CHARAKTERYSTYKA MORFOMETRYCZNA I GENETYCZNA POLSKICH POPULACJI MELOIDOGYNE HAPLA ORAZ MELOIDOGYNE ARENARIA

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 8 (1) 2008 CHARAKTERYSTYKA MORFOMETRYCZNA I GENETYCZNA POLSKICH POPULACJI MELOIDOGYNE HAPLA ORAZ MELOIDOGYNE ARENARIA KATARZYNA NOWACZYK 1, RENATA DOBOSZ 2, MARTA BUDZISZEWSKA 1, STEFAN KORNOBIS 2, ALEKSANDRA OBRĘPALSKA-STĘPLOWSKA 1 Instytut Ochrony Roślin Państwowy Instytut Badawczy Władysława Węgorka 20, Poznań 1 Międzyzakładowa Pracownia Biologii Molekularnej K.Nowaczyk@ior.poznan.pl 2 Zakład Zoologii I. WSTĘP Nicienie z rodzaju Meloidogyne są pasożytami roślin o znaczeniu gospodarczym, w uprawie których mogą powodować olbrzymie straty. Do chwili obecnej na obszarze Europy stwierdzono obecność 15 gatunków guzaków (Karssen 1999; Karssen i wsp. 200). Występowanie 8 z nich stwierdzono na terenie Polski (Karssen i Brzeski 1998). M. arenaria, M. incognita oraz M. javanica znane są jako szkodniki upraw szklarniowych, przede wszystkim ogórka i pomidora. występuje powszechnie na obszarze Polski i jest szkodnikiem upraw roślin dwuliściennych (Brzeski i Bojda 197; Głąba 1990; Szczygieł 197). M. naasi jest w Polsce gatunkiem niezwykle rzadkim i brak informacji o jego ewentualnej szkodliwości. Natomiast M. ardenensis, M. duytsi oraz M. kralli nie mają żadnego znaczenia gospodarczego. Do tej pory prowadzono niewiele badań na temat zróżnicowania roślin żywicielskich czy różnorodności morfologicznej wśród polskich populacji (Brzeski i Baksik 1981; Kornobis 2003). Brak natomiast danych dotyczących zróżnicowania genetycznego. Celem badań była charakterystyka morfometryczna i genetyczna wybranych populacji oraz M. arenaria z terenu Polski. Badania te są podstawą do dalszych prac mających na celu opracowanie molekularnych metod identyfikacji polskich nicieni z rodzaju Meloidogyne. II. MATERIAŁ I METODY Populacje M. arenaria hodowano w wazonach w warunkach szklarniowych na tytoniu, natomiast populacje rozmnożono na selerze i pomidorze. Larwy inwazyjne wyizolowano z korzeni stosując zmodyfikowaną metodę Baermanna. Pomiary larw zamkniętych w preparatach tymczasowych wykonano w kontraście fazowym na mikroskopie Axioskop 2+. Dane liczbowe analizowano testem Tukeya na poziomie istotności 0.05.

