMiD Z ZAKRESU MOLEKULARNYCH ASPEKTÓW GŁUCHOTY 2

3 Badania epidemiologiczne dowodzą, że uwarunkowania genetyczne stanowią istotny czynnik etiologiczny głuchoty. Równocześnie przełom jaki dokonał się w genetyce niedosłuchu jak też w biologii molekularnej doprowadził do lepszego poznania tła genetycznego niedosłuchu i identyfikacji wielu genów, których defekty odpowiedzialne są za wystąpienia najczęstszej postaci głuchoty prelingwalnej. Dodatkowym motywem podjecia badań i przygotowania ekspertyzy jest perspektywa wprowadzenia diagnostyki molekularnej do selektywnych badań przesiewowych, co umożliwiłoby szybką weryfikację rozpoznania klinicznego a przez to skuteczną terapię oraz objęcie rodzin ryzyka głuchoty poradnictwem genetycznym. Cele jakie postawiono przed ekspertyzą obejmowały: 1. Określenie przydatności stosowanych technik biologii molekularnej do diagnostyki DFNB1. 2. Weryfikację molekularną rozpoznania klinicznego DFNB1. 3. Określenie toku diagnostycznego dla chorych z rozpoznaniem klinicznym głuchoty prelingwalnej. 1. USZKODZENIE SŁUCHU JEST NAJCZĘSTSZYM DEFEKTEM NARZĄDÓW ZMYSŁU U LUDZI Ucho człowieka ucho jest jednostką anatomiczną spełniającą zarówno funkcje narządu słuchu jak i równowagi. Anatomicznie i czynnościowo wyróżnia się trzy składowe narządu słuchu: 1) ucho zewnętrzne, w którym dźwięki i wibracje ulegają wzmocnieniu i przenoszone są wzdłuż przewodu słuchowego do błony bębenkowej; 2) ucho środkowe, przenoszące drgania z ucha zewnętrznego do ucha wewnętrznego poprzez układ trzech kosteczek słuchowych: młoteczek, kowadełko i strzemiączko; 3) ucho wewnętrzne, które zamienia fale akustyczne w impulsy nerwowe oraz rejestruje zmiany położenia ciała. 3

4 Utrata słuchu może być wywołana uszkodzeniem każdego elementu narządu słuchu począwszy od zewnętrznego przewodu słuchowego, a skończywszy na ośrodkowym układzie nerwowym. Choroby ucha zewnętrznego i środkowego mogą zakłócać mechaniczne przewodzenie bodźców akustycznych i powodują niedosłuch typu przewodzeniowego. Najczęstsze przyczyny tego typu niedosłuchu to: niedrożność zewnętrznego przewodu słuchowego, zgrubienie lub perforacja błony bębenkowej, unieruchomienie lub resorpcja elementów kostnych ucha środkowego, niedrożność trąbki słuchowej. Uszkodzenie jednego z elementów ucha wewnętrznego i drogi słuchowej, począwszy od komórek słuchowych, a skończywszy na korze słuchowej może prowadzić do zaburzeń percepcji wrażeń słuchowych. Niedosłuch tego typu określany jest mianem odbiorczego 1 (Nadol 1993, Skarżyński 1998). O ile uszkodzenia centralnych dróg słuchowych zazwyczaj upośledzają słyszenie w niewielkim stopniu, o tyle patologie ucha wewnętrznego często prowadzą do całkowitej utraty słuchu. Jest to związane z budową histologiczną narządu Cortiego, w którym występuje jedynie komórek włoskowatych, z których znaczenie strategiczne w odbiorze dźwięków odgrywa jedynie Z drugiej strony liczba neuronów zaangażowanych w tworzenie dróg słuchowych sięga setek tysięcy. Uszkodzenie nawet niewielkiej liczby komórek receptorowych prowadzi w konsekwencji do upośledzenia słyszenia (Nobili i wsp., 1998). Utrata słuchu prowadzi do poważnego ograniczenia zdolności poznawczych oraz nierzadko jest też przyczyną izolacji dziecka i problemów w jego rozwoju psychospołecznym. Nasilenie tych zaburzeń zależy od wielu czynników, przede wszystkim od stopnia utraty słuchu i czasu jego pojawienia się jak też wieku dziecka, w którym choroba została rozpoznana. Niedosłuch jest najczęstszym defektem narządów zmysłu u ludzi i dotyczy około 10% społeczeństwa. Według 1 niedosłuch odbiorczy = niedosłuch zmysłowo-nerwowy 4

