(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 08.03.2000, PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:"

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/53787 PCT Gazette nr 37/00 (51) Int.Cl. C12N 15/40 ( ) C12N 7/04 ( ) C07K 14/08 ( ) A61K 39/12 ( ) (54) Replikony zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zastosowanie replikonów PRRSV, szczepionki zawierające replikony PRRSV i zastosowanie tych szczepionek (30) Pierwszeństwo: ,EP, (73) Uprawniony z patentu: BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GmbH,Ingelheim nad Renem,DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/03 (72) Twórca(y) wynalazku: Janneke Meulenberg,Amsterdam,NL Helene Verheije,Zeist,NL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/10 (74) Pełnomocnik: Bartnik Urszula, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp z o.o. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są replikony zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zastosowanie replikonów PRRSV, szczepionki zawierające replikony PRRSV i zastosowanie tych szczepionek. Wirus zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (porcine reproductive and respiratory syndrome virus - PRRSV) jest wirusem RNA o pozytywnej nici, należącym do rodziny arteriwirusów wraz z końskim wirusem zapalenia tętnic (equine arteritis virus - EAV), wirusem podwyższającym poziom dehydrogenazy mleczanowej (lactate dehydrogenase-elevating virus - LDV) i wirusem małpiej gorączki krwotocznej (simian hemorrhagic fever virus) (Meulenberg i wsp., 1993). Ostatnio Międzynarodowa Komisja ds. Taksonomii Wirusów zdecydowała o włączeniu tej rodziny do nowego rzędu wirusów - Nidovirales - wraz z Coronaviridae (długość genomowa kb) i Toroviridae (długość genomowa kb). Rząd Nidovirales zawiera wirusy RNA w otoczkach, zawierające genom RNA o nici dodatniej i wytwarzające w czasie replikacji umiejscowiony na 3' zestaw RNA subgenomowych. Subgenomowe RNA koronawirusów i arteriwirusów zawierają sekwencję liderową, pochodzącą z końca 5' genomu wirusa. Subgenomowe RNA torowirusów nie zawierają sekwencji liderowej. Podczas gdy ORF 1a i 1b, kodujące zależną od DNA polimerazę RNA, ulegają ekspresji z RNA genomowego, mniejsze ORF na końcu 3' genomów Nidovirales, kodujące białka strukturalne, ulegają ekspresji z mrna subgenomowego. W niniejszym opisie replikon definiuje się jako pochodzący z rekombinowanego kwasu nukleinowego. Chociaż pojawiają się informacje na temat genomu PRRSV, nie wiadomo na przykład, gdzie mogą być umiejscowione delecje lub modyfikacje w genomie PRRSV, aby powstały rekombinowany kwas nukleinowy można było zastosować jako replikon czynnościowy, umożliwiający replikację RNA in vivo, w (komplementarnych) komórkach wykazujących lub nie, ekspresję zasadniczych białek wirusowych (PRRS) takich jak polimeraza lub białka strukturalne (otoczkowe), lub umożliwiający niezależną replikację RNA in vivo u zwierząt, takich jak świnie, po szczepieniu szczepionką zawierającą kwas nukleinowy, kodujący taki replikon PRRS. PRRSV (wirus Lelystad) został po raz pierwszy wyizolowany w 1991 r. przez Wensvoorta i wsp. (1991) i udowodniono, że jest on przyczyną nowej choroby, znanej obecnie jako zespół reprodukcyjny i oddechowy świń (PRRS). Głównymi objawami choroby są zaburzenia oddechowe u świń i poronienia u macior, niekiedy powikłane padnięciem maciory. Chociaż ustały największe epidemie, takie jak obserwowane po raz pierwszy w Stanach Zjednoczonych w roku 1987 i w Europie w 1991, wirus ten, w swoich rozmaitych mniej lub bardziej zjadliwych postaciach, nadal powoduje znaczne straty ekonomiczne w stadach w Stanach Zjednoczonych, Europie i Azji. PRRSV preferencyjnie rozwija się w makrofagach pęcherzyków płucnych (Wensvoort i wsp., 1991). Na wirus podatnych jest również kilka linii komórkowych, takich jak CL2621 i inne linie komórkowe, klonowane z małpiej linii komórek nerkowych MA-104. Niektóre dobrze znane szczepy PRRSV znane są pod numerem CNCM I-1102, I-1140, I-1387, I-1388, ECACC V lub ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 i VR Genom PRRSV ma długość 15 kb i zawiera geny kodujące zależną od RNA polimerazę RNA (ORF1a i ORF1b) i geny kodujące białka strukturalne (ORF 2-7; Meulenberg i wsp., 1993 i Meulenberg i wsp., 1996). ORF 5 koduje główną glikoproteinę otoczki, oznaczoną jako GP 5. ORF 2, 3 i 4 kodują, odpowiednio, glikoproteiny oznaczone jako GP 2, GP 3 i GP 4. Glikoproteiny te nie są tak szeroko obecne w oczyszczonych wirionach izolatów wirusa Lelystad PRRSV. Białko GP 5 tworzy połączony dwusiarczkami heterodimer z białkiem błonowym M kodowanym przez ORF6. Białko nukleokapsydu N jest kodowane przez ORF7. Analiza sekwencji genomowej izolatów PRRSV z Europy i Ameryki Północnej i ich reaktywność z przeciwciałami monoklonalnymi dowiodła, że stanowią one dwa różne typy antygenów. Izolaty z tych kontynentów są genetycznie różne i rozwój ich, od wspólnego przodka, musiał podążyć inną drogą względnie dawno temu (Murtaugh i wsp., 1995). Świnie zarażają się PRRSV przez pysk i jamę nosową. Wirus w płucach jest wychwytywany przez makrofagi w pęcherzykach płucnych i w komórkach tych replikacja PRRSV dokonuje się w ciągu 9 godzin. PRRSV przemieszcza się z płuc do węzłów chłonnych płuc w czasie 12 godzin i do obwodowych węzłów chłonnych, szpiku kostnego i śledziony w ciągu 3 dni. W miejscach tych tylko nieliczne komórki barwią się dodatnio w kierunku antygenu wirusowego. Wirus obecny jest we krwi przez co najmniej 21 dni, a często znacznie dłużej. Po 7 dniach stwierdza się obecność przeciwciał przeciwko PRRSV we krwi. Jednoczesna obecność wirusa i przeciwciał u świń zakażonych PRRS wskazuje, że

