PL B1. MIĘDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMÓRKOWEJ W WARSZAWIE, Warszawa, PL BUP 07/06. GRZEGORZ KUDŁA, Zielonka, PL

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 15/11 ( ) C12N 15/06 ( ) C12N 15/31 ( ) C12N 15/63 ( ) (54) Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, zmodyfikowany gen, wektor ekspresyjny i komórka ssacza transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 07/06 (73) Uprawniony z patentu: MIĘDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMÓRKOWEJ W WARSZAWIE, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: GRZEGORZ KUDŁA, Zielonka, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Witek Rafał WITEK TWARDOWSKA ŚNIEŻKO KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH Spółka Partnerska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, sposób prowadzenia ekspresji białka w komórce ssaczej, zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej oraz wektor i komórka ssacza zawierające ten gen. Cechą charakterystyczną kodu genetycznego jest kodowanie jednego aminokwasu przez kilka wariantów kodonów (patrz tabela 1). Zazwyczaj kodony odpowiadające danemu aminokwasowi różnią się dwoma pierwszymi nukleotydami, co wiązane jest z ich wyjątkowym znaczeniem w oddziaływaniach pomiędzy trna i mrna w trakcie translacji. Zaobserwowano również, że pewne kodony są częściej używane przez określone organizmy lub tkanki, a także wpływ pewnych kodonów na wydajność i szybkość procesu translacji. Liczne publikacje opisują korelację obserwowaną w różnych organizmach istniejącą pomiędzy wyborem kodonów, a wydajnością translacji (przykładowo lida K. i Akashi H., Gene 261 (2000) i cytowane tam publikacje). Znane są sposoby podnoszenia poziomu ekspresji genów polegające na zmianie sekwencji kodowanego przez te geny mrna. Polegają one na dostosowaniu sekwencji poddawanego ekspresji genu do specyficznych warunków translacji cechujących komórkę, w której produkowane ma być dane białko. Znane sposoby opierają się na uwzględnieniu we wprowadzanych modyfikacjach preferencji używania poszczególnych kodonów (ang. codon usage) reprezentowanych w podlegającym translacji mrna, które to preferencje są obserwowane w danym organizmie. Tego rodzaju podejście opisano między innymi w US , EP , WO , WO , WO T a b e l a 1. Kodony występujące w mrna i odpowiadające im aminokwasy alanina (Ala) arginina (Arg) asparagina (Asn) aminokwas kwas asparaginowy (Asp) leucyna (Leu) lizyna (Lys) prolina (Pro) fenyloalanina (Phe) kodon 1 2 GCU GCC GCA GCG CGU CGC CGA CGG AGA AGG AAU AAC GAU GAC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AAA AAG CCU CCC CCA CCG UUU UUC

3 PL B1 3 cysteina (Cys) glutamina (Gln) kwas glutaminowy (Glu) glicyna (Gly) histydyna (His) izoleucyna (Ile) metionina (Met) seryna (Ser) treonina (Uhr) walina (Val) tryptofan (Urp) tyrozyna (Uyr) 1 2 UGU UGC CAA CAG GAA GAG GGU GGC GGA GGG CAU CAC AUU AUC AUA AUG UCU UCC UCA UCG AGU AGC ACU ACC ACA ACG GUU GUC GUA GUG UGG UAU UAC cd. tabeli 1 Podsumowując, można stwierdzić, że dotychczasowe sposoby podnoszenia wydajności ekspresji białek dotyczące zmian obojętnych dla sekwencji aminokwasowej produkowanego białka wprowadzanych w sekwencji kodującej pożądany polipeptyd skupiały się głównie na próbie optymalizacji przebiegu procesu translacji, a wprowadzane zmiany polegały na dostosowaniu kodonów obecnych w wykorzystywanym mrna do preferencji używania poszczególnych kodonów cechującej dany organizm. Istotnym ograniczeniem opisanych sposobów jest ścisłe powiązanie zakresu ich stosowania z rodzajem wykorzystywanego do ekspresji organizmu/tkanki/komórki wynikające z różnic w preferencjach używania poszczególnych kodonów charakterystycznych dla różnych typów gospodarzy. Istnieje jednak ciągłe zapotrzebowanie na metody pozwalające na zwiększanie wydajności rekombinowanych białek, zwłaszcza w komórkach ssaczych. Pożądane jest, aby takie metody niewywoływany zmiany właściwości produkowanego białka, a także nadawały się do stosowania w różnych typach komórek ssaczych. Nieoczekiwanie tak zdefiniowany cel udało się osiągnąć dzięki niniejszemu wynalazkowi. Przedmiotem niniejszego wynalazku są: sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, sposób prowadzenia ekspresji białka w komórce ssaczej, zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej oraz wektor i komórka ssacza zawierające ten gen, zdefiniowane w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