5 międzynarodowych danych epidemiologicznych jedno dziecko na 1000 jest dotknięte głębokim niedosłuchem od urodzenia lub wczesnego dzieciństwa. Kolejne dziecko na 1000 traci słuch przed osiągnięciem dorosłości. W krajach rozwiniętych ciężkie upośledzenie słuchu (próg słyszenia powyżej 65 db) dotyczy 0,3% populacji w wieku lat i około 2,3% u osób lat (Petit 1996; Nadol 1993; Morton 1991; Gorlin i wsp., 1995). Ze względu na stopień uszkodzenia słuchu, niedosłuch jest klasyfikowany jako: lekki, umiarkowany, ciężki i głęboki. Określenie głuchota 2 powinno używać się do opisu głębokiej formy niedosłuchu (Tab. 1). Tabela 1 KLASYFIKACJA TYPÓW NIEDOSŁUCHU Typ Stopień niedosłuchu utraty słuchu (db) Rozwój mowy Lekki zaburzenia artykulacji Umiarkowany Ciężki Głęboki > 80 utrata słuchu wywiera znaczny wpływ na opanowanie mowy, wymaga aparatowania głuche dziecko nie jest w stanie nauczyć się mówić nawet z pomocą aparatu słuchowego Na podstawie czasu ujawnienia się zaburzeń słyszenia wyróżnia się niedosłuch prelingwalny, gdy początek utraty słuchu ma miejsce przed rozwojem zdolności mowy (przed upływem 2 r.ż.), perilingwalny (w granicach 2 r.ż.) oraz postlingwalny, gdy zdolność ta jest już opanowana (po 2 r.ż.). Spośród w/w form niedosłuchu, postać prelingwalna w największym stopniu upośledza funkcjonowanie człowieka gdyż stopień uszkodzenia słuchu jest najczęściej głęboki, a czas 2 W publikacjach ukazujących się w ostatnich latach można zaobserwować konsekwentne odchodzenie od określania utarty słuchu terminem głuchota" i zastępowanie go bardziej ogólnym niedosłuch". Ta zmiana nomenklatury stwarza problemy w interpretacji danych zawartych w starszych publikacjach z uwagi na powszechne wtedy wymienne 5

6 ujawnienia choroby w najważniejszym okresie rozwoju mowy zaburza jej rozwój (Parving i Newton, 1994). U osób z niedosłuchem, zmiany chorobowe mogą dotyczyć elementów ucha odpowiedzialnych za przewodzenie impulsów dźwiękowych oraz ich rejestrację i przetwarzanie. W zależności od umiejscowienia defektu utratę słuchu klasyfikuje się na: przewodzeniową, czuciowo-nerwową oraz tzw. postać mieszaną (Nadol 1993). 2. PODŁOŻE UTRATY SŁUCHU Etiopatogeneza utraty słuchu jest złożona i stanowi kombinację czynników genetycznych i środowiskowych. Do najczęstszych czynników środowiskowych odpowiedzialnych za uszkodzenie narządu słuchu należą: infekcje okołoporodowe, urazy ucha wewnętrznego i mózgu, leki ototoksyczne (Nadol 1993) (Tab. 2). By usystematyzować rozważania nad etiologią niedosłuchu należy rozpatrywać ją oddzielnie dla form prei postlingwalnych. Większość prelingwalnych form niedosłuchu ma charakter wrodzony, część rozpoznawana jest jednak później, we wczesnym dzieciństwie przed rozpoczęciem nauki mowy. Według badań epidemiologicznych przeprowadzonych wśród uczniów szkół podstawowych w Stanach Zjednoczonych udział czynników genetycznych w patogenezie prelingwalnej utraty słuchu szacowany jest na 60%. Wartość ta systematycznie wzrasta w krajach rozwiniętych co związane jest z polepszeniem opieki zdrowotnej i obniżeniem udziału chorób infekcyjnych powikłanych głuchotą (Morton, 1991; Marazita i wsp., 1993). Cechą wyróżniającą niedosłuch prelingwalny jest ciężkie bądź głębokie upośledzenie słuchu, a także brak progresji utraty słuchu w miarę upływu czasu (Denoyelle i wsp., 1998). stosowanie obu terminów. 6

