GENETYCZNE BADANIA NAD ROZPRZESTRZENIANIEM INWAZYJNEGO GATUNKU ŚLIMAKA ARION LUSITANICUS W POLSCE

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 GENETYCZNE BADANIA NAD ROZPRZESTRZENIANIEM INWAZYJNEGO GATUNKU ŚLIMAKA ARION LUSITANICUS W POLSCE TOMASZ KAŁUSKI 1, JAN KOZŁOWSKI 1, MARIANNA SOROKA 2 1 Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy Zakład Zoologii Władysława Węgorka 20, Poznań tomaszkaluski@gmail.com 2 Uniwersytet Szczeciński Katedra Genetyki Piastów 40B, Szczecin I. WSTĘP Arion lusitanicus Mabille, 1868 to obcy dla polskiej malakofauny, inwazyjny gatunek ślimaka. Jego naturalny zasięg obejmuje Portugalię oraz Hiszpanię skąd począwszy od lat 50. ubiegłego wieku rozpoczął inwazję do innych krajów Europy (Simroth 1891; Quick 1952, 1960; Van Regteren Altena 1971; Chevallier 1972). Pierwsze osobniki tego gatunku ślimaka zostały najprawdopodobniej przywleczone do Polski pod koniec lat 80. XX wieku do Albigowej w województwie podkarpackim (Kozłowski i Kornobis 1994, 1995). W kolejnych latach stwierdzano występowanie ślinika luzytańskiego na nowych stanowiskach (Kozłowski 2000; Kozłowski i Sionek 2000; Kozłowski 2001), jednakże począwszy od 2005 roku obserwuje się gwałtowne rozprzestrzenianie tego ślimaka w Polsce (rys. 1). Ślinik luzytański jest gatunkiem synantropijnym, masowo występującym w ogrodach, uprawach rolniczych, parkach oraz na cmentarzach. Prowadzone od kilku lat obserwacje terenowe wskazują na konieczność opracowania kompleksowego systemu wykrywania, monitorowania oraz oceny uszkodzeń roślin powodowanych przez ten gatunek ślimaka. Dotąd prowadzono niewiele badań molekularnych w obrębie rodzaju Arion. Obejmowały one badania nad liczbą chromosomów, polimorfizmem loci enzymatycznych oraz losowo amplifikowanego DNA (RAPD) (Backeljau i De Bruyn 1990; Davis 1994; Noble i Jones 1996; Backeljau i wsp. 1997; Voss i wsp. 1999). Badania genetyczne polskich populacji ślinika luzytańskiego mogą pomóc określić ich pochodzenie oraz drogi migracji. Informacje te niezbędne są w monitorowaniu inwazyjnych gatunków ślimaków oraz w badaniach filogeograficznych. Celem badań było określenie rozmieszczenia A. lusitanicus w Polsce, zbadanie wewnątrz- i międzypopulacyjnego zróżnicowania genetycznego oraz wyznaczenie prawdopodobnych dróg migracji tego gatunku ślimaka.