3 PL B1 3 zakażenie wirusem może utrzymywać się długo, chociaż na niskim poziomie, mimo obecności przeciwciał. Przez co najmniej 7 tygodni populacja komórek pęcherzyków płucnych różni się od prawidłowych płuc SPF. PRRSV wymaga zakażenia świń swą otoczką przez pysk i jamę nosową, a fizjologiczna reakcja immunologiczna świni obejmuje zatem między innymi wytwarzanie neutralizujących przeciwciał, skierowanych przeciwko jednemu lub więcej białku otoczki; przeciwciała te mogą wyeliminować zakaźność wirusa. Po dojściu do makrofagów pęcherzyków płucnych wirus wytwarza jednak również nagie kapsydy, utworzone z RNA zamkniętego w kapsydzie z białka M i/lub N, niekiedy częściowo zawierających którąkolwiek z glikoprotein. Wewnątrz- i zewnątrzkomórkową obecność tych niekompletnych cząstek wirusowych lub (częściowo) nagich kapsydów można wykazać w mikroskopii elektronowej. Niekiedy można stwierdzić obecność nagich kapsydów bez zawartości kwasu nukleinowego. Nagie kapsydy wykazują rozmieszczenie w całym organizmie, przenosząc się z krwią, i są wychwytywane z krwi przez makrofagi w śledzionie, węzłach chłonnych i szpiku kostnym. Nie jest możliwa neutralizacja tych nagich, lecz zakaźnych kapsydów wirusowych przez przeciwciała wytworzone przez organizm świni, co wyjaśnia utrzymywanie się zakażenia wirusowego w obecności przeciwciała. W ten sposób potomstwo makrofagów z zakażonych komórek szpiku kostnego szerzy zakażenie wirusowe do nowych okolic ciała. Ponieważ nie wszystkie komórki linii makrofagów szpiku kostnego są zakażone, jedynie niewielka liczba makrofagów na obwodzie jest zakażona i wytwarza wirusy. Kapsydy PRRSV, złożone jedynie z białek ORF7, mogą tworzyć się w nieobecności innych białek wirusowych, poprzez na przykład zakażenie makrofagów rekombinacyjnym wektorowym wirusem wścieklizny rzekomej ORF7. Wirus PRV poddano manipulacji tak, aby zawierał genetyczną informację ORF7 PRRSV. Po 18 godzinach od zakażenia cytoplazma zakażonych komórek zawiera dużą liczbę małych, pustych struktur sferycznych o wymiarach nukleokapsydów wirusa PRRS. Chociaż dostępne są obecnie żywe atenuowane i zabite szczepionki PRRSV, wykazano, że ogólnie nie są one dostatecznie immunogenne, lub są zbyt zjadliwe dla pewnych grup świń, na przykład dla młodych prosiąt lub macior w trzecim trymestrze ciąży. Oczywiste jest, że niedostatecznie immunogenna szczepionka PRRSV nie utrzyma się na rynku. Jednakże niektóre z istniejących szczepionek immunogennych nie są bezpieczne, co ilustruje konieczność wprowadzenia atenuowanych szczepionek PRRSV o zmniejszonej zjadliwości. Ponadto, znów w szczególnych okolicznościach, niektóre z istniejących szczepionek szerzą się w populacji, i mogą w niezamierzony sposób zakażać inne świnie, nie wymagające szczepienia lub takie, u których szczepienie jest przeciwwskazane, co ilustruje konieczność wprowadzenia nie szerzących się szczepionek PRRSV. Ponadto, dostępnych szczepionek nie można zwykle odróżnić od wirusa typu dzikiego, co ilustruje konieczność wprowadzenia tak zwanej szczepionki markerowej, uzyskanej na przykład poprzez mutagenezę genomu, tak aby świnie zaszczepione można było odróżnić od świń zakażonych wirusem dzikim na podstawie różnicy przeciwciał w surowicy. Ponadto szczepionki PRRS, szeroko stosowane na całym świecie, i zwykle nie zakażające zwierząt innych, niż świnie, byłyby potencjalnie atrakcyjnymi szczepionkami do przenoszenia obcych antygenów pochodzących z innych (świńskich) patogenów dla zapewnienia ochrony przez tymi innymi patogenami, co ilustruje konieczność opracowania nośnika PRRSV lub szczepionek wektorowych, umożliwiających szczepienie przeciwko tym innym patogenom lub pozwalających na pozytywną identyfikację markera. Oczywiste jest, że korzystne byłoby sporządzenie takiej szczepionki PRRSV, która łączyłaby w sobie kilka tych cech, niniejszy wynalazek zapewnia tą właśnie potrzebę. Przedmiotem wynalazku jest replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), charakteryzujący się tym, że co najmniej niektóre z jego oryginalnych kwasów nukleinowych PRRSV uległy delecji, przy czym replikon ten zdolny jest do replikacji RNA in vivo i zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5' ORF1a-ORF1b-ORF7-regionu niekodującego 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi między nukleotydami z ORF7 PRRSV. Replikon według wynalazku zawiera ponadto kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego drobnoustroju heterologicznego, oraz korzystnie zawiera ponadto substytucje lub delecje kwasu nukleinowego w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N.

