moliwo wykorzystania w zapewnieniu bezpieczestwa i ochrony zdrowia konsumentów produktów ywnociowych pochodzenia zwierzcego. Przedstawiona do oceny

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Boena Obmiska-Mrukowicz Wrocław, Katedra Biochemii, Farmakologii i Toksykologii Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Marty Pitkowskiej pt. Pozostałoci leków weterynaryjnych, kokcydiostatyków i barwników w jajach aspekty analityczne i toksykologiczne. Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska stanowi cz bada zrealizowanych w ramach projektu finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki konkurs Sonata (2012/07/D/NZ7/03242) pt. Pozostałoci niedozwolonych barwników syntetycznych w jajach i wybranych produktach jajecznych. Ponadto, cz bada wykonana została w ramach projektów systemowych Stypendia naukowe dla doktorantów II oraz Stypendia naukowe dla doktorantów pracujcych w ramach zespołów badawczych, które były współfinansowane ze rodków Europejskiego Funduszu Społecznego, budetu pastwa i budetu województwa lubelskiego. Podjcie przez Doktorantk powyszych bada ma wysoce istotne znaczenie zarówno poznawcze, ale przede wszystkim aplikacyjne ze wzgldu na podjcie si opracowania i walidacji wieloskładnikowej metody pozwalajcej na równoczesne oznaczanie pozostałoci leków weterynaryjnych z grupy chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych, przeciwpasoytniczych, w tym kokcydiostatyków, a take barwników dodawanych do pasz kur niosek w celu uzyskania ółtka o intensywnej barwie w jajach. Ze wzgldu na konieczno oznaczania wielu analitów jednoczenie oraz zapewnienia czułoci i selektywnoci opracowywanej metody Doktorantka wykorzystała technik chromatografii cieczowej z tandemow spektrometri mas. Do bada wybrano substancje chemiczne, których obecno jest monitorowana standardowo w ramach krajowego programu bada kontrolnych pozostałoci chemicznych, biologicznych i leków w tkankach zwierzt i ywnoci pochodzenia zwierzcego. Dlatego te wybór przez Doktorantk tematu bada naley uzna za bardzo aktualny i o istotnym znaczeniu aplikacyjnym ze wzgldu na 1

2 moliwo wykorzystania w zapewnieniu bezpieczestwa i ochrony zdrowia konsumentów produktów ywnociowych pochodzenia zwierzcego. Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska obejmuje 144 strony maszynopisu, w których zawarte jest 19 zestawie tabelarycznych, 33 ryciny, 5 załczników, streszczenie w jzyku polskim i angielskim, wykaz skrótów wykorzystywanych w tekcie dysertacji, wykaz tabel oraz rycin oraz 186 pozycji pimiennictwa. Zarówno zestawienia tabelaryczne jak równie ryciny odpowiednio ponumerowane i opisane zostały umieszczone w kolejnych rozdziałach dysertacji co istotnie ułatwia czytelnikowi zrozumienie trudnych i wielowtkowych zagadnie przedstawionych w powyszej dysertacji. Na szczególn uwag zasługuje fakt, e wykorzystane przez Doktorantk przy pisaniu dysertacji pimiennictwo w liczbie 186 pozycji obejmuje 139 pozycji prac oryginalnych, 15 pozycji stanowi monografie lub podrczniki akademickie, 36 pozycji to stosowne dyrektywy oraz 1 pozycja to konsultacja ustna. Wykorzystanie przez Doktorantk w opracowaniu uzyskanych wyników licznych dokumentów prawnych wskazuje na aplikacyjne znaczenie i w konsekwencji moliwo wdroenia do przeprowadzanych w Polsce bada kontrolnych, opracowanych wieloskładnikowych metod oznaczania pozostałoci leków weterynaryjnych. Liczba, zakres i jako wykorzystanego przy pisaniu dysertacji pimiennictwa wiadczy o bardzo rzetelnym przygotowaniu Doktorantki do podjtego tematu badawczego. Naley równie podkreli 105 pozycji pimiennictwa obejmuje oryginalne prace dowiadczalne opublikowane w latach w czasopismach obcojzycznych wyrónionych w Journal Citation Reports co wiadczy o znaczeniu i aktualnoci wykonanych przez Doktorantk bada metodycznych. Przedstawiona dysertacja jest podzielona na standardowe rozdziały obejmujce wstp, cel bada, materiał i metody, przebieg i wyniki bada, dyskusj, wnioski, pimiennictwo i streszczenie w jzyku polskim i angielskim oraz 5 załczników. Załczniki stanowi dokumentacj potwierdzajc, e technika chromatografii cieczowej z tandemow spektrometri mas (LC-MS/MS) jest czuł i wiarygodn technik pozwalajc na równoczesne oznaczanie pozostałoci wielu substancji czynnych z grupy chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i przeciwpasoytniczych i barwników zakazanych w jajach oraz w produktach jajowych. Ponadto, analiza uzyskanych wyników bada przedstawionych w załcznikach jest niekwestionowanym dowodem wskazujcym szeroki, wielowtkowy zakres bada podjtych przez Doktorantk. Rozdziały dysertacji takie jak wstp, materiał i metody, przebieg i wyniki bada oraz dyskusja zawieraj odpowiednie podrozdziały posiadajce własne, logicznie sformułowane 2