7 Niedosłuch postlingwalny ma odmienną etiologię i większe zróżnicowanie przebiegu klinicznego. O ile rola czynników genetycznych w patogenezie formy prelingwalnej Tabela 2 ETIOLOGIA UTRATY SŁUCHU ETIOLOGIA UTRATY SŁUCHUTyp utraty słuchu Mechanizm Przyczyny Przewodzeniowy Czuciowonerwowy Mieszany zakłócenia przekazania dźwięku z zewnętrznego kanału słuchowego do ucha wewnętrznego utrata wtórna w stosunku do uszkodzenia ucha wewnętrznego lub nerwu słuchowego mechanizmy prowadzące do czuciowo-nerwowej i przewodzeniowej utraty słuchu -nieprawidłowości w budowie zewnętrznego kanału słuchowego i kosteczek słuchowych -zaburzenia drożności trąbki słuchowej -zapalenia ucha środkowego -ciała obce -otoskleroza -genetyczne -wirusowe infekcje wrodzone -zamartwica okołoporodowa -wcześniactwo -żółtaczka jąder podstawy mózgu -infekcje postnatalne (świnka, zapalenie opon mózgowordzeniowych) -urazy -leki ototoksyczne -czynniki środowiskowe (np. hałas) j.w. jest znaczna o tyle w odniesieniu do różnych form niedosłuchu ujawniające się w wieku dorosłym przeważa pogląd o decydującym znaczeniu czynników środowiskowych. Utrata słuchu może mieć różnorodny przebieg: od w miarę częstej postaci łagodnej do głuchoty włącznie. U wielu chorych obserwuje się pogarszanie słuchu w miarę upływu czasu, a także wybiórcze upośledzenie percepcji określonych 7

8 częstotliwości. Niedosłuch postlingwalny dotyczy znacznej części populacji. Według szacunkowych danych występuje u 10% osób w wieku 60 lat i 50% osób po 80 r.ż. Nie ma on jednak tak dramatycznych konsekwecji jak głęboki niedosłuch 8

9 UTRATA SŁUCHU 1,2-2,3 na 1000 urodzeń Ryc.2 Genetyka głuchoty ZESPOŁY DYSMORFICZNE 30% przypadków wrodzonej utrat słuchu POSTAĆ IZOLOWANA 70% przypadków wrodzonej utraty słuchu Dziedziczenie mitochondrialne <1% wśród przypadków izolowanej utraty słuchu Dziedziczenie sprzężone z płcią Dziedziczenie autosomalne dominujące Dziedziczenie autosomalne recesywne 27 loci (DFNB) 5% wśród przypadków izolowanej utraty słuchu (6 loci DFN) 20% wśród przypadków izolowanej utraty słuchu (29 loci DFNA) 75% wśród przypadków izolowanej utraty słuchu (28 loci DFNB) 50% wszystkich mutacji w loci DFNB DFNB1 (gen GJB2) 50% wszystkich mutacji w loci DFNB różne mutacje 10% wszystkich mutacji w genie GJB2 mutacja 35delG 90% wszystkich mutacji w genie GJB2 2% bezobjawowych nosicieli w populacji ogólnej Ryc.1 Genetyka utraty słuchu. prelingwalny (Gorlin i wsp.; 1995; Petit 1996; Davis 1989; Willems 2000). 3. GENETYKA NIEDOSŁUCHU Niedosłuch może być spowodowany mutacją w jednym genie (postać monogenowa) lub też wynikać z kombinacji mutacji 9

10 różnych genów i czynników środowiskowych (postać wieloczynnikowa). Genetycy podzielili postaci monogenowe niedosłuchu na dwie grupy: niedosłuch związany z zespołami dysmorficznymi, w którym utrata bądź ograniczenie słuchu jest jednym z elementów składających się na obraz zespołu wad i/lub cech dysmorficznych oraz na niedosłuch samoistny (izolowany) w którym utracie słuchu nie towarzyszą dodatkowe wady. Wśród różnych form niedosłuchu uwarunkowanego genetycznie dominują postaci samoistne stanowiące około 70% wszystkich dziedzicznych form głuchoty (Gorlin i wsp., 1995; Kalatzis i Petit, 1998). W ostatnich latach lawinowo powiększa się lista zidentyfikowanych loci i genów odpowiedzialnych za izolowane postaci niedosłuchu. Do chwili obecnej zidentyfikowano około 100 loci segregujących łącznie z różnymi postaciami niedosłuchu (Morton 1991; Willems 2000). Historycznie, pierwsze doniesienia były poświęcone niemal wyłącznie zespołom chorobowym ze współistniejącą głuchotą gdyż te ostanie dzięki wyrazistemu fenotypowi mogły być klasyfikowane w jednorodne grupy, w których analiza sprzężeń i klonowanie pozycyjne było wykonalne. Z drugiej strony wieloletnie opóźnienie badań nad izolowanymi postaciami głuchoty powodowane było trudnościami analizy sprzężeń dokonywanej dla pojedynczych rodzin obciążonych tą samą postacią choroby. 3.1 UTRATA SŁUCHU ZWIĄZANA Z ZESPOŁAMI WAD Obecnie przyjmuje się, że około 30% przypadków głuchoty dziedzicznej, stanowią chorzy, u których niedosłuch jest tylko jednym zespołem wad lub cech dysmorficznych. Do chwili obecnej opisano ponad czterysta różnych zespołów, a w wielu przypadkach scharakteryzowano podłoże molekularne choroby. Obraz audiologiczny stwierdzany u chorych jest bardzo różnorodny. Utrata słuchu ma najczęściej charakter przewodzeniowy bądź mieszany. Stopień upośledzenia słyszenia bywa również zróżnicowany, 10

