(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (72) (74)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) IntCl6: C 1 2 N 1 5 / 3 3 (54) Sposób wytwarzania zmodyfikowanego dużego powierzchniowego białka wirusa Hepatitis B (30) Pierwszeństwo: ,US,07/ (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 07/91 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/96 (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a., Genval /Rixensart/, BE (72) (74) Twórcy wynalazku: Martin Comberbach, La Hulpe, BE Nigel Harford, Overijse, BE Teresa Cabezon, Rhode-St-Genese, BE Apolonia Rutgers, Genval, BE Pierre Voet, Izel, BE Eric Jacobs, Dorlisheim, FR Cornelis P. Hollenberg, Dusseldorf, DE Zbigniew A. Janowicz, Erkrath, DE Armin J. Merckelbach, Dusseldorf, DE Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Spółka z o.o. PL B1 (57) 1. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego dużego powierzchniowego białka wirusa H epatitis B, zawierającego fragm enty aminokwasowej sekwencji białka L (podtyp ad lub ay) i obejm ującego reszty lub resztę 12 z następującymi po niej resztami 14-52, następujące po resztach i reszty , a po nich reszty białka L, znamienny tym, że w odpowiednim podłożu hoduje się kom órki gospodarza stransform ow ane zrekom binow anym wektorem zawierającym zrekom binow aną cząsteczkę DNA obejm ującą sekwencję D N A kodującą ekspresję zm odyfikowanego białka L określonego powyżej, połączoną funkcjonalnie z sekwencją regulacyjną i wydziela się wytworzone białko z lizatu kom órkow ego lub z ekstraktu hodowli.

2 Sposób wytwarzania zmodyfikowanego dużego powierzchniowego białka wirusa Hepatitis B Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego dużego powierzchniowego białka wirusa Hepatitis B, zawierającego fragmenty aminokwasowej sekwencji białka L (podtyp ad lub ay) i obejmującego reszty lub resztę 12 z następującym i po niej resztam i 14-52, następujące po resztach i reszty , a po nich reszty białka L, znamienny tym, że w odpowiednim podłożu hoduje się kom órki gospodarza stransform ow ane zrekom binow anym wektorem zawierającym zrekom binow aną cząsteczkę D N A obejm ującą sekwencję DN A kodującą ekspresję zmodyfikowanego białka L określonego powyżej, połączoną funkcjonalnie z sekwencją regulacyjną i wydziela się wytworzone białko z lizatu kom órkow ego lub z ekstraktu hodowli. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kom órka gospodarza w ybrana jest z grupy obejm ującej Saccharom yces, H ansenula, Pichia, C andida, Kluyverom yces i Schizosaccharom yces. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako kom órkę gospodarza stosuje się kom órkę drożdży S. cerevisiae lub H ansenula polym orpha. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się kom órki gospodarza stransform o- wane zrekom binow anym wektorem wybranym z grupy obejmującej prit12979, prit13192 i prit Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę kom órki gospodarza, która została dodatkow o stransform ow ana zrekom binow anym wektorem D N A zdolnym do ekspresji białka S oraz wydziela się z lizatu kom órkow ego lub ekstraktu hodowli cząstki białka o mieszanym składzie podjednostkow ym, obejm ujące określone w zastrz. 1 reszty am inokwasów i sekwencję am inokw asów białka S. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że cząstka o m ieszanym składzie podjednostkowym określona jest wzorem (L*, S), w którym L* oznacza zmodyfikowane białko L wirusa H epatitis B zawierające sekwencję am inokw asów obejm ującą reszty 12-52, a następnie kolejno reszty i reszty białka L, a S oznacza białko S powierzchniowego antygenu H epatitis B. 7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że białko S należy do podtypu ad, a zmodyfikowane białko L należy do podtypu ay, lub odwrotnie. * * * Przedm iotem wynalazku jest sposób w ytw arzania zm odyfikow anego dużego pow ierzchniowego białka H epatitis B. Zapalenie wątroby (Hepatitis) jest rozpow szechnioną pow ażną chorobą zakaźną, którą m ogą powodować różne czynniki. Jeden z istotnych czynników zidentyfikowano jako wirus Hepatitis B (HBV), mały wirion o średnicy około 43 nm zawierający szczególny genom złożony z 3200 par zasad dwuniciowego kolistego D N A z jednoniciow ą wstawką o długości około 200 par zasad. Zakażenie tym wirionem pow oduje ciężką, czasam i naw et śm iertelną chorobę. 58% zainfekow a- nych osób odzyskuje zdrowie po około 3 miesiącach choroby, około 1% cierpi na ostrą nekrozę tkanki wątrobowej, powodującą po krótkim czasie śmierć, a u około 10% obserwuje się naw roty choroby. U około 4% zainfekow anych osób rozw ija się chroniczny stan nosicielstw a ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia pierwotnego raka w ątroby lub marskości wątroby. Zakażenie następuje przew ażnie na drodze okołoporodow ego lub pozajelitow ego przeniesienia zakaźnego wirionu, np. w czasie transfuzji krwi, przez użycie zakażonych strzykawek lub igieł, albo też poprzez kontakt seksualny. Istnieje więc pilna potrzeba posiadania w iarygodnych środków diagnostycznych do wykryw ania H B V oraz dostępnej po niskich cenach szczepionki, chroniącej ludzi o wysokim stopniu ryzyka takich ja k m ałżonkow ie chronicznych nosicieli, osoby podróżujące do obszarów o wysokim endem icznym w ystępow aniu HBV, now orodki chronicznych

3 nosicieli, hom oseksualiści, prostytutki i narkom ani. Ponadto, w krajach trzeciego świata istnieje zapotrzebowanie na tanią szczepionkę dla programów szczepień masowych. Poza cząstkam i wirusowymi składającym i się z białek rdzeniowych (HBcAg) i białek kapsydu czyli antygenów pow ierzchniow ych we krwi zainfekow anych osobników m ogą występow ać znaczne ilości cząstek HBsAg zawierających białko antygenu powierzchniowego i lipidy gospodarza. Takie cząstki wydzielono z ludzkiej surowicy i zastosowano do w ytw arzania szczepionek, które jak wykazano chronią przed infekcją HBV (Szmuness i in., 1980). W opisie powołuje się na pewne publikacje podając w naw iasach nazwisko pierwszego auto r i rok publikacji. Pełne zestawienie pozycji literaturowych w porządku alfabetycznym zamieszczono na końcu opisu. Jednakże wytwarzanie szczepionek z HBsAg pochodzących z surowicy jest utrudnione ogra niczną dostaw ą zakażonej krwi oraz koniecznością poddaw ania ich długim i rygorystycznym testom w celu zapew nienia usunięcia i/lu b inaktywacji potencjalnych czynników zakaźnych. Z infekcją wirusem H epatitis B (HBV) u ludzi wiąże się występowanie w surowicy różnych struktur zawierających antygen powierzchniowy (HBsAg) H epatitis B (Tiollais i wsp., N ature, 1985,17,489). Oprócz zakaźnych wirionów występują także nitkow ate i sferyczne cząstki o średnicy 22 nm (zawierające około 100 białek otoczki), utworzone przez asocjację lipidów gospodarza z trzem a białkam i powierzchniowym i Hepatitis: głównym (S), średnim (M) i dużym (L). Białka te m ają wspólną tę sam ą sekwencję 226 kodonów aminokwasów w genomie HBV, znaną jako sekwencja kodująca białko S. C ałkow ita sekwencja kodująca am inokw asy, która bezpośrednio poprzedza sekwencję kodującą białko S, określana jest w niniejszym opisie jako sekwencja kodująca pres. Ta kodująca sekwencja pres koduje sekwencję 55 am inokw asów, które bezpośrednio poprzedzają białko S, zwaną regionem pres2 i, zależnie od podtypu wirusa, sekwencję 108 lub 119 aminokwasów poprzedzającą bezpośrednio region pres2, zwaną regionem pres1. A więc całkowita sekwencja kodująca pres koduje 163 (55 p res pres1) am inokw asy w p o d ty p ach ay i 174(55 p res pres 1) am inokw asy w większości podtypów ad. Porów nanie sekwencji kodujących pres w genomach wirusów podtypu ad i ay wykazało, że pierwszych 11 kodonów regionu pres 1 podtypu ad nie występuje w podtypach ay. Zgodnie z powszechnie przyjętą nom enklaturą, w zgłoszeniu tym przyjm uje się num erację kodonów i aminokwasów obow iązującą dla podtypów ad; tzn., że genomy HBV podtypów ad kodują region pres złożony ze 174 am inokwasów, ponum erowanych od 1 do 174, podczas gdy 163 aminokwasy regionu pres w podtypach ay są ponum erow ane od 12 do 174. Główne białko(s) kodow ane jest przez 226 kodonów genu S i istnieje w form ie glikozylowanej i nieglikozylowanej. Białko średnie (M ) zawiera region pres2 i białko S (białko M = aminokwasów). Białko M jest glikoproteiną występującą w dwóch formach zależnie od stopnia glikozylacji (Stibbe i wsp., J. Virol., 1983,46, ). 55 aminokwasów kodowanych przez region pres2 m a własności hydrofllowe i zawiera epitop im m unodom inujący umiejscowiony na powierzchni otoczki (reszty am ino kwasowe ). Epitop ten jest niezależny od wiązania dwusiarczkowego oraz, jak stwierdzono, jest bardziej im m unogenny niż epitopy białka S (N eurath i wsp., Science, 1984, 224, ; N eurath i wsp. N ature, 1985,315, ). Sekwencja pres2 zawiera również receptor dla spolimeryzowanej album iny ludzkiej (phsa) (Machida i wsp., G astroent., 1984,86, ). Ten receptor może również wiązać m onom eryczną HSA i może pośredniczyć w wiązaniu HBV do hepatocytów, u których również występuje receptor dla ph SA. Sugeruje się, że wiązanie takie u ludzi m oże prow adzić do tolerancji albo reakcji autoim m unizacyjnych. Duże białko (L) obejm uje region pres1, region pres2 i sekwencję białka S (białko L = 108 (lub 119) aminokwasów). W ystępuje w formie glikozylowanej i nieglikolizowanej (patrz H eerm ann i wsp., J. Virol., 1984,52,396). Białko L ma długość zm ienną, zależnie od podtypu, np. 389 lub 400 am inokwasów, odpow iednio dla podtypów ay i ad. P rodukt translacji pres1 bierze również udział w wiązaniu HBV do hepatocytów: Ponieważ prom otor dla specyficznych transkryptów S i M mieści się wewnątrz otw artej ram ki odczytu białka L, to transform acja kom órek ssaków przy użyciu D N A kodującego całkowitą otw artą ram kę odczytu dla białka L może powodować syntezę wszystkich trzech białek powierzch-

4 niowych. W komórkach ssaków cząstki HBsAg są wydzielane na zewnątrz (Tiollais i wsp., jak wyżej). W organizmach ssaków ekspresja białka S powoduje zaham owanie wydzielania cząstek HBsAg (patrz np. Ou i wsp., J. Virol., 1987, 61, 782). Sugeruje się, że zjawisko to związane jest z obecnością grupy N-mirystalowej w białku L, powodującej zakłócenia w procesie zarodkow ania lub wydzielania (Persing i wsp. Science, 1986, 234, ; Persing i wsp. J. Virol., 1987, 61, ). D la ułatwienia pow oływ ania się na określone sekwencje poniższa tabela 1 przedstaw ia kodujące sekwencje DNA oraz sekwencje aminokwasowe dla reginów pres1, pres2 i białek HBV omawianych w niniejszym zgłoszeniu. N um ery am inokwasów są umieszczone w nawiasach, powyżej kodonów i liczone są poczynając od pierwszego kodonu A T G obecnego w otwartej ramce odczytu dla białek otoczki wykrytej w sekwencji wirusa HBV adw, która została sklonow ana w plazmidzie prit Ponieważ pierwszych 14 kodonów jest sekwencji ad nie występuje w żadnej z kaset ekspresji opisanych w niniejszym zgłoszeniu, a więc sekwencje te zostały w tabeli 1 pom inięte. Plazmid pr IT w E. coli szczep 600 jest zdeponow any w Am erican Type Culture Collection, Rockville, M arylan, USA, pod nr. A TCC TABELA A REGION PRE-S1 NcoI ( 12 ) ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG GGA TTC TTT Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe (26) CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn (40) AAT CCA GAT TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG CCA Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro (54) GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA TTC GGG CCA GGG CTC Ala Ala Asn Gin Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu ( 68) ACC CCT CCA CAC GGC GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala (82) CAG GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT CCT CCT GCC Gin Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala

5 (96) TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser (110) (119) CCA CCT CTA AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala R E G I O N P R E - S 2 (1 2 0 ) ATG CAG Met Gln TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA GCT CTG CAG GAT Trp Asn Ser Thr Ala Phe His G ln Ala Leu Gln Asp (134) CCC AGA Pro Arg GTC AGG GGT CTG TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser (148) TCA GGA Ser Gly ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT CAC ATA Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile (162) (174) TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG GAC CCT GTG ACG AAC Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn B I A Ł K O S (175) ATG GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTG CTC GTG Met Glu Asn lle Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC ACA ATA Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu GGG GGA TCA CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC CCA Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro

6 ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCC TGT CCT CCA ATT TGT CCT Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro ll e Cys Pro GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATA TTC CTC Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTA TTG GTT CTT CTG Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu GAT TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly TCA ACA ACA ACC AAT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACT Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr CCT GCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGT ACA Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCG Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser TCC TGG GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GTC Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val CGT TTC TCT TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT TCA GCT ATA TGG Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG AGT Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser CCC TTT ATA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT CTC TGG GTA Pro Phe lle Pro Leu Leu Pro lle Phe Phe Cys Leu Trp Val (400) TAC ATT TAA Tyr lle Stop

7 W irusowe sygnały transkrypcji umiejscowione po stronie 5' od kodonów inicjacji translacji kontrolują ekspresję in vivo każdego z białek: pres1, pres2 i S. Przy translacji w kom órkach ssaków białka te m ogą być glikozylow ane dając w rezultacie zestaw antygenów pow ierzchniow ych przedstawionych w poniższej tabeli: Białko Długość (ilość aminokwasów) Oznaczenia Glikozylacja sekwencji białka S Glikozylacja specyficznych domen pres2 P białko S - - GP białko S + - GP białko pres2 - + GP białko pres2 + + P39* 389 białko pres1 - - GP42* 389 białko pres1 + - *'Podtyp ayw; białka pres1 pochodzące z podtypu adw są około 1,0-1,5kD większe, co zgodne jest z obecnością dodatkowych 11 aminokwasów przy końcu N (Hermann i wsp. 1984). Od czasu poznania sekwencji DNA kodujących region antygenu powierzchniowego poczyniono szereg prób w yprodukow ania białka S w oparciu o technikę rekom binacji D N A. Burell i wsp. (1974) oraz M urray i wsp. (1980), jak również szereg innych badaczy donosili o ekspresji HBsAg w E. coli, Valenzuela i wsp. (1982) donosił o ekspresji HBsAg w drożdżach. Po rozbiciu kom órek drożdży transform ow anych przy pom ocy wektora zawierającego sekwencje kodujące białko S pod kontrolą prom otora drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej I, m ożna było obserwować sferyczne cząstki zawierające HBsAg podobne do cząstek znajdowanych w surowicach osobników zainfekowanych H B F. W Europejskim Zgłoszeniu Patentowym (Tschopp i wsp.) ujawnione jest wytwarzanie białka S wirusa HBV w drożdżach Pichia. Synteza białka jest pod kontrolą regionu regulatorow ego reagującego na m etanol. Jednakże, chociaż szczepionki zawierające wyłącznie cząstki antygenu S m ają zwykle silnie ochronne właściwości (Szmuness i wsp. 1980), to niektórzy biorcy źle znoszą takie param etry. W celu przezwyciężenia takiego nie dającego się przewidzieć niepowodzenia szczepienia zostały opracowane systemy ekspresji białek pres2 i pres1. W iadom o jest, że pres2 jest nawet bardziej immunogenne niż białko S. Na przykład, przy immunizacji myszy subviralnym i cząstkam i niosącymi specyficzne epitopy pres2 i S, reakcja przeciwciała na obecność pres2 przewyższa reakcję anty-s (Milich i wsp. 1985). Co więcej, zaobserwowano, że im m unizacja cząstkam i zawierającymi pres2 może indukow ać również reakcję anty-s. Ostatnio dokonano przeglądu literatury dotyczącej roli białek pres1 i pres2 w immunizacji oraz specyficzności rozpoznaw ania przez kom órki T i B białek antygenu powierzchniowego HBV (Milich, 1988 i odnośniki tamże). Valenzuela i wsp. (1985) opisali ekspresję całkowitej sekwencji kodującej białko pres2 w drożdżach transform ow anych plazm idem zaw ierającym odpow iednie sekwencje wirusowe. Należy zaznaczyć, że przy tran sk ry p- cji u drożdży inicjacja musi odbywać się pod kontrolą prom otorów drożdżowych poprzedzających odpowiedni region kodujący, gdyż wirusowe sygnały inicjacji transkrypcji wewnątrz ram ki odczytu HBV-ORF nie są rozpoznawane przez system transkrypcyjny drożdży. Itoh i wsp. (1986) i innie badacze również wykrywali ekspresję białka pres2 u drożdży i jego agregację w cząstki. D ehoux i wsp. (1986) wykryli ekspresję białka pres1 o masie 39 kd u drożdży i stwierdzili, że jest ono zagregowane w formie cząstek. Im am ura i wsp. (1987) w swoim doniesieniu opisują ekspresję zarów no białka pres2 jak i pres1 w S. cerevisiae. Autorzy ci stwierdzają, że to wielkie białko znajduje się w formie względnie stabilnego nieglikozylowego produktu o masie cząsteczkowej 42 kd, który niezbyt łatwo ulega agregacji w form ę cząstek. Glikozylacja białek powierzchniowych produkowanych w drożdżach S. cerevisiae różni się od glikozylacji obserw ow anej w naturalnie występujących cząstkach izolow anych z osobników z a rażonych HBV. Białko S nie jest glikozylowane podczas gdy białka pres2 i pres1 są wytwarzane w form ach N-glikozylowanej i nieglikozylowanej. Zidentyfikowano też N-sprzężone łańcuchy o wysokiej zawartości m annozy jak i O-sprzężony łańcuch(y) oligosacharydowy (Itoch i wsp. 1986, Langley i wsp. 1988).

8 Przeprowadzono również ekspresję powierzchniowego antygenu HBV w kom órkach ssaków. Michel i wsp. (1984) wykazali syntezę HBsAg w kom órkach jajnika chom ika chińskiego (kom órki CH O) transform owanych plazm idem zawierającym sekwencję kodującą białko pres2. Persing i wsp. (1985) stwierdzili ekspresję trzech HBsAg-pokrewnych polipeptydów o masie cząsteczkowej , i daltonów w kom órkach myszy transform ow anych przy użyciu sekwencji kodującej białko pres2. Te trzy otrzym ywane polipeptydy mogą być uorganizowane w złożone im m unoaktywne cząstki HBsAg o średnicy około 22 mm. M clachlan i wsp. (WO ) donieśli o ekspresji różnych białek pokrewnych białkom HBV w kom órkach kręgowców. Jednakże ekspresja antygenu pres w kom órkach ssaków jest zwykle utrudniona z powodu względnej nadprodukcji białka pres1 w stosunku do białka S, gdyż wówczas wydzielanie cząstek HBsAg zostaje zaham owane (Ou i wsp. 1987). Ponadto stosunek różnych białek S-pokrewnych nie daje się kontrolować. Wreszcie, hodow la kom órkow a linii kom órek zwierzęcych jest m etodą kosztow ną, co w rezultacie powoduje wysoką cenę otrzym ywanego produktu. Mimo iż opisywane i stosowane szczepionki wykazują wysoką skuteczność, pewien procent osób otrzym ujących takie szczepionki, zwłaszcza osób immunologicznie uzależnionych, np. pacjentów poddaw anych hemodializie, nie reaguje na nie lub reaguje powoli [patrz np. H adler i inni, New Engl. J. Med., 315; (1986); Bruguera i inni, Post G rad. M ed. J., 63: (1987)]. W związku z tym istnieje zapotrzebow anie na sposoby i kompozycje przydatne do wytwarzania dodatkow ych skutecznych szczepionek przeciw HBV. Poniższe term iny występujące w niniejszym zgłoszeniu definiuje się następująco: Kaseta ekspresji oznacza jakikolw iek odrębny region D N A, który funkcjonuje w kom órce gospodarza jak o kom pletna jednostka ekspresji genu. Kom pletna jednostka ekspresji genu jest to gen strukturalny, z prom otorem i regionami regulacyjnym i wymaganymi dla jego transkrypcji i translacji. Funkcjonalny kodujący region D N A oznacza kodującą sekwencję D N A, która, po włączeniu w fazie do sekwencji kodującej białko S, nie przeszkadza w tworzeniu się mieszanych cząstek HBsAg. Pochodna funkcjonalna oznacza sekwencję kodującą zawierającą takie zmiany kodonów aminokwasowych, które nie przeszkadzają w form ow aniu się cząstek i które pozw alają na zachowanie niezmienionej immunogenności oraz innych funkcji. Takie funkcjonalne pochodne m ożna otrzym ać konwencjonalną m etodą mutagenezy sterowanej lub przy pom ocy innych standardowych technik. W ektor definiuje się jako D N A, które może przenosić i utrzymywać fragm ent D N A stanowiący przedm iot niniejszego wynalazku, łącznie np. z fagami i plazmidami. Sposobem według wynalazku wytwarza się nowe zmodyfikowane cząstki dużego białka powierzchniowego Hepatitis B, które m ogą być użyte same albo z innymi kom ponentam i HBsAg lub H bs do wytw arzania szczepionek przeciw ko zakażeniom HBV. Z m odyfikow ane białko wytwarzane sposobem według wynalazku zawiera fragmenty aminokwasowej sekwencji białka L (podtyp ad lub ay) i obejmuje reszty lub resztę 12 z następującym i po niej resztam i 14-52, następujące po resztach i reszty , a po nich reszty białka L. Sposób według wynalazku polega na tym, że w odpowiednim podłożu hoduje się kom órki gospodarza stransform ow ane zrekom binow anym w ektorem zaw ierającym zrekom binow aną cząsteczkę DNA obejm ującą sekwencję D N A kodującą ekspresję zmodyfikowanego białka L określonego powyżej, połączoną funkcjonalnie z sekwencją regulacyjną i wydziela się wytworzone białko z lizatu kom órkow ego lub z ekstraktu hodowli. Zm odyfikowane białko m ożna wytwarzać przez ekspresję w drożdżach m etylotroficznych oraz w innych drożdżow ych układach ekspresji, które wytw arzają białka w postaci cząstek zachowujących podstawowe miejsca antygenowe zakodowane przez trzy domeny, pres1, pres2 i S. Kom órki gospodarza wybiera się z grupy obejmującej Saccharomyces, H ansenula, Pichia, Candida, Kluyveromyces i Schizosaccharomyces, a korzystniej stosuje się kom órkę drożdży S. cerevisiae lub H ansenula polym orpha.

9 Korzystnie hoduje się kom órki gospodarza stransform ow ane zrekom binow anym wektorem w ybranym z grupy obejm ującej prit12979, prit13192 i prit Zm odyfikowane białko L m a sekwencję białka L, w której brak jest tych miejsc wybiórczo atakow anych przez proteazy. Eliminacja tych miejsc zapewnia uzyskanie cząsteczek o mniejszej wrażliwości na proteazę, które po ekspresji dają się łatwo oczyścić w form ie cząstek. Białko wytwarzane sposobem według wynalazku charakteryzuje się także tym, że nie zawiera am inokwasu niezbędnego przy mirystylowaniu białka oraz tym, że nie zawiera kilku potencjalnych miejsc glikozylacji. Eliminacja glikozylacji białka L popraw ia dostępność epitopów, które ulegają ekranow aniu, odkształceniu lub modyfikacji podczas glikozylacji białka zachodzącej w czasie ekspresji w kom órkach gospodarza. Zm odyfikowane, odglikozylowane białko L zawiera epitopy ochronne B i epitopy znaczące T h regionu pres1, pres2 i S, o prawidłowej konform acji, dobrze w yeksponow ane na pow ierzchni uzyskanych cząstek. Zm odyfikowane białko wytwarzane sposobem według w ynalazku charakteryzuje się też delecją części regionu pres2 zawierającego miejsce wiązania album iny surowicy ludzkiej (phsa). T aka m odyfikacja białka L eliminuje ewentualną tolerancję lub problem y autoim m unologiczne związane z obecnością recepotora ph SA, bez utraty podstawowych epitopów B w regionie pres2. R easum ując zm odyfikow ane białko L charakteryzuje się tym, że jest nieglikozylow ane, w ykazuje zmniejszoną wrażliwość na proteazę i obniżoną zdolność wiązania ph SA. Sposobem według wynalazku wytwarza się również zm odyfikowane białko powierzchniowe, które oprócz określonych powyżej sekwencji aminokwasów stanow iących fragm enty białka L zawiera także sekwencję am inokwasów białka S. W przypadku wytw arzania takich białek prow a- dzi się hodowlę kom órki gospodarza, która została dodatkow o stransform ow ana zrekom binow a- nym wektorem DNA zdolnym do ekspresji białka S oraz wydziela się z lizatu kom órkow ego lub ekstraktu hodow li cząstki białka o m ieszanym składzie podjednostkow ym. Zm odyfikowane białko m ożna wydzielić w postaci cząstek o mieszanym lub jednorodnym składzie podjednostkowym, zależnie od tego czy wystąpiła współekspresja zmodyfikowanego białka L wraz z białkiem S. Sposób wytwarzania zmodyfikowanych białek L według wynalazku m ożna prowadzić w innych układach ekspresji obejm ujących bakteryjne układy ekspresji, układy ekspresji typu k o m ó- rek owadów, np. układy bakulowirusowe, układy ekspresji typu kom órek ssaków, układy wirusa ospy oraz roślinne układy ekspresji. Zmodyfikowane białko L według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje delecję, insercję lub modyfikację szeregu aminokwasowych sekwencji w regionie pres. Zrozum iałe jest, że z cząsteczki L, która ma być zmodyfikowana i wytworzona na drodze ekspresji, dokonano już delecji pierwszych 11 aminokwasów, tak że zawiera ono 163 aminokwasy w regionie pres1 (patrz rów nocześnie wniesione zgłoszenie patentow e w Stanach Zjednoczonych A m eryki, n r ). O siągnięte w ten sposób zmniejszenie wielkości regionu pres ułatw ia tworzenie się cząstek w kom órce -gospodarzu i popraw ia różne właściwości biofizyczne cząsteczki, dzięki czemu zm odyfikowana cząstka L szczególnie nadaje się do wytwarzania i stosowania szczepionek. T ak np. skrócenie regionów pres, zgodnie z wynalazkiem, może zapewnić dostęp epitopów S i pres na powierzchni cząstki ułatwiający oddziaływanie z układem odpornościowym, zwiększając tym samym jej im m unogenność. Zgodnie z jednym z rozwiązań wynalazek dostarcza zm odyfikowanego białka L z delecją reszty am inokwasu Gly 13 w regionie pres1. Białko L wytworzone w wyniku ekspresji w drożdżach zawiera grupę m irystyrylową połączoną kowalencyjnie wiązaniem am idowym, jak to ujaw niono w rów nocześnie wniesionym zgłoszeniu patentow ym w Stanach Zjednoczonych A m eryki, nr 07/ Obecność N-końcowej reszty Gly stanowi w arunek konieczny m irystylowania białka [Towler i G ordon, Ann. Rev. Biochem., 57:69-99(1983)]. Z tego względu jedno z odpow iednio zmodyfikowanych białek L według wynalazku jest kodowane przez D N A, w którym dokonano delecji kodonu G ly13 (G G G ) w sekwencji nukleotydowej kodującej białko L. W wyniku tej delecji następuje synteza niem irystylowanego białka L. W użytym znaczeniu symbol Δ oznacza delecję. Tak np. Δ G lyl3 zmodyfikowane L oznacza zm odyfikow ane białko L nie zawierające reszty am inokw asu 13 (glicyny).