2 Genetyczne badania nad rozprzestrzenieniem 1279 II. MATERIAŁ I METODY W latach zebrano materiał pochodzący z 15 populacji A. lusitanicus zlokalizowanych w różnych regionach Polski (rys. 1). Z każdej populacji losowo pobrano 10 osobników, wszystkie zostały oznaczone w oparciu o cechy anatomiczne (Riedel i Wiktor 1974; Wiktor 2004). Ślimaki zakonserwowano w 70% alkoholu metylowym pobierając wcześniej fragment stopy z pięciu osobników z każdej populacji. Pobrane tkanki zamrożono w temperaturze 30 C. Rys. 1. Występowanie populacji A. lusitanicus w Polsce ( badane populacje) Fig. 1. Occurrence of populations of A. lusitanicus in Poland ( studied populations) Z tak przygotowanego materiału izolowano DNA przy użyciu zestawu DNEasy Tissue Kit (Qiagen, Niemcy). W celu uzyskania fragmentu mitochondrialnego genu podjednostki 1 oksydazy cytochromowej (cox1) przeprowadzono reakcję PCR przy użyciu uniwersalnych starterów LCO1490 i HCO2198 (Folmer i wsp. 1994). Szczegółowe warunki izolacji DNA oraz reakcji PCR przedstawiono w pracach Skujiene i Soroka (2003) oraz Soroka i Grygieńczo-Raźniewska (2005). Produkty amplifikacji genu były uwidaczniane w 1% żelu agarozowym po przeprowadzonej elektroforezie w świetle UV. Fragmenty genu cox1 uzyskane w reakcji PCR oczyszczono, a następnie zsekwencjonowano w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie ( oraz w Laboratorium Technik Biologii Molekularnej, Wydziału Biologii UAM w Poznaniu. Analizy porównawczej otrzymanych sekwencji oraz identyfikację miejsc polimorficznych wykonano przy użyciu programu DNAMAN (Lynnon BioSoft, Kanada).

3 1280 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W wyniku badań terenowych prowadzonych w latach potwierdzono występowanie populacji ślinika luzytańskiego w znanych wcześniej lokalizacjach oraz wyznaczono nowe nieznane dotąd lokalizacje populacji tego gatunku ślimaka (rys. 1). Obserwowane populacje A. lusitanicus zlokalizowane były w ogródkach przydomowych, w ogrodach, na polach uprawnych lub też w obrębie ogródków działkowych w obrębie miast. Zagęszczenie ślimaków w badanych populacjach wynosiło od kilku do 65 osobników na 1 m 2. Wykrycie dziesięciu nowych stanowisk A. lusitanicus w latach potwierdza hipotezę autorów pracy o szybkim rozprzestrzenianiu się tego gatunku ślimaka na terenie Polski. Jego zasięg nie ogranicza się już tylko do południowych regionów Polski, ale obejmuje lokalizacje na obszarze całego kraju. Zbliżone tempo rozprzestrzeniania się ślinika luzytańskiego obserwowano wcześniej w Austrii (Reischütz 1984), Wielkiej Brytanii (Davies 1987), Szwecji, Norwegii (Proschwitz 1992, 1994; Proschwitz i Winge 1994) i w Szwajcarii (Frank 1998). Nie można również wykluczyć, że ślimak ten występuje na innych stanowiskach w Polsce, ponieważ informacje o jego obecności docierają dopiero przy masowym jego wystąpieniu, a więc nawet w pięć lat po jego zawleczeniu. Dla 49 osobników A. lusitanicus uzyskano sekwencje mitochondrialnego genu cox1 o długości 674 par zasad. W oparciu o obserwowaną zmienność w 20 miejscach polimorficznych wyróżniono 9 genotypów, które zostały zgłoszone do GenBank-u (tab. 1). Tabela 1. Genetyczne zróżnicowanie pomiędzy 9 haplotypami A. lusitanicus z obszaru Polski, ich numery akcesyjne i częstości w gatunku Table 1. Genetic diversity between 9 haplotypes of A. lusitanicus using observed divergence, their accession number and frequencies in species Numer akcesyjny Accession number