11 począwszy od lekkiego upośledzenia słuchu aż po przypadki głuchoty. Niedobór słuchu ujawnia się zazwyczaj w okresie prelingwalnym, a jego przebieg może mieć charakter postępujący lub stacjonarny. Utracie słuchu towarzyszą nieprawidłowości ze strony innych układów i narządów np. zaburzenia widzenia, wady twarzoczaszki, zmiany skórne, cechy dysplazji szkieletowych, zaburzenia metaboliczne lub neurologiczne oraz różnego stopnia niesprawność intelektualna (Gorlin i wsp., 1995; Petit 1996). Zespoły wad z niedosłuchem dziedziczą się (zmiany w genomie jadrowym) w sposób autosomalny recesywny lub dominujący względnie sprzężony z chromosomem X. Podłoże molekularne najczęstszych zespołów zostało poznane. W wielu z nich znane są geny, spektrum mutacji odpowiedzialnych za chorobę, a także molekularne mechanizmy komórkowe prowadzące do powstania niedosłuchu. Geny odpowiedzialne za tego typu niedosłuch kodują białka pełniące różnorodne funkcje: enzymy, czynniki transkrypcyjne, składniki cytoszkieletu, składniki macierzy zewnątrzkomórkowej i inne (Willems 2000). Osobną grupę patogenetyczną stanowią tzw. choroby mitochondrialne np.: MERRF (ang. myoclonic epilepsy and ragged-red fibers), MELAS (ang. mitochondrial encefalopathy with lactic acidosis and stroke like episodes) czy zespół Kearnsa-Sayre. U chorych stwierdza się objawy kliniczne ze strony wielu tkanek i narządów np: neuropatie, myopatie, kardiomyopatie, retinopatie oraz cukrzycę, którym towarzyszy postępująca utrata słuchu. U podłoża tych schorzeń leżą mutacje mitochondrialnego DNA (mtdna). Genom mitochondrialny koduje 13 białek, 22 typy trna oraz 2 typy rrna. Mutacje w obrębie tych genów upośledzają podstawowe zadania mitochondriów: produkcję energii i kontrolę apoptozy. Ich efekty są najwcześniej widoczne w tkankach o wysokim zapotrzebowaniu energetycznym. Mutacje mtdna odpowiedzialne są również za 1% izolowanych postaci 11

12 głuchoty (Fischel-Ghodsian 1995, 1999; Estivill i wsp., 1998b; Prezant i wsp., 1993). 3.2 SAMOISTNE POSTACI NIEDOSŁUCHU Samoistne postaci niedosłuchu charakteryzują się występowaniem uszkodzenia słuchu bez towarzyszących im zaburzeń ze stron innych układów i narządów. Jest to grupa niejednorodna a różnice dotyczą podłoża molekularnego, sposobu dziedziczenia, objawów i przebiegu klinicznego. Do chwili obecnej zidentyfikowano 63 loci sprzężonych z utratą słuchu, które dla izolowanych postaci określane są skrótem - DFN (ang. deafness). W tej grupie 29 stanowią loci dla postaci dziedziczących się w sposób autosomalny dominujący (DFNA), 28 - autosomalny recesywny (DFNB), a 6 jest zlokalizowanych na chromosomie X (DFN) (Hereditary Hearing Loss Homepage, dane z ). W przypadku genetycznie uwarunkowanego niedosłuchu prelingwalnego, formy DFNB są najczęstsze i spotykane u około 75% badanych powodując u nich głęboki niedosłuch typu odbiorczego wywołany nieodwracalnym uszkodzeniem funkcji ślimaka. Z kolei częstość występowania DFNA jest oceniana na około 20%, a DFN - 5% (Ryc. 1) (Petit 1996; Kalatzis i Petit, 1998). Utrata słuchu o początku w okresie postlingwalnym jest o wiele częstsza niż postać prelingwalna i ma zazwyczaj podłoże wielogenowe. Postaci jednogenowe tej odmiany niedosłuchu najczęściej dziedziczą się w sposób autosomalny dominujący. Niedosłuch postlingwalny może mieć charakter postępujący, przewodzeniowy, odbiorczy lub mieszany zazwyczaj o lżejszym przebiegu niż DFNB. Przykładem może być otoskleroza - najczęstsza przyczyna genetycznie uwarunkowanego, przewodzeniowego uszkodzenia słuchu (0,2 1% populacji). Choroba ta dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący, ma niepełną penetrację i ujawnia się u młodzych dorosłych. W jej przebiegu dochodzi do ogniskowej przebudowy i kostnienia głównie w niszy okienka 12