3 podtytuły. Przed czci opisow pracy umieszczony został starannie przygotowany spis treci, wykaz skrótów oraz opis tabel i rycin z podan numeracj kadej pozycji oraz numerem strony pracy na której dana tabela lub rycina została umieszczona. Celem wykonanych przez Doktorantk bada było: 1. Opracowanie i walidacja wieloskładnikowej metody potwierdzajcej oznaczenia pozostałoci leków weterynaryjnych z grupy chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i przeciwpasoytniczych, w tym kokcydiostatyków w jajach wieych i wybranych, sproszkowanych produktach jajecznych z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej połczonej z tandemow spektrometri mas (LC- MS/MS), która spełnia midzynarodowe wymagania analityczne. 2. Zbadanie obecnoci pozostałoci leków weterynaryjnych z grupy chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i przeciwpasoytniczych w tym kokcydiostatyków oraz barwników zakazanych w próbkach archiwalnych pozyskanych z jaj przy uyciu opracowanej metody wieloskładnikowej dla jaj wieych technik LC-MS/MS. 3. Ocena naraenia konsumenta na obecno w jajach pozostałoci oznaczanych substancji czynnych (leków i barwników zakazanych). 4. Okrelenie zdolnoci dystrybucji do jaj oraz kinetyka zanikania barwnika Sudan I w jajach po stosowaniu u kur niosek paszy zawierajcej barwnik Sudan I we wzrastajcych steniach: 0,5 mg/kg paszy przez pierwsze 16 dni dowiadczenia, 5 mg/kg paszy przez kolejne 14 dni oraz 50 mg/kg przez kolejne 14 dni. Naley stwierdzi, e zakres bada podjtych przez Doktorantk jest bardzo szeroki przede wszystkim ze wzgldu na liczb oznaczanych substancji czynnych o zrónicowanej budowie chemicznej do których nale: 1.) chemioterapeutyki przeciwbakteryjne z grupy sulfonamidów (17 substancji), fluorochinolonów (11 substancji), diaminopyrymidyn (1 substancja); 2) antybiotyki przeciwbakteryjne: tetracykliny (6 zwizków), makrolidy (10 zwizków, w tym 1 z grupy pleuromutylin), penicyliny (8 zwizków), cefalosporyny (7 zwiazków), nitroimidazole (13 zwizków), linkozamidy (1 zwizek), amfenikole (2 zwizki) oraz aminoglikozydy (10 zwizków); 3) chemioterapeutyki przeciwpasoytnicze z grupy benzoimidazoli (21 zwizków, przy czym błdne jest zaklasyfikowanie lewamizolu do tej grupy, poniewa lewamizol naley do imidazotiazoli, które wywieraj działanie nicieniobójcze ale przez inny mechanizm działania ni benzoimidazole), insektycydów z grupy fosforoorganicznych lub karbaminianów (3 substancje czynne) oraz kokcydiostatyków (9 zwizków) oraz 4) barwników zakazanych (11 zwizków). 3