4 4 PL B1 Ponadto, bardziej korzystnie, zawiera modyfikację kwasu nukleinowego, polegającą na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub 76. W innej korzystnej odmianie wynalazku, replikon zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. Do replikona według wynalazku, korzystnie można także wprowadzić umożliwiający rozróżnienie serologiczne. W takim wykonaniu wynalazku, korzystnie replikon zawiera ponadto modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N, a modyfikacja kwasu nukleinowego może korzystnie prowadzić do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub 6. Replikon według wynalazku zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV, przy czym korzystnie modyfikację kwasu nukleinowego ma miejsce w ORF6, kodującej białko M przezbłonowe. Ta modyfikacja replikonu według wynalazku modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie replikonu jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania szczepionki. Korzystnie, szczepionka wytworzona w zastosowania według wynalazku jest szczepionką nierozprzestrzeniającą się, a bardziej korzystnie szczepionka ta jest szczepionką markerową. Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano powyżej. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie szczepionki jak zdefiniowano powyżej do szczepienia świń. Kolejno, przedmiotem wynalazku jest replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zdolny do replikacji RNA in vivo, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5' ORF1a-ORF1b-ORF7-region niekodujący 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi nukleotydom między nukleotydami z regionu ORF7 PRRSV i ponadto zawierający kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego heterologicznego drobnoustroju. Replikon według wynalazku zawiera ponadto substytucje lub delecje w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N. Modyfikacje kwasu nukleinowego, polegają w tym replikonie według wynalazku, na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub 76. W innym korzystnym wykonaniu, modyfikacja kwasu nukleinowego może też prowadzić do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. Replikon według wynalazku ma wprowadzony marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. W kolejnym korzystnym rozwiązaniu replikon według wynalazku zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N, a bardziej korzystnie replikon zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub 6, lub także może zawierać modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV. W najbardziej korzystnym wykonaniu replikon zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującą białko M przechodzące przez błonę, a modyfikacja ta modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. Replikon według wynalazku zawierający ponadto kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego heterologicznego mikroorganizmu charakteryzuje się tym, że ten drobnoustrój heterologiczny zawiera patogen, a patogenem tym korzystnie jest wirus. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie replikonu jak zdefiniowano powyżej do wytworzenia szczepionki. Szczepionka wytworzona zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest szczepionką nie rozprzestrzeniającą się, lub bardziej korzystnie szczepionką markerową. Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano powyżej. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie tej szczepionki według wynalazku do szczepienia świń. Jak to zdefiniowano powyżej szczegółowo przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zawierający co najmniej niektóre z oryginalnych delecji kwasów nukleinowych PRRSV, zawierający również substytucje, przy czym replikon ten

5 PL B1 5 zdolny jest do replikacji RNA in vivo, a ponadto pozbawiony jest co najmniej kilku z oryginalnych kwasów nukleinowych PRRSV i/lub został uzupełniony kwasami nukleinowymi pochodzącymi z heterologicznego drobnoustroju. Nieoczekiwanie stwierdzono, że genom PRRSV można pozbawić dość dużej ilości jego kwasów nukleinowych. Niezależny i funkcjonalny replikon PRRSV, zdolny do niezależnej replikacji RNA in vivo, może nadal istnieć, jeżeli delecji i/lub modyfikacji uległ odcinek kwasu nukleinowego, kodujący ORF2-ORF6. Dysponowanie replikonem, w którym tak długi odcinek kwasu nukleinowego uległ delecji lub modyfikacji, otwiera szerokie możliwości dodania do tego replikonu heterologicznego kwasu nukleinowego, pochodzącego z dowolnego organizmu innego, niż PRRSV, zapewniając w ten sposób replikon wektora PRRSV o dużych możliwościach nośnikowych. Jednocześnie niniejszy wynalazek zapewnia identyfikację konkretnych regionów kwasu nukleinowego