Częstotliwość w gatunku Frequencies in species EF ,306 G1 0 EF ,183 G2 0,021 0 EF ,102 G3 0,018 0,003 0 EF ,041 G4 0,009 0,018 0,015 0 EU ,082 G5 0,008 0,017 0,014 0,002 0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G10 EU ,041 G6 0,009 0,018 0,015 0,003 0,002 0 EU ,102 G7 0,009 0,018 0,015 0,003 0,002 0,003 0 EU ,102 G8 0,011 0,020 0,017 0,005 0,003 0,005 0,005 0 GQ ,041 G10 0,009 0,019 0,016 0,003 0,002 0,003 0,003 0,005 0 Zróżnicowanie genetyczne pomiędzy poszczególnymi haplotypami wahało się w granicach od 0,2 do 2,1% (tab. 1). Najmniejsze zróżnicowanie obserwowano pomiędzy ha-

4 Genetyczne badania nad rozprzestrzenieniem 1281 plotypami G5 i G4, G5 i G6 oraz G5 i G7, natomiast największe pomiędzy haplotypami G1 i G2 oraz G2 i G8 (tab. 1). Najczęściej występującym haplotypem w obrębie całego gatunku był haplotyp G1 (30,6% wszystkich osobników), natomiast haplotypami o najmniejszej frekwencji w obrębie gatunku były G4, G6 oraz G10 (po 4,1%). Spośród badanych populacji pięć to populacje monomorficzne: Poznachowice, Zawadka, Bielsko-Biała, Gronowo Górne oraz Podkowa Leśna, natomiast kolejne pięć są polimorficzne: Łańcut, Małujowice, Rzeszów, Leszno i Ochla. Wszystkie populacje polimorficzne, za wyjątkiem Ochli, charakteryzowały się występowaniem dwóch haplotypów, z których jeden był znacznie częstszy (0,6 0,8) niż drugi (0,2 0,4) (tab. 2). W populacji z Ochli obserwowano trzy haplotypy, z których jeden występował dwukrotnie częściej (0,5) niż dwa pozostałe (0,25) (tab. 2). Tabela 2. Genotypy i ich częstość w badanych populacjach A. lusitanicus w Polsce Table 2. Genotypes and their frequency in the studied populations of A. lusitanicus in Poland Populacja Population N Liczba genotypów Number of genotypes Genotypy i ich częstośći Genotypes and their frequencies G3 0,8 Łańcut 5 2 G1 0,2 Poznachowice 5 1 G2 1,0 Małujowice 5 2 G2 0,8 G4 0,2 Rzeszów, Słocina 5 2 G1 0,8 G3 0,2 Zawadka 5 1 G1 1,0 Bielsko-Biała 5 1 G1 1,0 Leszno 5 2 G5 0,6 G6 0,4 Gronowo Górne 5 1 G7 1,0 Podkowa Leśna 5 1 G8 1,0 Ochla 4 3 Razem Total 49 1,6/populacje 1.6/population G10 0,5 G4 0,25 G5 0,25 9 Wszystkie zbadane populacje ślinika luzytańskiego można podzielić na trzy grupy: południową, centralną oraz północną. Do grupy południowej należą między innymi pierwsze stanowiska A. lusitanicus obserwowane w Polsce na początku lat 90. XX wieku (stanowiska: Łańcut, Rzeszów,

5 1282 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 Bielsko-Biała i Zawadka). We wszystkich wymienionych południowych populacjach dominuje genotyp G1 za wyjątkiem populacji Łańcut, gdzie częstszy jest genotyp G3 niż G1 (rys. 1, tab. 2). Można więc uznać genotyp G1 jako ten, który pierwszy został zawleczony do Polski pod koniec lat 80. XX wieku. Potwierdza to również analiza częstości tego genotypu w całej polskiej populacji badanego gatunku ślimaka, występuje on bowiem u 30,6% wszystkich osobników. Kolejne populacje również zlokalizowane na południu kraju to populacje Małujowice i Poznachowice, gdzie dominującym genotypem jest genotyp G2, który genetycznie jest najbardziej zbliżony do genotypu G3 występującego również na południu w populacji Łańcut (rys. 1, tab. 2). Analiza podobieństwa genotypów wykazała, że genotyp G1 grupuje się osobno i jest bardziej podobny do genotypów G4, G5, G7, G8 i G10 niż do genotypów G2 i G3 (tab. 1, rys. 1). Może to wskazywać na kilkukrotne zawleczenie ślinika luzytańskiego w południowe rejony Polski. Rzadki