4 Do opracowania wieloskładnikowej metody oznaczenia pozostałoci w jajach wieych lub produktach jajecznych wymienionych powyej grup leków lub barwników zakazanych dodawanych do pasz Doktorantka wybrała technik chromatografii cieczowej połczonej z tandemow spektrometri mas (LC-MS/MS), która aktualnie ze wzgldu na czuło, precyzyjno i dokładno naley do uznanych i stosowanych w wiecie technik stosowanych w analizie ywnoci. Technika ta pozwala na oznaczanie wysoce niskich ste badanych substancji oraz co jest niezwykle korzystne umoliwia równoczesne oznaczenie pozostałoci substancji o zrónicowanej budowie chemicznej. To oznacza, e technika LC-MS/MS naley do technik z wyboru w analityce pozostałoci zarówno w procedurach potwierdzajcych jak równie przesiewowych. Wstp dysertacji został opracowany przez Doktorantk w sposób poprawny, a jego tre wiadczy o wiedzy Autorki i teoretycznym przygotowaniu do podjcia powyszego tematu badawczego. We wstpie Doktorantka przedstawiła w sposób zwizły charakterystyk uwzgldniajc budow chemiczn, właciwoci farmakodynamiczne, farmakokinetyczne oraz zastosowanie kliniczne u docelowych gatunków zwierzt chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych z grupy sulfonamidów, fluorochinolonów, nitroimidazoli oraz antybiotyków -laktamowych (penicylin i cefalosporyn), antybiotyków makrolidowych w tym pleuromutylin, amfenikoli, tetracyklin, a take grup leków przeciwpasoytniczych stosowanych u zwierzt do zwalczania i/lub prewencji przed inwazj pasoytów wewntrznych z grupy benzoimidazoli i kokcydiostatyków oraz do zwalczania pasoytów zewntrznych (karbaminiany i insektycy fosforoorganiczne). Jeden z podrozdziałów wstpu przedstawia wykaz i charakterystyk barwników dopuszczonych do stosowania u drobiu oraz barwników zakazanych. Wstp zawiera te istotne informacje dotyczce kryteriów oceny metod przesiewowych i potwierdzajcych stosowanych do oznaczania leków weterynaryjnych i dodatków paszowych w ywnoci pochodzenia zwierzcego, a take wymagania analityczne dla metod przesiewowych oraz zasady i kryteria walidacji metod słucych do oznaczania pozostałoci leków w ywnoci pochodzenia zwierzcego. W ostatnim podrozdziale wstpu Doktorantka przedstawiła przegld stosowanych w analizie pozostałoci substancji chemicznych metod wieloskładnikowych, które pozwalaj na jednoczesne oznaczenie pozostałoci wielu substancji rónicych si midzy sob struktur chemiczn. Pomimo, e zostały opracowane i s stosowane wieloskładnikowe metody pozwalajce na jednoczesne oznaczenie kilkudziesiciu leków weterynaryjnych i dodatków paszowych w rónych matrycach to niewiele tego typu metod zostało opracowanych dla matrycy jak s jaja. Powysze stanowiło wymierne uzasadnienie do podjcia bada nad 4

5 opracowaniem i walidacj wieloskładnikowej metody oznaczania pozostałoci leków weterynaryjnych z grupy chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i przeciwpasoytniczych, w tym kokcydiostatyków w jajach wieych i wybranych, sproszkowanych produktach jajecznych z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej połczonej z tandemow spektrometri mas (LC-MS/MS), która spełniałaby midzynarodowe wymagania analityczne. Opracowany przez Doktoranta rozdział Materiał i metody oraz Przebieg i wyniki bada budzi uznanie za zwizło, logiczno, oryginalno i nowatorstwo podjtego tematu, mudnego i trudnego pod wzgldem metodycznym do wykonania. W rozdziale Materiał i metody Doktorantka przedstawiła wykaz i pochodzenie prób stanowicych materiał biologiczny do bada, wykaz odczynników i substancji wzorcowych, zasady sporzdzania podstawowych i roboczych roztworów wzorcowych, wykaz aparatury pomiarowej wykorzystanej w badaniach oraz walidacj wieloskładnikowej metody według obowizujcych procedur obejmujcych: selektywno, liniowo sygnału, zakres roboczy, granic wykrywalnoci, granic oznaczalnoci, powtarzalno, odtwarzalno wewntrzlaboratoryjn, odzysk, limit decyzyjny, zdolno wykrywania, stabilno oraz odporno. Tak dobre przygotowanie metodyczne dało gwarancj, e uzyskane przez Doktorantk wyniki analiz s powtarzalne i w pełni wiarygodne co zostało potwierdzone przez zastosowanie wewntrznego sterowania jakoci przy uyciu karty kontrolnej wartoci redniej. Z kolei w rozdziale Przebieg i wyniki bada Doktorantka przedstawiła w sposób zwizły podstawy ustalenia wykazu analitów (leków przeciwbakteryjnych i przeciwpasoytniczych oraz barwników) oznaczanych w opracowywanej procedurze badawczej oraz zakres bada wykonanych w odpowiedniej kolejnoci polegajcych na doborze odpowiednich warunków detekcji analitów technik LC-MS/MS, warunków chromatograficznych HPLC-MS/MS, warunków izolacji analitów z matrycy stanowicej próbki wieych jaj oraz sproszkowanych produktów jajecznych oraz przeprowadzeniu walidacji opracowanych metod. Na podstawie uzyskanych wyników naley stwierdzi, e Doktorantka opracowała dwie wieloskładnikowe potwierdzajce metody oznaczania pozostałoci chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i przeciwpasoytniczych oraz obecnoci barwników zakazanych w dwóch matrycach (jajach oraz albuminie jaja kurzego) z wykorzystaniem techniki chromatografii cieczowej połczonej z tandemow spektrometri mas (LC-MS/MS). Opracowane metody pozwalaj na równoczesne oznaczenie, odpowiednio 120 i 85 analitów i spełniaj midzynarodowe wymagania analityczne. Wiarygodno opracowanej metody wieloskładnikowej dla wieych jaj została sprawdzona na archiwalnych próbkach pochodzcych z midzylaboratoryjnych 5