w genomie wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń, istotnych dla atenuacji wirusa, do nadania im właściwości nieszerzenia się, lub szerzenia się w niewielkim stopniu, lub w celu wprowadzenia markera, bez uszkadzania wirusowego kwasu nukleinowego w takim stopniu, aby nie mógł zapewniać replikacji RNA in vivo. Ponadto twórcy wynalazku wykazali, że replikon PRRSV można stosować jako wektor ekspresji obcych antygenów, korzystnie, pochodzących z innych (świńskich) patogenów, umożliwiając szczepienie przeciwko tym innym patogenom i pozytywną identyfikację markera. Minimalnymi wymaganiami co do sekwencji dla replikonu PRRSV lub replikonu wektora PRRSV według niniejszego wynalazku są zasadnicze elementy, zawierające niekodujący region 5'-ORF1a- -ORF1b-ORF7-region kodujący 3' (na przykład z regionu polimerazy PRRSV), przez co region kodujący ORF7 można poddać dalszej delecji, na przykład według danych ukazanych na fig. 2. W korzystnym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon PRRSV lub wektor, zawierający co najmniej zasadnicze elementy z regionu polimerazy PRRSV, takie na przykład, jak to opisano poniżej i/lub zawierający co najmniej kwas nukleinowy, pochodzący z zasadniczego regionu 44 nukleotydów między nukleotydami a w genie ORF7 (jak to zidentyfikowano w sekwencji kwasu nukleinowego izolatu wirusa Lelystad PRRSV, jednakże specjalista może łatwo ocenić przez wyrównanie, w którym dowolnym innym genomie PRRSV dany zasadniczy element się znajduje). W innym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon PRRSV, zawierający co najmniej kwas nukleinowy, pochodzący z zasadniczych elementów sekwencji z ORF1a i ORF1b, lub z regionu polimerazy PRRSV, i w którym delecji poddano kwas nukleinowy z ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 lub niezasadnicze elementy z ORF7, umożliwiając insercję obcego kwasu nukleinowego, zapewniając w ten sposób replikonowi wektora PRRSV zdolności kodowania obcego antygenu. Pozostaje to w kontraście w stosunku do opisu WO98/55626, w którym polimerazę homologiczną zastępuje się heterologiczną polimerazą arteriwirusową w celu uzyskania ekspresji ORF2-ORF7, w zasadzie bez opisywania ekspresji obcych antygenów, pochodzących z innych (świńskich) patogenów dla zapewnienia ochrony przed tymi innymi patogenami (i tym bardziej, w którym kwas nukleinowy genomu PRRSV, kodujący obce antygeny, może być umiejscowiony tak, aby dostarczyć replikonu wektora PRRSV, lub którego zasadnicze elementy sekwencji powinny pozostać). Uważa się, że poliproteina replikazowa PRRSV, kodowana przez ORF1, ulega cięciu na 13 ulegających obróbce produktów końcowych (zwanych białkami niestrukturalnymi - nonstructural proteins - nsps) i dużą liczbę produktów pośrednich. Poliproteina jest rozszczepiana przez domeny proteazowe, zlokalizowane w nsp1α, nsp1β, nsp2 i nsp4. Zidentyfikowano zasadnicze motywy RNA- -zależnej polimerazy RNA PRRSV i wiązania trójfosforanu nukleozydu/helikazy RNA, odpowiednio, w nsp9 i nsp10. Inną zachowaną (zasadniczą) domenę odkryto w nsp11, zachowaną domenę bogatą w Cys/His znaleziono w nsp10. Wykazano na przykład, że to ostatnie białko odgrywa rolę w syntezie mrna subgenomowego. W innym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon PRRSV, zdolny do niezależnej replikacji RNA in vivo, przy czym replikon ten jest transkryptem RNA zakaźnego cdna-kopii. Dla wielu RNA nici dodatniej wykazano, że ich regiony 5' i/lub 3'-końcowe zawierają zasadnicze sygnały, kontrolujące zapoczątkowanie syntezy nici plus i minus RNA. Dla PRRSV nie ustalono, czy same te sekwencje wystarczają do replikacji. Podobnie jak w przypadku większości wirusów RNA, PRRSV zawiera zwięzły genom i oczekuje się, że większość informacji genetycznej ma znaczenie zasadnicze. Ponadto nie jest jeszcze znana maksymalna zdolność integracji obcych genów do genomu PRRSV. Dodatkowym ograniczeniem jest to, że ORF, kodujące białka strukturalne PRRSV, częściowo nakładają się na siebie. Wprowadzenie mutacji do tych nakładających się regionów często