10 W innej wersji niniejszego wynalazku wytwarza się zmodyfikowane białko L z delecją w jednym lub więcej jego potencjalnych miejsc glikozylacji. Białko L powstające w wyniku ekspresji w drożdżach posiada N-sprzężony łańcuch oligosacharydowy przy A sn123 oraz kilka O-sprzężonych łańcuchów m annozowych związanych z resztami am inokwasowym i Ser i T hr w pres1- i pres2 -regionach cząsteczki, jak opisano w zgłoszeniu patentow ym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr wymienionym wyżej (patrz również Rutgers i wsp. Viral Hepatitis and Liver D isease Ed. A. J. Zuckerm an, A. R. Liss, New York, 1988, pp ). W celu usunięcia tego miejsca N-glikozylacji (które charakteryzuje się sekwencją Asn-X-(Ser lub Thr), gdzie X może stanowić dowolny am inokwas), zm ieniona jest sekwencja am inokw asow a w pozycji To miejsce N-glikozylacji może być usunięte poprzez delecję lub zam ianę aminokwasów w pozycji 123 i 125, delecję aminokwasu 124 lub delecję całej sekwencji W celu usunięcia miejsc O-glikozylacji, wszystkie albo niektóre z reszt aminokwasowych Ser i T hr w sekwencji L są wycięte lub podstawione innymi am inokw asam i. Białko L powstające w wyniku ekspresji z przykładowego plazm idu prit13192 odznacza się całkow itym brakiem glikozylacji. Inne zm odyfikow ane w edług niniejszego w ynalazku białko L zawiera delecję reszt am inokw a- sowych w sekwencji pres2 regionu pres2 warunkującego wiązanie spolimeryzowanej album iny surowicy ludzkiej (phsa) (patrz M achida i wsp., wyżej cytowani). Wiązanie ph SA do białek pozbaw ionych tej sekwencji jest znacznie zmniejszone. Inne białko zmodyfikowane według niniejszego wynalazku cechuje się delecją lub zm ianą miejsc wrażliwych na działanie protez. W iązania peptydow e wrażliwe na działanie p ro teazy znajdują się w sekwencji pres za resztą am inokwasową A rg wokół pozycji 100 w regionie pres1 (Heerm ann i wsp. Intervirology, 1987,28,14-25) oraz za resztam i aminokwasowymi A rg137, G ly149 i A rg167. Delecje lub inne modyfikacje wprowadzone do regionu kodującego białko L m ające na celu usunięcie niektórych lub wszystkich kodonów dla tych aminokwasów, dają w rezultacie białko L mniej wrażliwe n a działanie proteazy. W skazanym jest, aby delecje w prowadzane do regionu kodującego białko L w celu jego modyfikacji pozostawały nietknięte kodony dla am inokw asów i Przyjmuje się, że sekwencje te nadają zm odyfikowanem u białku zdolność indukow ania specyficznych przeciwciał pres związanych z osłoną immunologiczną (patrz Itoh i wsp., powyżej). Konstrukcja wzorcowego plazm idu pr IT ulegającego ekspresji w drożdżach i kodującego Gly13 białko L opisana jest poniżej w przykładzie X X II (F). Analiza ekspresji zmodyfikowanego białka L z plazm idu pr IT pod względem poziom u ekspresji, posttranslacyjnych m odyfikacji i układania się białka w m akrocząsteczki opisana jest poniżej w przykładzie X X III (F). Inne zmodyfikowane białko L zilustrowane jest na przykładzie plazm idu pr IT jak opisano w przykładzie X X IV (F). Pozbawione jest ono wszystkich trzech wyżej wymienionych właściwości, tzn. nie funkcjonuje jako substrat dla drożdżowych enzymów glikozylujących, nie posiada zdolności wiązania ph SA oraz nie jest wrażliwe na proteazy, a zostało zmodyfikowane przez pozbawienie kodonów dla aminokwasów i w regionie pres. Plazm id pr IT zawiera kodony am inokwasów i regionu pres. Analiza ekspresji białka L z plazmidu pr IT opisana jest w przykładzie XXV (F). Białko L powstające w wyniku ekspresji z pr IT wykazuje więc znacznie zmniejszoną zdolność wiązania ph SA, większą odporność na działanie p ro teaz i zm niejszoną glikozylację. Jeszcze w innym przykładem m odyfikacji białka L według niniejszego w ynalazku jest kom binacja delecji w prowadzonych do sekwencji kodujących białko L w plazmidzie pr IT i w plazmidzie pr IT Powstałe w wyniku ekspresji takiej sekwencji białko L jest niemirystylowane, w mniejszym stopniu glikozylowane, mniej wrażliwe na działanie proteaz i o zmniejszonej zdolności wiązania phsa. K onstrukcja ulegającego ekspresji w drożdżach plazm idu pr IT zawierającego insercję tak zmodyfikowanej sekwencji L jest również szczegółowo opisana w przykładzie XXIV. Sekwencje kodujące zm odyfikowane białko L wraz z całkowitą kodującą sekwencją S m ożna otrzymać do celów niniejszego wynalazku z sekwencji kodujących białko S i pres wg. tabeli A m etodą konwencjonalnej mutagenezy sterowanej (patrz np. Botstein i wsp., Science, 1985, 229, 1193) lub m etodam i rekom binacji D N A (patrz np. T. M aniatis i wsp., M olecular C loning, A

11 Laboratory M anual, Cold Spring H arbour Laboratory, 1982). D la jasności, num eracja am inokw a- sów używana poniżej zgodna jest z num eracją podaną w tabeli A. Jednakże inne publikow ane wersje sekwencji i pres m ogą być przez specjalistę użyte w celu przygotow ania zm odyfikowanych według niniejszego w ynalazku białek S. Na przykład, sekwencje białka S można wyizolować z D N A w yekstrahowanego z cząstek Dane z surowicy zainfekowanych osobników, poprzez wypełnienie jednoniciowego regionu D N A przy pom ocy polim erazy D N A (najlepiej endogennej polim erazy) i następnie trawienie endonukleazą restrykcyjną. W ybór endonukleazy będzie częściowo zależeć od typu cząstek D ane. Na przykład sekwencję kodującą HBsAg w DNA pochodzącym z cząstek D ane serotypu adw m ożna wyizolować w pojedynczym fragmencie BamHI; sekwencję kodującą HBsAg w D N A wirusa HBV pewnych cząstek D ane serotypu ayw można wyizolować we fragmencie H hal. D N A wirusa HBV z cząstek D ane tego sam ego serotypu może również wykazywać odm ienny w zór restrykcyjny. Zm odyfikowane według niniejszego wynalazku sekwencje dla białka L m ożna też skonstruować za pom ocą w ektorów pośredniczących. Techniki klonow ania fragm entów D N A w fagach są opisane np. przez C harnay'a i wsp. (Nature, 198, 286, ) i Tiollais (brytyjskie zgłoszenie patentow e nr ). Zm odyfikow ana według tego wynalazku sekwencja dla białka L może być skonstruow ana w zrekom binowanej cząsteczce D N A czyli wektorze. Zrekom binow any wektor stosow any w sposobie według w ynalazku zawiera zm odyfikowaną sekwencję kodującą białko L (według tego wynalazku) połączoną z regionem regulacyjnym w jednostkę funkcjonalną. Taki w ektor może też dodatkow o zawierać replikon, zależnie od wyboru i/lu b organizm u gospodarza. Pod term inem replikon rozum ie się taki najmniejszy region D N A, którego funkcjonowanie um ożliwia trwałe utrzym anie zrekom binow anego w ektora w formie pozachrom osom alnej w eukariotycznym lub prokariotycznym organizm ie transform owanym tymże w ektorem. Takie replikony są dobrze znane w dziedzinie inżynierii genetycznej. Term inem region regulacyjny określa się d a n ą sekw encję D N A zawierającą prom otor i inne sekwencje konieczne do transkrypcji sekwencji kodujących, które regulują transkrypcję sekwencji kodujących genu strukturalnego. Takie regiony regulacyjne są również dobrze znane w tej dziedzinie. W ektor taki m ożna sporządzić przy zastosowaniu konwencjonalnych m etod; np. przez inser cję sekwencji kodującej zmodyfikowane według niniejszego wynalazku białko, do w ektora już zawierającego replikon i sekwencje regulacyjne. Insercja pow inna być przeprow adzona w taki sposób aby ta sekwencja kodująca była połączona z regionem regulacyjnym w jednostkę funkcjonalną. T ak a cząsteczka D N A czyli kaseta ekspresji zaw ierająca sekwencję kodującą zm odyfikowane białko L, może być skonstruow ana przy zastosowaniu konwencjonalnych m etod, np. przez ligację kodującej sekwencji L z sekwencją regulacyjną. Trawienie D N A enzymami restrykcyjnymi w celu otrzym ania fragm entów D N A stosowanych w niniejszym wynalazku, ligację takich fragmentów w celu otrzym ania cząstek zrekom binow anego DNA używanych w niniejszym wynalazku oraz ich wprowadzanie do m ikroorganizm ów przeprowadza się przy użyciu znanych m etod opisanych w uprzednio i dalej cytowanych pracach. W arunki są dobrane tak aby uniknąć denaturacji D N A i enzymów. Enzymy restrykcyjne i ligazy używane w pracach nad tym wynalazkiem są dostępne w handlu i powinny być stosowane zgodnie z instrukcjami załączonym i przez producentów; preferow ane jest używanie ligazy polinukleotydow ej T 4. Różne fragm enty i konstrukcje finalne stosowane w celu ekspresji zmodyfikowanych białek L oraz części składowe wektorów przenoszących te kodujące sekwencje w celu ich ekspresji w kom órkach gospodarza zgodnie z m etodą niniejszego wynalazku, mogą być stosow ane łącznie z konw encjonalnym i m etodam i znanym i specjalistom. W wielu przypadkach geny zostały ju ż wyizolowane i zm apow ane przy użyciu enzymów restrykcyjnych, jak również zsekwencjonowane. W znanym zakresie m ożna więc wyciąć daną sekwencję enzymem restrykcyjnym, jak np. sekwencję kodującą białko otoczki HBV oraz, stosując w miarę potrzeby dalsze m anipulacje takie jak ponowne nacinanie enzymem B al31, mutagenezę in vitro, wypełnianie lepkich końców itp., otrzymać fragm ent o pożądanej długości, zawierający pożądaną sekwencję i mający odpowiednie zakończenia. Łączniki i ad ap to ry m ogą być używane w celu połączenia sekwencji oraz w celu

12 przyłączenia ponow nego sekwencji u traconych w w yniku użycia miejsca restrykcyjnego położonego po stronie wewnętrznej od regionu utraconego. Różne fragmenty D N A, które zostały wyodrębnione, m ożna oczyścić m etodą elektroforezy, wymyć z żelu m etodą elektroelucji, przyłączyć do innych sekwencji, sklonow ać, ponow nie wyizolować i poddaw ać dalszej obróbce. Użycie regionów regulacyjnych dla kontroli transkrypcji zmodyfikowanego genu L pozwala na wzrost kom órek gospodarza do wysokich gęstości przy niskim lub zerowym poziom ie transkrypcji tego genu strukturalnego i następnie, indukcję jego ekspresji przez zmianę warunków hodowli takich jak: pożywka, tem peratura i tem u podobne. Transform acja kom órek-biorców przy użyciu w ektora przenoszącego sekwencję kodującą białko L i ekspresja tego wektora w wybranej kom órce-biorcy przeprow adzana jest przy użyciu konwencjonalnych technik. K om órka ta jest następnie hodowana na odpowiednich pożywkach tzn. na pożywkach umożliwiających tym kom órkom przeżycie i wytwarzanie zmodyfikowanego białka L w ilościach umożliwiających jego pozyskanie. Na przykład, jeśli jak o kom órkę-biorcę wybrano drożdże to właściwą do tego celu jest pożywka minimalna Yeast N itrogen Base. Odpowiednie pożyw ki m ogą być dobierane przez specjalistów zależnie od rodzaju gospodarza używanego w danej metodzie. Zm odyfikow ane cząsteczki białka L w sposobie według mniejszego w ynalazku m ożna wyizolować z lizatu kom órkowego lub z pożywki hodow lanej, zależnie od zdolności danych kom órek do wydzielania zmodyfikowanego białka. Odzyskiwanie białka wytwarzonego według niniejszego wynalazku przeprow adza się przy pom ocy konw encjonalnych m etod oczyszczania białek. Do wytworzenia zmodyfikowanych białek L według tego wynalazku specjalista może wybrać jako biorców odpowiednie kom órki lub linie kom órkow e. Właściwymi kom órkam i lub liniami kom órkowym i mogą być kom órki drożdży. Wiele szczepów drożdży znanych specjalistom jest dostępnych w charakterze kom órek - biorców do ekspresji zm odyfikowanych białek L według niniejszego wynalazku. W praktyce, według tego wynalazku, może być użyty każdy gatunek drożdży. W przykładach opisanych poniżej używane są Saccharomyces, a dokładniej - Saccharomyces cerevisiae. Szereg szczepów S. cerevisiae jest dostępnych z publicznych depozytów i laboratoriów, np. American Type Culture Collection, Rockville, Nd. Zgodnie z innym rozwiązaniem stosować m ożna H ansenula polym orpha. Tym niemniej inne gatunki drożdży mogą być również używane włączając w to, bez ograniczeń: Hansenula, Pichia, Candida, Kluyveromyces i Schizosaccharomyces. Ponadto inne rodzaje eukariotycznych komórek gospodarzy np. kom órki ssaków takie jak kom órki jajnika chomika chińskiego (CHO) lub kom órki 3T3 mogą być stosow ane jak o kom órki-biorcy w celu ekspresji białek L tu opisanych. W ybór odpowiednich kom órek-gospodarzy ssaków oraz m etod transform acji, hodowli, amplifikacji, testów eliminacyjnych oraz otrzym ywania i oczyszczania produktu, są znane specjalistom z tej dziedziny. Patrz np. Gething i Sam brook, N ature, 1981, 293, lub alternatywnie, Kaufm an i wsp. Mol. Cell. Biol. 1985, 5(7), , lub Fowley i wsp., Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr Inne odpowiednie linie kom órkow e ssaków to: linia kom órkow a COS-1 z małpy i linia kom órkow a CV-1. Oczywistym jest, że niektóre z opisanych wyżej delecji wprowadzone do sekwencji kodującej białko L zmieniły wewnętrzne sekwencje biorące udział w transkrypcji i translacji m R N A specyficznych dla białek M i S w kom órkach ssaków. T aka zm odyfikowana sekwencja kodująca białko L pozwala więc na niezależną ekspresję białka S i zmodyfikowanego białka L w kom órce ssaka mieszczącej w sobie ich oddzielne kasety ekspresji. Do celów niniejszego wynalazku jako kom órki-biorcy nadają się także kom órki bakteryjne. Na przykład, różne szczepy E. coli (np. HB101, MC1061 oraz szczepy użyte w niżej podanych przykładach) są dobrze znane jako kom órki-gospodarze w dziedzienie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Pseudomonas itp. m ogą być również używane w tej metodzie. Ponadto, w miarę potrzeby, w m etodzie według niniejszego wynalazku jak o kom órki biorcy mogą być również używane kom órki owadzie. Patrz np. Miller i wsp. G enetic Engineering, (Plenum Press), 1986, 8, i cytow ane tam odnośniki. Niektóre wirusy, takie jak baculowirusy lub wirusy vaccinia mogą także być używane do ekspresji białek L według tego w ynalazku. W ybór właściwego gospodarza, odpow iednich w arunków hodow li, pożywki oraz składników w ektora przydatnego do ekspresji w w ybranych kom órkach gospodarza leżą w ram ach możliwości specjalisty w dziedzinie biotechnologii.

13 W system ach ekspresji opisanych powyżej oraz w poniższych przykładach, może być użyty dowolny znany prom otor zdolny do kontroli ekspresji sekwencji kodujących białko w wybranej kom órce-gospodarzu. Jeśli wybranym biorcą są kom órki drożdży, to prom otory przydatne do ekspresji zm odyfikowanego białka L mogą obejmować silny prom otor T D H 3 lub inne konstytutywne lub regulowane prom otory pozwalające na modulację poziom u białka L, zależnie od składu pożywki. Ponadto np. prom otory PG K, ARG3 i APH1 są przykładowym i prom otoram i przydatnymi w w ektorach zgodnie z niniejszym wynalazkiem. W ynalazek ten pozw ala też na ekspresję zmodyfikowanych według niniejszego wynalazku białek L jako składnika cząstek HBsAg o mieszanym składzie polipeptydow ym, jak to szczegółowo opisano w równoczesnym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Am eryki nr M etoda polega na koekspresji, w kom órkach drożdży, pierwszego białka S i drugiego białka X-S, gdzie S jest faktycznie głównym białkiem powierzchniowym HBV, a X - dla celów niniejszego wynalazku, stanowi zm odyfikowaną sekwencję pres zakodowaną w funkcjonalnym kodującym regionie D N A fuzjowanym w fazie z sekwencją kodującą S. Przy odwoływaniu się do zgłoszenia patentowego w Stanach Zjedn. Amer. nr 07/ należy wziąć pod uwagę, że zasadniczo takie same informacje m ożna znaleźć w pracy Jacobsa i innych, G ene 80: (1989). W edług tej m etody sekwencja kodująca białko S ulega koekspresji wraz ze zmodyfikowaną sekwencją am inokw asow ą białka L. Regiony kodujące to białko L, jak również i sekwencje dla białka S, m ożna skonstruow ać jak opisano wyżej, przy użyciu konwencjonalnych m etod syntezy chemicznej lub rekom binacji DNA. Zm odyfikowane białko L tworzy razem z białkam i S cząstki o m ieszanym składzie podjednostkow ym. W konstrukcji białek X-S zawierających zmodyfikowane według niniejszego wynalazku białko L lepiej jeśli S stanowi całkowite dojrzałe białko powierzchniowe HBV (około 226 am inokwasów, patrz tabela A). Alternatyw nie, białko S może być kodow ane przez sekwencje kodujące białko S pochodzące z genom u HBV, gdzie S jest faktycznie takie samo jak autentyczne białko S z HBsAg. Obcięte białka S m ogą być również użyte w konstrukcji cząstek mieszany zawierających zmodyfikowane białko L, o ile nie zaburzy to procesu układania się białek w cząstki. Sekwencje kodującą białko S umieszcza się w pierwszej kasecie ekspresji przy zastosowaniu konwencjonalnych technik, tak aby pozwalała na ekspresję białka S w gospodarzu-drożdżach. K odującą sekwencję białka S albo istotną jej część stosuje się w fuzji z częściami sekwencji kodującej pres i umieszcza w drugiej kasecie ekspresji, aby umożliwić produkcję zmodyfikowanego białka L według niniejszego wynalazku. D rożdżowe kom órki gospodarza transform uje się przy użyciu konwencjonalnych technik wektorem (skonstruow anym przy użyciu opisanych wyżej konwencjonalnych m etod) niosącym kasetę ekspresji białka S o raz jednym lub więcej w ektoram i niosącym i kasetę ekspresji zm odyfikowanego białka L. Alternatywnie, kasety ekspresji białka S i kasety ekspresji dla jednego lub więcej zmodyfikowanych białek L umieszczone są razem w tym samym wektorze, którym transform uje się kom órki gospodarza-drożdży. Jako wektorów m ożna użyć integrujących wektorów Ty, jak to szczegółowo opisano w równoczesnym zgłoszeniu patentow ym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr W innej, alternatywnej metodzie, stosuje się zgodnie autonomicznie replikujące w ektory niosące pożądane kasety ekspresji i zdolne do transform acji kom órek drożdżowych. Przykładowe układy wektorów opisane są szczegółowo w następujących publikacjach: Mellor i inni, Yeast. 2:145 (1985); Boeke i inni, Celi, 40, 491 (1985); Boeke i inni, Cell, 42:507 (1985) oraz zgłoszenia patentow e w Stanach Zjednoczonych Amer. nr , , i ) publikacja zgłoszenia patentow ego europejskiego nr ). K orzystna wersja m etody według niniejszego wynalazku stosuje integracyjne wektory Ty niosące kasetę ekspresji dla białka S oraz autonomicznie replikujące w ektory plazmidowe niosące kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L. Użycie wektorów Ty niosących kasetę ekspresji białka S um ożliw ia stabilną integrację tych sekwencji do chrom osom ów kom órek drożdży. Takie integracje są stabilne dzięki niskiej częstotliwości ich wycinania. Tak więc w ektory te są homogennie rozmieszczone w populacji kom órek umożliwiając podobne tem po syntezy białka w każdej kom órce.

14 Transform acja tych kom órek autonom icznie replikującymi plazm idam i niosącymi kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L zapewnia, że stosunek poziom ów syntezy białka S do syntezy zmodyfikowanego białka L w każdej kom órce zmienia się zgodnie z liczbą kopii plazm idu obecnego w tej komórce. Zgodnie z kolejnym korzystnym rozwiązaniem zarów no kasetę ekspresji białka S i kasetę ekspresji zmodyfikowanego białka L m ożna wstawić do integracyjnych wektorów Ty i oddzielnie integrować w kom órkach drożdży jako żywicielach, o przeciwnych typach kojarzenia. Szczepy przynoszące pożądane ilości przypadków integracji kasety S i kasety zm odyfikowanego L m ożna następnie krzyżować w celu uzyskania kom órek diploidalnych, w których następuje ekspresja zarów no polipeptydu S jak i zmodyfikowanego L. W razie potrzeby otrzym ać m ożna haploidalne segreganty przenoszące obydwa typy kaset ekspresji, w wyniku przetrw alnikow ania takich diploidów. Następnie kom órki te są hodowane w odpowiedniej pożywce, tzn. w pożywce umożliwiającej biorcy ekspresję białka S i zm odyfikowanego białka L w cząstkach o mieszanym składzie podjed nostkow ym, w ilościach um ożliw iających ich pozyskiw anie. Powstające zm odyfikowane białka L będą wytwarzane w kom órkach drożdży jednocześnie z białkiem S i układane razem w form ie mieszanych cząstek złożonych. Takie cząstki są niniejszym definiowane jako m ultim etryczne zestawy dwu lub więcej polipeptydów w strukturze cząstkowej, która to struktura - będąca zestawem o mieszanym składzie polipeptydow ym - odznacza się swoim złożonym charakterem. N a powierzchni takich mieszanych cząstek różne peptydy są ułożone w przestrzennych konfiguracjach. Obecność nowego zm odyfikowanego białka L na cząstce HBsAg wywoła odpowiedź im m unologiczną podobną do odpowiedzi wywoływanej przez determ inante natywną. Niniejszy wynalazek umożliwia więc produkcję w drożdżach takich cząstek HBsAg, które imitują cząstki naturalne jeśli tylko zawierają one istotne miejsca antygenowe białek S, M i L wirusa HBV. Wydzielenie cząstek mieszanych z lizatu kom órkow ego lub z pożywki hodowlanej przeprowadza się według konw encjonalnych m etod otrzym yw ania białka. W praktyce, według wynalezionej m etody, do celów wytwarzania mieszanych cząstek,, HBsAg, w charakterze gospodarza może być użyty dowolny gatunek drożdży, dla którego są znane systemy transform acji, klonow ania i ekspresji. U innych rodzajów drożdży sekwencje Ty są nieobecne, a więc należy zaprojektować systemy wektorów umożliwiających koekspresję sekwencji kodujących białko S i zmodyfikowane białko L, w celu wytworzenia opisanych cząstek mieszanych. D latego m ożna zaprojektow ać kasety ekspresji przeznaczone do integracji w chrom osom ach drożdżow ych używając innych pow tarzalnych sekwencji DNA lub plazm idów takich jak plazm idy zawierające ARS w drożdżach takich jak Pichia, um ożliw iających integrację w chrom osom ach. Przykład takich stosow nych plazm idów ARS opisany jest w pracy Craig'a i wsp., Mol. Cell. Biol. 1985, 5 (12), W opisanych wyżej systemach ekspresji, np. oba systemy wektorów Ty, i innych, element regulacyjny zawiera prom otor, który oddziaływuje na wiązanie polim erazy RNA i na transkrypcję. M ogą być także używane prom otory podlegające regulacji tzn. indukowalne lub dereprymowalne. Szereg prom otorów przydatnych do ekspresji heterologicznych polipeptydów w drożdżach jest już dostępnych. Są to: prom otor genu m etalotioneiny indukowany miedzią (CUP1) i konstytutywny p ro m o to r genów glikolitycznych, dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego (T D H 3) i dehydrogenazy alkoholowej (A D H ). Regiony dla term inacji transkrypcji w drożdżach pochodzą z końca 3' któregoś z genów drożdżowych np. z genu izo-1-cytochrom u C (CYC1). Systemy ekspresji do zastosowania w Kluyveromyces są ujaw nione np. w P C T W O 83/04050, Hollenberg i wsp.; w Schizosaccharomyces, np. w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym , Yam om oto,; w Pichia, np. Cregg i wsp., Bio Technology, 1987, 5, 479; i w Hansenula, np. w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym , Hollenberg i wsp. Przykłady według niniejszego wynalazku dotyczą szczególnie szczepów S. cerevisiae zdolnych do syntezy białka S w wyniku integracji do genomu kaset ekspresji białka S, za pom ocą wektorów typy Ty. Jeden taki w ektor, pr IT L, zawierający kasetę ekspresji; TD H 3 - sekwencja kodująca białko S - ARG3 oraz m arker URA3 opisany jest w przykładzie nr 1 równoczesnego zgłoszenia patentow ego Stanów Zjednoczonych A m eryki n r

15 Inny Tyl w ektor, pr IT L zawiera tę samą kasetę ekspresji i m arker URA3 ale, d odatkowo, zawiera gen CU P1, który może służyć jako dodatkow y m arker w CUP1S lub cu p 1Δ szczepach - biorcach drożdży. Preferowane szczepy drożdży są pozbawione funkcjonalnych chrom osom ow ych genów CUP 1, które są wrażliwe na toksyczne działanie miedzi, w celu ułatwienia selekcji transform antów posiadających kilka zintegrow anych kopii wektorów. D w a preferow ane szczepy drożdży cup1: E JcuplA 3d i E Jcu p la 7 b są opisane w przykładzie nr 9 równoczesnego zgłoszenia patentow ego Stanów Zjednoczonych Am eryki nr Szczepy drożdży zawierające kilka zintegrowanych kopii prit13133-l lub prit13034-l opisane są w przykładzie 5 niniejszego wynalazku. Transform acja tych szczepów drożdży przy użyciu autonom icznie replikujących plazm idów ulegających ekspresji w drożdżach i niosących kasetę ekspresji zm odyfikowanego białka L opisana jest w przykładach poniżej. Diploidalne szczepy drożdży zawierające szereg zintegrowanych kopii zarów no kaset ekspresji S jak i zmodyfikowanego L, opisane są poniżej w przykładzie X X X I (część F). Sposób według w ynalazku wytwarzania takich zm odyfikowanych białek L, samych lub w postaci cząstek o mieszanym składzie podjednostkowym, znajduje z powodzeniem zastosowanie przy wytwarzaniu szczepionek przeciw chorobotwórczym m ikroorganizm om. Tak np. zm odyfikowane białka L występując w różnych preparatach szczepionkowych zawierają powierzchniowy antygen hepatitis B i m ogą przynieść korzyści nie osiągane w przypadku znanych szczepionek przeciw HBV. Cząstka HBsAg z mieszanej kompozycji podjednostkow ej, zawierająca zm odyfikowane białko L, jest podobna do cząstek lub włókienek wirionów występujących w krwi osób zainfekowanych HBV, które zawierają na swoich powierzchniach odsłonięte epitopy pres1 i pres2 oprócz epitopów białek podstaw ow ych, tak że może również znaleźć zastosowanie w nowych preparatach szczepionek. Zm odyfikowane białka L lub mieszane cząstki o mieszanym składzie podjednostkow ym, zaw ierające to białko, m ogą wykazywać właściwości odpornościow e nie uzyskiwane w przypadku indyw idualnych mieszanin białek S, M i L. Zmodyfikowane białko L lub cząstka zawierająca zmodyfikowane białko L w postaci o mieszanym składzie podjednostkow ym (S, zmodyfikowane L) lub też hom ogennej (zm odyfikowane białko L) w ytw orzone sposobem według wynalazku służą do w ytw arzania szczepionek. T aka szczepionka będzie zaw ierać zapewniającą odporność ilość cząstek lub zm odyfikow a- nych białek L, to znaczy tak ą, przy podaw aniu której ilość białek lub cząstek będzie wystarczająca do wywołania wystarczającej reakcji ochronnych przeciwciał w stosunku do HBV, bez poważnych efektów ubocznych. Szczepionki takie wytwarzać można znanymi sposobami. Tak np. szczepionka pobudzająca ochronę przed HBV-infekcją u ludzi może zawierać cząstki i/lu b zm odyfikowane białka L, opisane powyżej oraz odpowiedni znany nośnik. Cząstki lub białko L m ogą być w roztworze wodnym buforow anym do fizjologicznego ph, do bezpośredniego użycia. A lternatyw - nie białko lub cząstki m ogą być wymieszane lub zaadsorbowane na zwykłym środku pom ocniczym, takim jak w odorotlenek glinu lub fosforan glinu. Takie cząstki lub zmodyfikowane białko L łączyć m ożna także z innym i im m unogenam i uzyskując w ten sposób szczepionki kom binow ane. Patrz np. New Trends and Developm ents in Vaccines, wyd. Voller i inni, University P ark Press, Baltimore, W D (1978). Takie zm odyfikowane białka L, same lub w cząstkach o mieszanym lub hom ogenicznym składzie podjednostkow ym, opisane powyżej, poszerzają zakres działania przeciwciał w stosunku do HBV i mogą zapewnić wcześniejszą reakcję na zmiany spowodow ane atakiem wirusowym u osób zaszczepionych szczepionkam i zawierającymi takie białka. Ponadto szczepionki zawierające takie zmodyfikowane białka L m ogą zapewnić u osób, które nie reagują na białka S wywoływanie reakcji pres, albo pow iększyć lub wzmocnić reakcję S. Cząstki wytwarzane i/lu b zmodyfikowane białka L mogą również znaleźć zastosowanie jako próbki lub reagenty do w ykrywania HBV lub białek pochodzących z HBV, albo przeciwciał anty-h B V w próbkach biologicznych, na drodze zwykłych p rób im m unologicznych itp. Wszystkie opisane szczepionki podawać można w odpowiedni sposób, np. podskórnie, dożylnie lub domięśniowo. Ilość im m unogenu w każdej dawce szczepionki dobiera nadzorujący lekarz biorąc pod uwagę wiek pacjenta, jego wagę, płeć, ogólny stan fizyczny itp. Ilość w yw ołująca reakcję