6 bada porównawczych przez potwierdzenie obecnoci wykrytych zwizków metodami urzdowymi słucymi do oznaczania pozostałoci chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i kokcydiostatyków w jajach kur. Drugi etap stanowiły badania in vivo wykonane na kurach nioskach skarmianych pasz zawierajc wzrastajce stenia barwnika Sudan I, która została przygotowana w warunkach laboratoryjnych. Badania in vivo polegały na okreleniu zawartoci badanego barwnika w ółtkach i białkach jaj pochodzcych od kur poddanych ekspozycji na barwnik Sudan I oraz okreleniu czasu zanikania barwnika w ółtkach jaj. Wykonanie dowiadcze na kurach zostało poprzedzone doborem odpowiednich warunków detekcji barwników technik LC- MS/MS, warunków chromatograficznych do oznaczania barwników, warunków izolacji barwników z ółtek jaj oraz przeprowadzeniem walidacji opracowanych metod. Badania wykonane na kurach nioskach zostały wykonane prawidłowo, chocia brakuje uzasadnienia dlaczego co dwa tygodnie zwikszano 10 krotnie stenie badanego barwnika. By moe ze wzgldu na czas ekspozycji kur niosek na barwnik Sudan I oraz wielko jego stenia w paszy proces dystrybucji barwnika w organizmie kur oraz jego eliminacja z organizmu nie została w sposób zadowalajcy wyjaniona. W dokumentacji bada brakuje informacji dotyczcej zgody Lokalnej Komisji Etycznej na przeprowadzenie bada na kurach nioskach. W rozdziale Dyskusja Doktorantka w sposób bardzo rzeczowy i rzetelny podejmuje w polemik z danymi naukowymi na zrealizowany temat badawczy, które zostały opublikowane przez innych autorów z innych orodków naukowych. Dobrze udokumentowane wyniki bada pozwoliły Doktorantce na postawienie 4 prawidłowo skonstruowanych wniosków, które stanowi zadowalajc odpowied na załoone cele badawcze. Pity punkt, nie moe by traktowany jako wniosek, poniewa nie dotyczy uzyskanych wyników bada, natomiast jest jedynie sugesti wskazujc na zasadno opracowania i wykonania bada okrelajcych szybko i stopie degradacji Sudanu I przez flor bakteryjn przewodu pokarmowego drobiu oraz oznaczenie jego pozostałoci w jajach i tkankach drobiu po ekspozycji na ten barwnik. Ponadto naley zwróci uwag na fakt, e maszynopis pracy został przygotowany w sposób staranny, a praca została napisana poprawnie pod wzgldem jzykowym. Reasumujc stwierdzam, e przedstawiona do oceny dysertacja doktorska mgr Marty Pitkowskiej zatytułowana Pozostałoci leków weterynaryjnych, kokcydiostatyków i barwników w jajach aspekty analityczne i toksykologiczne jest oryginalnym, 6

7