6 6 PL B1 powoduje powstanie dwóch zmutowanych białek strukturalnych, bardziej prawdopodobne jest zatem wytworzenie nieżywotnego wirusa. Wytworzenie klonu zakaźnego umożliwiło analizę sygnałów replikacji w genomie PRRSV. W badaniu tym dokonano mapowania elementów sekwencji o działaniu cis, koniecznych do replikacji, przez wprowadzenie delecji do klonu zakaźnego. Nieoczekiwanie wykazano, że również elementy sekwencji o działaniu cis z regionu genomu, kodującego białka strukturalne, mają zasadnicze znaczenie dla właściwej replikacji. Wykazano, że transkrypty pochodzące z klonów cdna, w których brak jest genu ORF7, nie ulegają replikacji. Bardziej systematyczna analiza delecji wykazała, że region 44 nukleotydów między nukleotydami a w genie ORF7 miał zasadnicze znaczenie dla replikacji RNA PRRSV. Było to interesujące odkrycie, ponieważ sekwencje o zasadniczym znaczeniu dla replikacji większości wirusów RNA o nici dodatniej są obecne w regionach niekodujących 5' i 3'. Jest to stwierdzenie ważne dla badań, których celem jest opracowanie replikonów wirusowych, które można ocalić jedynie poprzez uzupełnienie liniami komórkowymi, wykazującymi ekspresję ORF, które uległy delecji. Minimalne wymagania sekwencji dla tych RNA są umiejscowione w regionie niekodującym 5'-ORF1a-ORF1b-ORF7-regionie niekodującym 3'. RNA wirusowe lub replikony zawierające te elementy sekwencji, uzupełnione wyborem fragmentów z innych otwartych ramek odczytu PRRSV lub fragmentów otwartych ramek odczytu, wykazujących ekspresję antygenów lub innych (heterologicznych) patogenów, można pakować do cząstek wirusa, gdy białka zasadnicze dla wytworzenia wirusa dostępne są w postaci trans. Gdy cząstki te podaje się świniom, na przykład jako szczepionkę, będą wchodzić do swoistych komórek-gospodarzy, takich jak makrofagi antygeny wirusowe lub heterologiczne ulegają ekspresji i indukują reakcje immunologiczne z uwagi na replikujący RNA. Jednakże ponieważ RNA nie wykazuje ekspresji (wszystkich) białek koniecznych do pakowania i wytwarzania nowych cząstek, replikon nie może szerzyć się dalej, tworząc bardzo skuteczną, lecz bezpieczną i nie szerzącą się szczepionkę rekombinacyjną, skutecznie działającą przeciwko PRRSV i/lub patogenom heterologicznym. W korzystnym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon według niniejszego wynalazku, niezdolny do tworzenia kapsydu N-białkowego. Na przykład obecne są dwie reszty Cys w pozycjach 27 i 76 w sekwencji białka N i poddanie mutacji lub delecji Cys-27 i Cys-76 z białka N hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek PRRSV. Gen ORF7, kodujący białko N, poddano mutacji jako taki, tak że podstawiono reszty Cys za reszty Asn i Leu, jednakże substytucja innym aminokwasem lub delecja sekwencji kodującej prowadzi również do pożądanego wyniku, jak to można na przykład zobaczyć poniżej. Następnie mutacje Cys-27 i Cys-76 wprowadzono do zakaźnego klonu pabv437 izolatu wirusa Lelystad PRRSV, tworząc plazmidy pabv (Cys-27 Asn) i pabv (Cys-76 Leu). RNA transkrybowano z tych zmutowanych klonów zakaźnych i transfekowano do komórek BHK-21. Białka strukturalne uległy odpowiedniej ekspresji, te zmutowane RNA poddano replikacji i uzyskano syntezę RNA subgenomowego. Jednakże nie doszło do wydzielenia zakaźnych cząstek, ponieważ przeniesienie nadsączu z transfekowanych komórek BHK-21 do makrofagów nie spowodowało wytwarzania białek wirusowych w makrofagach ani też indukcji cpe. Tak więc reszty te mają zasadnicze znaczenie dla właściwej struktury, czynności lub i struktury, i czynności białka N w tworzeniu wirusa PRRSV. Białko N bierze udział w pierwszych etapach powstawania wirusa, wiązaniu wirusowego RNA genomowego i tworzeniu struktury kapsydu. Ponieważ transkrypty klonów cdna o długości genomowej, zawierające delecję Cys-27 i/lub Cys-76, ulegały replikacji na poziomie typu dzikiego, mutacje w resztach Cys niszczą wiązanie RNA przez białko N. Zamiast tego indukują one różną strukturę białka N, hamującego tworzenie się prawidłowych kapsydów. Defekt w zamykaniu wirusowego genomu RNA w kapsydzie można uzupełnić poprzez przejściową lub stałą ekspresję białka N typu dzikiego w linii komórkowej BHK-21. W ten sposób wytwarzany jest wirus zdolny do ukończenia tylko jednego cyklu zakażenia/replikacji. Tak więc wirus taki uważa się za bardzo bezpieczną szczepionkę do ochrony przed PRRSV u świń. Zgodnie z innym przykładem wynalazek dostarcza replikon niezdolny do tworzenia kapsydu białka N, w którym substytucje w genomie kodującym okolicę białka N, zawierającą dwa regiony antygenowe, oznaczone B i D, hamują wytwarzanie zakaźnych cząstek wirusowych. Region B zawiera aminokwasy (QLCQLL), region D; aminokwasy (PEKPHFPLAAEDDIRHH), region D i aminokwasy (ISTAFNQGAGT) białka N PRRSV. Przy wyrównywaniu białek N tych szczepów znajduje się odpowiednie miejsce w VR2332 i innych szczepach amerykańskich. Ponieważ replikacja