16 odpornościową u pacjenta bez widocznych niekorzystnych efektów ubocznych może zmieniać się w zależności od stosow anego im m unogenu oraz ewentualnej obecności dodatków. Zazywczaj oczekuje się, że każda dawka pow inna zawierać μg białka, a korzystnie 1-200μg. Dawki początkow o m ożna ewentualnie następnie zwiększyć w razie potrzeby. Sposób leczenia lub zapobiegania infekcji hepatitis B u ludzi polega na podaw aniu pacjentowi w ym agającem u tego wywołującej ochronę daw ki szczepionki według w ynalazku. Szczególnie korzystne są te szczepionki, które zawierają kom pozytowe cząstki o strukturze (L*, S), gdzie ma znaczenie podane poniżej, a S oznacza białko S powierzchniowego antygenu hepatitis B, najkorzystniej w ytw orzone w wyniku ekspresji w S. cerevisiae lub H. polym orpha. W użytym znaczeniu sym bol L* oznacza zm odyfikowano białko L zawierające reszty 12-52, i , w odniesieniu do wielkiego otwartego szkieletu odczytywania wirusa HB, serotyp ad, przedstawionego powyżej w tabeli A. Podobnie symbol gly L* oznacza zmodyfikowane białko L zawierające resztę 12, a następnie kolejno reszty 14-52, i W ynalazek ilustrują następujące przykłady i rysunki. Figura 1: Konstrukcja plazm idu pm E4 z ph A R S1. Fragm ent HARS1 został przeniesiony do pojedynczego miejsca PvuII poprzedniego ph A R S1, przy czym sekwencje między poprzednią pozycją HARS i genem β-laktam azy, a także sam koniec 5' genu β -laktam azy, zostały wycięte. Figura 2: Schematyczne przedstawienie fagów λ zawierających fragm enty genomowego D N A Hansenula polym orpha, obejmujące a) gen M OX oraz b) gen FM D. Figura 3: M apa plazm idu pt-24. Plazm id ten zawiera fragm ent D N A obejmujący term inator genu M OX klonowany w miejscu Sm ai wielozadaniowego miejsca klonow ania puc19. Figura 4: M apy plazm idów prb-s-269 i prb-s-271 wytwarzających w wyniku ekspresji S-gen pod kontrolą odpowiednio prom otora M OX i FM D. Figura 5: Mapy plazm idów pbc, pm S-2, pfs-9. O statnie 2 plazm idy pochodzą z pbc zawierającego gen URA3 H ansenula polym orpha i powstały w wyniku insercji kaset ekspresji zawierających prom otor M OX (pms-2) lub prom otor FM D (pfs-9) do sekwencji kodującej gen URA3. Figura 6: M apa plazm idu ph K 2. Plazm id ten zawiera gen kanam ycyny (pochodzący z Tn5) pod kontrolą prom otora ADH1 z Saccharomyces cerevisiae. Plazm id ph K 2 dodatkow o zawiera rów nież sekwencję HARS1. Figura 7: Mapy plazm idów prb-s-322 i prb-s-326. Jednostka funkcyjna zawierająca gen odporności na kanamycynę oraz p rom otor ADH1, występujące w plazm idzie ph K, zostały wstawione do regionów HARS plazm idów prb-s-269 i prb-s-271. Figura 8: Konstrukcja pm PS-22 z pm O X -P /T 1. Gen pres wirusa Hepatitis B został wstawiony w miejsce EcoRI plazm idu p M O X -P /T 1. W uzyskanym plazm idzie pm PS-22 gen pres jest regulowany przez prom otor MOX. Figura 9: M apa plazm idu pm PS-9. W celu konstrukcji tego plazm idu wykonano insercję kasety ekspresji pres z pm PS-22 między miejsca XhoI i Stul fragm entu H ansenula wyjściowego plazm idu pbc. Figura 10: M apa genu URA3 H ansenula polym orpha wraz z sąsiednimi regionami DNA. Figura 11: Diagram ilustrujący budow ę plazm idu pm PT121, do którego m ożna wstawić obce sekwencje genowe pod kontrolą prom otora MOX. Figura 12: Diagram ilustrujący budowę plazm idu pk L *l, zawierającego kasetę ekspresji białka L* pod kontrolą prom otora M OX. Figura 13: Schematyczny d iagram przedstaw iający etapy konstrukcji plazm idu E. coli kotw i- czącego kasetę ekspresji białka L, z wyciętą G lyl3, prit Figura 14: Schematyczny diagram ilustrujący procedurę wytwarzania plazm idu drożdżowego prit12979 zdolnego do ekspresji białka L z wyciętą G lyl3. Figura 15: Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję plazm idu prit13191 zaw ierającego sekwencję kodującą białko L, z którego wycięto am inokw asy i Figura 16: Schematyczny diagram ilustrujący konstrukcję drożdżowych plazm idów ekspresji prit13192 i prit13193, zaw ierających kasety ekspresji białek odpow iednio L* i ΔGlyL*.

17 I M ateriały 1. Plazmidy Plazmidy wspom niane w opisie opisane są w części A poniżej. 2. Szczepy drożdży H ansenula polym orpha RB 10 (ura 3) jest m utantem H ansenula polym orpha A TCC uzyskanym w wyniku mutagenezy z wykorzystaniem m etanosulfonianu etylu (EM S), zasadniczo w sposób opisany przez R oggenkam pa i innych (1986). 3. Enzymy Endonukleazy restrykcyjne, ligazę T4 DNA oraz inne stosow ane enzymy otrzym ano z Boeh ringer, M annheim, Republika Federalna Niemiec lub z Bethesda Research Laboratories, Eggen stein, Republika Federalna Niemiec. Enzymy te stosowano zgodnie z instrukcjam i odpowiedniego wytwórcy. 4. Reagenty immunologiczne a) S 1.1: m onoklonalne przeciwciało mysie, specyficzne względem dom eny S 1 białka pres1 (Sm ithkline Biologicals, R ixensart, Belgia). b) S2.1, S2.2 oraz S2.5: m onoklonalne przeciwciała mysie specyficzne względem dom eny S2 powierzchniow ego antygenu hepatitis B (Sm ithkline Biologicals, R ixensart, Belgia). Przeciwciała specyficzne względem dom eny S 1 i dom eny S2 powierzchniowego antygenu hepatitis B określane są ja k o przeciwciała pres. c) RF6: m onoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem domeny S powierzchniowego antygenu hepatitis B (H. Thom as, Royal Free Hospital, Londyn) d) RF1: m onoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem konform acyjnie uzależnionego epitiopu zlokalizowanego w regionie S (H. Thom as, Royal Free Hospital, Londyn). e) HBS1: m onoklonalne przeciwciało mysie skierowane przeciw epitopowi odpornem u na denaturację i redukcję, pochodzącem u z plazmowego HBsAg, zlokalizowanego w regionie S (Sm ithk line B iologicals, R ixensart, Belgia). To m onoklonalne przeciw ciało stosow ano w eksperymentach zamiennie z M ab RF6. Przeciwciała a), b) oraz e) wykonano zgodnie ze standardowym i proceduram i dokonując fuzji mysich kom órek ze śledziony, z kom órkam i myeloma. Opis m etody znajduje się w pracy K ohlera i Milsteina, M etody ujawnione są ponadto w książce G odinga, M onoclonal Antibodies, Principles and Practice, Academ ic Press, Londyn f) AUSRIA (A bbott Laboratories, W iesbaden-delkenheim, Republika Federalna Niemiec i Louvain-Lać'Neuve, Belgia): handlowy zestaw zawierający poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw rodzim ym epitopom konform acyjnym. g) AUSZYM E (A bbott Laboratories, W iesbaden-delkenheim, Republika Federalna Niemiec oraz Louvain-La-N euve, Belgia): handlow y zestaw zawierający m onoklonalne przeciw ciała skierowane przeciw rodzim em u epitopowi konformacyjnemu. Przeciwciała wymienione w punktach f) i g) są dostępne w handlu. Nie reagują one z m onom e rycznym pow ierzchniow ym antygenem hepatitis B. h) AUSAB (A bbott Laboratories, Louvain-La-Neuve, Belgia): handlowy zestaw do wykrywania przeciwciał anty-hbsag. 5. Ośrodki Pepton 190, ekstrakt drożdżowy, kwasy Casam ino oraz bazę drożdżow o-azotow ą, stosow ane do przygotowywania ośrodków, otrzym ano z Gibco Ltd., Paisley, Wielka Brytania. W celu przygotow ania płytek agarowych do odpowiedniego ośrodka dodaw ano przed autoklawowaniem 1 8 g/dm 3 agaru (Gibco Ltd.). a) SMR: Średnio bogaty ośrodek nieselektywny Składnik Ilość, g /dm 3 Pepton Ekstrakt drożdżowy 1 Kwasy Casamino (Pepton 5) 3 Baza drożdżowo-azotowa, bez (NH4)2SO4 1,4 (NH4)2SO4, 5 Źródła węgla: glikoza 20 albo gliceryna 20 albo metanol 10

18 SMR zawierający m etanol określany jest również jako Met-SMR. b) YNB: Ośrodek selektywny Baza drozdżowo-azotowa bez (NH4)2SO4 (Gibco lub Difco) 1,4 g /d m 3 (NH4)2SO4 5 g /dm 3 Źródła węgla: glikoza 20g/dm 3 albo gliceryna 20 g /dm 3 albo metanol 10 g /dm 3 c) YEPD: Nieselektywny, bogaty ośrodek Ekstrakt drożdżowy 10 g /dm 3 Pepton g /dm 3 Glikoza 20 g /d m 3 W razie potrzeby dodawano gentamycynę G418 w ilości 1 mg/ml ośrodka d) Ośrodek S Składnik Ilość w 1 dm 3 (NH4)2SO4 KH2PO4 Mg4SO4 7H2O NaCl CaCl2 2H2O Monochlorowodorek L-histydyny LD-metionina LD-tryptofan H 3BO CuSO4 5H2O KJ FeCl3-6H 2O MnSO4 H2O Na2MoO4 2H2O ZnSO4 7H2O Biotyna Pantotenian Ca Kwas foliowy Inozytol Niacyna Kwas p-aminobenzoesowy Chlorowodorek pirydoksyny Ryboflawina Chlorowodorek tiaminy 5g 4g 2g 0,1 g 0,4 g 10 mg 9 mg 9 mg 2 mg 0,16mg 0,4 mg 0,8 mg 1,6 mg 0,8 mg 1,6 mg 0,16 mg 32 mg 0,16mg 160 mg 0,4 mg 0,2 mg 32 mg 0,2 mg 32 mg II Metody 1. Manipulowanie DNA Rozszczepianie endonukleazam i restrykcyjnymi, ligowanie z wykorzystaniem ligazy T4 DNA, fosforylowanie DNA, wydzielanie D N A z E. coli, rozdzielanie DNA m etodą elektroforezy na żelu, a także inne techniki należące do dziedziny inżynierii i technologii genetycznej, wykorzystywane w przykładach, przeprow adzano zasadniczo w sposób opisany przez M aniatisa i innych, Transformawanie drożdży Drożdże m etylotropowe transform uje się sposobam i opisanymi uprzednio (Roggenkam p i inni, 1986). Korzystnie stosuje się metodę z nieczynnymi zamrożonymi kom órkam i (Klebe i inni, 1983). a) Transformowane kom órki identyfikuje się na podstawie kom plementacji deficytu ura3 lub odporności na gentamycynę. Odporność na gentamycynę G418 badano dokonując powiewu kom órek na płytkach YEPD zawierających 25 ml zestalonego ośrodka. Po prowadzeniu hodowli na płytkach w ciągu 6 godzin na każdą z płytek naniesiono 1 ml roztw oru wodnego zawierającego 25 mg gentam ycyny 418 i inkubację kontynuowano przez 2-3 dni. Gentam ycynę G418 (nazwa handlow a - Geneticin) otrzym ano z Gibco Ltd.

19 b) Segregację mitotycznie trwałych transform antów przeprow adzano wybierając transform anty z płytki do selektywnej transform acji i hodując je w ciekłym ośrodku selekcyjnym (YNB lub Y EPD, z 1 m g/m l G418) w ciągu 20 generacji (2 przejścia). Po tym okresie wzrostu kom órki przenoszono do nieselektywnego ośrodka (SMR lub YEPD) i prow adzono hodowlę w ciągu generacji (5-6 przejść). Z kolei kom órki posiewano na selektywnej płytce (YNB lub YEPD z 1 m g/m l G 4 18), w wyniku czego zachowane zostały klony wytwarzające w dalszym ciągu w wyniku ekspresji selektywny m arker. 3. Wydzielanie DNA drożdży Całkowity D N A z drożdży otrzymywano w sposób opisany przez Struhla i innych (1979). 4. Analiza DNA drożdży Strukturę D N A w transform antach drożdży analizowano na drodze roztw arzania odpowiednimi endonukleazam i restrykcyjnym i, a następnie elektroforezy na żelu agarozowym. Fragm enty D N A przenoszono na nitrocelulozę i hybrydyzow ano z odpow iednią sondą radioaktyw nie znaczonego D N A (Southern, 1975). 5. Analiza immunologiczna Blotting m etodą W esterna a) Procedura Am ersham Białka uzyskane z surowych ekstraktów lub z frakcji gradientow ych rozdzielano m etodą elektroforezy na SDS-żelu poliakryloam idowym (Laemmli, 1970), stosując 12,5% rozdzielające, 5% zbierające żele. Pasm a białek przenoszono następnie na nitrocelulozę zasadniczo w sposób opisany przez Tow bina i innych, (1979). M ateriał antygenowy wykrywano przeprowadzając reakcję plam y ze specyficznymi przeciwciałami. Kom pleks antygen-przeciwciało wilualizowano działając; na filtr biotynylowanym przeciwciałem RPN 1001 (Am ersham Buchler Gm bh and Co., Ltd. Braunschweig, Republika Federalna Niemiec) w rozcieńczeniu 1:300, a następnie prow adząc inkubację z kom pleksem peroksydaza-streptaw idyna RPN 1051 (Amersham). Wszystkie etapy eksperym entu prow adzono zgodnie z instrukcjam i producenta. b) Alternatyw nie filtr następnie inkubowano z 0,05% (w agow o/objętościow ych) Tween w PBS. Po inkubacji z danym przeciwciałem m onoklonalnym, wiązanie przeciwciała wykrywano prow adząc kolejno inkubację z biotynylow anym przeciwmysim IgG z owcy (R PN 1021, A m ersham ) w rozcieńczeniu 1:250, z dodatkiem 0,05% Tween 20, z kom pleksem streptaw idyny z biotynylow aną peroksydazą z chrzanu (RPN 1051, A m ersham, rozcieńczenie 1:400 w PBS zaw ierającym 1% żelatyny), a na koniec z 30μI H 2O2 i 10 ml odczynika do barwnego wywoływania H R P, zawierającego 4-chloro-1-naftol (3m g/m l metanolu) w 50 ml PBS. Między poszczególnymi inkubacjami filtr przemywano PBS zawierającym 0,05% Tween 20. Ocenę ilościową wytworzonych monomerycznych antygentów (S i pres) wykonywano porów nując próbki 0,01-0,3μg oczyszczonego HBsAg pochodzącego z drożdży (SmithKline Biologicals) z 3-5 różnymi rozcieńczeniami ekstraktu surowego białka H ansenula, zawierającego 2-20μg pełnego białka kom órkow ego. Stężenie białek oznaczano z wykorzystaniem zestawu do analizy białek BioRad (BioRad, M onachium, R epublika Federalna Niemiec). Przykłady. Część A Plazmidy Przykład I. K onstrukcja plazm idów umożliwiających ekspresję białka w Hansenula polym orpha a) K onstrukcja podstawowego plazmidu zawierającego sekwencję ulegającą autonomicznej replikacji, z H ansenula polym orpha (pme4). Macierzysty plazm id wykorzystywany w konstrukcji plazm idów zawierających gen S pod kontrolą prom otorów H ansenula stanowi pm E4, opisany już w pracy doktorskiej M. Eckarta, pm E4 jest pochodną YIp5 (Struhl i inni, 1979; Stinchcomb i inni, 1980) uzyskiwaną na drodze następujących m odyfikacji: Autonom icznie ulegają replikacji sekwencję HARS1 z H anensula polym orpha klonuje się w miejscu SalI w YIp5, jak to ujawniono w pracy Roggenkampa i innych (1986) uzyskując phars.

20 Plazmid phars zrekonstruow ano następnie dokonując delecji i ponownej insercji fragm entu H A R Sl-Sall o 440 parach zasad w miejscu PvuII tego samego w ektora. Lepkie końce Sall fragm entu zmieniono w tępe przed ligowaniem, na drodze inkubacji z egzonukleazą VII, a następnie reakcji z polim erazą Klenowa. W wyniku takiej konstrukcji uzyskano pojedyncze miejsce Sall w genie odporności na tetracyklinę w części pbr322 plazm idu. Uzyskany w ten sposób pośredni plazm id poddano ponow nie rekonstrukcji w celu uzyskania genu β -laktam azy nie zawierającego wyjściowej sekwencji sygnalnej, w którym sekwencja sygnalna została zastąpiona linkerem przedstaw ionym poniżej; szczegóły - p atrz E ckart (1988): SalI EcoRI BstEII GTC CAG GAC CTG GAA CTT TTC AAG AAA TTT ATG TAC Met TCC AGG Ser G G T CAC CCA GTG Gly His β-laktamaza Ten etap, w którym uzyskuje się plazm id pm E4, przedstaw iono na fig. 1. b) Fragmenty prom otorów M OX i FM D W ydzielanie prom otora M OX z H. polym orpha opisane jest przez Eckarta, D la celów wynalazku genomowy fragm ent EcoRI-Sall o 1525 bp, zawierający górny region kontrolny genu M OX oraz kodony pierwszych pięciu am inokwasów w białku M OX, klonow ano w pochodnej pbr322. Schematyczne przedstawienie genu M OX podano na fig. 2. Ten pośredni plazm id rozszczepiono za pom ocą EcoRI, poddano obróbce nukleazą Ba131 i zligowano z linkierami EcoRI. Uzyskano w ten sposób szereg fragm entów prom otora zawierających końce EcoRI 3' oraz SalI 5', po rozszczepieniu endonukleazą restrykcyjną SalI. Pozycje różnych końcowych punktów delecji ustalono na podstawie sekwencjonow ania D N A zgodnie z m etodą M axam a i G ilberta, W dalszych eksperym entach przedstaw ionych w tym opisie zastosowano plazm id oznaczony jako pbr322-mp zawierający delecję aż do pozycji -3 (przy czym pierwszą zasadą kodonu inicjowania translacji M O X jest zasada + 1). Plazm id pbr322-m P opisany jest przez E ckarta, Wydzielanie i charakterystyka prom otora FM D opisane są w zgłoszeniu patentowym europejskim nr D la celów wynalazku fragm ent Bam H I o 1,4 kb, zawierający przedni fragment prom otora o około 1000 bp, klonowano w miejscu Bam HI w puc19. W yselekcjonowano klon, w którym insert został zorientow any w taki sposób, aby przy końcu 3' w staw ionego fragm entu znajdowało się pojedyncze miejsce EcoRI zpu C19. Schematyczne przedstawienie genomowego klonu zawierającego gen FM D obejm ujący jego prom otor, podano na fig. 2B. W ykonano szereg delecji nukleazą Bal31, poczynając od miejsca EcoRI wewnątrz linkera puc19, w celu uzyskania plazm idów zawierających prom otor bez sekwencji genu strukturalnego. Po obróbce za pom ocą Bal31 D N A zligowano z linkeram i EcoRI, DNA rozszczepiono za pom ocą Bam HI i uzyskane fragm enty Bam H I-EcoRI klonow ano w pbr322. Uzyskano w ten sposób różne delecje. Najbardziej efektywne w późniejszych eksperymentach okazały się delecje do pozycji -5 i -9 od pierwszego ATG. W dalszych eksperym entach przedstawionych w opisie wykorzystywano plazmid przenoszący fragm ent prom otora zawierający delecję do pozycji -9 od pierwszego ATG (plazmid pbr322-fmd-p-9). Schematyczne przedstawienie fragmentów prom otorów M OX i FM D, stosowanych w konstrukcjach kolejnych plazm idów, pokazano poniżej, a) Fragment prom otora M OX (-3) S a li EcoRI / 1500 b p / AAACTACAAAAAC GGAATTCC L inker

21 b) Fragm ent prom otora FM D (-9) BamHI EcoRI / 1000 b p / TTCATC GGAAT TCC L inker C) Term inator Wydzielanie term inatora transkrypcji z genu MOX opisano w pracy Eckarta, Schematyczne przedstawienie regionu 3' genu M OX pokazano poniżej: Arg Ph e Stop AGA TTC TAA S a l I A s p E c o R V N r u I < b p > < b p > < b p > < b p > Fragm ent Sall-N rul przedstaw iony na powyższym schemacie subklonow ano w pbr322 pom iędzy miejsca SalI i N rul, po czym plazmid ten rozszczepiono za pom ocą endonukleazy restrykcyjnej A sp718 uzyskując dzięki temu linearyzację plazm idu na skutek pojedynczego miejsca Asp718 wewnątrz otwartego szkieletu odczytywania, który poddano delecjom Ba131. W wyniku analizy sekwencji DN A uzyskanych fragm entów zidentyfikowano fragm ent term i- natora o około 320 bp (E ckart, 1988), który w dalszym ciągu działa jak o term inator. Ten fragm ent term inatora z lepkimi końcam i (G A C A TA C C -315bp-EcoR V ) zligowano z miejscem Sm al w puc19. Orientację fragm entu ustalono na podstawie analizy sekwencyjnej (M axam i G ilbert, 1977). Uzyskany klon pt-24 przedstaw iono na fig. 3. Klon ten zastosow ano w konstrukcji w ektorów ekspresji, ja k to przedstaw iono poniżej. D) Selektywne geny markerowe. pm E4 (opisany powyżej, patrz fig. 1) rozszczepiono za pom ocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono polim erazą Klenowa. Plazmid pt-24 roztworzono za pom ocą EcoRI i H in d lll, po czym wydzielono fragm ent zawierający linker puc19 i fragm ent term inatora MOX. Lepkie końce tego fragm entu przekształcono w końce tępe stosując obróbkę polim erazą Klenowa, po czym fragm ent z tępymi końcam i zligowano z pme4. Uzyskany plazm id nazwano pp/t-24. Miejsca klonow ania pochodzące z pu C 19 wykorzystano następnie w kolejnych etapach klonow ania. Plazmid pp/t -24 zawiera gen S. cerevisiae URA3 jako selektywny m arker. Jako kolejny selektywny m arker wprow adzono gen nadający odporność na chloram fenikol. Gen ten wydzielono z wektora pbr325 jako fragm ent A atll-c lal o 1,7 kb, który poddano krótkiem u trawieniu B al31 w celu usunięcia po około 4 p ar zasad z każdej ze stron i tępo zakończono w wyniku reakcji wypełniania Klenowa. Następnie fragm ent zligowano z pp/t -24, który rozszczepiono za pom ocą N rul. Uzyskany plazmid wykazujący odporność na chloramfenikol nazwano pp/t-24-c.

22 Przykład II. K onstrukcja plazm idu zawierającego gen powierzchniowego antygenu H epattis B w funkcjonalnej kom binacji z term inatorem H ansenula polym orpha. W celu uzyskania funkcjonalnej jednostki zawierającej S-gen Hepatitis B oraz term inator skutecznie działający w H ansenula polym orpha, gen S wprow adzono jako N col-ecori fragm ent o 683 bp do miejsca Bam HI plazm idu pp/t -24C występujące w części tego plazmidu odpowiadającej linkierowi puc19. Fragm ent o 683 bp otrzym ano z prit12331 będącego zwykłym wektorem puc9 opartym na E. coli, zawierającym fragm ent D N A N col-ecor I o 683 bp, kodujący białko S od N col w kodonie ATG (C C A TG G ) do EcoRI poza kodonem stopu TAA (TAACGAATTC). Sekwencję kodującą antygen powierzchniowy otrzym ano zwykłymi technikami zrekom binowanego DNA z pr IT ujaw niono w opisie patentow ym europejskim nr A oraz w pracy H arforda i innych, prit10616 zawiera genom wirusa HBV serotypu adw, klonowany w pacyc184. Zdeponowano go w Am erican Type Culture Collection na w arunkach Konwencji Budapeszteńskiej, dnia 2 czerwca 1982, p o d nr ATCC Lepkie końce fragm entu genu S oraz pp/t-24c rozszczepionego za pom ocą Bam HI przekształcono w końce tępe na drodze wypełniania, przed ligowaniem. Ligowanie fragm entu z odpowiednią orientacją regeneruje sąsiednie miejsce Bam HI i N col w konstrukcji, tuż przy 5' względem regionu kodującego genu S. U zyskany plazm id nazw ano prb-s. Przykład III. K onstrukcja plazm idów zawierających funkcyjną kasetę ekspresji obejm u- jącą prom otory pochodzące z H ansenula polym orpha, gen antygenu powierzchniowego Hepatitis B oraz term inator Hansenula polym orpha. Pochodzące z pbr322, pbr322-m P i pbr322-fm D -/-9, zawierające odpowiednio prom o- tory MOX i FM D strawiono za pom ocą EcoRI, po czym lepkie końce wypełniono stosując polimerazę Klenowa. Plazmidy rozszczepiono następnie za pom ocą SalI. Uzyskany fragm ent zawierający MOX obejmuje wyłącznie genomowy D N A z H ansenula polym orpha, podczas gdy fragm ent zawierający prom otor FM D obejmuje dodatkow o sekwencje pbr322 o 275 bp (pozycje od bp 375 do pb 650 na mapie pbr322). Plazmid prb-s przecięto przy zregenerowanym miejscu B am H I, miejsce przekształcono w tępy koniec w wyniku wypełniania polim erazą Klenowa, po czym plazm id strawiono za pom ocą SalI. Fragmenty prom otora zawierające lepki koniec SalI oraz tępy koniec zligowano z wielkim fragmentem prb-s o tępym końcu SalI, zawierającym region kodujący region S oraz term inator H ansenula polym orpha. Uzyskane plazm idy nazwano prb-s-269 (prom otor M OX) oraz prb-s- 271 (prom otor FM D, delecja -9). Zawierają one gen S pod kontrolą prom otora i term inatora H ansenula polym orpha, jak to przedstaw iono na fig. 4. Sekwencję otaczającą połączenie między genem S i prom otoram i przedstaw iono schem atycznie poniżej. a) Połączenie MOX - prom otor (prb-s-269) Plazmidom skonstruow anym identycznie jak prb-s-271 i prb-s-269, ale nie zawierającym insercji fragmentu restrykcyjnego o 440 bp, przenoszącego sekwencje HARS1, nadano nazwy prb-s-2691 i prb-s Plazm idy te zastosowano do wytwarzania integrantów zawierających 1-3 kopie kasety ekspresji.