2 Charakterystyka morfometryczna i genetyczna polskich populacji Meloidogyne hapla Do wstępnych analiz genetycznych wybrano 5 spośród 11 badanych morfometrycznie populacji, wyizolowanych z różnych gospodarzy roślinnych oraz pochodzących z różnych regionów Polski (tab. 2.) w celu zwiększenia prawdopodobieństwa wykazania zróżnicowania między populacjami. Na podstawie dostępnych w bazie danych sekwencji nukleotydowych rybosomalnego DNA (rdna), holenderskiej (AY593898) i amerykańskich (AY335816, AY 52815) populacji zaprojektowano startery specyficzne dla wymienionych sekwencji. Tabela 1. Zróżnicowanie morfometryczne polskich populacji Table 1. Morphometric diversity of Polish populations of Nr No. Gospodarz The host plant 1 pomidor tomato 2 marchew pozyskano z gleby obtained from soil 10 marchew marchew 26 pasternak parsnip 35 ziemniak potato 5 burak cukrowy sugar beet 8 marchew 9 marchew dł. ciała body length Pomiary Measurements (n = 10) (min-max) dł. ogona tail length h a b c dł. sztyletu stylet legth 8 ± ± 8 16 ± 3 3 ± 2,5 ± 0,2 8, ± 0,8 10,5 ± 0,5 Piotrywki 6 ± ± 13 ± 3 33 ± 2 2,8 ± 0,2 8,6 ± 0, 10,7 ± 0,6 Środa 3 ± ± 3 12 ± 2 33 ± ± 0.2 8,5 ± 0, 10,6 ± 0, Pochodzenie populacji Source of the population Jawiszowice Smarchowice 15 ± 15 7 ± 3 13 ± 2 36 ± 2 2,8 ± 0,2 8,8 ± 0,3 10,6 ± 0,3 Poznań 02 ± 12 8 ± 6 13 ± 2 31 ± 3 2,5 ± 0,2 8,2 ± 0,6 10,7 ± 0,5 Żyrawie 389 ± ± 5 12 ± 2 29 ± 1 2,6 ± 0.2 7,7 ± 0, 10,5 ± 0,5 Nowy Tomyśl chryzantema chrysanthemum Wymysływ 383 ± 10 8 ± 5 12 ± 3 28 ± 3 2,5 ± 0,2 8,5 ± 0,3 10., ± 0,5 366 ± 20 5 ± 5 11 ± 30 ± 3 2,3 ± 0,2 8,0 ± 0, 10,2 ± 0,2 Mielec 363 ± 1 7 ± 5 11 ± 2 29 ± 2 2,2 ± 0.1 7,8 ± 0,68 11,1 ± 0, Leszno 360 ± 13 5 ± 3 11 ± 2 29 ± ± 0.2 7,2 ± 0,2 10,3 ± 0,3 Żnin 359 ± 15 9 ± 5 10 ± 8 29 ± ± 0.2 7, ± 0,2 10, ± 0,3 Pogrubioną czcionką zaznaczono numery, źródło i miejsce pochodzenia populacji, dla których analizowano sekwencje DNA Numbers, source and origin of populations whose DNA sequences were analysed are in bold

3 128 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 8 (1) 2008 Tabela 2. Porównanie podobieństwa fragmentów sekwencji rdna populacji M. arenaria i między sobą oraz z danymi z bazy Table 2. Comparison of rdna fragments of populations of M. arenaria and with each other and with data derived from database M. arenaria M. arenaria M. arenaria % 96% 9% 9% 93% 96% M. arenaria 96% 9% 9% 93% 96% % 9% 92% 100% 100% 97% 9% 97% 9% 92% Całkowity DNA izolowano z cyst nicieni po całonocnym trawieniu proteinazą K, przy użyciu zestawu DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Fragmenty sekwencji rdna amplifikowano metodą PCR, izolowano i oczyszczano z żelu, a otrzymane fragmenty klonowano do wektora pgem T-Easy i transformowano bakterie E. coli. Plazmidowe DNA pozytywnie zweryfikowanych klonów izolowano i używano do sekwencjonowania w Wydziałowej Pracowni Technik Biologii Molekularnej Wydziału Biologii UAM. Otrzymane sekwencje składano i edytowano w programie GeneDoc. Sekwencje porównywano z dostępnymi w bazie danych sekwencjami rdna i M. arenaria. III. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Porównanie wyników analizy morfometrycznej pomiędzy badanymi populacjami wykazała istotne zróżnicowanie długości ciała larw inwazyjnych J 2. Odnośnie innych cech tj. długość ogona, długość części hyalinowej, długości sztyletu oraz parametrów a, b i c nie obserwowano podobnych różnic (tab. 1). Dla analizowanych populacji ustalono sekwencję fragmentów rdnao zróżnicowanej długości: 28 pz (5), 687 pz (26), 696 pz (35) i 708 pz () dla populacji (w nawiasach podano numery populacji) oraz fragmentu ok pz dla M. arenaria. Porównania między sekwencjami dokonano w programie blastn na podstawie najkrótszej dostępnej sekwencji. Zbiorcze wyniki analizy porównawczej przedstawiono w tabeli 2., a przyrównanie wielosekwencyjne na rysunku 1. Korelacja zaobserwowanej zmienności długości ciała larw inwazyjnych J 2 z rodzajem gospodarza wydaje się trudna do oszacowania. Zróżnicowanie między populacjami jest wyraźnie większe pod względem sekwencji DNA niż cech morfologicznych. Rodzaj gospodarza może więc mieć większy wpływ na cechy genetyczne niż morfologiczne danej populacji. Rozpoczęte badania populacyjne z zastosowaniem techniki RAPD