genotyp G4 wystąpił dwukrotnie w populacjach Małujowice oraz Ochla. Zróżnicowanie współwystępujących genotypów jest niskie i wynosi 0,2 0,3% dla genotypów G10, G4 i G5 z populacji Ochla oraz wysokie (1,8%) dla genotypów G2 i G4 z populacji Małujowice (rys. 1, tab. 1). Wskazuje to, że osobniki stanowiące populacje Małujowice mogą pochodzić z różnych stanowisk. Do grupy centralnej i północnej należą 4 populacje: Ochla, Leszno, Podkowa Leśna i Gronowo Górne (rys. 1), w których genotypy osobników grupują się razem w analizie podobieństwa (rys. 2). Polimorficzna populacja Leszno o genotypach G5 i G6 wykazuje niewielkie zróżnicowanie genetyczne (0,2%). Wskazuje to na jednorodne osobniki założycielskie tej populacji. Przedstawiony powyżej podział stanowisk oraz zróżnicowanie genetyczne populacji A. lusitanicus znajduje odzwierciedlenie w czasie pojawiania się tego szkodnika w poszczególnych rejonach kraju oraz zwiększaniu zasięgu występowania ślinika luzytańskiego z południa na północ. Rys. 2. Genetyczne podobieństwo genotypów oraz populacji A. lusitanicus Fig. 2. Genetic similarity of genotypes and populations of A. lusitanicus

6 Genetyczne badania nad rozprzestrzenieniem 1283 Gatunek A. lusitanicus w szybkim tempie rozprzestrzenia się na terenie Polski od końca lat 80. ubiegłego wieku w wyniku naturalnej ekspansji i w sposób przypadkowy, najprawdopodobniej z materiałem roślinnym (sadzonki, produkty roślinne), ziemią, odpadami komunalnymi lub środkami transportu. Ślimak ten dobrze adaptuje się w nowych siedliskach, tworzy liczebnie duże populacje i wyrządza dotkliwe szkody w uprawach roślin ogrodniczych. Można przypuszczać, że ten inwazyjny gatunek ślimaka będzie w stanie opanować coraz większe obszary poddane antropopresji, co w znacznym stopniu zwiększy szkody wyrządzane w uprawach roślin. Stwarza to realne zagrożenie powstania dużych strat ekonomicznych oraz zakłóceń w rodzimych ekosystemach. Stwierdzone duże zróżnicowanie między- i wewnątrzpopulacyjne A. lusitanicus wskazuje, że pochodzenie występujących w Polsce populacji tego ślimaka jest niejednorodne i prawdopodobnie jest wynikiem wielokrotnych, niezależnych introdukcji tych ślimaków do Polski. Jednakowy genotyp występujący w czterech pierwszych populacjach na południu Polski sugeruje odmienne ich pochodzenie, najprawdopodobniej z południa Europy, w stosunku do populacji z pozostałych regionów Polski. IV. LITERATURA Backeljau T., De Bruyn L On the infrageneric systematics of the genus Arion Férussac, 1819 (Mollusca, Pulmonata). Bulletin de l Institut Royal Sciences Naturelles de Belgique 60: Backeljau T., De Bruyn L., De Wolf H., Jordaens K., Van Dongen S., Winnepenninckx B Allozyme diversity in slugs of the Carinarion complex (Mollusca, Pulmonata). Heredity 78: Chevallier H Arionidae (Mollusca, Pulmonata) des Alpes et du Jura français. Haliotis 2: Davies S.M Arion flagellus Collinge and A. lusitanicus Mabille in the British Isles: a morphological, biological and taxonomic investigation. J. Conch. 32: Davis G.M Molecular genetics and taxonomic discrimination. The Nautilus 2: Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebtates. Molecular Biology and Biotechnology 3 (5): Frank T Slug damage and numbers of the slug pests, Arion lusitanicus and Deroceras reticulatum, in oilseed rape grown beside sown wildflower strips. Agric., Ecosyst. Environ. 