4 4 PL B1 Sposób według wynalazku polega na takiej zmianie sekwencji genu kodującego dane białko, żeby uzyskać wysoką częstość występowania nukleotydów G i C w obszarze kodującym genu, bez zmieniania sekwencji aminokwasowej białka. W praktyce polega to na takiej zamianie większości nukleotydów A i T, najczęściej w trzecich pozycjach kodonów, na nukleotydy C i G, aby nie zmienić sekwencji kodowanego białka. Stosowane w niniejszym opisie pojęcie cicha substytucja" dotyczy takiej zmiany w sekwencji nukleotydowej, która nie prowadzi do zmiany kodowanej przez nią sekwencji aminokwasowej. Każdorazowo prowadzi ona do osiągnięcia zmiany synonimicznej. Stosowane w niniejszym opisie pojęcie częstość występowania nukleotydów G i C charakteryzujące sekwencję nukleotydową może być utożsamiane z zawartością procentową tych nukleotydów w całkowitym składzie nukleotydowym danej sekwencji. Zaproponowana metoda może być stosowana wobec różnych znanych genów kodujących pożądane białko, zarówno naturalnych jak i rekombinowanych, które mają być poddane ekspresji w komórkach ssaczych. Sekwencje takich genów są łatwo dostępne dla specjalisty i mogą być przykładowo uzyskane z bazy GeneBank dostępnej w Internecie ( Zmodyfikowany gen według wynalazku może być łatwo otrzymany znanymi technikami, przykładowo techniką wprowadzania poszczególnych mutacji punktowych do polinukleotydu genu poddawanego modyfikacji albo poprzez zautomatyzowaną syntezę de novo całego genu lub jego fragmentów. Pojęcie znane odmiany i rekombinowane pochodne" stosowane w niniejszym opisie wobec białek kodowanych przez gen modyfikowany metodą według wynalazku obejmuje wszelkie znane warianty, mutanty i pochodne takich białek. Mogą to być białka naturalne albo rekombinowane, posiadające np. ulepszone właściwości funkcjonalne. Przykładowymi pochodnymi białek są białka fuzyjne, białka humanizowane lub białka posiadające dodatkowe sekwencje ułatwiające ich oczyszczanie. Specjalista, w oparciu o powszechnie dostępną wiedzę, będzie w stanie wskazać odpowiednie sekwencje aminokwasowe jak również zaproponować ich pożądane modyfikacje. Szczególnym przykładem białek nadających się do produkowania metodą według wynalazku są białka terapeutyczne wymienione w Tabeli 2. Są to białka, których ekspresja jest szczególnie pożądana, ze względu na ich oczekiwane właściwości terapeutyczne. T a b e l a 2. Wybrane białka terapeutyczne Klasa Białko Wskazanie Hormony Enzymy Insulina zwierzęca Rekombinowana insulina ludzka Rekombinowany ludzki hormon wzrostu Hormon uwalniający gonadotropinę Ludzka kosmówkowa gonadotropina Kalcytonina z łososia Rekombinowana ludzka erytropoetyna (epoetyna) Czynnik VIII rhdnaza Rekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu Rekombinowana streptokinaza Rekombinowana stafylokinaza cukrzyca cukrzyca Niedobór hormonu wzrostu, Zespół Turnera Męska niepłodność Hipogonadyzm hipogonadotropowy Choroba Pageta, hiperkalcemia w chorobie nowotworowej osteoporoza postmenopauzalna anemia Hemofilia Mukowiscydoza Thromboliza w ostrym zawale mięśnia sercowego Thromboliza w ostrym zawale mięśnia sercowego Thromboliza w ostrym zawale mięśnia sercowego