7 PL B1 7 RNA i synteza mrna genomowego wydawała się pozostawać na poziomie właściwym dla typu dzikiego, mutacje te najprawdopodobniej zapobiegały tworzeniu właściwych kapsydów przez białko N. Wynalazek dostarcza ponadto replikon do którego wprowadzono marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. Na przykład wynikiem mutagenezy pojedynczego aminokwasu w regionie D (Asp-62 lub należące do niego aminokwasy) białka N jest powstanie replikonu o profilu wiązania MAb różnym od PRRSV i wszystkich innych wirusów PRRSV. Replikon taki indukuje różne spektrum przeciwciał u świń, w porównaniu z tymi innymi izolatami PRRSV. Tak więc można go odróżnić od wirusa dzikiego na podstawie przeciwciał w surowicy i jest mutantem doskonale nadającym się do dalszego rozwoju szczepionek markerowych przeciwko PRRSV. Powyższy przykład obejmuje subtelną modyfikację, dającą w wyniku replikon nadający się do szczepionki markerowej. Obecnie są jednak możliwe bardziej szerokie zmiany, jeżeli wie się, że można częściowo lub całkowicie usunąć kwas nukleinowy kodujący białka strukturalne 2, 3, 4, 5 i/lub 6 bez hamowania właściwości replikacyjnych powstałego replikonu. Replikon PRRSV nie posiadający jednego lub kilku (antygenowych) fragmentów tych białek strukturalnych jest korzystny, ponieważ nie dochodzi do powstawania reakcji immunologicznej, konkretniej, do wytwarzania przeciwciał przeciwko tym usuniętym fragmentom, na przykład po szczepieniu szczepionką zawierającą taki replikon. Ponownie, taki replikon indukuje spektrum przeciwciał u świń różne od spektrum dla PRRSV typu dzikiego. Tak więc można go odróżnić od wirusa dzikiego na podstawie przeciwciał w surowicy i jest on doskonałym mutantem do dalszego rozwoju szczepionek markerowych przeciwko PRRSV. Ponadto wynalazek dostarcza replikon, zawierający modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV. Nie wyjaśniono dokładnie znaczenia markerów wirulencji PRRSV, mimo tego, że obserwowano rozmaite różnice w wirulencji. Dla powodzenia w atenuowaniu PRRSV lub jego replikonu wiedza ta jest jednak przydatna, do doboru najmniej zjadliwego, lecz najbardziej immunogennego możliwego replikonu lub wirusa. Obecnie, kiedy wiadomo, że możliwa jest delecja lub modyfikacja regionu ORF2-ORF6 bez wpływu na właściwości replikacji RNA in vivo, takie markery wirulencji można łatwo wykrywać. Na przykład przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, zawierający modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującym białko M błonę przechodzące przez. Stwierdzono, że to białko błonowe wpływa na tworzenie wirusa, stabilność wirusa lub wchodzenie wirusa do makrofagów; wszystkie te czynniki przyczyniają się do wirulencji PRRSV. Białko M jest najbardziej zachowanym białkiem strukturalnym wśród arteriwirusów i koronawirusów. Białko to jest integralnym białkiem błonowym, zawierającym trzy N-końcowe hydrofobowe domeny, przechodzące przez błonę (Rottier, 1995). Białko to przechodzi przez błonę, trzykrotnie opuszczając krótką domenę N-końcową poza wirionem i krótką domenę C-końcową wewnątrz wirionu. Wykazano, że białko M koronawirusów odgrywa ważną rolę w tworzeniu wirusa (Vennema i wsp., 1996), lecz nie stwierdzono wówczas, aby był czynnikiem wirulencji. W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, w którym modyfikacja ta zmienia białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę, mającym zasadnicze znaczenie w określaniu wirulencji danego izolatu PRRSV. Na przykład przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, zawierający vabv575. Mutacja Thr-59 Asn jest umiejscowiona między drugim a trzecim przechodzącym przez błonę fragmentem M w vabv575. Mutacja ta wpływa na tworzenie wirusa, stabilność wirusa lub wchodzenie wirusa do PAM. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto replikon według niniejszego wynalazku, w którym heterologiczny drobnoustrój zawiera patogen. Ponieważ PRRSV swoiście zakaża makrofagi, można go stosować jako wektor do podawania ważnych antygenów lub innych (oddechowych) czynników do tej swoistej komórki układu immunologicznego. Zakaźny klon cdna umożliwia nam wprowadzenie mutacji swoistej dla miejsca, delecji i insercji do genomu wirusa. W korzystnym wykonaniu przedmiotem niniejszego wynalazku jest replikon, w którym patogen jest wirusem. Z powodzeniem stosowaliśmy PRRSV jako wektor do ekspresji antygenu obcego białka, epitopu HA hemaglutyniny wirusa grypy A. Wytworzono rekombinacyjne replikony wektora PRRSV, wytwarzające tag HA, który uległ fuzji z końcem N lub C białka N. Ponadto stworzono mutant PRRSV, zawierający tag HA, jak również proteazę 2A wirusa pryszczycy (foot-and-mouth-disease - FMDV), poddaną fuzji z końcem N białka N. Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku jest szczepionka, zawierająca replikon lub replikon wektora według niniejszego wynalazku. Szczepionki PRRSV wykazują obecnie szczególną antygenowość lub immunogenność, i są na przykład dodatkowo dostatecznie bezpieczne dla określonej grupy świń, na przykład dla młodych prosiąt lub macior w trzecim trymestrze ciąży.