23 Przykład IV. K onstrukcja wektorów integracyjnych zawierających gen S. a) Konstrukcja plazm idu pbc zawierającego sekwencje autonom icznie ulegające replikacji, z Hansenula Polym orpha oraz gen URA3 Hansenula polym orpha. Plazmid pbc stanow i pochodną plazmidu YRp7 (Tschum per i C arbon, 1980) zawierającą sekwencję ARS1 Saccharom yces cerevisiae. Ta autonom icznie ulegająca replikacji sekwencja została zdezaktyzow ana w wyniku insercji fragm entu B glll-sphi o 5400 bp, zawierającego gen URA3 z H ansenula polym orpha. Autonomicznie ulegającą replikacji sekwencję 1 (HARS1) H ansenula klonow ano rów nież w miejscu SalI genu odporności na tetracyklinę (fig. 5). b) Insercja kaset ekspresji w plazm idzie pbc. Plazmid prb-s-269 poddano trawieniu za pom ocą BspM II i SalI. Uzyskany fragm ent zawierający kasetę ekspresji obejm ującą prom otor M OX, region kodujący powierzchniowy antygen Hepatitis B oraz term inator, przekształcono tak, że zawierał tępe końce, po czym zligowano z plazm idem pbc, po czym przeprow adzono rozszczepianie za pom ocą X hol i Stul i wypełnianie lepkich końców X hol. Uzyskany plazm id pm S-2 zawiera kasetę ekspresji genu S otoczoną sekwencjami flankującymi z fragmentu genu URA3 H ansenula polym orpha. W celu zintegrow ania kasety ekspresji genu S w genomie H ansenula polym orpha, plazm id pm S2 rozszczepiono za pom ocą N hel i uzyskany fragm ent o 6,1 kb zastosow ano do transform o- wania komórek. W ektor pfs-9 skonstruow ano w analogiczny sposób, z tym że kasetę ekspresji wydzielono z prb-s-271, zawierającego prom otor FM D. Szczegółowy opis uzyskanych plazm idów przedstaw iono n a fig. 5. Przykład V. K onstrukcja plazmidów zawierających kasetę ekspresji oraz dodatkow y gen selektywnego m arkera. a) Konstrukcja podstaw owego plazmidu phk2. W celu w ykonania konstrukcji plazm idu ph K 2 (fig. 6; zdeponow any na w arunkach K onw encji budapeszteńskiej w D SM (Deutsche Sammlung von M ikroorganism en und Zellkulturen G m bh ) pod nr 5328 dnia 27 kw ietnia 1989) gen odporności na kanam ycynę wydzielono z transpozonu Tn5 (Grindley i Joyce, 1980). Niepotrzebne sekwencje wycięto stosując obróbkę genu strukturalnego za pom ocą nukleazy Bal31. Uzyskany fragm ent obejmujący strukturalny gen kanamycyny obejm ujący term inator kanamycyny, zligowano z prom otorem ADH1 z Saccharomyces cerevisiae (H itzem an i inni, 1981). Ponadto sekwencję HARS1 wprow adzono jako fragm ent SalI o 440 bp do plazm idu. b) K onstrukcja szczepów odpornych na kanamycynę, pochodzących z prb-s-269 i prb-s-271. Fragm ent H in d lll z ph K obejmującego region kodujący odporność na kanamycynę (3,5 kb) klonowano w miejsce H in d lll występujące w sekwencji HARS1 w plazm idach prb-s-269 i prb-s-271. Uzyskane plazm idy, którym nadano odpowiednio nazwy prb-s-322 i prb-s-326, przedstaw iono na fig. 7. Przykład VI. K onstrukcja macierzystego plazmidu dla ekspresji białek pre-s. Plazmid pp/t -24 (przykład II) zrekonstruow ano w celu uzyskania plazm idu p M O X -P /T 1 (fig. 8) przenoszącego uniw ersalną kasetę ekspresji zawierającą prom otor M OX, miejsce wielokrotnego klonowania i term onator MOX. W celu dokonania insersji linkera zawierającego miejsca restrykcyjne endonukleaz SalI, EcoRI, B glll i Bam H I, linker puc19 z plazm idu pp/t -24 zastąpiono częściowo syntetycznym D N A zawierającym m iejsca restrykcyjne dla wyżej w spom nianych enzymów. Plazmid pp /T -24 rozszczepiono endonukleazami restrykcyjnym i Bam H I i SalI. Miejsca te pochodzą z linkera puc19 (Bam H I) oraz z pm E4 (SalI). D okonano insercji linkera - cząsteczki zawierającej miejsca restrykcyjne SalI, EcoRI, Bglll i BamHI. Uzyskany plazm id p T 1 roztw orzono za pom ocą EcoRI i SalI, po czym dokonano insercji prom otora M OX jako fragm entu EcoRI-Sall o 1,5 kb, uzyskując plazm id pt2. Istotne obszary plazm idu pt 2 przedstaw iono poniżej:

24 S a li EcoRI Bglll BamHI / / ----AAAAAC GGAATTC AGATCT GGATCC AGCTT < > Prom otor MOZ T erm inator Plazmid pt2 zawiera ponadto gen ARS H ansenula polym orpha oraz URA3 Saccharomyces cerevisiae, podobnie jak plazm id prb-269 (fig. 3). Następny etap konstrukcji obejm ow ał zastąpienie genu URA3 Saccharomyces cerevisiae przez gen URA3 pochodzący z H ansenula polym orpha. Klon zawierający ten gen wydzielono w sposób opisany poniżej w przykładzie IX. G en URA3 wydzielono jako fragm ent B am H I-B glll o 1,2 kb. Podczas gdy miejsce B glll jest oryginalnym miejscem genom owym, miejsce Bam H I pow stało w wyniku zligowania miejsca Sau3A z miejscem Bam H I stosowanym w konstrukcji banku genomowego. Lepkie końce tego fragm entu B am H I-B glll wypełniono polim erazą Klenowa i dokonano insercji w miejsce A val w pbr322, które również zostało wypełnione polim erazą Klenowa. Miejsce A val zostało zregenerowane w wyniku ligowania. Uzyskany plazm id oznaczono jako pu R A -P1. Plazmid URA3-P1 straw iono za pom ocą N rul i BspM II. Miejsca te pochodzą z pbr322, pozycje bp 974 i bp 1664 na zwykłej m apie pbr322. Plazmid pt2 poddano pełnem u roztw arzaniu za pom ocą N rul (bp 974 w pbr322) oraz częściowemu trawieniu za pom ocą BspM II. Istnieją 2 miejsca BspMII w pt2: pierwsze w pbr322 (bp 1664), a drugie zlokalizowane w term inatorze M OX. Fragm ent N rui-b spm II w pt2 (1800 bp) zawiera gen URA3 z Saccharomyces cerevisiae. Fragm ent NruI-BspM II z URA3-P1 zawierający gen H ansenula polym orpha URA3 klonowano w pt2 zastępując w ten sposób gen S. cerevisiae URA3 zlokalizowany w odpowiednim fragmencie N rui-bspm II. Uzyskany plazm id pt3 zawiera term inator M OX, linker, prom otor M OX oraz gen URA3 z Hansenula polym orpha, w podanej kolejności. Plazm id pt3 nie zawiera jednak funkcjonalnego genu β-laktamazy, jak w macierzystym plazmidzie pm E4. W celu zastąpienia tego zdefektow anego genu β-laktam azow ego przez gen funkcjonalny, pbr322 strawiono za pom ocą EcoR I, lepkie końce wypełniono polim erazą Klenowa, po czym przeprow adzono ligowanie z linkerem Asp718 o 8 bp, a następnie trawienie za pom ocą Pvul (pozycja 3738 na mapie pbr322). Uzyskany w ten sposób fragm ent Asp718-Pvul o 633 bp zawiera oryginalny p rm otor i kodon inicjow ania translacji genu β-laktam azow ego. Plazmid pt3 poddano rozszczepieniu za pom ocą Asp718 (Asp718 zlokalizowany jest na końcu term inatora MOX) i częściowemu trawieniu za pom ocą Pvul. Fragm ent Asp718-Pvul uzyskany w sposób opisany powyżej wstawiono następnie w poddany wstępnej obróbce pt3 uzyskując plazmid p M O X -P /T 1. Plazm id p M O X -P /T 1 przedstaw iono na fig. 8. Plazm id ten zawiera funkcyjny gen β-laktam azow y. Przykład VII. K onstrukcja plazm idów dokonujących ekspresji białek S. Gen pre-s kodujący białko presl-s2-s (wielkie białko) wirusa H epatitis B otrzym ano jako fragm ent N col-h indlll z prit prit12816 jest zwykłym wektorem E. coli opartym na pbr322, zawierającym fragm ent N c o l-h in d lll o 1185 bp kodujący białko presl-s2-s od N col przy kodonie ATG (CCA TG G ) do H in d lll przy bp 15 poza kodonem stopu TAA (...AAGCTT). Fragm ent sekwencji kodującej p res 1-S2-S otrzym ano technikami zwykłego klonowania z pr IT ujawnionego w zgłoszeniu patentow ym europejskim nr A oraz w pracy H arforda i innych, Fragm ent o 861 bp kodujący sekwencję pres2-s m ożna z niego również wydzielić w zwykły sposób. Fragm ent N c o l-h in d lll tępo zakończono stosując wypełnianie polim erazą Klenow a, po czym przeprow adzono klonow anie w również tępo zakończone miejsce EcoRI w pm OX- P / T 1. W wyniku prawidłowego ligowania miejsce EcoRI na początku genu strukturalnego pres 1 zostanie zregenerowane na skutek ligowania z tępo zakończonym N col/e cor I. Konstrukcji dokonującej ekspresji genu pres pod kontrolą prom otora M OX nadano nazwę pmps-22. Przedstaw iono ją na fig. 8. Analogicznej konstrukcji zawierającej p rom otor FM D nadano nazwę pm PS-21.

25 Przykład VIII. K onstrukcja wektora zawierającego kasetę ekspresji pres. Kasetę ekspresji Sall-A sp718 z plazmidu pmps22 zakończono tępo na drodze wypełniania, po czym dokonano jej insercji wypełnione miejsce X hol i miejsca Stul w plazmidzie pbc opisanym w przykładzie IV a) powyżej. Uzyskany plazm id, którem u nadano nazwę pm PS-9, przedstaw iono na fig. 9. Przykład IX. Klonowanie genu URA3 Hansenula polym orpha. Gen URA3 z H ansenula polym orpha kolonowano na drodze kom plem entacji odpowiedniej m utacji pyrf szczepu MB 1000 E. coli. Fragm enty genomowego D N A o wielkości w zakresie 6-9 kbp wydzielono na drodze częściowego trawienia za pom ocą Sau3A, rozdzielania na niskotopliwym żelu agarozowym i wydzielania odpowiedniej frakcji DNA. Oczyszczone fragm enty zligowano w jednostkowym miejscu B am H I w ektora YRp7, zawierającego sekwencję ulegającą autonom icznej replikacji z H ansenula polym orpha, wstawioną w miejsce SalI. U zyskaną m ieszaninę ligacyjną zastosowano do transform ow ania szczepu MB 1000 E. coli, po czym transform anty wyselekcjonowano na płytkach z pożyw ką m inim um bez uracylu. Uzyskane transform anty poddano analizie, a plazmidy wydzielono. W ydzielono podfragm ent przedstawiony na fig. 10, który pośredniczył w odtworzeniu fenotypu U R A + w przeprowadzonych za pom ocą 5'-m onofosforanodekarboksylazy orotydyny m utantach E. coli, Saccharomyces cerevisiae i H ansenula polym orpha. Blotting Southerna powtwierdził, że struktura klonowanego D N A była identyczna ze strukturą genomowego regionu URA3. M apę restrykcyjną fragm entu genu URA3 H ansenula polym orpha przedstawiono na fig. 10. Część B Ekspresja powierzchniowego antygenu H epatitis B (HBsAg) w H ansenula polymorpha. Przykład X. K onstrukcja szczepów H ansenula polym orpha zawierających gen S. H ansenula polym orpha RB 10 transform ow ano wyżej opisanym i plazm idam i prb-s-269, prb-s-269-i, pr B-S-271 i prb-s-271-i. O trzym ano szereg klonów zaw ierających plazm idy ulegające autonom icznie transform acji (tranform antów ) lub zintegrow ane obce D N A (integrantów). Te transform anty/integranty zbadano następnie w celu stwierdzenia, czy występuje w nich ekspresja genu S, m etodam i immunologicznymi. Zastosowano dwa układy badań: blotting W esterna oraz testy AUSRIA i AUSZYM E (Abbott). W ytwarzanie m onom eru HBsAg analizowano m etodą blottingu W esterna z wykorzystaniem m onoklonalnych przeciwciał RF6. Zestawy A bbotta, AUSRIA i AUSZYM E zastosowano zgodnie z instrukcjam i producenta w celu oceny ilości cząstek HBsAg wytwarzanych w Hansenula. Transform anty wykazujące stabilny i wysoki poziom ekspresji wyselekcjonowano, a ich DNA poddano analizie m etodą blottingu Southerna, a następnie rozdzielania elektroforetycznego. a) Transform anty Szereg kolonii zaw ierających sw obodnie replikujący plazm id otrzym ano z H ansenula polym orpha transform ow anego plazm idam i prb-s-269 i prb-s-271. Analiza Southerna pełnego DNA uzyskanego z tych transform antów, strawionego różnymi endonukleazam i restrykcyjnym i wykazała oczekiwany w zór restrykcyjny. b) Integranty H ansenula polym orpha m ożna stransform ow ać z dużą częstością wektoram i integracyjnymi prb-s-269-i oraz prb-s-271-i. Integranty hodowane na pełnej pożywce (YEPD ) są mitotycznie trwałe. Alternatyw nie m itotyczną trwałość obcego DNA w H ansenula m ożna również uzyskać w wyżej opisany sposób, zgodnie z którym wektor ulegający autonom icznej replikacji, korzystnie plazm id z dużą ilością kopii, taki jak prb-s-269 lub prb-s-271, integruje się spontanicznie w genomie. Uzyskane integranty również wykazują wysoką stabilność m itoryczną obcego D N A. Obydwie wspom niane wyżej m etody zastosowano w celu otrzym ania szczepów dokonujących wydajnej ekspresji genu S w nieselektywnej, pełnej pożywce. Zachow ano 3 szczepy: szczep o num erze identyfikacyjnym 352, który transform ow ano prb-s-271, w którym gen S jest regulowany prom otorem FM D oraz szczepy nr 415 i 416, transform owane prb-s-269 zawierającym gen S regulowany przez M OX; szczepy te zastosowano w kolejnych eksperym entach.

26 Przykład XI. M itotyczna stabilność obcego D N A w integrantach. Stabilność zrekom binow anych szczepów 352, 415 i 416, zbadano zgodnie z następującą m etodyką: szczepy hodow ano w nieselektywnym ośrodku SMR tak, aby uzyskać 40 pokoleń. Z hodowli wydzielono 20 niezależnych kolonii przed i po okresie 40-pokoleniowym. Strukturę obecego D N A oraz ilość kopii kasety ekspresji analizow ano w wydzielonych klonach metodą blottingu Southerna w kom binacji z elektroforezą na żelu agarozowym fragm entów restrykcyjnych oraz elektroforezą żelową z gradientem drgającego pola pełnych chrom ozonów. Ta ostatnia technika um ożliw ia rozdzielanie i analizę chrom ozom ów drożdży (Schw artz i C antor, 1984). Elektroforeza żelowa w polu drgającym (PFG E). K om órki szczepów 415, 416 i 352 poddano łagodnej lizie w gnieździe na próbki z 0,7% (wagowo/objętościowo) żelu agarozowego. Uwolnione in situ chrom ozom y oddzielono za pom ocą urządzenia LK B-Pharm acia Pulsaphor Plus, zgodnie z instrukcjam i LKB-Pharm acia. Po PFG E D N A przeniesiono na nitrocelulozę, zgodnie z procedurą Southerna (1975). Plamę poddano hybrydyzacji z zastosowaniem sond znaczonych 32P, specyficznych dla M OX i/lu b genu FM D albo genu URA3 z H ansenula polym orpha, przy czym wiadom o, że genom zawiera pojedynczą kopię tego ostatniego genu. Porów nanie sygnałów pochodzących z dopuszczalnych m ultim erycznych integrantów i sygnałów jednokopiowych genów (m arkerów wewnętrznych) umożliwiło ocenę ilości kopii związanych kaset ekspresji znajdujących się wewnątrz kom órki. Analiza chrom ozom ów m etodą PFG E wykazała, że klon 415 zawiera około kopii kasety ekspresji, podczas gdy klon 416 zawiera około 5-6 kaset ekspresji, a klon 352 około 10 kaset ekspresji. Analiza wykazała, że obcy D N A jest zintegrowany w genomie Hansenula. A naliza Southerna. Szczepy 352, 415 i 416 hodow ano przez 40 pokoleń w ośrodku SMR. Z każdej partii wydzielono 12 niezależnych kolonii, przed i po wyżej wspom nianym okresie hodowli. Preparaty D N A z tych sub-klonów poddano analizie S outherna po rozszczepianiu różnym i enzym am i restrykcyjnymi, z zastosowaniem sond D N A znaczonych 32P. A naliza wzorów restrykcyjnych wykazała, że kasety ekspresji pozostały nienaruszone, oraz że wprowadzony D N A był genetycznie trwały. Analiza potwierdziła ponadto, że genom szczepu 415 zawiera długie pow tórki z szeregu kopii plazm idu. W ywnioskowano, że w pow tórce takiej występuje połączenie plazm idów typu głowa do ogona. Przykład XII. Badania ekspresji. Zrekom binowane szczepy badano rutynow o w celu stwierdzenia obecności HBsAg, metodą blottingu W esterna oraz za pom ocą testów A U SRIA /A U SZY M E. a) W zrost hodowli i blotting W esterna. Szczepy 352, 415 i 416 hodow ano w 11 kolbach z 200 ml ośrodka SMR-gliceryna, w tem peraturze 37 C, z intensywnym napowietrzaniem. Na początku fazy stacjonarnej, która charakteryzuje się wyczerpaniem gliceryny, dodano 50 m l/d m 3 5-krotnie stężonego ośrodka SMR bez gliceryny oraz m etanol w ilości odpowiadającej jego ostatecznem u stężeni 10g/dm 3. Próbki objętości 10 ml pobrano z hodowli przed dodaniem m etanolu oraz w 24 godziny po dodaniu m etanolu. W celach porównawczych te same szczepy hodow ano również w ośrodku SMR zawierającym 3 0 g /d m 3 glikozy (depresja prom otorów ). K om órki zebrano w późnej fazie dłużyzn. Z zebranych kom órek wykonano surowe ekstrakty białkowe na drodze dyspergowania pastylki kom órek odpowiadającej około 0,1 g suchej masy, w 5 ml buforu PE (0,5 M NaCl, 0,1% T riton X-100, 10 mm bufor fosforanow y ph 7,5, 2nM PM SF). D odano w przybliżeniu równą objętość kuleczek szklanych o średnicy 0,45 mm, tak że uzyskano prawie stałą mieszaninę. Mieszaninę intensywnie wytrząsano w ciągu 4 m inut w tem peraturze 4 C, w hom ogenizatorze Braun MSK (B. Braun i Diessel Biotech G m bh, M elsungen, Republika Federalna Niemiec). Następnie dodano 4 ml buforu PE i produkt homogenizacji wymieszano i odwirowano w ciągu 5 m inut w tem peraturze 4 C, przy przeciążeniu xg. Próbki po 5-25 μg cieczy znad osadu nanoszono na żel do elektroforezy (SD S-poliakryloam id), stosując jak o wzorce kontrolne 0,05-0,5 μg HBsAg. Obecność m ateriału antygenowego w ykazano przenosząc białko na nitrocelulozę, zgodnie z m etodyką Towbina (1979), z detekcją m onoklonalnego przeciwciała RF6 w sposób opisany powyżej w metodzie 5a. Blotting W esterna umożliwił dokonanie oceny ilości antygenu wytworzonego w klonach 3 5 2, 415 i 416, w odniesieniu do znanych ilości czystego HBsAg pochodzącego z drożdży.

27 W yniki zestawino w tabeli 1. W hodowli w kolbach indukowanej m etanolem (ośrodek SMR) przy gęstości kom órek około 5 g suchej m asy/dm 3 białko S stanow i około 2-5% całości białka w yesktrahow anego z transform ow anych szczepów. Porów nanie ekspresji w kom órkach hodowanych w w arunkach indukcji (m etanol), derepresji (gliceryna) i represji (glikoza) wykazuje ścisłą regulację prom otorów M OX i FM D. Ekspresja jest całkowicie zablokow ana w kom órkach hodowanych na glikozie. W glicerynie poziom syntezy HBsAg stanow i około 30% poziom u uzyskiwanego w kom órkach indukow anych. b) Antygenowość HBsAg wytworzonego w wyniku ekspresji w H ansenula polym orpha. Antygenowość m ateriału zawartego w surowych ekstraktach oznaczano wykonując test AUSZYM E A bbotta oparty na m onoklonalnych przeciwciałach. W yniki podaw ano w umownych jednostkach (absorbancja przy 492 nm na 0,1 μg białka; rozcieńczanie surow ych ekstraktów i reakcję prow adzono w 150 mm N acl, 25 mm buforze fosforanowym o ph 7,4,0,01 % BSA, 0,01 % Tween 20). Reaktywność w teście AUSZYM E wykazuje obecność konform acyjnych epitopów charakterystycznych dla cząstek sub-wirusowych. Tabela 1 Wytwarzanie HBsAg w szczepach z ekspresją genu S Szczep Prom otor ź ródło węgla HBsAg oceniany metodą blottingu Westerna, m g /100mg białka HBsAg oceniany w teście AUSZYME, umowne jednostki A492/ 0, 1 μg białka 352 FM D glikoza brak sygnału 0,3 gliceryna 0,8-1,2 10,0 metanol 2,5-3,0 25,0 415 MOX glikoza brak sygnału 0,1 gliceryna 1,0-1,5 12,0 metanol 4,0-5,0 45,0 416 MOX glikoza brak sygnału brak sygnału gliceryna 0,5-0,8 5,0 metanol 2,0-3,0 22,0 c) W irowanie z gradientem gęstości surowych ekstraktów H. polym orpha. Surowe ekstrakty otrzym ane zgodnie z metodyką opisaną powyżej poddano wirowaniu z gradientem gęstości, stosując CsCl lub sacharozę jako gradienty. Sedym entacyjne wirowanie gradientow e z rów now agą sacharozow ą w ykonyw ano dodając μg (200μl) surow ego ekstraktu białkowego na wierzch 20-50% gradientu sacharozowego, w 50 mm N ac l, 2m M ED TA, 25 mm N ah 2PO4 o ph 7,2. Probówki o objętości 5 ml wirowano w ciągu 18 godzin z szybkością obrotów /m inutę w wirniku Beckman SW W irow anie z gradientem chlorku cezowego przeprow adzano rozcieńczając 1 objętość surowego ekstraktu białkowego 1 objętością 3 M CsCl w 25 mm buforze fosforanowym o ph 7,4. W irowanie prow adzono w tem peraturze 4 C z szybkością 40 obrotów /m inutę w w irniku Beckman 50 Ti, w ciągu 40 godzin. G radienty poddano frakcjonow aniu, po czym różne frakcje przetestow ano z zastosowaniem przeciwciał RF6, m etodą blottingu W esterna lu b /i z wykorzystaniem testów A U SRIA i/lu b AUSZYM E. Stwierdzono, że pik m ateriału HBsAg o gęstości około 1,16-1,19 g /m l tworzy się w gradiencie gęstościowym CsCl. M ateriał występujący w tym piku reaguje bardzo dobrze nie tylko z przeciwciałami RF6 w plam ach W esterna, ale również w próbie A U SRIA i AUSZYM E. Gęstość ta, a także reaktywność w testach A U SRIA /A USZY M E wskazują na obecność konform acyjnych epitopów charakterystycznych dla cząstek. Ponadto w kolejnym eksperym encie porów nano gęstości uzyskiwanego m ateriału i sub-wirusowych cząstek wydzielonych z surowicy ludzkiej. Stw ierdzono, że obydw a m ateriały w ykazują zbliżone gęstości przy izopiknom etrycznym wirow a- niu w roztw orach CsCl. Przy wirowaniu surowych ekstraktów z gradientem sacharozowym uzyskano frakcje pików reagujące z AUSRIA i AUSZYM E, zawierające co najmniej 80% HBsAg, na co wskazuje analiza frakcji gradientowych prow adzona równolegle z AUSRIA /A U SZY M E i blottingiem W esterna.

28 Stwierdzono, że pozostałe 20% m ateriału znajduje się w wierzchnich i spodnich frakcjach gradientu i wykazuje reaktywność tylko przy analizie m etodą blottingu W esterna, co oznacza, iż m ateriał ten stanowi monomeryczna form a białka. Analiza frakcji pikowych uzyskanych z gradientów CsCl również potw ierdziła, że co najmniej 80% m ateriału tw orzy cząstki. Cząstki pochodzące z H ansenula są odporne na proteolizę. Inkubacja surowych ekstraktów białkowych zawierających cząstki w ciągu kilku godzin w różnych tem peraturach wykazała jedynie bardzo mały stopień degradacji, co stwierdzono analizując wielkości AUSZYM E oraz badając stopień nienaruszenia polipeptydu z wykorzystaniem denaturacji w SD S-PAGE, a następnie blottingu W esterna. M ateriał analizowano również m etodą m ikroskopii elektronowej. Obrazy z m ikroskopu elektronow ego wyraźnie pokazują obecność cząstek o średnicy około 22 nm. Wyżej opisane wyniki uzyskano w przypadku wszystkich 3 szczepów, 352, 415 i 416. Część C Ekspresja białka pres1-s2-s w Hansenula polymorpha Przykład X III. K onstrukcja szczepów H ansenula polym orpha zaw ierających gen pres1-s2-s. H ansenula polym orpha RB 10 transform ow ano fragm entem Pvul-Asp718 o 5570 bp, pochodzącym z pm PS-22, obejmującego gen URA3 i gen pres1 pod kontrolą prom otora M OX (patrz fig.8). Odpowiedni fragm ent zawierający gen pres1 pod kontrolą prom otora FM D (delecja -9) otrzym ano ponadto z plazm idu pm PS-21. Stwierdzono, że integranty uzyskane z tych transform a- cji zawierają 1-2 kasety ekspresji, co w ykazała analiza m etodą Southerna. Integrantom zaw ierającym gen pres1 pod kontrolą prom otora M OX nadano nazwę pres-am, a integrantom zawierającym gen pres pod kontrolą prom otora FM D nadano nazwę pres-af. Integranty zawierające szereg kaset ekspresji uzyskano wykonując transform ację Hansenula polym orpha autonom icznie replikującym i plazm idam i pm PS22 i pm P S 21, zaw ierającym i sekwencję HARS. Integranty powstały w wyniku sam orzutnej integracji tych plazm idów, jak to opisano w części Materiały i m etody, punkt 2b. Tego typu integrantom (transform antom ) nadano ogólną nazwę pres-bm (prom otor MOX) oraz pres-bf (prom otor FM D). Szczepy pres-am-405, pres-bm-402, pres-bm-403 i pres-bm-454, w których ekspresja genu pres1 jest kontrolow ana przez prom otor M OX, zachow ano do dalszej analizy. 2. Stabilność m itotyczna. Stabilność m itotyczną obcego D N A występującego w 4 szczepach zidentyfikowanych w przykładzie X III powyżej zbadano wykonując analizę Southerna 12 niezależnych subklonów wydzielonych przed i po okresie hodowli przez 40 pokoleń, w sposób opisany w części B. Analiza potwierdziła genetyczną stabilność zintegrowanych wektorów (patrz również przykład XVI w części D). 3. Ekspresja białka pres w H ansenula polym orpha. Szczepy pres-bm-402, pres-bm-403, pres-am -405 i pres-bm-454 hodow ano w ośrodku SMR zawierającym glicerynę, a następnie prow adzono indukowanie kom órek m etanolem (10g/dm 3) dokładnie w taki sam sposób, jak to opisano w części B. K om órki zebrano po 25 godzinach od dodania m etanolu, po czym przygotow ano surowe ekstrakty w sposób opisany w części B. a) Ilości po 12μg surowych ekstraktów ze szczepów pres-bm-402, pres-am-405 i pres-bm- 454 analizowano wykonując najpierw elektroforezę na poliakryloamidowym żelu SDS, a następnie blotting W esterna z zastosowaniem mieszaniny m onoklonalnych przeciwciał (S1.1, S2.2 i S2.5), w sposób opisany w M etody 5(a). Obydwa typy szczepów wykazały obecność podwójnego pasm a antygenowego przy 38/39 kd oraz dodatkow ego pasm a przy 45 kd. Szczep pres-am-405 wykazał mniejszą zaw artość składników 45 kd w stosunku do składników 39 kd niż szczep pres-bm-402. Szczep pres-bm-454 wykazał największą względną zawartość składników o 45 kd. Profil elektroforetyczny białka pres z powyższych szczepów porów nano z antygenem pochodzącym z cząstek z ludzkiej surowicy. Z porów nania plam W esterna wynika, że preparaty, zarówno ludzki jak i drożdżowy, wykazują pasm o przy około 38/39 kd. b) Zaobserwowano również różne poziom y ekspresji w przypadku różnych szczepów. Różnice te są spow odow ane przede wszystkim różnicam i w liczbie kopii kasety ekspresji m iędzy szczepami.