13 owalnego (postać strzemiączkowa), co prowadzi do unieruchomienia strzemiączka i w konsekwencji całego łańcucha kosteczek słuchowych. Utrata słuchu w otosklerozie może mieć początkowo charakter przewodzeniowy, potem odbiorczy kiedy to zaburzenia kostnienia obejmą swym zasięgiem ślimak. Otoskleroza jest chorobą o złożonym i nie do końca wyjaśnionym podłożu genetycznym. Do tej pory udało się zmapować na chromosomie 15q25-q26 pierwszy locus, ze spodziewanych kilku loci (Nadol 1993; Tomek i wsp., 1998; Skarżyński 1998). 4. GŁUCHOTA DFNB1 Spośród wszystkich genów uwikłanych w patogenezę niedosłuchu, jeden GJB2, odpowiedzialny za DFNB1, jest szczególny z uwagi na wysoką częstość jego mutacji stwierdzanych wśród osób głuchych. Badania molekularne wykazały obecność mutacji w obu allelach genu GJB2 u około 50% wszystkich przypadków recesywnej postaci głuchoty samoistnej w populacji kaukaskiej. Jest ona jedną z najczęstszych chorób uwarunkowanych genetycznie o autosomalnie recesywnym sposobie dziedziczenia. W niektórych populacjach np. krajach basenu Morza Śródziemnego jej częstość występowania jest podobna do częstości mutacji odpowiedzialnych za wystąpienie najczęstszej choroby o tym sposobie dziedziczenia w populacji kaukaskiej mukowiscydozy (Zelante i wsp., 1997; Denoyelle i wsp., 1997; Estivill i wsp., 1998a; Carasquillo i wsp., 1997). Utrata słuchu powodowana defektem genu GJB2 jest samoistna, nerwowo-czuciowa i obustronna. Głuchota ma charakter prelingwalny, jednak rozpoznanie choroby bywa nierzadko opóźnione. Wśród chorych z niedosłuchem postlingwalnym, zarówno rodzinnym jak i sporadycznym nie znaleziono mutacji w genie GJB2. Stopień upośledzenia słuchu jest zróżnicowany od lekkiego do głębokiego, choć w większości przypadków dominuje utrata słuchu głębokiego 13

14 stopnia (około 60%). Badania Denoyelle i wsp. (1999) przeprowadzone wśród dzieci z niedosłuchem prelingwalnym wykazały, że mutacje genu GJB2 występują odpowiednio u 55% dzieci z głębokim niedosłuchem, 48% - ciężkim, a 42% umiarkowanym. Te same badania wykazały, że upośledzenie słuchu w około 70% przypadków nie ulega zmianie w miarę upływu czasu. U części pacjentów obserwuje się jednak stopniową progresję, zwykle łagodną (5-10 db) aż do wieku osiągnięcia dojrzałości (Tab. 3). Badania audiometryczne pacjentów z DFNB1 są niecharakterystyczne choć wśród badanych najczęściej obserwuje się płaską krzywą audiometryczną dla obu uszu. Pacjenci mają upośledzony odbiór wszystkich częstotliwości bądź wybiórczo wysokich (nie występuje wybiórcze osłabienie odbioru niskich i średnich częstotliwości). W przypadku głuchoty tego typu stwierdza się zróżnicowanie stopnia niedosłuchu w obrębie rodzin np. między rodzeństwem o identycznym genotypie w locus DFNB1. W cytowanej wcześniej pracy Dennoyelle i wsp. (1999), u połowy rodzin stopień uszkodzenia słuchu u krewnych o identycznym genotypie dla GJB2 był różny. Badania obrazowe techniką tomografii komputerowej oraz próby błędnikowe nie wykazują odchyleń od normy (Denoyelle i wsp., 1999; Estivill i wsp., 1998a; Marlin i wsp., 1998; Cohn i wsp., 1999a; Cohn i Kelley, 1999b; Murgia i wsp., 1999). W chorobach o autosomalnie recesywnym sposobie dziedziczenia, nosiciele defektywnych alleli nie wykazują cech choroby. W przypadku nosicieli mutacji w locus DFNB1, niektórzy autorzy postulują obecność zmian subklinicznych np. w wyniku badania otoemisji akustycznej (Morell i wsp., 1998) GEN GJB2 Badania prowadzone w kilku niezależnych zespołach doprowadziły w 1997 roku do identyfikacji genu 14