8 8 PL B1 Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku są nieszerzące się szczepionki PRRSV, zawierające replikon lub replikon wektorowy, na przykład niezdolne do tworzenia kapsydu z białka N, lub niezdolne do dalszego zakażania ze względu na nieobecność (fragmentów) białek strukturalnych, kodowanych przez ORF 2-6, bez hamowania ich właściwości replikacji RNA in vivo, umożliwiając wytwarzanie białek, przeciwko którym korzystne jest uzyskanie reakcji immunologicznej. Ponadto przedmiotem niniejszego wynalazku jest szczepionka, którą można rozróżnić od wirusa typu dzikiego, tak zwana szczepionka markerowa, wytworzona na przykład poprzez mutagenezę genomu, tak że świnie zaszczepione można odróżnić od świń zakażonych wirusem typu dzikiego na podstawie różnic w przeciwciałach w surowicy. Ponadto szczepionki PRRSV, tak szeroko stosowane na świecie, zwykle niezakaźne dla zwierząt innych, niż świnie, dostarcza się obecnie jako szczepionki wektorowe do przenoszenia obcych antygenów, pochodzących z innych (świńskich) patogenów, umożliwiając szczepienie przeciwko tym innym patogenom i dodatnią identyfikację markera. Zastosowanie szczepionki według niniejszego wynalazku jest szczególne korzystne do szczepienia świń, ponieważ PRRSV jest zwykle bardzo swoisty w odniesieniu do gospodarza i replikuje się w makrofagach świń, ukierunkowując się na ważną komórkę prezentującą antygen układu immunologicznego. Niniejszy wynalazek dokładniej objaśniono w szczegółowym opisie, poniżej. Szczegółowy opis 1. Mutacja Cys-27 i Cys-76 w białku N hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek PRRSV Nukleokapsydowe białko N (ulegające ekspresji przez ORF7) obecne jest w postaci monomeru w oczyszczonych wirionach PRRSV. Jednakże w niektórych doświadczeniach wykrywaliśmy również homodimer N. Na przykład przy immunoprecypitacji białka N z oczyszczonych wirionów z N-swoistymi MAb i jego elektroforezie na żelu z soli sodowej siarczanu poliakrylamidowego (SDS-PAGE), obserwowano głównie białko o ciężarze 15 kda w zredukowanych warunkach (Meulenberg i wsp., 1996). Jednakże, kiedy stosowano związki takie, jak N-metylomaleimid lub jodoacetamid, do zapobiegania tworzeniu się nieswoistych wiązań dwusiarczkowych, nie wykrywano tych dimerów N. Wskazuje to, że dimery N tworzą się wskutek tworzenia nieswoistych wiązań dwusiarczkowych w czasie obróbki lizatów komórek do analizy. W sekwencji białka N obecne są dwie reszty cysteinowe. Powstaje pytanie, które reszty cysteinowe są odpowiedzialne za tworzenie nieswoistych wiązań dwusiarczkowych i pytanie, czy reszty cysteinowe mają znaczenie dla struktury i czynności białka N. W celu uzyskania odpowiedzi na to pytanie zmutowaliśmy indywidualnie dwie reszty cysteinowe w zakaźnym klonie cdna PRRSV i badaliśmy zakaźność powstałych zmutowanych wirusowych RNA genomowych. 2. Wprowadzenie markera do białka N Białko N PRRSV zawiera 4 miejsca antygenowe, oznaczone A-D (Meulenberg i wsp., 1998). Dwa miejsca, B i D, zawierają epitopy, zachowane w europejskich i północnoamerykańskich izolatach PRRSV. W celu wytworzenia wirusów, które można serologicznie odróżnić od wirusów typu dzikiego, do zakaźnego klonu cdna PRRSV wprowadzono mutacje w domenie B i D, rozrywające wiązanie N-swoistych MAbs. Analizowano transkrypty powstałych zmutowanych, pełnej długości klonów cdna pod kątem replikacji RNA poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych i wytwarzanie zakaźnego wirusa. 3. Wyjaśnienie sygnałów replikacji, obecnych w regionie kodującym białka strukturalne wirusa Lelystad Wirusy RNA o nici dodatniej zawierają niekodujące regiony 3' i 5', mające zasadnicze znaczenie dla replikacji. Sekwencje RNA końca 5' i 3' zwykle mają swoistą strukturę drugorzędową, rozpoznawaną przez zależną od wirusowego RNA polimerazę RNA w celu zapoczątkowania syntezy nici dodatniej i ujemnej i w przypadku arteriwirusów syntezy RNA subgenomowego. Poddaliśmy delecji gen ORF7 z zakaźnego klonu ORF7 PRRSV (Meulenberg i wsp., 1998) w pierwszej próbie wytworzenia defektywnego replikonu RNA, który można byłoby uzupełnić do wytwarzania cząstek zakaźnych po transfekcji do komórki, wykazującej ekspresję białka N. Gen ORF7 precyzyjnie usunięto, nie uszkadzając nie kodującego regionu 3' wirusa. Nieoczekiwanie RNA tego mutanta delecyjnego nie ulegał replikacji w komórkach BHK-21. Sugerowało to, że w regionie kodującym ORF7 znajdują się sygnały replikacji RNA. Celem tego badania była dalsza lokalizacja tych sygnałów replikacyjnych. Poprzez rozległą analizę delecji regionu kodującego i leżących w kierunku końca 5' sekwencji ORF7 byliśmy w stanie zidentyfikować 44-nukleotydowy region w genie ORF7, ważny dla replikacji RNA PRRSV.