29 Na podstawie blottingu W esterna oceniono, że antygen pres stanowi 0,1-1,5% całości białka komórkowego w różnych szczepach pres-a i pres-b, jak to przedstawiono w tabeli 2. Na surowych ekstraktach wykonano również test AUSZYM E w celu zbadania obecności cząstek. W yniki zamieszczone w tabeli 2 wykazują bardzo m ałą reaktywność podaną w jednostkach A492 na 0,1 μg białka. Tabela 2 Ekspresja pres w H. polymorpha Klon Zawartość białka pres oceniana metodą Blottingu Westerna mg pres1/ 100mg AUSZYME jednostki A492 na 0,μ g białka pres-am-405 0,1-0,2 0,01 pres-bm-402 0,3-0,5 0,02 pres-bm-403 0,4-0,6 0,02 pres-bm-454 1,2-1,5 0,1-0,2 c) Glikozylowanie: Szczep pres-bm-453 charakteryzujący się wysoką produkcją białka pres (około 1,5% całości białka kom órkow ego) oraz silnym pasm em 45 kd wybrano do badań glikozylowania. Białko pres z pres-bm-454 analizowano prow adząc inkubację surowych ekstraktów białkowych z endoglikozydazą EndoH. Uzyskane wyniki wyraźnie wskazują, że m ateriał 45kD stanowi glikozylow aną form ę białka pres. W wyniku inkubacji 45 μg surowego białka w ciągu 0,5,1,0 i 24 godzin z 0,5 m U endoglikozydazy EndoH, zgodnie z instrukcjam i producenta (Boehringer M annheim, Republika Federalna Niemiec), nastąpiło przesunięcie pasm a 45 kd do pozornej masy cząsteczkowej 42 kd. To przesunięcie oznacza, że m ateriał 45 kd stanowi N-glikozylowaną form ę białka pres, zawierającą jedną grupę rdzeniową o około 3000 D. Do badania glikozylow ania białka pres w Hansenula polym orpha wykorzystano również tunikamycynę, znaną jak o silny inhibitor N-glikozylowania. Szczep pres-bm-454 hodow ano do uzyskania gęstości A600=10,0, w ośrodku YNB zawierającym glikozę (10 m g/dm 3). Porcją 10 ml tej hodowli zaszczepiono 100 ml YNB zawierającego 10g/dm 3 m etanolu oraz 50 μg /m l tunikam y cyny. ph ośrodka utrzym yw ano na stałym poziomie 7,2-7,5. Doświadczenie kontrolne prow a- dzono bez dodatku tunikam ycyny. Komórki zbierano po 10, 15 i 30 godzinach od m om entu zaszczepienia ośro d k a zawierającego tunikamycynę. Surowe ekstrakty białkow e analizowano m etodą blottingu W esterna. Badania wykazały, że w kom órkach hodow anych w obecności tunikamycyny widoczne jest pojedyncze pasm o przy 42 kd oraz podwójne pasm o przy 38/39 kd. W doświadczeniu kontrolnym pasm o 24 kd zostało zastąpione przez pasm o 45 kd. Podobne wyniki uzyskano w przypadku ekstraktów ze szczepów pres-bm-402, pres-bm -403 i pres-am-405, które jednak wytwarzają znacznie mniejsze ilości partii białka o 45 kd (nie więcej niż 5-10% całkowitego zsyntetyzowanego białka; pres). W yniki te sugerują, że pasm o 42 kd reprezentuje O-glikozylowaną form ę białka pres. d) W irow anie z gradientem gęstości. Surowe ekstrakty szczepu pres-am-405 oraz szczepów pres-bm-402, pres-bm-403 i pres- BM-454 poddano analizie m etodą gradientowego wirowania z sacharozą i CsCl. W arunki wirowania podano w przykładzie X II (c), część B. Frakcje gradientowe badano m etodą blottingu W esterna i testów AUSZYM E. Analiza potw ierdziła, że w przeciwieństwie do szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji antygen S (część B) albo zarów no antygeny pres1 jak i S (część D), szczepy pres nie wytwarzają wydajnie cząstek sub-wirusowych. Ani przy izopiknometrycznym wirowaniu z CsCl, ani przy gradientowym wirow aniu z sacharozą nie zaobserwowano tworzenia się pasm a o wymaganej gęstości. Potwierdziło to również fakt, że m ateriał zbliżony do HBsAg z frakcji gradientow ych oraz surowe ekstrakty źle reagują w testach AUSRIA i AUSZYME.

30 Część D Wytwarzanie cząstek kompozytowych zawierających zarówno antygeny pres i jak i S. Przykład XIV. Konstrukcja szczepów. Skonstruow ano szereg szczepów charakteryzujących się różnym i stosunkam i ekspresji pres1 do S oraz różnymi całkowitymi poziom am i ekspresji. Różnice te osiągnięto zmieniając się liczbę kopii kaset ekspresji przypadających na genom. D odatkow ą zmienność uzyskano umieszczając geny pod kontrolą tht różnych prom otorów Hansenula. Trzy podstaw ow e typy szczepów rekom binantow ych uzyskano w następujący sposób: a) Szczepy zawierające jedną kopię genu pres1 oraz jedną kopię genu S (szczepy A). F ragm ent D N A N hel o 6,6 kb, zaw ierający kasetę pres1 oraz gen U R A 3 wydzielono z plazm idu pm PS9 (fig. 9). Fragm ent D N A N hel zawierający gen S wydzielono z plazm idu pm PS2 (fig. 5). Fragm enty zligowano następnie stosując ligazę T4 D N A, po czym połączone fragm enty zawierające po jednej kopii każdego z genów wydzielono z żeli agarozowych. Fragm enty te zastosowano do transform ow ania szczepu RB 10 Hansenula polym orpha aż do osiągnięcia niezależności od uracylu. Uzyskane transform anty analizow ano m etodą blottingu Southerna, selekcjonując następnie klony zawierające po jednej zintegrowanej kopii każdej kasety. Szczep pres/a -A -293 zachowano do dalszej analizy. b) Szczepy zawierające jed n ą kasetę ekspresji pres oraz szereg kaset ekspresji S (szczepy B). H ansenula polym orpha stransform ow ano fragm entem A sp718-pvul o 5570 bp, z pm PS-22 zawierającego kasetę ekspresji pres 1. W yselekcjonow ano transform anty zaw ierające jed n ą zintegrow aną kopię kasety. Uzyskanym szczepem byą pres-am-405 opisany w części C, przykład X III, powyżej. Szczep pres-am-405 stransform ow ano następnie plazm idam i ulegającymi autonom icznie replikacji prb-s-322 (prom otor M OX) lub pbr-s-326 (prom otor FM D ) (fig. 7), zawierającymi gen S pod kontrolą odpowiednich prom otorów. Obydwa plazm idy dodatkow o zawierają gen kodujący odporność na gentamycynę G 4 18 jako selektywny m arker. Gen K an jest pod kontrolą prom otora ADH1 z Saccharomyces cerevisiae (fig. 1), jak to opisano powyżej. W wyniku transformacji uzyskano szereg szczepów zawierających w każdym przypadku jedną zintegrow aną kopię kasety pres1 oraz szereg zintegrowanych kopii (30-100) kasety zawierającej gen S, co wykazały analizy metodą blottingu Southerna i PFG E. Szczepy pres/s-b-431, pres/s-b-432 i pres/s-b-433 zachowano do dalszej analizy. Szczep pres/s-b -431 przenosi gen S kontrolow any prom otorem MOX, podczas gdy szczepy pres/s-b-432 i pres/s-b-433 zawierają kasety ekspresji obejmujące prom otor FM D. c) Szczepy zawierające szereg kaset ekspresji zarówno genu S jak i genu pres (szczepy C). H ansenula polym orpha stransform ow ano plazm idem pm BS-22 ulegającym autonom icznie replikacji, zawierającym gen pres-1 (fig. 8). W wyniku transform acji uzyskano szereg szczepów zawierających zmienne ilości kaset ekspresji zintegrow anych w jednym genom ie. Izolaty zaw ierające 2-20 kaset ekspresji pres1 zidentyfikowano m etodą blottingu Southerna. Szczepy te opisano w części C jako pres-bm-402, pres-bm-403 i pres-bm-454, wytwarzają w wyniku ekspresji różne ilości antygenu pres. Takie szczepy pres stransform ow ano następnie ponow nie plazm idam i ulegającym i autonomicznie replikacji, prb-s-322 (prom otor MOX) i prb-s-326 (prom otor FM D ), zawierającymi gen S (fig. 7). Jak o m arker transform acji zastosowano odporność na G418. W w yniku selekcji stabilnych integrantów uzyskano szereg klonów w przypadku każdej z tran sfo rm a- cji, przy czym część z nich poddano dalszej analizie. D o dalszej analizy zachow ano następujące szczepy: pres/s-c-452, pres/s-c-465 pochodzący ze szczepu pres-bm-402, szczep pres/s-c-466 pochodzący ze szczepu pres-bm-403, szczep pres/s-c-448-c4 pochodzący ze szczepu pres-bm- 454, w którym kasety ekspresji gen S zawierają prom otor FM D. W tabeli 3 przedstaw iono szczegółowe inform acje dotyczące pochodzenia i przeznaczenia wyżej w ym ienionych szczepów.

31 Tabela 3 Charakterystyka szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji zarówno białko pres jak i S Szczep Szacunkowa liczba kaset pres Szacunkowa liczba kaset S Ekspresja całkowita pres/s (W estern/ /m g/ 100 mg Reaktywność z AUSZYME jednostki umowne A492x Szacunkowy stosunek pres/s na podstawie immunoblottingu pres/s-a ok. 0,3-0,4 5,0 ok. 1:1 pres/s-b ok.10 1,5-2, ok. 1:15 pres/s-b ok ,5-3, ok. 1:15 pres/s-b ok.20 2,0-2, ok. 1:20 pres/s-c-452 kilka ok ,0-4, ok. 1:8 pres/s-c-453 kilka ,5-4, ok. 1:10 pres/s-c-465 kilka ,5-4, ok. 1:5 pres/s-c-466 kilka ,5-4, ok. 1:8 pres/s-c-448-c ,0-3, ok. 5:3 x Liczby reprezentują najmniejsze i największe wielkości wyznaczone dla danego szczepu. Przykład XV. Ekspresja białek pres i S w H. polym orpha. Ekspresję białek pres i S w różnych stransformowanych szczepach H. polym orpha zbadano m etodą im m unoblottingu opisaną w części Materiały i m etody, 5a oraz testu AUSZYM E. Podsum owanie wyników i właściwości różnych zbadanych szczepów podano w tabeli 3. Szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji zarówno białko pres jak i S hodow ano i indukowano w sposób opisany w przykładzie X II, część B, z tym że objętość hodowli wynosiła 30 ml. Surowe ekstrakty kom órkow e przygotow ano w sposób opisany powyżej i poddaw ano je elektroforezie na żelu SD S-poliakryloam idowym, a następnie blottingowi W esterna z wykorzystaniem do detekcji RF6 lub mieszanych przeciwciał m onoklonalnych S 1.1 i S μg surowych ekstraktów z indukow anych m etanolem kom órek szczepów pres/s-a-293, pres/s-b-431, pres/s-b-432, pres/s-b-433, pres/s-c-453, pres/s-c-465, pres/s-c-466 i pres/s-c-448-c4 poddaw ano immunoblottingow i stosując do detekcji m onoklonalny RF6. A naliza ta wykazała, że m ożna uzyskać cały zakres szczepów wytwarzających w wyniku ekspresji białka pres i S w różnych stosunkach. Na podstaw ie tych i innych pom iarów immunoblottingowych oszacowano, że stosunek białka pres do S w przypadku szczepu pres/s-b431 wynosi około 1:15, w przypadku szczepu pres/s-b-431 wynosi około 1:15, w przypadku szczepu pres/s-c-452 około 1:8, a w przypadku szczepu pres/s- 448-C4 około 5:3. Stwierdzono również, że szczepy różnią się poziom em wytwarzania białek, na co wskazują wyniki zarówno im m unoblottingu jak i testu AUSZYM E, przedstaw ione w tabeli 3. D okonano także im m unoblottingu ekstraktów komórkowych z tych szczepów z w ykorzystaniem do detekcji m onoklonalnego S 1.1 W przypadku większości szczepów białko pres wykryto w postaci podwójnego pasm a białkowego przy kd z mniejszymi ilościami pasm a 45 kd (które, jak to oszacow ano, stanow i zaledwie około 5% całości wykrytego białka pres). W przeciwieństwie do powyższego szczep pres/s-c-448-c4 wytwarza w wyniku ekspresji w przybliżeniu takie same ilości m ateriałów o kd i 45 kd. Przykład XVI. Stabilność obcego DNA. Stabilność obcego D N A w wyżej opisanych transform antach i integrantach p re S /S analizowano w sposób opisany w części B. Badania wykazały bardzo dobrą stabilność m itotyczną zrekom binow anych klonów. Analiza Southerna 12 niezależnych kolonii wydzielonych przed i po 40-pokoleniow ej ferm entacji szczepów pres/s-453 i pres/s-431 w ykazała, że we wszystkich p rzypadkach zaobserwować m ożna ten sam wzór fragmentów restrykcyjnych. Szczepy zestawione w tabeli 3, pers /S, analizow ano ponadto metodą elektroforezy gradientowej w polu drgającym. D okonano blottingu wydzielonych chrom ozomów na m em branach nitrocelulozowych, po czym hybrydyzow ano je z różnym i sondam i radioaktywnego DNA. Procedura taka um ożliwia oszacowanie ilości kopii kasety ekspresji S. Potwierdziła ona ostatecznie, że szczepy pres /S są integrantami. W yniki tych eksperymentów zestawiono w tabeli 3 powyżej.

32 Przykład XVIII. Wydzielanie i charakteryzowanie kompozytowych cząstek. a) Częściowe oczyszczanie kom pozytow ych cząstek z H ansenula polym orpha. Hodowlę z ferm entatora, szczep pres/s-b-431 H ansenula polym orpha, hodow ano w ośrodku S opisanym powyżej w M ateriałach, 5d, po czym kom órki oddzielono przez odwirowanie, po 78-godzinnej indukcji metanolem. Pastylkę kom órek ponownie zawieszono do uzyskania stężenia około 120 g suchej masy kom órek/dm 3, w buforze zawierającym 0,5% (wagowo/objętościowych) Tween 20, 2m M ED TA, 4m M PM SF, 5% (objętościowych) izopropanolu i 50 mm bufor z fosforanu sodowego, o ph 9,0. K om órki rozbito w młynie perełkowym (Dynom ill Type KLD, Bachofen A G, Bazylea, Szwajcaria) zawierającym perełki szklane o średnicy 0,45-0,7 m m, w ykonując 4 przejścia z szybkością przepływu 6 dm 3/godzinę przy czasie przebywania w kom orze 7 m inut. Ekstrakt kom órkow y wyklarowano w wyniku wirow ania przez 45 m inut przy przeciążeniu 16000g, w tem peraturze 4 C, po czym ciecz znad osadu oddzielono. D o cieczy znad osadu dodano 1% (wagowo-objętościowy) krzem ionki koloidalnej (Aerosil 380, Degussa, F rankfurt, Republika Federalna Niemiec) i całość mieszano przez noc w tem peraturze 4 C w celu doprow adzenia do adsorpcji HBsAg. Krzemionkę odwirowano w ciągu 30 m inut przy 4000 g w tem peraturze 4 C, po czym dw ukrotnie przem yto 0,9% (wagowo-objętościowych) NaCl stosując ponow ne dyspergowanie pastylki i ponow ne wirowanie. HBsAg zaadsorbow any na krzemionce zdesorbowano w wyniku ponownego zawieszenia przemytej pastylki w 10 mm pirofosforanie sodowym o ph i inkubowanie w ciągu 3 godzin w tem peraturze 37 C, z mieszaniem. Bufor z pirofosforanu sodowego dodano w objętości stanowiącej około 1/8-1/10 początkowej objętości wyklarowanego ekstraktu kom órkowego. Roztwór odwirowano przez 60 m inut w tem peraturze 4 C przy g, po czym ciecz znad osadu oddzielono. D o cieczy znad osadu dodano CsCl do uzyskania stężenia 1,5 M, po czym mieszaninę wirowano do uzyskania równowagi izopiknometrycznej, w ciągu 70 godzin z szybkością obrotów na minutę, w wirniku 50.2 Ti (Spinco Division, Beckman Instrum ents, Palo A lto, St. Zjedn. Amer.). Uzyskane gradienty CsCl rozfrakcjonow ano, po czym frakcje poddano analizie w celu wykrycia obecności HBsAg, z wykorzystaniem zestawu Elisa (Enzygnost, Behring-W erke AG, M arburg, Rep. Feder. Niemiec), w sposób podany przez producenta. Frakcje pikowe połączono i dializowano względem 10 mm fosforanu sodow o/potasow ego, 0,15 M NaCl, ph 6,8. Testy wykonane z tym m ateriałem oraz z surowym ekstraktem kom órkow ym wykazały, że przy zastosowaniu tej metodyki odzyskuje się 48% całości m ateriału reaktywnego według AUSRIA, mniej niż 3% całości białek, mniej niż 0,2% całości cukrów oraz mniej niż 2% całości lipidów. Pastylkę kom órek szczepu pres/s-c-452 H ansenula polym orpha ekstrahow ano również w dokładnie taki sam sposób, uzyskując podobne wyniki. Próbki częściowo oczyszczonych preparatów HBsAg ze szczepów pres/s-b-431 i pres/s-c- 452 analizowano m etodam i elektroforezy żelowej i im m unoblottingu z zastosowaniem m onoklonali HBS1 i S1.1 jako detektorów H BsAg-podobnych białek, w sposób opisany w przykładzie XVII, poniżej. Im m unoblotting z m onoklonalnym i H B S1 wykazał obecność reaktywnego pasm a przy 24 kd, a ponadto pasm a o około 38/39 kd w obydwu preparatach. Im m unoblotting z m onoklonalnym S1.1 doprowadził do wykrycia jedynie białka pres1-pokrewnego w paśmie 38/39 kd, w obydwu preparatach. Badania te wykazały, że zarówno białka pres1 jak i białka S ulegają współoczyszczaniu na drodze adsorpcji na krzemionce koloidalnej oraz izopiknometrycznego wirowania z gradientem gęstości CsCl. b) W irowanie kom pozytow ych cząstek z gradientem gęstości CsCl. Pobraną z ferm entatora hodowlę szczepu pres/s-b -431 H. polym orpha hodow ano w ośrodku S (M ateriały, 5d), przy czym zbioru dokonano po 73 godzinach indukcji m etanolem. Pastylkę kom órek oddzieloną po wirowaniu ponownie zawieszono, po czym ekstrakt kom órkow y oddzielono w wyniku przepuszczania zawiesiny przez prasę Frech Press, w sposób opisany poniżej. O kruchy kom órek usunięto z pokruszonego lizatu na drodze wirowania przez 30 m inut przy g. Surowe ekstrakty kom órkow e wirowano do stanu równowagi przy g, 1,5 M CsCl, w roztworze soli buforow anym fosforanem do p H 7,5. G radienty rozfrakcjonow ano, po czym

33 przeprow adzono analizę każdej z frakcji pod kątem antygeniczności, stosując testy ELISA (Enzygnost: Behringwerke A G, M arburg, Rep. Feder. Niemiec) specyficzne względem HBsAg oraz względem białka pres1. W testach Enzygnost oznacza się tylko cząstki zgrupowanego HBsAg, a nie m onomery białkowe. W teście Elisa specyficznym względem białka pres1 stosuje się mysie m onoklonalne przeciw ciało S 1.1 do wychw ytyw ania i detekcji antygenu, opisane poniżej w przykładzie XV III, część D. Szczytową aktywność HBsAg zaobserwowano przy gęstości 1,18-1,19 g /cm 3, w gradiencie CsCl. Podstawowy pik białka pres1 zaobserwowano przy tej samej gęstości, wraz z pikiem ubocznym przy gęstości 1,26 g/cm 3. G radientow e frakcje analizow ano również pod kątem obecności białka pres1 i białka S, m etodą im m unoblottingu. Po elektroforezie w żelu poliakryloam idow ym z dodecylosiarczanem sodowym, zgodnie z Laemmli'm (1970) i blottingu na nitrocelulozie, Tow bin i inni, 1979, arkusz nitrocelulozy inkubow ano z poliklonalną surowicą króliczą nastaw ioną na HBsAg pochodzący z surowicy. Detekcję w iązania przeciw ciał wykonywaną m etodą fosfatazy alkalicznej. Zaobserwowano podstawowe pasm o białka przy 24 kd odpow iadające białku S oraz podwójne pasm o przy 38/39 kd. M aksym alną aktywność im m unoblottingu w przypadku wszystkich trzech rodzajów białek zaobserwowano w przypadku frakcji z gradientu CsCl o gęstości 1,18-1,19 g /d m 3, co odpow iada pikowi aktywności HBsAg ustalonem u w teście Enzygnost. Oznacza to, że większość białek pow ierzchniow ego antygenu HBV w surow ym ekstrakcie występuje w stru k turach lipoproteinow ych o gęstości charakterystycznej dla HBsAg. Kolejny arkusz nitrocelulozowy inkubowano z mysim m onoklonalnym przeciwciałem S 1.1. Przeciwciało to wykrywało jedynie pasm a białek przy 38/39 kd, we frakcjach odpowiadających gęstości CsCl 1,18-1,19 g/cm 3. Surowe ekstrakty kom órkowe poddano także strefowemu przy gradiencie sacharozy. Surowe ekstrakty kom órkowe naniesiono na 5-20% (wagowo-objętościowo) gradienty sacharozy przygotow ane w 50 mm buforze Tris-HCl o ph 8,1, po czym wirowano przy g w ciągu 200 m inut. G radienty rozfrakcjonowano, po czym frakcje analizowano pod kątem obecności HBsAg z wykorzystaniem testu Enzygnost Elisa oraz pod kątem obecności HBsAg zawierającego białko pres1, wychwytując antygen przeciwciałam i specyficznymi dla HBsAg, z testu Enzygnost i dokonując detekcji za pom ocą M ab S 1.1 specyficznego względem białka pres1. Test Enzygnost wykazał obecność piku o aktywności HBsAg sedymentującego przez gradient. M ab. 1.1 Elisa wykazał obecność tego samego piku, co test Enzygnost, ale z ram ieniem aktywności rozciągającym się do większych gęstości sacharozy. To ram ię m ateriału o większym współczynniku sedymentacji zostaje wyeliminowane, gdy surowe ekstrakty ze szczepu pres/s-b- 431 Hansenula polym orpha częściowo oczyszcza się metodą adsorpcji/desorpcji na krzemionce koloidalnej i odwirowuje się z gradientem CsCl przed wirowaniem z gradientem gęstości sacharozy. W yniki te wykazują, że HBsAg i białko pres1 ulegają współsedym entacji w gradientach gęstości CsCl i w ykazują charakterystykę gęstości cząstek lipoproteinow ych. c) Antygenowość kom pozytowych cząstek HBsAg wytworzonych w wyniku ekspresji w H. polym orpha. Cząstki powierzchniowego antygenu HBsAg z surowego ekstraktu szczepu pres/s-b-431 H. polym orpha oczyszczono częściowo w sposób opisany powyżej w punkcie a. Preparat ten badano pod kątem reakcji z mysimi przeciwciałami monoklonalnym (M abs) skierowanym i przeciw epitopom zlokalizowanym w regionach pres1, pres2 i S białka powierzchniowego antygenu oraz pod kątem obecności receptora polim erów albuminy z ludzkiej surowicy (receptora phsa) w regionie pres2. C 1. Reakcja z M abs1. Mysie m onklonalne przeciwciało (M ab) S 1.1 skierowanie przeciw epitopowi pres1 białka powierzchniowego antygenu HBV zastosowano w celu wykrywania obecności tego miejsca na cząstce kom pozytowej, w teście ELISA. Za pom ocą M abs1.1 pow leczono zagłębienia płytki do m ikrom ianow ania (Im m unoplate I; Nunc, Gibco Europe, G hent, Belgia), po czym prow adzono inkubację z częściowo oczyszczonym surowym ekstraktem. Po przem yciu w celu usunięcia nie związanego m ateriału wychwycenie reaktywnych cząstek potw ierdzono prow adząc inkubację z M abs.1 sprzężonym z peroksydazą chrzanową, metodą W ilsona i N akam e, 1978.

34 Wywoływanie barwne potwierdzające wiązanie drugiego przeciwciała wykonano stosując o-fenylenodiaminę jako chrom ogen. A bsorbancję m ierzono przy 490 nm (względem filtru wzorcowego przy 620 nm) w urządzeniu Interm ed Im m unoreader, N J 2000 (Analis, Ghent, Belgia). Częściowo oczyszczony ekstrakt szczepu pres/-s-b -431 H. polym orpha dawał reakcję dodatnią w próbie, świadczącą o wychwytywaniu i wiązaniu M abs1.1 wykazującemu specyficzność względem regionu pres1. Oczyszczone cząstki powierzchniowego antygenu zawierające jedynie białko S, z S. cerevisiae RIT4376 (H arford i inni, 1987) nie dawało reakcji w tym teście. C2. Reakcja z M abs2.5 Mysie m onoklonalne przeciwciało S2.5 jest skierow ane przeciw regionowi pres2 pow ierzchniowego antygenu HBV. To M ab zastosowano w teście ELISA w celu stwierdzenia obecności epitopu pres2 na cząstkach kompozytowych. Za pom ocą MabS2.5 powleczono zagłębienia płytki do m ikrom ianow ania, po czym prow adzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem kom órkowym z H. polym orpha pres/s-b-431. W iązanie antygenu potw ierdzono na drodze inkubacji z MabS2.5 sprzężonego z peroksydazą chrzanową oraz barwnego wywoływania w sposób opisany powyżej. W przeprowadzonym teście częściowo oczyszczony ekstrakt kom órkow y z H. polym orpha pres/s-b-431 dawał reakcję dodatnią, co wskazywało na obecność epitopu regionu pres2 na cząstkach powierzchniowego antygenu. Cząstki powierzchniowego antygenu zawierające wyłącznie oczyszczone białko S z S. cerevisiae RIT4376 nie daw ały reakcji w tej próbie. C3. Reakcja z Mabs RF1 i S 1.1 (HRP). Mysie m onoklonalne przeciwciało RF1 (H. Thom as, Royal Free H ospital, Londyn), skierowane przeciw epitopowi zależnemu od konform acji, zlokalizowanemu w regionie S, zastosowano w teście ELISA. M ab ten zastosowano do powlekania zagłębień płytkach do m ikrom ianow ania, po czym prow adzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem szczepu pres/s-b-431 H. polym orpha. W iązanie cząstek potwierdzono na drodze inkubacji M ab S 1.1 sprzężonego z peroksydazą chrzanową, w sposób opisany w części C 1 powyżej. Częściowo oczyszczony ekstrakt H. polym orpha daw ał w tej próbie reakcję d odatnią, podczas gdy oczyszczone cząstki pow ierzchniowego antygenu z S. cerevisiae RIT4376 nie dawały reakcji. C4. Test dotyczący receptora phsa. Test wykrywania z receptora ph SA obecnego w regionie pres2 wykonano zgodnie z procedurą Pontisso i innych (1983). Polimeryzowaną album iną z ludzkiej surowicy pokryto zagłębienia w płytce do m ikrom ianowania, po czym prow adzono inkubację z częściowo oczyszczonym ekstraktem kom órkowym szczepu pres/s-b-431 H. polym orpha. Po przemyciu w celu usunięcia nie związanego m ateriału cząstki wychwycone na płytce wykrywano prowadząc inkubację z poliklonalnym i przeciwciałami króliczymi przeciw-hbsag, znaczonymi J 125 (zestaw AUSAB). Częściowo oczyszczony ekstrakt z H. polym orpha daje w tej próbie reakcję dodatnią, podczas gdy oczyszczony HBsAg z S. cerevisiae RIT4376 nie daje reakcji w tej próbie. Powyższe wyniki wykazały, że H B sa g-reaktyw ny m ateriał występujący w częściowo oczyszczonym ekstrakcie z H. polym orpha zawiera miejsca antygenowe specyficznie wiązane przez M abs skierowane przeciw epitopom w regionach pres1, pres2 i S powierzchniowego antygenu HBV oraz że m ateriał ten zawiera również miejsce reagujące z phsa. d) Im m uno-strącanie cząstek kom pozytowych. W celu stwierdzenia, czy m ateriał reaktywny w teście AUSRIA, występujący w częściowo oczyszczonym ekstrakcie szczepu pres/s-b-431 H. polym orpha zawierał cząstki kompozytowe, przeprowadzono im m uno-strącanie z m onoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla białka pres 1. Immonokom pleksy wychwycono przez utrw alone form aliną kom órki Staphylococcus aureus (Staph A) (Im m unoprecipitin, BRL, G aithesburg, M D, St. Zjedn. Am er.), stosując przeciwmysią surowicę królika jako przeciwciało przekładkowe między przeciwciałem m onoklonalnym i kom órkam i Staph A. Kom órki Staph A poddano wstępnej obróbce, zgodnie z zaleceniami dostawcy, po czym ponownie zawieszono uzyskując 10% (wagowo-objętościowo) zawiesinę w PBS. Staph A kom órki (120μl 10% wag.-objęt. zawiesiny) inkubow ano następnie z 20μI przeciwmysiej surowicy króliczej (RAM ) przez 2 godziny w tem peraturze pokojowej. Kompleks Staph A-Ram odwirowano, przem yto dwukrotnie PBS zawierającym 0,1% objęt. Tween 20 i na koniec ponownie zawieszono do uzyskania około 10% (wag.-objęt.) zawiesiny w PBS zawierającym 0,1% objęt. Tween 20.