15 zlokalizowanego w locus DFNB1, który jak się okazało koduje białko połączenia szczelinowego - koneksynę 26 (GJB2 lub Cx 26). Locus DFNB1 znajduje się na chromosomie 13q12 i po raz pierwszy został opisany w 1994 na podstawie analizy sprzężeń przeprowadzonych w dwóch rodzinach tunezyjskich (Guilford, 1994). Późniejsze prace sprecyzowały położenie DFNB1 względem markerów genetycznych i zawęziły badany region do 14 cm (Gasparini i wsp., 1997). Tabela 3 CECHY KLINICZNE GLUCHOTY TYPU DFNB1 Cechy kliniczne głuchoty DFNB1 - początek w okresie prelingwalnym - upośledzenie słuchu: zazwyczaj głębokie - podobny stopień utraty słuchu w obu uszach - upośledzenie odbioru zazwyczaj wszystkich częstotliwości - zróżnicowany w obrębie rodziny stopień upośledzenia słuchu - zazwyczaj niepostępujący charakter upośledzenia słuchu - brak zmian patologicznych ucha wewnętrznego w badaniach radiologicznych - prawidłowe testy przedsionkowe Gen GJB2 został sklonowany przez dwa niezależne zespoły badawcze. Pierwszy zastosował strategię genu kandydata badając chorych z głuchotą oraz rogowcem dłoni i stóp pod kątem mutacji w GJB2 i zidentyfikował mutacje w GJB2 (Kelsell i wsp., 1997). Drugi zespół kontynuował klonowanie pozycyjne analizując rodziny DFNB1 co zaowocowało zawężeniem badanego region do odcinka 5cM. Badania te doprowadziły do powiązania locus DFNB1 z genem GJB2, a także umożliwiły identyfikację najczęstszych uszkodzeń tego genu (Zelante i wsp., 1997). Gen GJB2 złożony jest z dwóch eksonów, z których pierwszy pełni jedynie funkcje w regulacji ekspresji genu podczas gdy drugi niesie pełną sekwencje białka. Produktem ekspresji genu jest transkrypt o długości ok pz odnajdywany w wielu tkankach organizmu. Białko składa się z 227 aminokwasów i ma 4 domeny przezbłonowe (Willecke i wsp., 1990). 15

16 Kodowana w genie GJB2 koneksyna 26 należy do dużej rodziny białek odpowiedzialnych za tworzenie złącz synaptycznych typu gap junction. Obecnie znanych jest około 13 przedstawicieli tej rodziny białek. Koneksyny, ze względu na strukturę białka podzielono na dwie klasy: klasę α i β. Koneksyna 26 należy do klasy białek β (ang. gap junction protein β2 GJB2). Cechą wspólną wszystkich koneksyn jest uproszczona budowa genu, w którym cały region kodujący jest zawarty w jednym eksonie. Złącza typu gap junction mają charakter międzykomórkowego kanału koneksonu, złożonego z 2 półkanałów (koneksonów) zakotwiczonych odpowiednio w błonach komórkowych stykających się komórek. Każdy półkanał składa się z 6 podjednostek (koneksyn) ułożonych promieniście wokół centralnego poru (White i Paul., 1999). W skład pojedynczego koneksonu mogą wchodzić identyczne koneksyny tworząc koneksony homomeryczne lub różne - heteromeryczne. Teoretyczne daje to możliwość różnorodnych kombinacji zarówno w składzie jakościowym jak i rozkładzie przestrzennym podjednostek w obrębie koneksonu. Powoduje to, że takie złącza mają unikatowe właściwości w odniesieniu do przepuszczalności molekularnej. Istnienie heteromerycznych koneksonów zostało potwierdzone w badaniach in vivo (Jiang i wsp., 1996). Koneksyny są obecne w komórkach organizmów wielokomórkowych i tworzą ścisłe połączenia między komórkami. Dzięki nim możliwy jest przepływ jonów oraz metabolitów o małej masie cząsteczkowej (poniżej 1000 Da). Tego typu złącza uczestniczą również w przewodzeniu impulsów w tkankach pobudliwych. W tkankach niepobudliwych przepływ wtórnych przekaźników oraz jonów przyczynia się do koordynacji i ujednolicenia komórek tworzących narządy i układy (Bruzzone i wsp., 1985). Mutacje w obrębie genów koneksyn prowadzą do wielu chorób zarówno u ludzi (Tab. 4) jak i u zwierząt doświadczalnych. 16