4 Charakterystyka morfometryczna i genetyczna polskich populacji Meloidogyne hapla Nazwy sekwencji pobranych z u zaznaczono kolorem szarym Names of sequences derived from were coloured grey Rys. 1. Przyrównanie wielosekwencyjne fragmentów rdna polskich populacji i M. arenaria oraz sekwencji dostępnych w u Fig. 1. Multisequence alignment of rdna fragments of Polish populations of and M. arenaria and sequences available in database potwierdzają duże zróżnicowanie wewnątrzgatunkowe (niepublikowane dane). Dla pełniejszej oceny zróżnicowania konieczne są dalsze doświadczenia z uwzględnieniem większej liczby populacji. Kolejne analizy będą prowadzone pod kątem badania zmienności morfologicznej nicieni pasożytujących na tym samym gospodarzu oraz wpływu położenia geograficznego i klimatu miejsca pochodzenia analizowanych populacji na cechy morfologiczne i genetyczne populacji. IV. WNIOSKI Stopień zróżnicowania pomiędzy polskimi populacjami nicieni z rodzaju Meloidogyne wyizolowanych z różnych gospodarzy jest wyższy na poziomie sekwencji rdna niż na poziomie morfologii. Może to świadczyć o wpływie rodzaju gospodarza na genom nicieni. Wstępne badania sekwencyjne wskazują na wysokie podobieństwo i M. arenaria, zidentyfikowano jednak fragmenty o zróżnicowaniu wystarczającym dla opracowania metod skutecznego różnicowania pomiędzy tymi dwoma gatunkami. V. LITERATURA Brzeski M.W., Baksik A Typy populacji Meloidogyne hapla w Polsce. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 29: Brzeski M.W., Bojda Z Mątwik północny (Meloidogyne hapla Chitw.) na marchwi szkodliwość i zwalczanie. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 15: Głąba B Występowanie guzaka północnego w uprawach ziemniaka, buraka i koniczny w województwie gdańskim. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 391: Karssen G The plant-parasitic nematode genus Meloidogyne Goldi, 1892 (Tylenchida) in Europe. PH.D. Thesis, Uniwersytet Gent.

5 130 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 8 (1) 2008 Karssen G., Brzeski M.W Meloidogyne Goldi, s W: Nematodes of Tylenchina in Poland and Temperate Europe (M.W. Brzeski, red.). Muzeum i Instytut Zoologii PAN, Warszawa. Karssen G., Block R.J., van Aelst A.C., van den Beld I., Kox L.F.F., Korthals G., Molendijk L., Zijstra C., van Hoof R., Cook R Description of Meloidogyne minor n. sp. (Nematoda: Meloidogynine), a root knot nematode associated with yellow patch disease in golf courses. Nematology 6 (1): Kornobis S Diversity of Meloidogyne hapla Chitwood, 199 population in Poland. Russ. J. Nematol. 12 (1): Szczygieł A Plant parasitic nematodes associated with strawberry in Poland. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 15: KATARZYNA NOWACZYK, RENATA DOBOSZ, MARTA BUDZISZEWSKA, STEFAN KORNOBIS, ALEKSANDRA OBRĘPALSKA-STĘPLOWSKA MORPHOMETRIC AND GENETIC CHARACTERISTIC OF POLISH POPULATIONS OF MELOIDOGYNE HAPLA AND MELOIDOGYNE ARENARIA SUMMARY Nematodes from the genus Meloidogyne are parasitic to many economically important crop plants and cause great losses in the crop production. M. arenaria is known as a pest of greenhouse plants. occurs commonly in Poland and feeds on dicotyledonous plants. The aim of our study was to characterize selected Polish populations of and M. arenaria morphometrically and genetically. Populations of M. arenaria were grown in glasshouse on tobacco; populations of were grown on celery and tomato in open field conditions. Total DNA was isolated from larvae and large fragments of rdna were amplified by PCR using specific primers. Obtained products were cloned and sequenced. Morphometric analysis of invasive larvae J 2 have shown some variability in body length. In the case of other features, such as tail length, hyalin part length, stylet length and parameters a, b and c no such variability was observed. Obtained sequences were compared with rdna fragments of other populations from both species, available in database. The preliminary results show a high similarity level between sequences of Polish populations and other populations analysed previously, in variable regions as well as in more conservative ones, like 28S rrna. Presented results are preliminary to further research, attempting to establish molecular identification methods for Polish populations of Meloidogyne. Key words: Meloidogyne hapla, Meloidogyne arenaria, population variability, rdna