35 D o częściowo oczyszczonego preparatu cząstek szczepu pres/s-b-431 H. polym orpha, otrzym anych w sposób opisany powyżej oraz do próbek cząstek HBsAg pochodzącego z drożdży białka S (partia HB193, Smith Kline Biologicals, Rixensart, Belgia), z których każdy zawierał po 2μg m ateriału reaktywnego w teście AUSRIA, w 500μ, dodano 1 μl M abs1.1 (638μg białka na ml) i mieszaniny inkubow ano w ciągu 2 godzin w tem peraturze pokojow ej. Z kolei dodano 20μl kom pleksu Staph A-RAM i inkubację kontynuuowano przez noc w tem peraturze 4 C. Utworzone im m unokom pleksy odw irow ano, przem yto 5 razy PBS zawierającego 0,1% objęt. Tween 20 i raz samym PBS, przed ponownym zawieszeniem pastylek w buforze do prow adzenia elektroforezy na SDS-żelu poliakryloam idowym. W ytrącone immuno-osady analizow ano m etodą im m unoblottingu w sposób opisany poniżej, stosując mysie m onoklonalne przeciwciało RF6 (H. Thom as, Royal Free H ospital, Londyn) do wykrywania składników zawierających białko HBsAg. M onoklonalne przeciwciało RF6 skierowane jest przeciw epitopowi odporności na denaturację i redukcję w HBsAg pochodzącym z plazmy i konkuruje w wiązaniu z m onoklonalnym HBS1. Im m unoblotting wykazał, że im m uno-strącenia uzyskane z cząstek H. polym orpha pres/s-b- 431 zawierały nie tylko białko pres1, ale również białko S, podczas gdy im m uno-strącenia z HBsAg pochodzącego z Saccharom yces nie zawierały białka S. Potw ierdza to, że kom pozytowe cząstki o mieszanym składzie polipeptydow ym występują w oczyszczonym częściowo m ateriale z esktraktów kom órkow ych szczepu pres/s-b-431 H. polym orpha. e) M ikroskopia elektronow a. Częściowo oczyszczone cząstki HBsAg ze szczepu pres/s-b-431 H. polym orpha zbadano w m ikroskopie elektronowym. M ateriał rozcieńczono 20 mm buforem Tris-HCl o ph 8,2, z 0,1% wag.-objęt. album iny z surowicy bydlęcej, po czym osadzono na siarkach miedziano-rodowych pokrytych błoną z celloidyny, przed barwieniem octanem uranylu. Obserwacje w m ikroskopie elektronow ym wykazały obecność sferoidalnych lub kulistych cząstek o przeciętnej średnicy 27 nm. W ielkość ta leży w zakresie przeciętnej średnicy cząstek zmierzonej w ten sam sposób dla szeregu oczyszczonych preparatów HBsAg ze szczepu RIT 4376 S. cerevisiae (H arford i inni, 1987). Przykład XVIII. 5. Porów nanie kompozytowych cząstek wytworzonych w wyniku ekspresji w H. polym orpha i S. cerevisiae. Hodow le szczepu pres/s-b-453 H. polym orpha i szczepu Y1108 S. cerevisiae hodow ano w ośrodku S, w sposób opisany w M ateriałach 5d. Szczep Y1108 jest diploidalnym szczepem S. cerevisiae wytwarzającym w wyniku ekspresji zarówno białko pres1 jak i S, z kaset ekspresji zintegrow anych w genomie przez wektory Ty. Szczep zawiera 5-7 kopii kasety ekspresji pres1 oraz 3-4 kopie kasety ekspresji S. D o wzrostu szczepu konieczna jest obecność tryptofanu. K onstrukcja i integracja chrom ozom ow a takich kaset ekspresji z zastosowaniem wektorów Ty opisana jest w zgłoszeniu patentow ym Stanów Zjedn. Am er. n r 07/ Jak o źródło węgla do wzrostu H. polym orpha zastosowano glicerynę w ilości 1,5% wag.-objęt. Szereg 2-litrowych kolb Erlenmeyera zawierających po 400 ml ośrodka zaszczepiono szczepem pres/s-c-453, po czym prow adzono inkubację w wytrząsarce obiegowej w ciągu około33 godzin w tem peraturze 30 C, do wyczerpania gliceryny. K om órki z trzech kolb odwirowano, a pastylkę kom órkow ą przechowywano w tem peraturze -70 C przed późniejszym wykorzystaniem. Z każdej z 6 kolb odlano po 100 ml ośrodka hodowli i zastąpiono go 100 ml świeżego ośrodka zawierającego 4% wag.-objęt. m etanolu, po czym kontynuow ano inkubację. Trzy hodowle zebrano i odw irow ano po kolejnych 14 godzinach inkubacji, a kolejne 3 po 38 godzinach inkubacji w obecności m etanolu. Kom órki odwirowano, a pastylkę kom órkow ą przechow yw ano w tem peraturze -70 C przed późniejszym wykorzystaniem. W drugim eskperymencie kultury S cerevisiae Y1108 hodow ano w sposób opisany powyżej, zbierając je po 19,5 godzinach inkubacji. K ultury H. polym orpha pres/s-c-453 rów nież h o d o- wano w sposób opisany powyżej, z tym że kom órki zbierano po 26 godzinach wzrostu w ośrodku glicerynowym i po 45 godzinach w ośrodku zawierającym m etanol. Pastylko kom órkow e H ansenula polym orpha ponownie zawieszono, do uzyskania stężenia około 25% wag.-objęt. wilgotnych kom órek w buforze zawierającym 0,5% wag.-objęt. Tween 20, 2 mm ED TA, 4 mm PM SF (fluorek fenylometylosulfonylu), 5% wag.-objęt. izopropanolu i 50 mm fosforan sodow y, ph 9,0. 10 ml uzyskanej mieszaniny przepuszczono 6 razy przez prasę French

36 Press pod ciśnieniem 140 M Pa w celu rozbicia kom órek. Surowy ekstrakt kom órkow y w yklarowano na drodze odw irow ania przy g w ciągu 45 m inut w tem peraturze 4 C, po czym ciecz znad osadu oddzielono. Pastylki kom órkow e S. cerevisiae obrabiano w identyczny sposób, z tym że kom órki zawieszano do uzyskania stężenia około 50% wag.-objęt. wilgotnych kom órek w buforze opisanym powyżej. Zawartość białka w każdej z cieczy znad osadów oznaczano m etodą Lowry'ego i innych (1951). W yklarowane ekstrakty kom órkow e analizow ano pod kątem obecności HBsAg stosując test AUSRIA i pod kątem obecności epitopu białka pres1 stosując test Elisa. Zagłębienia w plastikowych tackach (Nunc Im m unoplate 1. Gibco Europe, G hent, Belgia) powleczono mysim przeciwciałem m onoklonalnym S 1.1 w 50 mm wodorowęglanie sodowym jako buforze o ph 9,6, w ciągu 2 godzin w tem peraturze 37 C, po czym roztw ór przeciw ciał usunięto. Zagłębienia zablokowano prowadząc inkubację roztworem PBS zawierającym 1% wag.-objęt. album iny z surowicy bydlęcej, w ciągu 1 godziny w tem peraturze 37 C. W ykonano dwa kolejne dw ukrotne rozcieńczenia ekstraktów kom órek w PBS, dodano następnie do zagłębień 0,2% wag.-objęt. album iny z surowicy bydlęcej i prow adzono inkubację w ciągu 1 godziny w tem peraturze 37 C. Zagłębienia przem yto następnie 3 razy roztw orem zawierającym 0,9% wag.-objęt. NaCl i 0,05% wag.-objęt. Tween 20. W ychwytywanie przeciwciał potw ierdzono prow adząc inkubację z monoklonalnym przeciwciałem S1.1 sprzężonym z peroksydazą chrzanową, w sposób opisany przez Wilsona i Nakane (1978). D o każdego z zagłębień dodano skoniugowane przeciwciało w PBS, 0,2% wag.-objęt. albuminy surowicy bydlęcej, po czym prow adzono inkubację w ciągu 1 godziny w tem peraturze 37 C. W iązanie drugiego przeciwciała potw ierdzono dodając 100μl roztworu zawierającego 4 mg o- fenylenodiaminy (Sigma) i 15 μl nadtlenku wodoru rozpuszczonego w 10 ml 0,1 M K H 2PO 4, ph 6,0 i prowadząc inkubację w ciągu 15 m inut w tem peraturze pokojowej. Reakcję zablokow ano dodając 25μl 1N H 2SO4, po czym zmierzono gęstość optyczną przy 490nm (wobec filtru wzorcowego 620 nm) w urządzeniu Interm ed Im m unoreader, NJ200 (Analis, G hent, Belgia). W yniki wyliczano z liniowych części uzyskanych krzywych gęstości optycznej, przedstawiając je w jednostkach gęstości optycznej (OD) na mg białka. Ilość HBsAg i białka pres1 reagującego w teście AUSRIA, wyznaczoną w kom órkach (ekstraktach) S. cerevisiae i H. polym orpha, z dwóch eksperym entów, przedstawiono w tabelach 4 i 5. Ilości materiałów reaktywnych w teście AUSRIA, stwierdzone w surowych ekstraktach z S. cerevisiae, szczep Y1108, są około 100 razy mniejsze od ilości w ekstraktach z H. polym orpha pres/s-c-453 indukowanego w ciągu godzin w m etanolu. Ilość białka pres stwierdzona w próbie Elisa jest około 3-8 razy mniejsza, co oznacza iż w szczepie Y1108 S. cerevisiae stosunek białka pres do białka S jest znacznie większy niż w szczepie pres/s-c-453 H. polym orpha. Tabela 4 Test AUSRIA w przypadku surowych ekstraktów komórkowych Ekstrakt komórkowy Nr kolby Białko (mg/ml) HBsAg (AUSRIA) % całkowitej ilości białka Białko pres1 (Elisa); jednostki OD na mg białka S. cerevisiae a 16,2 0,011 2,9 Y 1108 b 18,0 0,008 3,0 c 12,0 0,010 4,4 H. polymorpha a 6,8 0,077 2,4 pres/s-c-453 b 7,4 0,123 2,3 hodowla w c 9,2 0,143 1,7 glicerynie Indukowanie a 5,5 1,15 9,2 metanolem d 7,0 1,40 11,3 38 godzin c 7,4 1,46 8,8

37 Tabela 5 Test AUSRIA w przypadku surowych ekstraktów komórkowych Ekstrakt komórkowy Nr kolby Białko (mg/ml) HBsAg (AUSRIA) % całkowitej ilości białka Białko pres1 (Elisa); jednostki OD na mg białka S. cerevisiae a 13,3 0,009 8,3 Y 1108 b 15,0 0,015 9,7 c 17,1 0,013 8,9 H. polymorpha a 8,4 0,070 1,3 pres/s-c-453 b 8,2 0,061 0,3 hodowla w c 7,9 0,082 0,3 glicerynie Indukowanie a 6,3 1,106 4,1 metanolem b 6,5 1,314 6,8 45 godzin c 7,7 1,688 5,1 W yniki te potw ierdzono przeprow adzając im m unoblotting ekstraktów z pierw szego eksperymentu oraz ekstraktów hodowli indukowanych metanolem, szczepów 454 i 448-C4 jak o szczepów kontrolnych. Próbki zaw ierające 15μg białka poddano elektroforezie przez 5% zatrzym ujące, 12,5% rozdzielające żele, zgodnie z m etodą Laemmli'ego (1971), po czym poddano im m unoblottingow i w sposób opisany w M ateriałach i M etodach, 5a, z zastosowaniem do detekcji m onoklonalnego HBS1. Ekstrakty ze szczepu pres/s-c-453 wykazują silnie reaktywne pasm o przy 24 kd, zbliżone do białka S oraz pasm o przy kd, zbliżone do białka pres. Pasm o 45 kd jest słabo wykrywalne. W przeciwieństwie do powyższego ekstrakty z S. cerevisiae, szczep Y 1108, wykazują słabe pasm a przy 24 kd i 45 kd. Pasm o dubletowe kd białka pres jest słabo wykrywalne. W yniki im m unoblottingu potwierdziły, że S. cerevisiae wytwarza w wyniku ekspresji mniej białka S i pres niż H. polym orpha indukow any metanolem oraz że białko wytworzone w wyniku eskpresji (jako białko pres) z S. cerevisiae jest przede wszystkim w formie glikozylowanej o 45 kd. Przykład XIX. M irystyloilowanie białka pres w H. polym orpha. K ultury szczepu LR9, szczepy 452 i 453 hodowano w wytrząsanych kolbach, w ośrodku minimum, z 2,5% objęt. gliceryny w ciągu 24 godzin, po czym dodano 1% objęt. m etanolu. 6 godzin po dodaniu m etanolu dodano znaczony trytem kwas mirystynowy i inkubację hodowli kontynuowano przez 16 godzin. K om órki zebrano, przemyto i rozbito szklanym i perełkam i w obecności 1% SDS i β -m erkaptoetanolu. W yekstrahowane białka oddzielono na drodze elektroforezy na SDSżel PAGE, po czym wizualizowano je m etodą im m unoblottingu z m onoklonalnym HBS1 i fluorograficznie. W yniki wykazały, że pasm o odpowiadające białku pres1 przy 38/39 kd uległo znakowaniu w przypadku esktraktów ze szczepów 452 i 453, ale nie uległo znakowaniu w przypadku ekstraktu ze szczepu LR9. Zgadza się to z post-translacyjnym usuwaniem N-końcowej m etioniny i m irystyloilowaniem reszty glicynowej przy pozycji 2 w polipeptydzie (Towler i G ordon, Ann. Rev. Biochem., 57:69-99, 1988). Przykład XX. Immunogeniczność antygenów pres z H. polym orpha. Z hodowanych w obecności m etanolu kultur szczepów 452 i 454 wykonano surow e ekstrakty białkowe i zaadsorbow ano je na wodorotlenku glinu do uzyskania ostatecznego stężenia 1 m g/m l. Zawartość epitopu pres1 w każdym z ekstraktów zmierzono techniką ELISA z zastosowaniem jako wzorców m onoklonalnego przeciwciała S1.1 i częściowo oczyszczonego białka pres1 z S. cerevisiae. Im m unokom pleksy do wstrzykiwania wykonano również prowadząc inkubację 600μl m onoklonalnego przeciwciała S1.1 z 1 ml Sepharose Protein G 4 Fast Flow (otrzym anego z Pharm acia LKB, Bruksela, Belgia) w ciągu 2 godzin w tem peraturze 4 C. M ieszaninę odw irow ano następnie, przem yto PBS i uzyskaną pastylkę ponownie zawieszono w 1 ml PBS. 250μl tej zawiesiny dodano do 3,4 ml każdego z surowych ekstraktów kom órkow ych i uzyskane mieszaniny inkubow ano w ciągu 1 godziny w tem peraturze 20 C.

38 Po inkubacji mieszaninę Sepharose Protein G / S1.1/surow e białko odw irow ano, a pastylkę zawieszono w 10 mm fosforanie sodowym jako buforze. Połowę tego m ateriału zaadsorbow ano na w odorotlenku glinu do uzyskania ostatecznego stężenia 1 m g/m l. G rupom po 5 myszy B alb/c wstrzyknięto dootrzewnow o 4 preparaty. Po upływie miesiąca myszom zaaplikow ano dodatkow y zastrzyk z zaadsorbowanych na w odorotlenku glinu 1μ g cząstek, częściowo oczyszczonych, z hodowanej w obecności m etanolu kultury szczepu 453. Po upływie 15 dni myszom upuszczono krew. M iana przeciwciał anty-s, anty-pres2 i anty-pres1 w surow icy wyznaczono w sposób opisany powyżej. W tabeli 6 przedstaw iono m iana odpowiednich przeciwciał indukow ane w myszach Balb/c, wyrażone jak o m iana średnie geom etryczne (GM T). Wyniki te wskazują, że przeciwciała anty-pres są indukowane u myszy, którym wstrzyknięto ekstrakt zawierający pres1-s2-s (szczep 454) lub ekstrakt zawierający cząstki kompozytowe (szczep 452), po uzupełnieniu cząstkam i kom pozytow ym i (szczep 453). Tabela 6 Preparat μg wstrzykniętego antygenu (a) (b) α-hbs GM T w m lu /m α GM T (c) α GM T (c) α GM T (c) Szczep 454 ekstrakt surowy lmmunoprecypitat Szczep 452 ekstrakt surowy <100 lmmunoprecypitat (a) W stosunku do antygenu pres1-s2-s z S. cerevisiae (b) Wszystkim myszom zaaplikowano zastrzyki w 30 dniu (dodatkowo) zawierające częściowo oczyszczone cząstki ze szczepu 453. (c) Miana wyrażono jako odwrotności rozcieńczenia, przy którym uzyskuje się gęstość optyczną (OD) 1,0. Część E Przykład XXI. Ekspresja cząstek kom pozytowych zawierających zarów no zmodyfikowane antygeny pres1-s2-s (Lx) ja k i antygeny S, pojedynczego lub m ieszanego podtypu. 1) Konstrukcja sekwencji kodującej L x (ad) Sekwencję kodującą zm odyfikowane pres1-s2-s (Lx) nadającą się do bezpośredniej insercji na wektorze ekspresji H anensula pm PT-121 (fig. 11) skonstruow ano w sposób następujący. Plazm i- dowy DNA z prit13192 opisanego poniżej strawiono endonukleazą H in d lll w celu uzyskania fragm entów liniowych. Około 1 ng tego DNA wymieszano z oligonukleotydam i BC74 i BC75 i poddano reakcji amplifikacji łańcucha polimerazowego (PCR). Technika PCR jest dobrze znana i opisana w PCR Protocols, A guide to m ethods and applications, M. A. Innes i inni (wyd.), Academic Press Inc., San Diego Ca, Oligonukleotydy BC71 i BC75, zawierające sekwencje przedstawione poniżej zsyntetyzowano na drodze zwykłej chemicznej syntezy fosforoam idytow ej. BC74 5' CCC AGA TC T A A G CTT ATT AAA TG T ATA CCC A 3' BC75 5' CCC GAA TTC AAA A T G G G G ACG AAT CTT TC T 3' Oligonukleotyd BC74 wykazuje hom ologię z końcem 3' w sekwencji kodującej Lx w prit13192 wraz z wydłużeniami, miejscami restrykcyjnymi H in d lll i B g lll. Oligonukleotyd BC75 wykazuje homologię z końcem 5' sekwencji kodującej Lx w prit13192 wraz z miejscem EcoRI i krótką sekwencją liderującą przed kodonem A TG, jako wydłużeniem. O koło 1 ng templatowego D N A zprit13192 wymieszano z 50 m M KC1, 10 mm Tris-HCl o ph 8,3, 1,5 m M M gc h, 0,01% wag.-objęt. żelatyny, po 200 μm każdego z datp, dctp, dg T P i dttp, po 1μM każdego z podkładów oligonukleotydow ych oraz z 2,5 jednostkam i polim erazy T aq, do uzyskania ostatecznej objętości 100μl, stosując dostępne w handlu reagenty do amplifikacji D N A (zestaw Gene Amp DNA Amplification Reagent z Perkin Elmer Cetus, otrzymany z b an d e r Heyden, Bruksela).

39 Mieszaninę poddano 25 cyklom denaturacji (2 minuty, 92 C), wygrzewania (2 m inuty, 48 C) i wydłużania (2 m inuty, 72 C) w urządzeniu D N A Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, otrzym ane z V ander H eyden, Bruksela). 1 ng uzyskanego zm odyfikow anego fragm entu zam plifikow anej sekwencji kodującej Lx poddano pow tórnej amplifikacji w drugiej rundzie z tymi samymi oligonukleotydam i w takich samych w arunkach, po czym wydzielono z mieszaniny reakcyjnej na drodze strącania etanolem. Próbkę około 250 ng przystosowanego fragmentu Lx z D N A o 870 bp strawiono endonukleazami EcoRI i B glll i sklonow ano między miejsca EcoRI i B glll plazm idu prit12555, będącego pochodną pbr327, uzyskując prit prit12555 zawiera replikon pbr327 wraz z miejscem Bglll wprowadzonym w wyniku insercji linkera między m iejsca EcoRI i ClaI wyjściowego plazm idu. Kolejną próbkę przystosow anego fragm entu Lx straw iono endonukleazam i EcoRI i B glll, po czym w ykonano insercję między miejsca EcoRI i Bglll w plazm idzie pmpt121 (fig. 11). Pow oduje to umieszczenie sekwencji kodującej Lx między prom otorem M O X i term inatorem M O X w plazmidzie ekspresji nadającym się do wprowadzenia do H. polym orpha w wyniku transform acji. Sekwencjonowanie D N A uzyskane plazm idu plx- 11 wykazało, że sekwencja regionu kodującego Lx jest prawidłowa. 2) Konstrukcja sekwencji kodującej S-(ay) pr IT jest plazm idem pochodnym pbr322, zawierającym pełną sekwencję kodującą pres2-s uzyskaną w wyniku zwykłych manipulacji zrekom binow anym D N A z p R IT 10601, który zawiera pełny genom wirusa hepatitis B subtypu ay, klonowany w pbr322. p R IT zdeponowano w Am erican Type C ulture Collection, Rockville, M D, dnia 2 czerwca 1982 roku, pod nr A TCC D la specjalistów zrozum iałe jest, że w manipulacjach opisanych poniżej prit13490 m ożna zastąpić przez pr IT lub inny dowolny sklonowany fragm ent HBV zawierający pełną sekwencję kodującą S-(ay). D N A z prit13490 strawiono endonukleazą H in d lll w celu uzyskania linearyzacji plazm idu i wymieszano z oligonukleotydem BC74 opisanym powyżej oraz z oligonukleotydem BC74 wykazującym hom ologię z końcem 5' sekwencji kodującej S w pr IT 13490, wraz z miejscem EcoRI i krótką sekwencją liderującą przed kodonem A T G jako wydłużeniem. BC73 5' CCC G A A TTC A A A A TG GAC AAC ATC A C A TCA 3'. M ieszaninę pr IT strawionego za pom ocą H in d lll oraz oligonukleotydów am plifikowano wykonując 2 rundy PC R w sposób opisany powyżej, w celu wytworzenia fragm entu sekwencji kodującej S-(ay) o 700 bp, oflankowanego miejscami restrykcyjnym i EcoRI i B glll. O koło 250 ng tego m ateriału straw iono endonukleazam i EcoRI i B glll i sklonow ano między miejsca EcoRI i Bglll w prit12555 uzyskując prit13438 potwierdzono na podstawie sekwencjonowania DNA. 3) Konstrukcja sekw encji kodującej L* (ad/ay) Około 1 ng fragm entu zam plifikowanego m etodą PC R, stosow anego w konstrukcji p R IT 13488, zam plifikowano wykonując 2 rundy amplifikacji PCR w obecności oligonukleotydu BC75 (opisanego powyżej) oraz BC30, o następującej sekwencji BC30 5' A C G A G T CTA G A C TCT G C G GTA 3' BC30 jest hom ologiczny z regionem wokół miejsca X bai w sekwencji kodującej S pochodzącej z klonu prit10616 wirusa HB subtypu ad. Z amplifikacji wydzielono fragm ent o 280 bp i około 250 ng tego fragm entu straw iono endonukleazam i EcoRI i X bal. Około 1 ng fragm entu zamplifikowanego metodą PC R, stosowanego do konstrukcji prit13438, zam plifikowano ponow nie wykonując 2 rundy am plifikacji PCR w obecności oligonukleotydów BC74 (opisanego powyżej) oraz BC12, o następującej sekwencji: BC125' A T G G A G AAC ATC ACA TCA 3'. BC12 jest hom ologiczny z pierwszymi 6 kodonami sekwencji kodującej S wirionów HB klonowanych w prit10601 i prit Po amplifikacji PCR około 250 ng fragm entu o 700 bp strawiono endonukleazam i X bal i Bglll. Fragm enty zamplifikowane m etodą PCR, strawione dw om a endonukleazam i, zligowano następnie z D N A z prit12555, strawionym za pomocą EcoRI i Bglll.