67: Kozłowski J Distribution and places of occurrence of the slug Arion lusitanicus Mabille (Gastropoda: Pulmonata: Arionidae). Bulletin of the Polish Academy of Sciences, Biological Sciences 48: Kozłowski J A new site of occurrence of Arion lusitanicus Mabille, 1868 (Gastropoda: Pulmonata: Arionidae). J. Plant Protection Res. 41: Kozłowski J., Kornobis S Arion sp. (Gastropoda: Arionidae) szkodnik zagrażający roślinom uprawnym w województwie rzeszowskim. Materiały 34. Sesji Nauk. Inst. Ochr. Roślin, cz. 2: Kozłowski J., Kornobis S Arion lusitanicus Mabille, 1868 (Gastropoda: Arionidae) w Polsce oraz nowe stanowisko Arion rufus (Linnaeus, 1758). Przegląd Zoologiczny 39: Kozłowski J., Sionek R Seasonal fluctuations of abundance and age structure of Arion lusitanicus Mabille, 1868 (Gastropoda: Pulmonata: Arionidae). Folia Malacologica 8:

7 1284 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, 49 (3) 2009 Noble L.R., Jones C.S A molecular and ecological investigation of the large arionid slugs of North-West Europe the potential for new pest species. s W: The Ecology of Agicultural Pests: Biochemical Approaches (W.O.C. Symondson, J.E. Linddell, red.). London, Chapman and Hall. Proschwitz T. von Spanska skogssnigeln Arion lusitanicus Mabille en artisnabb spridning med människan i sverige. Göteborgs Naturhistorika Museum, Ärstryck: Proschwitz T. von Oxychilus cellarius (Müller) and Oxychilus draparnaudi (Beck) as predators on egg-clutches of Arion lusitanicus Mabille. J. Conchology, Lond. 35: Proschwitz T. von, Winge K Iberiaskogsnegl en art pä spredning i Norge (Arion lusitanicus Mabille an anthropochorous slug spreading in Norway). Fauna 47: Quick H.E Rediscovery of Arion lusitanicus Mabille in Britain. Proc. Malacol. Soc. Lond. 29: Quick H.E British slugs (Pulmonata: Testacellidae, Arionidae, Limacidae). s W: Bulletin of the British, Museum of Natural History (Zoology). Ed. London. Reischütz P.L Zum massenhaften Auftreten von Arion lusitanicus Mabille in den Jahren 1982 und Mitteilungen der Zoologischen Gesellschaft Braunau 4: Riedel A., Wiktor A Arionacea ślimaki krążałkowate i ślinikowate (Gastropoda: Stylommatophora). Warszawa, Fauna Poloniae 2: Simroth H Die Nacktschnecken der portugiesisch azorischen Fauna. Nova Acta Verh. Kais. Leop. Carol. dtsch. Akad. Naturf. 56: Skujiene G., Soroka M A comparison of different DNA extraction methods for slugs (Mollusca: Pulmonata). Ekologija 1: Soroka, M., Grygieńczo-Raźniewska E Mitochondrial DNA-based diagnostic molecular markers for freshwater bivalves. Folia Malacologica 13: Van Regteren Altena C.O Neue Fundorte von Arion lusitanicus Mabille. Arch. Moll. 101: Voss M.C., Jenneckens I., Meyer J.N., Hoppe H.H Species differentiation of slugs (Mollusca, Pulmonata) by using DNA-fingerprinting techniques (SSR-a PCR; RAPD). J. Plant Dis. Protect. 106: Wiktor A Ślimaki Lądowe Polski. Wyd. Mantis, Olsztyn, 302 ss. TOMASZ KAŁUSKI, JAN KOZŁOWSKI, MARIANNA SOROKA GENETIC STUDIES OF THE DISTRIBUTION OF INVASIVE SLUG SPECIES ARION LUSITANICUS IN POLAND SUMMARY The studies were carried out in on different populations of alien invasive slug Arion lusitanicus. The mitochondrial cox1 gen was analyzed in 49 specimens from 10 different populations in Poland. The obtained results suggested that this slug species was introduced to Poland several times from different regions. The molecular analysis confirmed that the southern populations are the oldest populations in Poland. Key words: Arion lusitanicus, invasive, slug, distribution, cox