5 PL B Cytokiny IFN-alfa2a Hepatitis C, Niektóre nowotwory cd. tabeli 2 Czynniki wzrostu Receptory i antagoniści IFN-alfa2b IFN-beta 1a, 1b IL-2 IL-3 białko fuzyjne IL-3 GM-CSF (PIXY321) GM-CSF Ludzki G-CSF CD4 Lenercept (TNF białko rozpuszczalnej formy receptora) Etanercept (TNF białko rozpuszczalnej formy receptora) Leukemia, guz nowotworowy Stwardnienie rozsiane, niektóre nowotwory niektóre nowotwory niektóre nowotwory niektóre nowotwory niektóre nowotwory Neutropenia HIV Stwardnienie rozsiane Reumatoidalne zapalenie stawów G-CSF = czynnik stymulujący wzrost granulocytarnych kolonii; GM-CSF = czynnik stymulujący wzrost granulocytarnychmakrofagowych kolonii; HIV = ludzki wirus upośledzenia odporności, IFN = interferon; IL = interleukina; rhdnase = rekombinowana ludzka deoksyrybonukleaza; TNF = czynnik martwicy nowotworu Geny pozyskane metodą według wynalazku zgodnie z jednym z jego aspektów mogą być wykorzystywane w przemysłowej produkcji białek w odpowiednich kulturach hodowlanych. Zarówno warunki hodowli jak i dobór odpowiedniego gospodarza i zaprojektowanie wektora właściwego do jego transfekcji leżą w możliwościach specjalisty dysponującego dostępną wiedzą z tej dziedziny. Zgodnie z innym aspektem wynalazku, geny modyfikowane mogą być wykorzystywane w terapii genowej. Również w tym przypadku należy zwrócić uwagę na odpowiedni wybór wektora stosowanego do wprowadzania genu modyfikowanego dostosowany do leczonego organizmu lub tkanki, czy też pożądanego efektu terapeutycznego lub planowanej metody leczenia. Specjalista w oparciu o dostępną wiedzę z tej dziedziny będzie w stanie dokonać koniecznego doboru pozostałych elementów i warunków terapii. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nieoczekiwanie ustalono, że geny o wysokiej zawartości nukleotydów G i C w sekwencji kodującej są poddawane ekspresji skuteczniej niż geny o niskiej zawartości G i C. Zwiększenie zawartości nukleotydów G i C w genie wpływa na zwiększenie ilości mrna produkowanego przez ten gen. Natomiast nie stwierdzono wpływu zawartości nukleotydów G i C na prędkość translacji. Można postulować co najmniej dwa mechanizmy zaobserwowanego efektu, mianowicie wydajniejsza produkcja mrna przez geny o wysokiej zawartości G i C może być wynikiem większej stabilności mrna albo też wydajniejszej transkrypcji. Celem lepszego zilustrowania wynalazku opisano poniżej przykłady jego realizacji dla pewnych genów ssaczych. Zilustrowano również obserwowany efekt wzrostu poziomu ekspresji dla genów modyfikowanych. Nie należy jednak ograniczać zakresu przedmiotowego wynalazku jedynie do wskazanych przykładowych genów, komórek ssaczych, wektorów i warunków ekspresji. W szczególności należy oczekiwać, że wzrost poziomu ekspresji będzie obserwowany również dla innych genów i ssaczych układów ekspresyjnych. P r z y k ł a d 1. Porównanie wydajności ekspresji w komórkach ssaczych genów o wysokiej i niskiej zawartości nukleotydów G i C. W celu porównania wydajności ekspresji genów o wysokiej i niskiej zawartości nukleotydów G i C użyto wektora pegfp-n2 (BD Clontech) oraz wektora pgfp-n2, stworzonego przez nas. Wektory te zawierają promotor CMV do ekspresji w komórkach ludzkich i są identyczne na całej długości, z wyjątkiem sekwencji genów kodujących białka EGFP i GFP. Gen kodujący białko EGFP zawiera 97% nukleotydów G i C w trzeciej pozycji kodonów, a gen kodujący białko GFP - 33% nukleotydów G i C w trzeciej pozycji kodonów. Sekwencje aminokwasowe białek EGFP i GFP są identyczne; identyczne są również 3' i 5' UTRy genów GFP i EGFP oraz sekwencje Kozak w tych genach.