40 W ydzielono plazm id pr IT zawierający pr IT wraz z EcoRI-X bai fragmentem z PCR-am plifikowanego fragm entu stosowanego w konstrukcji prit13488 oraz XbaI-BglII fragm entem z PCR-amplifikacji fragm entu stosowanego w konstrukcji prit Sekwencjonowanie DNA insertu kodującego Lx wprit13491 wykazało, że wprow adzono błąd w 5 aminokwasie w regionie kodującym S. W celu skorygow ania błędu PCR-am plifikow any fragm ent, zastosowany powyżej w konstrukcji pr IT strawiono endonukleazam i EcoRI i X bal i zastosowano w celu zastąpienia odpowiedniego fragm entu EcoR I-X bai w pr IT 13491, zawierającego błąd. Uzyskany plazm id prit13489 określa sekwencję kodującą hyorydowy Lx, w której część od kodonu inicjowania ATG do miejsca X bal pochodzi z sekwencji wirusa subtypu ad, a część od miejsca X bal do kodonu terminacji pochodzi z sekwencji wirusa podtypu ay. Odpowiedni polipeptyd będzie należał do subtypu ay. Następnie dokonano insercji fragm entu EcoRI-Bglll z prit13489 zawierającego sekwencją kodującą hybrydowy Lx (ad-ay) między miejsca EcoRI i Bglll w plazmidzie pmpt-121 uzyskując w ektor ekspresji pl x 13 H. polym orpha. 4) Ekspresja w H. polymorpha zmodyfikowanych antygenów pres1-s2-s i antygenów S z wytworzeniem cząstek kom pozytow ych Skonstruow ano szereg szczepów charakteryzujących się różnym i stosunkam i ekspresji Lx i S oraz różnym łącznym poziom em ekspresji. Różnice te uzyskano zmieniając ilość kopii kaset ekspresji przypadającą na genom. Szczep RB 10 H. polym orpha stransform ow ano w sposób opisany powyżej plazm idem pl x 11 zawierającym kasetę ekspresji L x (ad). W wyniku transform acji uzyskano szereg szczepów zawierających różne ilości kaset ekspresji zintegrowanych w genomie. Dwa takie szczepy, oznaczone symbolami L 13/1 i L19/1 zbadano bardziej szczegółowo. Analiza m etodą blottingu Southerna potwierdziła, że szczepy te zawierają szereg kopii kasety ekspresji Lx (ad). Poziom ekspresji Lx (ad) w tych szczepach oceniono na podstaw ie analizy m etodą blottingu W esterna z zastosowaniem m onoklonalnego przeciwciała H B S1. W ykryto pasm o 33 kd odpowiadające antygenowi Lx. Oszacow ano, że poziom ekspresji stanowi około 0,5-2% całości białka kom órkow ego, gdy kom órki hoduje się w ośrodku glicerynow ym, dodając następnie m etanol. Szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji Lx (ad) stransform ow ano ponow nie plazmidem prb-s-322 zawierającym gen S(ad) pod kontrolą prom otora MOX. prb-s-322 opisano powyżej (patrz. fig. 7). Jako m arker transform acji wykorzystano odporność na gentamycynę. Uzyskano trwałe integranty wykorzystując wyżej opisane metody. Dwa z uzyskanych szczepów zbadano bardziej szczegółowo: szczep LM S9/1 i szczep LM S26/2, obydwa pochodzące ze szczepu biorczego L 13/1. Analiza m etodą blottingu Southerna potw ierdziła, że szczepy te zawierają szereg kopii kasety ekspresji Lx (ad) a także szereg kopii kasety ekspresji S(ad). Ekspresję antygenów Lx i S w transform antach H. polym orpha zbadano m etodą blottingu W esterna z zastosowaniem m onoklonalnych przeciwciał HBS1 i S1.1, w sposób opisany powyżej. Uzyskano grupę szczepów, w których w wyniku ekspresji uzyskuje się antygeny Lx i S w różnych stosunkach. Przeciwciała HBS1 wykrywają białko o 24 kd odpowiadające antygenowi S oraz pasm a 30 i 33kD odpowiadające antygenowi Lx. Przeciwciała S1.1 specyficzne względem regionu pres 1 potwierdzają występowanie pasm a 33 kd oraz pasm a 30 kd. Oszacowano, że stosunek Lx/S wynosi około 1:1 w przypadku szczepu LM S9/1 oraz około 1:10 w przypadku szczepu LM S26/2. Oszacowano, że poziom ekspresji wynosi około 5-6% całości białka kom órkow ego w przypadku, gdy komórki hoduje się w w arunkach indukcji metanolem. Badania glikozylowania wykazały, że białko o 33 kd reprezentuje glikozylowaną postać antygenu Lx. Podczas inkubow ania surowych ekstraktów białkowych ze szczepów LM S9/1 i LM S26/2 z endoglikozydazą H następuje przesunięcie pasm a 33 kd do pozornej m asy cząsteczkowej 30 kd. 30 kd to oczekiwana m asa cząsteczkowa antygenu Lx. W związku z tym część antygenu Lx wytworzonego w H. polym orpha zawiera glikozylowany rdzeń, podczas gdy resztę stanowi nieglikozylowana form a Lx. W celu sprawdzenia, czy tw orzą się cząstki, surowy ekstrakt kom órkowy ze szczepu LMS9/1 poddano wirowaniu z gradientem gęstości CsCl. Frakcje gradientowe analizow ano m etodą immunoblottingu z zastosowaniem przeciwciała HBS 1. Pig m ateriału reagującego z HBsAg zawierający antygen S o 24 kd oraz form y antygenow e L x o 30 i 33 kd zaobserw ow ano przy gęstości 1,18 g/cm 3. W ynik ten wskazuje, że w wyniku współekspresji w H. polym orpha tw orzą się kom pozytowe cząstki zawierające polipeptydy Lx i S.

41 Zgodnie z kolejnym wariantem według wynalazku uzyskano szczep H. polym orpha wytwarzający w wyniku współekspresji białka Lx i S, dokonując dalszej transform acji szczepu 415 opisanego powyżej. Szczep 415 zawiera kaset ekspresji S(ad) pod kontrolą prom otora M OX i charakteryzuje się w ysokim poziom em ekspresji antygenu S. S konstruow ano w ektor ekspresji Lx (ad) zawierający gen odporności na kanam ycyny F ragm ent N rul o 3,5 kb, kodujący gen odporności na kanamycynę pod kontrolą prom otora A D H I oraz sekwencję H A RS wydzielono z plazm idu ph K 2 (fig. 6). Plazmid pl x 11 straw iono endonukleazam i N rul i SalI, po czym tępo zakończono stosując wypełnianie polim erazą D N A Klenowa. Trawienie N ru l/s a ll wyeliminowało sekwencję HARS z wektora plx 11. Fragm ent N ru l z ph K 2 zligowano następnie z tępo-zakończonym wielkim fragm entem N rul-sall w ektora plx11, wprowadzając w ten sposób gen odporności na kanamycynę oraz ponownie wprow adzając sekwencję HARS, która została wyelim inowana. Uzyskany plazm id oznaczono jako pk L x1 lub pk L x10, zależnie od orientacji kasety genu odporności na kanamycynę. Strukturę pk L xl przedstaw iono na fig. 12. Plazm idy te m ożna wprowadzać do H. polym orpha na drodze transform ow ania i selekcji w oparciu o odporność na gentamycynę, jak to opisano powyżej w M etodach. Szczep 415 stransform ow ano za pom ocą pk L*1 i pk Lx10, zawierającym i kasetę ekspresji Lx(ad) i po selekcji w oparciu o odporność na gentamycynę uzyskano trw ałe transform anty. Szereg szczepów poddano dalszej analizie. A naliza m etodą blottingu W esterna z zastosow aniem przeciwciała H B S 1 w ykazała obecność białka 24 kd odpowiadającego antygenow i S oraz pasm 30 i 33 kd odpow iadających glikozylowanej i nieglikozylowanej formie antygenu Lx. W tych szczepach ze szczepu 415 stosunek Lx/S wahał się od około 1:1 w przypadku szczepu LM S do około 1:20 w przypadku szczepu KM S Szczepy rosną w w arunkach pełnej indukcji metanolowej. O szacowano, że poziom ekspresji antygenu Lx/S stanowi 5-6% całości białka kom órkow ego. Nie zaobserw ow ano różnicy między szczepami transform owanym i za pom ocą pk L x1 i szczepami transform ow anym i za pom ocą pk L x10. 5) Współekspresja antygenów L* i S prowadząca do cząstek kom pozytow ych mieszanego subtypu. W celu uzyskania szczepów H. polym orpha wytwarzających cząstki Lx/S mieszanego subtypu (ad/ay), plazm id pl x13 przenoszący kasetę ekspresji Lx (ad/ay) stransform ow ano w H. polym orpha RB 10. Stabilne klony wytwarzające w wyniku ekspresji antygen Lx m ożna wytworzyć i stransform o- wać plazm idem z prb-s-322 przenoszącym kasetę ekspresji S /a d / z wykorzystaniem do selekcji odporności na gentam ycynę. Stabilne szczepy z drugiej transform acji analizow ano m etodą b lo t- tingu W esterna oraz przy pomocy tekstu AUSRIA, w celu ustalenia odpowiednich poziom ów ekspresji antygenów Lx (ad/ay) oraz S (ad), a także całkowitego poziom u ekspresji pow ierzchniowego antygenu. Szczep 145 wytwarzający w wyniku ekspresji białko S (ad) m ożna również retransform ować pochodną pl x13, która przenosi funkcyjny m arker odporności na gentam ycynę, w celu wytworzenia trwałych transform antów wytwarzających w wyniku ekspresji zarów no polipeptydy Lx (ad/as) jak i S(ad), w postaci cząstek kom pozytowych o specyficzności zarów no subtypu ad jak i ay. Część F Przykład XXII. K onstrukcja plazm idu prit12979 kodującego nie m irystylowane wielkie białko HBV. Zarys konstrukcji plazm idu prit12979 przedstawiono na fig. 13 i 14. Na fig. 13 przedstawiono etapy konstrukcji plazm idu E. coli z zakotw iczoną kasetą ekspresji białka Gly 13 L, prit Na fig. 14 przedstaw iono procedurę wytwarzania plazmidu drożdżowego pr IT zdolnego do ekspresji białka G ly l3 L. Zrozum iałe jest, że reszta Gly 13 jest kodow ana przez drugi kodon sekwencji kodującej białko L, przedstawionej w tabeli A. Substancją wyjściową w tej konstrukcji jest plazmid prit12863, pochodna pbr327 zawierającego prom otor TD H 3 (region) oraz region term inacji transkrypcji AGR3 [Cabezon i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: (1984)], rozdzielone linkerem B am H I, Sm al, EcoRI. Linker zawierający miejsce Bglll usytuowany jest w górę od sekwencji prom otora TD H 3. pbr327 opisany w pracy Soberona i innych, Gene, 9: (1980), otrzymano od F. Bolivara (D epartam ent of M olecular Biology, National University of Mexico). Plazmid ten m ożna wydzielać w sposób opisany w zgłoszeniu patentow ym w Stanach Zjedn. Amer. nr

42 Kasetę ekspresji nie m irystylow anego białka L konstruuje się w regionie linkera w prit Plazmid prit12816 będący plazmidem E. coli pochodzącym z pa Sl [Rosenberg i inni, M ethods Enzymol., 101: (1983)], zawiera region kodujący wielkie białko HBV (serotyp adw) oflankowane miejscem N col (zachodzącym na A TG w pozycji kodonu 12 sekwencji kodującej białko L) oraz miejscem EcoRI poza kodonem stopu. Plazm id ten konstruuje się zwykłymi technikami zrekom binowanego D N A (patrz T. M aniatis i inni, op. cit.). Plazmid prit12816 trawi się BstXI i EcoRI, po czym odzyskuje się fragm ent BstXI-EcoRI o 304bp, kodujący N-końcow ą część regionu pres1, i liguje się z następującym syntetycznym adapterem BamHI-BstXI: BamHI X bal BstX I GAT CC CTC TAG A CG AAT CTT TCT GTT CCC AAC C GGAGATC TGG TTA TAA AGA CAA GGG TT Fragm ent ten wstawia się do prit12863, straw ionego uprzednio enzymami Bam H I i EcoRI, uzyskując plazm id pr IT Syntetyczny adapter B am H I-B stx I kotwiczy N-końcowy region pres1, ale nie zapewnia prawidłowego odczytywania szkieletu z miejscem Bam H I umieszczonym w reszcie ATG prom otora TD H 3. Prawidłowy szkielet odczytywania uzyskuje się trawiąc pr IT za pom ocą Bam H I i X bal, a następnie stosując obróbkę enzymem ze strąków mung, w celu wyeliminowania wystających przedłużeń i ligowania. Uzyskuje się w ten sposób plazm id prit N a koniec dokonano insercji fragm entu EcoRI o 839 bp, z prit12816, w miejsce EcoR I w pr IT 12997, przy prawidłowym zorientow aniu, aby odzyskać całkowitą sekwencję kodującą białko Δ Gly L. Uzyskany plazm id pr IT zawiera kasetę ekspresji kodującą białko L, z delecją Gly 13 i nie może służyć jako substrat dla transferazy mirystoilowej. W celu skonstruow ania plazm idu drożdżowego zdolnego do ekspresji białka Δ Gly L plazm id prit12998 straw iono enzymami Bglll i SalI. Fragm ent Bglll-Sall o 5822 bp, zawierający kasetę ekspresji, oczyszczono i wstawiono do zwykłego w ektora drożdżowego p R IT będącego pochodną pbr327, dostarczającego gen Am pr, sekwencje 2μ, replikon E. coli oraz m arker drożdżowego LEU2 w celu wykonania selekcji. Uzyskany plazm id prit12979 zastosowano do transform ow ania LEU-S. cerevisiae szczep 10S44cir (pep4-3, leu2-3, leu2-1 12), określanego rów nież sym bolam i TCY1 lub Y482, zdeponow a- nego w Am erican Type Culture Collecitio, Rockville, M aryland St. Zjedn. Amer. pod nr ATCC Po transform acji uzyskany szczep drożdży L E U + nazwano Y720. Przykład XXIII. Charakterystyka porównawcza białka Δ Gly L i białka L. Szczep drożdży Y720 z przykładu X X II zbadano pod względem ekspresji białka Δ Gly L w porów naniu ze szczepem drożdży Y587 (TCY1 stransform ow any plazm idem pr IT12845), wytwarzającym w wyniku ekspresji białko L. pr IT 12845), zawiera kasetę ekspresji o 3370 bp obejm ującą pochodzącą z D N A HBV sekwencję kodującą 389 am inokwasów białka L, 5'-flankow aną i będącą pod kontrolą fragm entu prom otora TD H 3 o 1050 bp oraz 3'-flankowaną fragm entem o 1150 bp, przenoszącym term inator transkrypcji ARG3. p R IT opisano szczegółowo w przykładzie 16A zgłoszenia patentowego w Stanach Zjedn. Am er. nr Szczep drożdży Y1017, będący szczepem T C Y 1 stranform ow anym plazm idem pr IT 12741, służył jako ujemny szczep kontrolony. A. M irystylowanie W ykonano znaczenie kom órek Y720, Y587 i Y1017 za pom ocą kwasu 3H-mirystylowego w sposób opisany w zgłoszeniu patentow ym w Stanach Zjedn. Amer. nr Ekstrakty SDS z tych kom órek analizowano m etodą elektroforezy w układzie SDS-żel poliakryloam idow y (SDS- PAGE), a następnie im m unoblottingu i fluorograficzną [patrz np. Towler i Glaser, Proc. Natl. Acad. Sci., U SA., 83: (1986)].

43 Im m unoblotting, opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr , obejmował detekcję za pom ocą S-specyficznych m onoklonalnych przeciwciał (M ab), M ab RF6 (H. Thom as, Royal Free H ospital, Londyn) lub M an HBsl (SmithKline Biologicals). Przeciwciała te rozpoznają nakładanie się epitopów odporności na denaturację i redukcję w białku S. Im m unoblotting wykazał ekspresję dwóch form białka L, o 38 kd i 45 kd, zarów no w Y720 jak i w Y587. Fluorogram wykazał obecność znacznika 3H w białku L o 38 kd, pochodzącym z kom órek Y587, jak to opisano w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr Niewielkie ilości znacznika zaobserw ow ano również w pochodzącym z niego białku L 45 kd. W przeciw ieństwie do powyższego, ani w białku Δ Gly L o 38 kd, ani o 45 kd, pochodzącym z kom órek Y720, nie stwierdzono w budow ania znacznika. W ykazało to, że eliminacja kodonu glicyny w pr IT likwiduje m irystylow anie białka Δ Gly L w S. cerevisiae. B. Poziom ekspresji Kom órki Y720, Y587 i Y1017 hodow ano w identycznych w arunkach w YNB bez am inokw a- sów (Difco Labs), przy stężeniu 0,675%, z dodatkiem 2% glikozy, w kolbach Erlenmeyera. Zarów no całość rozbitych kom órek jak i surowe ekstrakty analizow ano m etodą ilościowego im m unoblottingu w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr Analizow ano dw ukrotne kolejne rozcieńczenia próbek, przy czym immuno-detekcję oparto na S-specyflcznych M abs R F6 lub H B s1, albo na pres1-specyficznym m onoklonalnym przeciwciele S 1.1 (SmithKline Biologicals). Im m unoblotting wykazał 2-5-krotnie większy poziom ekspresji w przypadku białka Δ Gly L (Y720) niż białka L mirystylowanego w Y587. W ydajność ekstrakcji okazała się w przybliżeniu taka sam a w przypadku białek nie m irystylowanych jak i mirystylowanych. Udział białka L stw ierdzony w formie glikozylowanej o 45 kd nie uległ zmianie w wyniku eliminacji m irystylow ania. C. Struktura lipoprotein Surowe ekstrakty z kom órek Y720 i Y587 poddano równowagowem u wirowaniu z CsCl. Frakcje gradientow e analizow ano przy pomocy im m unoblottingu, testu AUSRIA (A bbott Labs) oraz testu ELISA specyficzynego dla epitopu pres1 z zastosow aniem M ab S1.1, przy czym za pom ocą M abs1.1 powleczono zagłębienia w płytkach do m ikrom ianow ania (Im m unoplate I; Gibco Europe), po czym prow adzono inkubację z badanym i próbkam i. Po przemyciu w celu usunięcia niezwiązanego m ateriału wychwycenie reaktywnych cząstek oceniano na podstawie inkubacji z MabS1.1 sprzężonym z peroksydazą chrzanową, sposobem W ilsona i N akane (1978) opisaną w Im m unofluorescence and Related Techniques, W. K napp i inni (wydawcy), Elsevier, A m sterdam (1978). W ywoływanie barwne w celu potwierdzenia wiązania drugiego przeciwciała prow adzono za pom ocą o-fenylodiaminy jako chromogenu. Absorbancję m ierzono przy 490 nm względem filtra wzorcowego o 620 nm, w urządzeniu Interm ed Im m unoreader, NJ2000 (Analis, G hent, Belgia). Profil antygenowy i wynikający z im m unoblottingu był identyczy. Zarów no w przypadku Δ Gly L jak i białka L dzikiego typu zaobserwowano pasm a przy gęstości około 1,25 g /d m 3, co wskazuje, iż zarówno m irystylowane jak i niemirystylowane białka występują w postaci struktur lipoproteinowych w surowych ekstraktach komórkowych. W irowanie z gradientem prędkości w sacharozie m ateriału oczyszczonego na drodze równowagowego gradientowego wirowania w CsCl wykazało identyczne charakterystyki sedymentacyjne struktur lipoproteinowych zawierających m irystylow ane i niem irystylow ane białko L, co wskazuje, że takie struktury lipoproteinow e charakteryzują się zbliżonym i właściwościami fizycznymi. Przykład XXIV. K onstrukcja plazm idów kodujących zmodyfikowane białko L HBV nie zawierające potencjalnych miejsc O- i N-glikozylowania, potencjalnych miejsc wiązania ph SA i potencjalnych miejsc wrażliwych na proteazę. Zarys konstrukcji dw óch w ektorów drożdżow ych, p R IT 13192, kodującego ekspresję m irystylowanego modyfikowanego białka L (Lx) oraz prit13193, kodującego ekspresję niemirystylowanego modyfikowanego białka L (Δ G ly Lx), przedstawiono na fig. 15 i 16. prit10616, zdeponowany jako ATCC 39131, trawi się enzymem Bglll i największy fragm ent liguje się z replikonem pac177 [C hang i Cohen, J. Bacteriol., 134:1141 (1987)], uprzednio straw ionym enzymem Bam HI. Pośredni plazm id uzyskany w ten sposób strawiono enzymem EcoRI i ponow nie zligowano uzyskując prit10633, który zawiera kom pletny gen kopertow y HBV.

44 Plazmid prit12331 stanowi pochodną puc9 (Amersham, W ielka Brytania i Pharm acia, Szwecja) zawierającą fragm ent prom otora H indlll-n col ARG3 o 1500 bp, z pr IT [Cabezon i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: (1984) połączony w odpowiedniej orientacji z fragmentem N col-ecori o 681 bp, zawierającym sekwencje kodujące S, z miejscem Ncol obejm u- jącym kodon A TG oraz miejscem EcoRI na zewnątrz i w sąsiedztwie kodonu stopu, wstawiony między miejsca restrykcyjne H in d lll i EcoRI w puc9. prit10633 strawiono enzymami BstEII i X bal. Fragm ent B steii-x bal o 648 bp, w którym wydłużenie BstEII zostało wypełnione polim erazą Klenowa, zawierający pełny region pres1-pres2 oraz N-końcowe sekwencje regionu S, oczyszczono i wstawiono między miejsca Sm al i X bal w puc12 (Amersham). Uzyskano w ten sposób plazm id prit Plazmid prit13188 straw iono za pom ocą BalI i Bam H I, w wyniku czego nastąpiła delecja regionu pres1 kodującego am inokwasy rozciągające się od reszty 52 do 133 (kodony aminokwasów 53 i 132 zostały objęte delecją). W ielki fragm ent potraktow ano polim erazą Klenowa, a następnie zligowano uzyskując plazm id prit13189, w którym miejsce B am H I zostało odtw orzone. DNA odpowiadające regionowi pres am inokwasów rozciągającem u się od reszty 145 do 175 (kodony am inokwasów ) wycięto w wyniku trawienia prit13189 za pom ocą Bam H I i X bal. W ektor ten zligowano z następującym syntetycznym adapterem : W ydłużenie BamHI W ydłużenie N col GAT CC CAGAGT CAGG- GGTCTG -TATTTTCCTGCTGGTGG GGTCTCAGTCCC-CAGACA-TAAAAGGACGACCACCGTAC AspProArgValArgGlyLeuTyrPheProAlaGlyGly oraz fragmentem N col-x bal z prit12331, zawierającym N -końcową część genu S. Uzyskano w ten sposób plazm id prit C-końcowy region genu S, zakończenie regionu transkrypcji ARG3 oraz gen drożdżowy LEU2 dodano w wyniku insercji fragm entu X bal-sall o 4145 bp z prit12660, między miejsca X bal i SalI w prit [prit zawiera kasetę ekspresji o 3050 bp, obejm ującą pochodzącą z D N A HBV sekwencję kodującą 281 am inokwasów białka M, 5'-flankowanych przez oraz pod kontrolą, fragm entu prom otora T D H o 1050 bp oraz 3'-flankowanych fragmentem o 1150 bp zawierającym term inator transkrypcji ARG3. prit12660 opisany jest szczegółowo w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr ]. Uzyskano w ten sposób plazm id prit W celu odtworzenia kaset ekspresji dla białka Lx i Δ Gly Lx, prom otor TD H 3 zasocjowany z N-końcowym regionem kodującym białko L lub z N-końcowym regionem kodującym białko Δ Gly L, wstawiono w prit Z prit12845 wydzielono fragm ent EcoRI-Ball o 1234 bp, zawierający sekwencję kodującą białko L, opisaną powyżej oraz w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr , a z prit12979 wydzielono fragm ent B glll-b all o 1227 bp, zawierający sekwencję kodującą białko Δ Gly L, opisaną powyżej. Każdy z fragm entów wymieszano z wielkim fragmentem Scal-Bam H I z prit13191, po czym całość zadano polim erazą T4 i zligowano. Uzyskanym plazm idom nadano symbole prit13220 i pr IT Sekwencja kodująca występująca w kasecie ekspresji obecnej w pr IT zawiera sekwencję pres1 reszt aminokwasowych od 12 do 52, sekwencję pres2 reszt oraz pełną sekwencję S, jak to przedstaw iono w tabeli A. prit13222 jest identyczny z pr IT z wyjątkiem delecji kodonu G ly13 (GGG). Ostatni etap obejmował wytwarzanie z prit13220 i prit13222 fragm entu C la l-c la l zawierającą kasety ekspresji zarówno białka Lx jak i Δ G ly Lx oraz jej zligowanie z fragmentem C la l-c la l z plazm idu pr IT 12845; uzyskano w ten sposób odpowiednio plazm idy prit13192 i prit Te ostatnie plazmidy zastosow ano do transform ow ania szczepu TCY1 S. cerevisiae uzyskując szczepy LEU +, odpowiednio Y 1139 i Y 1140.

45 Przykład XXV. Ekspresja Lx i Δ Gly Lx w drożdżach. Surowe ekstrakty drożdży z Y587 (białko L), Y1139 i Y1140 (odpowiednio Lx i A G lylx) z przykładu XXIV oraz Y724 (kontrolony szczep S. cerevisiae bez insersji kaset ekspresji) poddano SD S-PAGE oraz im m unoblottingow i z detekcją za pom ocą S-specyficznego M ab H B s1 lub M ab S1.1. Ekstrakty Y 1139 i Y 1140 wykazały obecność dwóch pasm o oczekiwanych m asach cząsteczkowych około 33 i 3 0 kd, specyficznie rozpoznawane przez obydw a pres1- oraz S-specyficzne przeciwciała. W wyniku obróbki ekstraktów endoglikozydazą H (New England Nuclear lub Boehringer) lub glikopepsydazą F (Boehronger) wystąpił zanik pasm a 33 kd oraz zwiększenie pasm a 30 kd. Oznacza to, że pasm o 33 kd reprezentuje glikozylowaną form ę białka Lx i Δ G ly Lx z przykładu XXIV, zaw ierającą N-połączony glikan typu w ysoko-m annozow ego. Znaczenie hodowli kom órkow ych kwasem 3H-mirystynowym, a następnie analiza ekstraktów kom órkowych m etodą SD S-PA G E, blottingu białek i fluorografii lub im m uno-detekcji, wykazała silną obecność znacznika 3H w paśmie 30 kd oraz słabe wprowadzenie znacznika 3H w paśmie 33 kd, pochodzącym z ekstraktu Y H obecny w tych pasm ach jest odporny na obróbkę hydroksyloam iną. Nie zaobserw ow ano wprowadzania znacznika 3H w przypadku odpowiednich pasm białek z esktraktu Y1140. W ykazuje to, że białko Lx uzyskane w wyniku ekspresji w kom órkach Y 1139 służy jak o substrat dla drożdżowej transferazy N-mirystylowej oraz że delecją reszty Gly 13 w białku Δ G ly Lx z Y1140 zapobiega m irystylowaniu białka. Analiza ekstraktów z Y1189 i Y1140 metodami równowagowego wirowania z CsCl oraz wirowania z gradientem prędkości w sacharozie wykazała obecność w ekstraktach cząstek lipoproteinow ych. Przykład XXVI. Szczepy drożdżowe Y 1088 i Y 1295 zawierające zintegrowane kopie kasety ekspresji białka S. W ykonano konstrukcje szczepów drożdży zawierających szereg kopii kasety ekspresji S zintegrow anych w genom ie. A. Szczep drożdży Y1088 Liniowy wektor prit13133-l oparty na Ty, opisany w zgłoszeniu patentow ym w Stanach Zjedn. Amer. nr , zawierający kasetę ekspresji białka S (prom otor TD H 3 - sekwencja kodująca białko S - region term inacji ARG3) zastosowano do transform ow ania obydwu sparow a- nych typów szczepu S. cerevisiae 10S69d (ura3, leu2, trp 1, gal1, cir0) opisanego w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr Różne transform anty haploidalne przenoszące szereg kopii w ektora zintegrow anych ich genomach skrzyżowano ze szczepami haploidalnym i o przeciwnie sparow anym typie. A naliza metodą blottingu Southerna genomowego D N A wydzielonego z segregantów z wykorzystaniem fragmentu DNA S jako sondy, wykazała segregacje 2 /2 fragm entów wektorów w analizach tetrad. Uzyskano w ten sposób jeden segregant haploidalny, zawierający 5-7 kopii w ektora prit13133-l, oznaczony symbolem Y957. Uzyskano również T R P+-rew ertant Y957, któ ry oznaczono symbolem Y1088. B. Szczep drożdży Y1295 Liniowy w ektor prit13034-l, oparty na Ty, opisany w zgłoszeniu patentow ym w Stanach Zjedn. Amer. nr , zawiera kasetę ekspresji białka S, identyczną z kasetą w prit13133-l. prit13034-l zawiera gen CUP1 jako dodatkow y m arker, który może być wykorzystywany w szczepach przejmujących CUP1S lub cup1 Δ. Dwa haploidalne szczepy cup1δ S. cerevisiae (gen CUP1 zniszczony w szczepie zawierającym pojedynczą kopię tego genu) stosuje się korzystnie jako przejm ujące szczepy drożdży dla tego liniowego w ektora Ty. Szczepy te zawierają odpowiednio genomy: E J cu p 1Δ3 d (ura 3, leu 2, trp 1, gal 1Δ, cup 1Δ, a) oraz Ej cup 1Δ7b (ura 3, trp 1, gal 1Δ, cup 1Δ, α) i opisane są w zgłoszeniu patentowym w Stanach Zjedn. Amer. nr Liniowy w ektor pr IT13034-L oparty na Ty, zawierający kasetę ekspresji białka S zastosowano do transform ow ania szczepów S cerevisiae E J c u p 1 Δ 3d, a także EJ cup1 Δ7b, transform anty URA3 wydzielono i poddano selekcji pod kątem odporności na zatrucie miedzią. Okazało się, że najbardziej odporne transform anty zawierały 2-5 kopii zintegrowanych wektorów. W wyniku klasycznego krzyżow ania genetycznego między tymi szczepami i selekcji haploidalnego segreganta LEU- TR P- uzyskano szczep haploidalny zawierający 4-5 kopii kasety ekspresji S. TR P+ - rewertant tego szczepu oznaczono symbolem Y1295.