17 Koneksony złożone z Cx 26 biorą udział w krążeniu jonów potasu. W ślimaku koneksyna 26 występuje w 2 typach komórek: komórkach rąbka blaszki spiralnej, bruzdy wewnętrznej i zewnętrznej, komórkach wspomagających, nabłonku czuciowym (I grupa) oraz komórkach rąbka blaszki spiralnej, więzadła spiralnego i prążka naczyniowego (II grupa) (Kikuchi i wsp., 1995). Patofizjologia utraty słuchu w DFNB1 nie jest do końca wyjaśniona. Brak ekspresji Cx 26 zaburza obieg potasu w układzie: synapsy komórki włoskowate komórki wspomagające endolimfa. Prowadzi to do miejscowego zatrucia narządu Cortiego przez potas co w konsekwencji skutkuje utratą słuchu (Johnstone i wsp., 1989; Oesterle i Dallos, 1990; Somjen, 1979). Koneksyna 26 ma zdolność tworzenia kompleksów z innymi białkami z tej rodziny. Jedna z hipotez tłumaczy zróżnicowanie kliniczne postaci DFNB1 przynajmniej częściową kompensacją utraconej funkcji genu GJB2 na skutek tworzenia heterotypowych kanałów np. z koneksynami 32, 46 czy 50 (White i Paul., 1999). Badania wykonane dla szeregu zmutowanych alleli genu GJB2 wykazały, że za przyczynę utraty funkcji białka Cx 26 odpowiadają: przyśpieszona proteoliza, upośledzony transport Cx 26 na błonę komórkową, zmiany struktury przestrzennej białka zaburzające transport czy niezdolność do asocjacji w heksamery. Badania funkcji Cx 26 wyjaśniły istnienie pewnych odstępstw od generalnego wzorca choroby obserwowanych dla niektórych alleli np. autosomalny dominujący wzór dziedziczenia M34T. Mutacja ta spotykana jest u około 3,2% osób z DFNB1 i zazwyczaj prowadzi do łagodnej bądź umiarkowanej utraty słuchu. W niektórych rodzinach przyjmuje jednak charakter dominujący, a utracie słuchu towarzyszy rogowiec stóp i dłoni (PPK) (Denoyelle i wsp., 1998; Kelsell i wsp., 2000). 17

18 Tabela 4 CHOROBY CZŁOWIEKA O ETIOLOGII KONEKSYNOWEJ (WHITE I PAUL., 1999) Koneksyna Funkcja Choroba Objawy -zespół demielinizacyjny Cx 32 umożliwiają transport odżywczy i jonów między cytoplazmą okołojądrową a okołoaksonalną w komórkach Schwanna choroba Charcot- Marie-Tooth (1:2500, X) związany z uszkodzeniem komórek Schwanna -postępująca degeneracja nerwów obwodowych -osłabienie mięśni dystalnych i postępująca atrofia -osłabienie czucia powierzchownego i głębokiego Cx 31 (GJB3) uszkodzenie słuchu erytrokerat odermia zmienna (EKV) -uszkodzenie słuchu różnego stopnia i o różnej penetracji lub erytrokeratoder-mia zmienna w zależności od mutacji Cx 31 Cx 30 (GJB6) Cx 50 łączą komórki soczewki w funkcjonalne syncytium, transport odżywczy, homeostaza jonowa uszkodzenie słuchu zaćma wrodzona -zaburzenia odbioru środkowych i wysokich tonów -zmętnienia soczewki Badania nad koneksyną 26 wykazały ponadto, że poziom tego białka jest obniżony w komórkach nowotworowych (złośliwe nowotwory pochodzenia epidermalnego) co powoduje, że część autorów zalicza koneksynę 26 do przedstawicieli II klasy genów supresji nowotworowej (White i Paul., 1999). 18