6 6 PL B1 Wektor pgfp-n2 uzyskano przez podstawienie sekwencji kodującej białko GFP w wektorze pegfp-n2 przez sekwencje kodującą GFP z wektora ps65t-c1 (BD Clontech), oraz 3 mutagenezy prowadzące do uzyskania jednakowej sekwencji aminokwasowej białek GFP kodowanych przez wektory pegfp-n2 i pgfp-n2. Sekwencje wektorów przedstawiono na figurach 1 i 2. Sekwencję części kodującej GFP wektora pgfp-n2 sprawdzono przez sekwencjonowanie. Poziom ekspresji genów GFP i EGFP monitorowano przy użyciu cytofluorymetru przepływowego. Komórki HeLa wysiewano na płytce 6-dołkowej w ilości komórek na dołek, a następnego dnia transfekowano 1.5 µg wektorów pgfp-n2 albo pegfp-n2, przy użyciu 5 µg odczynnika Lipofectamine2000. Podobnie komórki HEK293 wysiewano na płytce 6-dołkowej w ilości na dołek, a następnego dnia transfekowano 2 µg wektorów pgfp-n2 albo pegfp-n2, przy użyciu 4 µg odczynnika PEI. Po 24 godzinach komórki trypsynizowano, zawieszano w buforze PBS i mierzono fluorescencję na cytofluorymetrze. Poziom białka EGFP był kilkudziesięciokrotnie wyższy niż białka GFP. Wyniki zaprezentowano na fig. 3 i fig. 4. W celu porównania ilości mrna genów EGFP i GFP, 24 godziny po transfekcji komórek wykonano izolację całkowitego RNA komórkowego za pomocą zestawu NucleoSpin firmy Macherey-Nagel. Po określeniu ilości RNA we wszystkich próbkach wykonano odwrotną transkrypcję za pomocą zestawu firmy Fermentas, a następnie ilościowe oznaczenie cdna za pomocą urządzenia Light-Cycler (Roche) przy użyciu odczynnika Sybr-Green. Sekwencje starterów przyłączały się do cdna EGFP i GFP w obszarze 3'UTR, co gwarantowało identyczną wydajność PCR w obu przypadkach, ponieważ obszary 3'UTR tych genów są identyczne. Jako kontroli jednakowej wydajności transfekcji wektorami pegfp-n2 i pgfp-n2 użyto sekwencji cdna genu oporności na neomycynę, znajdującego się na tych plazmidach. Ilości produktów genu oporności na neomycynę były podobne w przypadku transfekcji wektorami pegfp-n2 i pgfp-n2. Przeciwnie, poziom mrna genu EGFP był kilkudziesięciokrotnie wyższy niż poziom mrna genu GFP, zarówno w komórkach HeLa jak i HEK293. W świetle wcześniejszej wiedzy uzyskany efekt należy uznać za nieoczekiwany. Wyniki zaprezentowano na figurze 5. P r z y k ł a d 2. Porównanie wydajności ekspresji w komórkach ssaczych podobnych genów ssaczych o wysokiej i niskiej zawartości nukleotydów G i C. Przykładem ludzkich genów o podobnej sekwencji, ale różnej zawartości nukleotydów G i C są geny HSPA1A i HSPA8, kodujące odpowiednio białka Hsp70 i Hsc70. Gen HSPA1A zawiera 92% nukleotydów G i C w trzeciej pozycji kodonów, a gen HSPA8-46% nukleotydów G i C w tej pozycji. W celu porównania wydajności ekspresji tych genów stworzono wektory pet-hsc70 i pet-hsp70 zawierające promotor dla polimerazy T7, pozwalający na syntezę mrna w warunkach in vitro. Zsyntetyzowane mrna wykorzystano następnie do pokazania, że mimo różnicy w zawartości nukleotydów G i C, prędkość translacji obu genów jest identyczna (szczegółowo eksperyment opisano w publikacji Grzegorz Kudła, Aleksandra Helwak, i Leszek Lipiński, Gene Conversion and GC-Content Evolution in Mammalian Hsp70", Molecular Biology and Evolution : ). Stworzono następnie wektory pcdna3.1-hsc70-ha oraz pcdna3.1-hsp70-ha, których sekwencje zaprezentowano na figurach 6 i 7. Są to wektory pozwalające na ekspresję genów Hsc70 i Hsp70 w komórkach ludzkich, zawierające promotor CMV oraz tag HA umożliwiający skuteczne wykrywanie białek w lizatach komórkowych metodą Westernbloting. Uzyskane wyniki ekspresji powinny potwierdzić wpływ zawartości nukleotydów G i C na poziom ekspresji - w tym przypadku podobnych genów. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania zmodyfikowanego genu, znamienny tym, że w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej genu wprowadza się ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Ala zastępuje się kodonem wybranym spośród GCC i GCG. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Cys zastępuje się kodonem TGC. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Asp zastępuje się kodonem GAC.