46 Przykład XXVII. K onstrukcja szczepów drożdży wytwarzających w wyniku współekspresji antygeny S i L. Każdy z następujących plazm idów :pr IT (białko L), prit12979 (białko Δ G ly L, przykład XXII), prit13192 (białko Lx, przykład XXIV), prit13193 (białko Δ G ly L x, przykład X X IV ) oraz prit12914 (bez insercji genu hepatitis) zastosow ano do transform acji szczepu drożdży Y 1088 do LEU+. Uzyskanym szczepom drożdży nadano odpowiednio następujące symbole: Y1301 (S, L), Y1302 (S, Δ Gly L), Y 1142 (S, Lx), Y1261 (S, Δ Gly Lx) oraz Y 1141 (szczep kontrolny wytwarzający w wyniku ekspresji tylko białko S). Plazmidy pr IT 12845, pr IT 12979, pr IT 13192, pr IT oraz pr IT (bez insercji genu hepatitis) wprowadzono również do szczepu drożdży Y1295. Uzyskanym szczepom drożdży Y1295. Uzyskanym szczepom drożdży nadano odpowiednio następujące symbole: Y1304 (S, L), Y 1305 (S, Δ Gly L), Y 1306 (S, Lx), Y 1307 (S, Δ Gly Lx) oraz Y 1308 (szczep kontrolny wytwarzający w wyniku ekspresji tylko białko S). W spółekspresję białek S i L wykazała analiza surowych ekstraktów kom órkow ych m etodą im m unoblottingu. Reakcja plam y z M ab H B s1 specyficznym względem epitopu S wykazała obecność pasm a o ocenianej masie cząsteczkowej około 23 kd, migrującego do pozycji przewidywanej dla białka S w każdym z ekstraktów z wyżej wymienionych szczepów. Ekstrakty z Y1301, Y1302, Y1304 i Y1305 wykazały oprócz pasm a 23 kd również pasma 38 kd i 45 kd, m igrujące w podobny sposób jak nieglikozylowane i glikozylowane form y białka L, opisane uprzednio w zgłoszeniu patentow ym w Stanach Zjedn. Am er. nr oraz w przykładzie X X III powyżej. W wyniku obróbki ekstraktów endoglikozydazą H następuje konwersja pasm a 45 kd do pasm a 41 kd, podczas gdy pasm a 23 kd i 38 kd pozostały nie zmienione. Ekstrakty z Y1142, Y1261, Y1306 i Y1307 wykazały oprócz pasm a 23 kd również pasma 30 kd i 33 kd, migrujące w podobny sposób jak nieglikozylowane i glikozylowane form y białka Lx i Δ G l y Lx, opisane w przykładzie XXV. W wyniku obróbki ekstraktów endoglikozydazą H następuje konwersja pasm a 33 kd do pasm a 30 kd, identycznie jak w przypadku wyników uzyskanych w przykładzie XXV. Znakowanie kom órek kwasem 3H mirystynowym oraz analiza ekstraktów m etodą SDS- PA G E, a następnie m etodą im m unoblottingu i fluorografii, wykazała obecność odpornego na obróbkę hydroksyam iną znacznika 3H w pasm ach 38 kd (ekstrakty z Y1301 i Y1304) oraz 30 kd (ekstrakty z Y 1142 i Y1306) oraz niewielkie jedynie ilości znacznika 3H w pasm ach białek o 45 kd (ekstrakty z Y1301 i Y1304) oraz 33 kd (ekstrakty z Y1142 i Y1306). Odpowiednie pasm a w ekstraktach z Y1302, Y1305, Y1261 i Y1307 nie zawierały wykrywalnych ilości znacznika 3H. Form y 38 kd i 45 kd białek L i Gly L są rozpoznawane w im m unoblottingu przez pres1- specyficzne M ab S1.1 oraz M A 18/7 (W.H. Gerlich, University of G ottingen, Rep. Feder. Niemiec) oraz pres-2-specyficzne M ab S2.4, S2.5, S2.7, S2.8, S2.9 i S.2.10 (Smith Kline Biologicals). Form y 30 kd i 33 kd białek Lx i Δ G ly Lx są rozpoznawane przez M ab S.1.1 (rozpoznawanie epitopu w ystępującego w sekwencji am inokw asów 12-32), M A 18/7 (rozpoznaw anie epitopu w ystępującego w sekwencji am inokw asów 28-47) oraz S2.5 (rozpoznaw anie epitopu w ystępującego w sekwencji aminokwasów ). D oniesiono, że MA 18/7 inhibituje wiązanie wirionów z m em branam i kom órek w ątroby [Pontisso P. i inni, Virology, 173: (1989)]. Form y 30 kd i 33 kd białek Lx i Gly Lx nie są rozpoznaw ane przez M ab S.2.4, S2.8 i S2.9, które nie reagują z peptydem w teście ELISA, ani przez M ab S2.7 i S2.10, które przypuszczalnie rozpoznają epitop zlokalizowany w am inokwasach M onoklonalny F35-25 (otrzym any od M -A Petita, INSERM unite' 131, Clam art, Francja) wiąże się z oczyszczonymi cząstkam i ze szczepu Y1307, co wykazał test ELISA, ale nie wiąże się z cząstkam i S. M onoklonal ten rozpoznaje sekwencję peptydow ą (M-A Petit i inni, Molec. Im m unol., 26: ,1989), która ja k to wykazano, odgrywa rolę w wiązaniu wirusa z kom órkam i H epg 2 hepatom a (N eurath i inni, Cell, 46: , 1986). Stwierdzono ponadto, że cząstki (S, Lx) wiążą się z kom órkam i HepG 2 hepatom a oraz że wiązaniu tem u, jak również wiązaniu cząstek wirusa HB może zapobiec m onoklonalny F (M-A Petit i inni, The Intl. Symposium on Viral H epatitis and Liver Disease, A bstract 105, H ouston, USA, 4-8 kwietnia 1990). M ab Q 19/10(W. H. G erlich, University of G ottingen, Rep. Feder. Niemiec), który rozpoznaje epitop pres2 uzależniony od glikozylow ania (H eerm ann i inni, w Viral H epatitis and

47 Liver Disease, wyd. A. Zuckerm an i Alan R. Liss, Inc. New York, str ,1988) oraz reaguje z form ą 45 kd białek L i Gly L, nie reaguje z form am i 30 lub 33 kd białek Lx lub Gly Lx. W yniki te zgodne są z delecjami aminokwasu wprowadzonymi w białkach Lx i Gly Lx. Przykład XXVIII. W spółekspresja białek S i L lub zm odyfikowanego L prowadzi do tw orzenia się cząstek o m ieszanym składzie subjednostkowym. E kstrakty wykonane z każdego ze szczepów opisanych w przykładzie XXVII wykazują HBsAg-pokrew ną antygenowość, co wykazują dodatnie wyniki testu AUSRIA przeprowadzonego zgodnie z instrukcjam i producenta (A bbott Lab.). Ekstrakty z Y130I, Y1302, Y1142, Y1261, Y 1304, Y 1305, Y 1306 i Y 1307, ale nie z Y 1141 i Y 1308, dają dodatnią reakcję w teście ELISA-S1.1. Przy równowagowym wirowaniu z CsCl m ateriał dający dodatnią reakcję w testach AUSRIA i ELISA-S1.1 współtworzył pasm o wokół gęstości 1,2 g/cm 3. Im m unoblotting potw ierdził profile antygenow ości w ykazując, że rodzaje białka, których obecność stw ierdzono w surow ych ekstraktach, wspólnie skupiają się w dodatnim piku AUSRIA i ELISA -S1.1. W irowanie przy gradiencie prędkości z sacharozą dializow anych frakcji pikow ych pochodzących z rów now agow ych gradientów z CsCl, wykazują współsedymentację białek S i L lub zmodyfikowanych białek L, co potw ierdziły testy A U SRIA i ELISA-S1.1 oraz immunoblotting. Potwierdza to, że białka S i L lub zm odyfikow ane L skupione są w cząstkach lipoproteinow ych. Reakcje im m unostrącania z M ab S1.1 zastosowano do w ykazania, że białka S i L lub zm odyfikowane L są zasocjowane tworząc pod względem fizycznym jedną całość, to znaczy cząstki o m ieszanym składzie subjednostkow ym. W ykonano ekstrakty ze szczepów drożdży w ytw arzających w wyniku ekspresji białka S i L lub zmodyfikowane L, pojedynczo lub wspólnie, np. z Y1139 (białko Lx, przykład XXIV), Y 1141 (białko S, przykład XXVII) oraz Y1142 (białko S i Lx, przykład XXVII). Po częściowym oczyszczaniu cząstek na drodze wirowania z CsCl i dializie frakcji pikowych cząstki poddano reakcji im m uno-strącania z M ab S.1.1 Jako dodatkow ą próbę kontrolną zastosow ano mieszaninę cząstek z Y i Y1141. Białko Lx ulegało im m uno-strącaniu w każdym przypadku. W spółstrącanie białka S z białkiem Lx zaobserwow ano tylko w reakcji z cząstkami pochodzącym i z Y Identyczne wyniki uzyskano w przypadku innych szczepów wytwarzających w wyniku współekspresji białka S i L lub zmodyfikowane L (Y 1301, Y 1302, Y1261, Y 1304, Y 1305, Y 1306 i Y 1307). Przykład XXIX. Stabilność i wiązanie z phsa cząstek zawierających zmodyfikowane białko L. W rażliwość na degradację proteolityczną pod wpływem proteaz drożdżowych białek Lx i Δ Gly Lx zbadano prow adząc inkubację surowych ekstraktów kom órkow ych z Y1142 i Y1161 w ciągu 4 godzin w tem peraturze 37 C lub w ciągu 65 godzin w tem peraturze 4 C. E kstrakty z Y1301 i Y1302 służyły jako porównawcze źródła białka L i Δ G ly L. Analiza ekstraktów m etodą im m unoblottingu przed i po inkubacji wykazała prawie całkowity zanik białek L i Δ G ly L w wyniku inkubacji, podczas gdy białka Lx i Δ G ly Lx były w dalszym ciągu wykrywalne. Oczyszczone preparaty cząstek ze szczepów Y1306 i Y1307 inkubow ano w ciągu 7 dni w tem peraturze 37 C, po czym zbadano je m etodą SDS-PAGE i zabarw iania srebrem w celu w ykazania obecności polipeptydów. Nie m ożna było zaobserwować żadnej wykrywalnej degradacji polipeptydów Lx lub S. Cząstki w yodrębnione z Y 1142 m etodą wirowania z CsCl zbadano w zm odyfikowanym teście wiązania ph SA, opisanym przez Pontisso i innych, J. Virol. M ethods, 6, (1983). M ikropłytki (Im m unoplate I; Nunc, Gibco Europe) pokryto album iną z ludzkiej surowicy spolimeryzow aną aldehydem glutarowym (5 μg/m l ph SA w PBS, 2 godziny w tem peraturze 37 C) i niespecyficzne miejsca wiązania białka na płytkach wysycono na drodze inkubacji (1 godzina w tem peraturze 37 C) z PBS zawierającym 1% album iny z surowicy bydlęcej (BSA). Kolejne rozcieńczenia badanych próbek w PBS zawierającym 0,2% BSA pozostawiono na 1 godzinę w tem peraturze 37 C do przereagow ania z płytkam i pokrytym i ph SA, po czym związane cząstki wykrywano na drodze inkubacji (1 godzina w tem peraturze 37 C) z kompleksem o nieorganiczonym stężeniu peroksydazy chrzanowej sprzężonej z m onoklonalnym przeciwciałem anty-s1 (RF1, H. C. Thom as, Royal

48 Free Hospital, Londyn) w PBS zawierającym 0,2% BSA, a następnie wizualizowano za pom ocą H 2O2 z o-fenylenodiaminą jako podkładem. Między inkubacjam i płytki przemywano 0,15 M NaCl zawierającym 0,05% Tween 20. Cząstki pochodzącej z Y 1141 służyły jako negatyw na próbka kontrolna, a oczyszczone cząstki ze szczepu 10S44C cir zawierające pr IT 12660, jak o dodatnia próbka kontrolna. W iązanie ph SA uległo znacznemu zmniejszeniu w cząstkach pochodzących z Y 1142 (aktywność szczątkowa 2%) w porów naniu z cząstkam i pochodzącym i z 10S44C cir zawierającego pr IT Nie wykrywa się również wiązania ph SA w przypadku preparatów oczyszczonych ze szczepów Y 1306 i Y1307. Przykład XXX. Immunogeniczność cząstek zawierających białko Lx. Im m unogeniczność cząstek (S, Lx) według w ynalazku badano na myszach B a 1b /c. Cząstki pochodzące z Y 1142 (S, Lx) lub z Y 1141 (S) częściowo oczyszczono na drodze wirowania z CsCl, po czym zaadsorbow ano na A l(o H )3. G rupom po 8 myszy w strzyknięto po 50 lub 5 μg całkowitego białka (co odpow iada 1 lub 0,1 μg antygenu na podstaw ie testu AUSRIA), z każdego z preparatów antygenowych w dniach 0 i 30. W 45 dniu dokonano upustu krwi, po czym na różnych surow icach wykonano różne testy. Przeciwciała Anty-HBs zm ierzono za pom ocą zestawu AusA b (A bbott, St. Zjedn. Amer.). W yniki podano w m IU /m l, wykorzystując wzór Hollingera [Hollinger i inni, w Viral H epatitis, Szumness i inni. Franklin Institute Press, Philadelphia, str (1982)]. Przeciwciała anty-pres oznaczono w bezpośrednim teście ELISA, zgodnie z którym wybrane syntetyczne peptydy (peptyd 12-32, peptyd i peptyd ) zaadsorbow ano na polistyrenowych ściankach m ikropłytki (Im m unoplate I ; N unc, Gibco Europe). Adsorpcję prow adzono przez noc w tem peraturze 4 C z roztworu 0,5 μg/m l peptydu w 0,05 M buforze N a2co3/n a H C O 3 o ph 9,6, 100 μl / zagłębienie. Niespecyficzne miejsca na płytkach zablokowano na drodze inkubacji z 250 μl 5% płodowej surowicy bydlęcej w PBS w ciągu 1 godziny w tem peraturze 37 C. D w ukrotne rozcieńczenia surow icy mysiej w PBS zaw ierającym 1% płodowej surow icy bydlęcej, 0,05% Tween 20, w ilości 100 μl/zagłębienie, pozostaw iono do przereagow ania z płytką pokrytą peptydem w ciągu 2 godzin w tem peraturze 37 C. Po przemyciu związane przeciwciała wykrywano za pom ocą biotynylowanego przeciwmysiego Ig z owcy (Amersham, 500-krotnie rozcieńczenie w PBS zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej, 0,05% Tween 2 0, 100μl/zagłębienie, inkubacja przez 1 godzinę w tem peraturze 37 C), a następnie kompleksu streptawidyny z biotynylow aną peroksydazą chrzanow ą (A m ersham, 1000-krotnie rozcieńczenie w PBS zaw ierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej i 0,05% Tween 20) w ciągu 1 godziny w tem peraturze 37 C, 100 μl/zagłębienie. Między poszczególnymi inkubacjam i płytki przem yw ano 0,15 M NaCl z 0,05% Tween 20. Ostatecznej wizualizacji dokonano za pom ocą H 2O 2 i o-fenylenodiaminy jako chrom ogenu (15μl H 2O 2 i 4 mg o-fenylenodiaminy w 10 ml 0,1 M fosforanu potasu jako buforu o ph 6,0, 100μ l (zagłębienie). Reakcję przerywano po upływie 20 m inut dodając 25μl 1N H 2SO 4, po czym mierzono absorbancję przy 490 nm w urządzeniu Interm ed Im m unoreader, N J 2000, Analis. M iano każdej z surowic wyliczano jako odwrotność największego rozcieńczenia zapewniającego gęstość optyczną 1,00. W tabeli 7 przedstaw iono odpowiednie m iana przeciwciał wywołanych w myszach B alb/c, wyrażone jako m iano średnie geometryczne (GM T). Tabela 7 Cząstki Dawka α-hbs α α α32-47 pochodzące μg GMT w GM Tx GM Tx GMTx z m IU /m l Y (S, Lx) Y <200 (S) < <200 (x)miana wyrażano jako odwrotności rozcieńczenia przy OD równy 1,0.

49 Oczyszczone cząstki ze szczepów Y 1307 (S, Δ Gly Lx) lub RIT4376 [J. Petre i inni, Postgrad. Med. J. 63 (Suppl. 2), (1987)] zaadsorbowano na A l(o H )3 i wstrzyknięto grupom po 10 myszy Ba1b /c w dniach 0 i 30. Myszom spuszczono krew w dniu 45, po czym zebrane surowice badano pod kątem obecności przeciwciał anty-s i anty-pres, w sposób opisany powyżej. W tabeli 8 przedstaw iono m iana odpow iednich przeciwciał wywołanych u m yszy B alb/c. Tabela 8 Oczyszczone cząstki z Y1307 (S, gly Lx) RIT4376 (S) Dawka μg -HBs m lu /m l 12-32x 32-47x Przykład XXXI. Integracja kasety ekspresji Lx w genom ie S. cerevisiae na drodze hom ologicznej rekom binacji z udziałem Tyl. Pożądane jest dokonanie integracji kaset ekspresji zarówno Lx jak i S w genomie żywiciela, aby uzyskać genetycznie stabilne szczepy i uniknąć 20-30% kom órek bezplazmidowych obserw owanych zazwyczaj w 2μ wektorach opartych na S. cerevisiae. Plazmidy pr IT i p R IT skonstruow ano w sposób opisany dla w ektora p R IT p w zgłoszeniu patentow ym w Stanach Zjedn. Amer. nr oraz w pracy Jacobsa i innych, (Gene 80: , 1989). Gel LEU2, wydzielony jako fragm ent X hoi-sali o 2200 bp z wektora pcv9 (Peters i inni, Cell 19:765,1980), wstawiono między miejsca SalI elem entu Tyl w prit12927, zastępując fragm ent oryginalny. O trzym ano w ten sposób prit Fragm ent H indlll-k pni o 3050 bp, zawierający kasetę ekspresji Lx z prit13220 opisanego w przykładzie XXIV, zadano polim erazą T4 i zligowano z zadanym polim erazą T4 miejscem SalI pozostającym w p R IT 13144, z zastosowaniem szczepu XL1-Blue z E. coli jako biorcy transform acji. XL1-Blue, opisany przez D. H anahana w J. Mol. Biol., 166: (1983) jest dostępny do kupna z Stratagene, N orth Torrey Pines Road, La Jolla, Kalifornia. Uzyskano obydwie orientacje insercji fragm entu kasety H indlll-k pni. p R IT zawiera region term inatora ARG3 kasety w sąsiedztwie genu LEU2, a p R IT zawiera prom otor TD H 3 kasety w sąsiedztwie genu LEU2. W ielkie fragm enty X hoi o około 7700bp, zarów no z prit13459 ja k i prit13460, oczyszczono na 1% żelach agarozowych i zastosowano do transform ow ania szczepu E J c u p 1 Δ 3d (patrz przykład XXVI powyżej) w celu uzyskania niezależności leucynowej, m etodą H innena i innych (Proc. N atl. Acad. Sci. USA, 75:1929, 1978). Z obydwu fragm entów uzyskano transform anty LEU+, po czym po 12 kolonii z każdej serii analizow ano m etodą blottingu W esterna pod kątem ekspresji białka Lx oraz m etodą blottingu Southerna pod kątem liczby zintegrowanych kaset. W wyniku transform ow ania E J cup 1 Δ 3d fragm entem z pr IT13459 uzyskano szczep Y1528, który wykazywał poziom ekspresji Lx rów noważny z Y1306 i zawierał 3-5 kopii kasety. W wyniku transform ow ania EJ cu p 1 Δ 3d fragm entem z prit13460 uzyskano szczep Y1529 o właściwościach zbliżonych do Y1528. Y1528 i Y1529 skojarzono ze szczepem Y1295 i jego m atecznym trp - szczepem Y1215 (patrz p rzykład X X V I pow yżej) oraz ze szczepem Y1367, uzyskując następujące diploidy: Y1528 X Y1295 = Y1586', Y1528 X Y1215 = Y1587, Y1528 X Y1367 = Y1588, Y1529 X Y1295 = Y1589, Y1529XY1215 = Y1590 oraz Y1529XY1367 = Y1591. Szczep Y1367, będący α, leu2, trp l, i zawierający 6-8 kopii tej samej kasety białka S co szczep Y1295, otrzym ano z wykorzystaniem szczepów i technik opisanych w przypadku konstrukcji Y1295 w przykładzie XX V I. D iploidalne szczepy wymienione powyżej selekcjonuje się pod względem poziom ów ekspresji antygenu powierzchniowego oraz stosunku polipeptydów Lx i S w cząstkach, z wykorzystaniem blottingu W esterna, testu AUSRIA i epitopowo-specyficznego testu ELISA, stosując reagenty i m etody opisane powyżej, zwłaszcza w przykładach XXIII i XXVII. Liczbę i stabilność zintegrow a- nych kaset ekspresji ustalono m etodą blottingu Southerna. W razie potrzeby diploidalne szczepy m ożna zarodnikow ać w celu uzyskania segregantów haploidalnych, które m ożna następnie selekcjonow ać pod kątem ekspresji i stabilności genetycznej, w sposób opisany powyżej.

50 W wyniku insercji fragm entu H indlll-k pni o 3050 bp zprit13222 w pr IT 13144, a następnie postępow ania w wyżej opisany sposób uzyskać m ożna szczepy S. cerevisiae zaw ierające zintegrowane kopie kasety ekspresji Δ gly Lx oraz szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji cząstki S, Δ gly Lx. Zgodnie z kolejnym rozwiązaniem dokonuje się insercji kasety ekspresji Lx w wektorze zbliżonym do prit13134-p (Jacobs i inni, Gene 80: , 1989), przenoszącym geny URA3 i CUP1 jako selektywne m arkery wstawione wewnątrz elementu Tyl w prit Z wektora tego, o symbolu prit13501, odzyskać m ożna fragm ent B glll o około 6500 bp i zastosować go do transform ow ania i integracji w odpowiednich drożdżach-żywicielach, dokonując selekcji pod kątem transform antów URA+. Po transform acji ilość zintegrowanych kaset m ożna dogodnie zwiększyć dokonując selekcji pod kątem zwiększonych poziom ów odporności na miedź, jak to ujawniono w opisie patentowego zgłoszenia w Stanach Zjedn. Amer. nr 07/ Przykład XXXII. Ekspresja mieszanych cząstek S, Lx z determ inantam i subtypu ad i ay. W ykonano konstrukcję integracyjnego wektora z kasetą ekpresji białka Lx subtypu ay dokonując wymiany fragm entu X bai-sac II kodującego C-końcową część białka S subtypu ad oraz część term inatora transkrypcji A R G na odpowiedni fragm ent genu S s subtypu ay. Plazmid prit13459 (przykład XXXI) straw iono endonukleazam i X bal i Scali, po czym największy fragm ent oczyszczono na 1% żelu agarozowym i zligowano z oczyszczonym fragm entem X bal-s acll o 1000 bp, z prit10780, uzyskując prit prit10780 opisano w pracy De Wilde i innych, D evelop. Biol. S tandard, 59: (1985). Sekwencja kodująca Lx w prit13500 zawiera D N A z sekwencjami takim i samymi jak w wirusie o specyficzności ad, od kodonu A TG do miejsca X bal oraz D N A pochodzące z wirusa o specyficzności ayw, od miejsca X bal do kodonu terminacji. W ytworzony w wyniku ekspresji polipeptyd Lx będzie zawierał determ inanty subtypu ay. Fragm ent X hol o około 7700 bp z prit13500 m ożna zintegrować w genomie drożdżowym i uzyskane transform anty skojarzyć ze szczepami takim i jak Y1295 i Y1367, sposobam i opisanym i powyżej, tak aby uzyskać szczepy wytwarzające w wyniku ekspresji mieszane cząstki, w których polipeptyd Lx należy do subtypu ay, a polipeptyd S do subtypu ad. Powyższy opis i przykłady ilustrują wynalazek, nie ograniczając go. W ykonać m ożna np. szereg dodatkowych modyfikacji białka L, takich jak częściowe deglikozylowanie lub kom binacja różnych wykonywanych w nim m odyfikacji, oprócz wspom nianych w przykładach, w celu wytworzenia zmodyfikowanych białek L oraz cząstek o mieszanym lub jednorodnym składzie podjednostkow ym, zawierających takie zm odyfikow ane białka L, o składzie odpow iednim dla zastosow ania w szczepionkach. D o dodatkow ych m odyfikacji, które m ożna wykonać, należy ponow ne w prow adzanie sekwencji pres, wprowadzanie sekwencji kodujących pochodzących z sekwencji kodujących białko HBV, innych niż z genu kopertowego HBV, np. sekwencji z genu rdzeniowego HBV, albo też sekwencji kodujących im m unologicznie istotne regiony am inokw asów z innych patogenów. S tosować można dodatkow e znane składniki wektorowe w celu zastąpienia specyficznych genów m arkerowych, prom otorów i sekwencji linkerowych oraz innych elementów stosowanych w przykładach. W ykorzystywać m ożna także kom órki-żywiciele innego typu. Kom órki-żywiciele, wektory oraz składniki wektorów zastosowane w przykładach stanow ią jedynie ilustracje, tak że mogą być zastąpione innymi szczepami lub modyfikacjami. W ynalazek obejmuje swym zakresem wszystkie ulepszenia i m odyfikacje objęte zastrzeżeniam i.

51 Zestawienie pozycji literaturowych Burrell i inni, N ature 279, (1979) Charney i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, (1979) Cregg i inni, Mol. Cell. Biol. 5, (1985) Dehoux i inni, Gene 48, (1986) Eble i inni, Mol. Cell. Biol. 6, (1986) Eckart i inni, K lonierung und Charakterisierung der Gene für die D ihydroxyacetonsynthease und M ethanoloxidase aus der m ethylotrophen Hafe H ansenula polym orpha, praca dokt., University D üsseldorf (1988) Ellis i inni, Mol. Cell, Biol. 5, (1985) Galibert i inni, N ature 281, (1979) Grindley i inni, Proc. N atl. Acad. Sci. USA 77, (1980) H arford i inni, Postgrad. Medical J. 63, Suppl. 2, (1987) H eerm ann i inni, J. Virol. 52, (1984) Hitzem ann i inni, N ature 293, (1981) Im am ura i inni, J. Virology 61, (1987) Itoh i inni, Biochem. Biophys. Res. Comm. 138, 268 (1986) Jacobs i inni, Gene 67, (1988) Janow icz i inni, Nuci. Acid. Res. 13, (1985) Jimenez i Davies, N ature 287, (1980) Kingsman i inni, Biotech. Gen. Eng. Res. 3, 377 (1985) Klebe i inni, Gene 25, (1983) Kniskern i inni, H epatology 8, (1988) Köhler i Milstein, N ature 227, (1970) Langley i inni, Gene 67, 229 (1988) Ledeboer i inni, Nucleic A cid Res. 13, (1985) Lowry i inni, J. Biol. Chem. 193, (1951) M aniatis i inni, Cold Spring H arbor Laboratory, Cold Spring H arbor (1982) M axam i G ilbert, Proc. N atl. Acad. Sci. USA 74, (1977) M clachlan i inni, patent W O 88/06185 (1988) Michel i inni, Proc. N atl. Acad. Sci. USA 81, (1984) Milich i inni, Science 228, (1985) Milich i inni, Im m unology Today 9, (1988) M urray i inni, zgłoszenie patentow e EP-A (1980) Ou i inni, J. Virol. 61, 782 (1987) Persing i inni, Proc. N atl. Acad. Sci. USA 82, (1985) Pontisso i inni, J. Virological M ethods 6, (1983) Roggenkamp i inni, M ol. Gen. Genetics. 302, (1986) Rutgers i inni, Viral H epatitis and Liver Disease: wyd. A. S. Zuckerm ann i A. R. Liss, New York (1988) Rutgers i inni, Biotech. 6, (1988) Schwartz i C antor, Cell. 37, 67 (1984) Sninsky i inni, N ature 279, (1979) Southern, J. M ol. Biol. 98, (1975) Stinchcomb i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, Struhl i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, (1979) Szumeness i inni, New England J. Med. 303, (1980)

52 Tischopp i inni, zgłoszenie patentow e EP-A Tschum per i Carbon, Gene 10, (1980) Towbin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, (1979) Valenzuela i inni, N ature 280, (1979) Valenzuela i inni, N ature 298, 347 (1982) Valenzuela i inni, Biotech. 3, 317 (1985) W ilson i Nakame w Im m unofluorescence and Related Techniques