19 Tabela 6 MUTACJE W GENIE GJB2 Mutacja Kodon Typ zmiany Domena -3170G - defekt składania transkryptu - M1V 1 substytucja 31del zmiana ramki odczytu 31del zmiana ramki odczytu G12V 12 substytucja IC1 35delG zmiana ramki odczytu 35insG zmiana ramki odczytu 51del12insA zmiana ramki odczytu S19T 19 substytucja W24X 24 terminacja translacji TM1 M34T 34 substytucja V37I 37 substytucja W44C 44 substytucja W44X 44 terminacja translacji G45E 45 substytucja E47X 47 terminacja translacji 167delT 56 zmiana ramki odczytu Q57X 57 terminacja translacji EC1 G59A 59 substytucja del zmiana ramki odczytu Y65X 65 terminacja translacji D66H 66 substytucja R75W 75 substytucja W77R 77 substytucja W77X 77 terminacja translacji 235delC zmiana ramki odczytu V84L 84 substytucja TM2 L90P 90 substytucja 269insT 90 zmiana ramki odczytu V95M 95 substytucja R98Q 98 substytucja H100Y 100 substytucja delAT 100 zmiana ramki odczytu 313del zmiana ramki odczytu delAA 111- zmiana ramki odczytu IC2 S113R 113 substytucja delGAG 120 delecja 1 aminokwasu K122I 122 substytucja Q124X 124 terminacja translacji R127H 127 substytucja Y136X 136 terminacja translacji R143W 143 substytucja 509insA 170 zmiana ramki odczytu TM3 P175T 175 substytucja R184P 184 substytucja S199F 199 substytucja EC delGT 210 zmiana ramki odczytu IC3 IC1, 2, 3 - domeny wewnątrzkomórkowe; TM1, 2, 3, 4 - domeny przezbłonowe; EC1,2 - domeny zewnątrzkomórkowe 19

20 4.2 MUTACJE GENU GJB2 Badania populacyjne mające na celu określenie częstości występowania poszczególnych mutacji genu GJB2 zostały wykonane w wielu krajach (Denoyelle i wsp., 1997; Kelsell i wsp., 1997; Zelante i wsp., 1997; Estivill i wsp., 1998a; Scott i wsp., 1998; Morell i wsp., 1998; Kelley i wsp., 1998; Rabionet i wsp., 2000). Zidentyfikowano 47 różnych mutacji (Tab. 6) oraz określono ich spektrum dla poszczególnych grup etnicznych (Tab. 7). Większość mutacji jest zlokalizowana w regionie kodującym (ekson 2) genu GJB2. Wyjątek stanowi substytucja -3170G>A, wykryta u kilku chorych, a zlokalizowana w 5 końcu eksonu 1. Mutacja ta zaburza prawidłowe składanie transkryptu (Denoyelle i wsp., 1997; Green i wsp., 1999). Wśród pozostałych mutacji przeważają mutacje zmiany sensu. Wykryto również mutacje typu nonsens, delecje ze zmianą ramki odczytu i jedną delecję bez zmiany ramki. Zidentyfikowano również w populacji kontrolnej pięć zmian polimorficznych. Większość opisanych mutacji ma charakter unikatowy i została zidentyfikowana w jednej lub kilku rodzinach. Z drugiej strony istnieje kilka bardzo częstych mutacji, których występowanie zależy od pochodzenia etnicznego badanych. Najczęstszą mutacją występującą w populacji kaukaskiej jest delecja G w pozycji 35 (35delG). W Europie, mutacja ta jest obecna w 70-85% zmutowanych allelach genu GJB2 i stanowi około 40% wszystkich mutacji wykrywanych u chorych z genetycznie uwarunkowaną postacią głuchoty wrodzonej (Denoyelle i wsp., 1997; Estivill i wsp., 1998a). Najwyższa częstość mutacji 35delG wśród zmutowanych alleli GJB2 została znaleziona w populacji basenu Morza Śródziemnego (Zelante i wsp., 1997). W międzynarodowych badaniach epidemiologicznych wykazano, że częstość występowania mutacji 35delG w zdrowej populacji waha się w granicach od 3,3% na Sardynii do 0,5% w Wielkiej Brytanii. Średnia wartość dla populacji Europejskiej została oszacowana na 20