7 PL B Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Glu zastępuje się kodonem GAG. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Phe zastępuje się kodonem TTC. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Gly zastępuje się kodonem wybranym spośród GGC i GGG. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający His zastępuje się kodonem CAC. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Ile zastępuje się kodonem ATC. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Lys zastępuje się kodonem AAG. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Leu zastępuje się kodonem wybranym spośród TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, korzystnie kodonem CTG albo CTC. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Asn zastępuje się kodonem AAC. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Pro zastępuje się kodonem wybranym spośród CCG albo CCC. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Gln zastępuje się kodonem CAG. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Arg zastępuje się kodonem wybranym spośród CGT, CGC, CGA, CGG, AGG, korzystnie kodonem CGC albo CGG. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Ser zastępuje się kodonem wybranym spośród TCC, TCG albo AGC. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Thr zastępuje się kodonem ACC albo ACG. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Val zastępuje się kodonem GTC albo GTG. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kodon odpowiadający Trp stosuje się TGG, a jako kodon odpowiadający Met stosuje się ATG. 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodon odpowiadający Thr zastępuje się kodonem ACC albo ACG. 21. Sposób według jednego z zastrz. od 1 do 20, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen kodujący białko wybrane spośród: czynników transkrypcyjnych, chaperonów (białek opiekuńczych), hormonów białkowych, enzymów, cytokin, czynników wzrostu lub receptorów i antagonistów lub ich znanych odmian i rekombinowanych pochodnych. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że hormon białkowy jest wybrany z grupy obejmującej: insulinę zwierzęcą, insulinę ludzką, ludzki hormon wzrostu, hormon uwalniający gonadotropinę, ludzką kosmówkową gonadotropinę, kalcytoninę z łososia, ludzką erytropoetynę lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne. 23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że enzym jest wybrany z grupy obejmującej: Czynnik VIII krzepnięcia krwi, rhdnazę, tkankowy aktywator plazminogenu, streptokinazę, stafylokinazę lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne. 24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że cytokina jest wybrana z grupy obejmującej: IFN-alfa2a, IFN-alfa2b, IFN-beta 1a, 1b, IL-2, IL-3 lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne. 25. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że czynnik wzrostu jest wybrany z grupy obejmującej: białko fuzyjne IL-3 GM-CSF (PIXY321), GM-CSF, ludzki G-CSF lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne. 26. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że receptor lub antagonista jest wybrany z grupy obejmującej: CD4, lenercept, etanercept lub ich znane odmiany i rekombinowane pochodne. 27. Sposób prowadzenia ekspresji białka w komórce ssaczej, znamienny tym, że identyfikuje się sekwencję nukleotydową genu kodującego rzeczone białko, w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej genu wprowadza się ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C, syntetyzuje się wektor ekspresyjny zawierający gen o zmodyfikowanej sekwencji połączony operacyjnie z sekwencjami umożliwiającymi ekspresję w komórek ssaczej, a następnie (znanymi

8 8 PL B1 metodami) wprowadza się otrzymany wektor ekspresyjny do komórki ssaczej i uzyskuje się ekspresję zmodyfikowanego genu. 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wprowadzając substytucje dokonuje się zmiany kodonów według zastrz. od 2 do Sposób według zastrz. 27 albo 28, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen według zastrz. od 21 do Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że komórka ssacza jest komórką ludzką lub jej pochodną. 31. Sposobi według zastrz. 27, znamienny tym, że ekspresję zmodyfikowanego genu uzyskuje się in vitro albo w organizmie ssaka. 32. Zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, znamienny tym, że w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej zawiera ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C. 33. Zmodyfikowany gen według zastrz. 32, znamienny tym, że zawiera zmiany kodonów według zastrz. od 2 do Zmodyfikowany gen według zastrz. 32 albo 33, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen według zastrz. od 21 do Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, przy czym rzeczony gen w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej zawiera ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C. 36. Wektor ekspresyjny według zastrz. 35, znamienny tym, że zmodyfikowany gen zawiera zmiany kodonów według zastrz. od 2 do Wektor ekspresyjny według zastrz. 35 albo 36, znamienny tym, że modyfikowanym genem jest gen według zastrz. od 21 do Wektor ekspresyjny według zastrz. 35 albo 36 albo 37, znamienny tym, że jest wektorem do przemysłowej produkcji białka albo wektorem to terapii genowej. 39. Komórka ssacza, znamienna tym, że jest transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym zmodyfikowany gen o zwiększonym poziomie ekspresji w komórce ssaczej, przy czym rzeczony gen w obszarze kodującym sekwencji nukleotydowej zawiera ciche substytucje zwiększające częstość występowania nukleotydów G i C. 40. Komórka według zastrz. 39, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny według zastrz. od 35 do 38.

9 PL B1 9 Rysunki

10 10 PL B1

11 PL B1 11

12 12 PL B1

13 PL B1 13

14 14 PL B1

15 PL B1 15

16 16 PL B1

17 PL B1 17

18 18 PL B1

19 PL B1 19

20 20 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)