9 PL B Wytwarzanie atenuowanego wirusa PRRSV przez delecję miejsca Ndel w ORF6 Ostatnio ustaliliśmy jaki jest cdna klonu zakaźnego PRRSV (Meulenberg i wsp., 1998). Pełnej długości klon cdna zawiera dwa miejsca Ndel, pierwsze na nukleotydzie (ORF3) i drugie na nukleotydzie (w ORF6) w sekwencji genomowej. W celu ułatwienia mutagenezy i wymiany fragmentów w regionie kodującym białka strukturalne (ORF 2-7) wirusa, zniszczyliśmy drugie miejsce Ndel przez mutagenezę kierowaną PCR. Spowodowało to substytucję aminokwasu w pozycji 59 w białku M (Thr Asn). Poddano analizie właściwości wzrostu wirusa wytworzonego ze zmutowanego, pełnej długości klonu cdna, zawierającego unikalne miejsce Ndel. 5. Wirus Lelystad jako wektor ekspresji obcych antygenów lub białek Wytworzenie zakaźnego klonu cdna PRRSV (Meulenberg i wsp., 1998) jest przełomem w badaniach nad PRRSV i otwiera nowe możliwości rozwoju nowych wektorów wirusowych. Ponieważ PRRSV swoiście zakaża makrofagi, można go stosować jako wektor do dostarczania ważnych antygenów innych (oddechowych) środków do tej swoistej komórki układu immunologicznego. Zakaźny klon cdna umożliwia nam wprowadzenie swoistych dla miejsca mutacji, delecji i insercji do genomu wirusowego. Jednakże nadal nie wiadomo, które regiony genomu PRRSV mają zasadnicze znaczenie lub umożliwiają mutagenezę. Podobnie jak w przypadku większości wirusów RNA, PRRSV zawiera zwięzły genom i oczekuje się, że większość informacji genetycznej będzie informacją o zasadniczym znaczeniu. Ponadto nie jest jeszcze znana maksymalna zdolność do integracji obcych genów do genomu PRRSV. Dodatkowym ograniczeniem jest to, że ORF kodujące białka strukturalne PRRSV częściowo nakładają się na siebie. Wprowadzenie mutacji do tych nakładających się regionów powoduje powstanie dwóch zmutowanych białek strukturalnych, a zatem częściej można spodziewać się powstania w wyniku tego nieżywotnego wirusa. Celem niniejszego badania było zidentyfikowanie regionów w genomie PRRSV, umożliwiających wprowadzenie obcych antygenów, które byłyby eksponowane na układ immunologiczny świni po zakażeniu zmutowanym wirusem. W pierwszym podejściu wybraliśmy mały epitop 9 aminokwasów ludzkiej hemaglutyniny grypy A do ekspresji w PRRSV. Metody Komórki i wirusy Komórki BHK-21 hodowano w pożywce BHK-21 (Gibco BRL), uzupełnionej 5% FBS,10% bulionem z fosforanem tryptozy (Gibco BRL), 20 mm HEPES ph 7,4 (Gibco BRL) i 200 mm glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Makrofagi pęcherzyków płucnych świni (PAM) utrzymywano w pożywce MCA-RPMI-1640, zawierającej 10% FBS, 100 μg/ml kanamycyny, 200 U/ml penicyliny i 200 μg/ml streptomycyny. Zapas wirusa wytworzono poprzez seryjne pasażowanie rekombinacyjnych wirusów PRRSV, wydzielonych w nadsączu hodowli transfekowanych komórek BHK-21 na PAM. Wirus zebrano, gdy PAM wykazały efekt cytopatyczny (cpe), co następowało zwykle w 48 godzin po zakażeniu. Oznaczono miana wirusów (wyrażone jako dawki zakażające 50% hodowli tkankowych [TCID 50 ] na ml na PAM, stosując rozcieńczenie punktu końcowego (Wensvoort i wsp., 1986). Mutageneza 1. Mutageneza Cys-27 i Cys-76 Cys-27 poddano mutacji do Asn poprzez ukierunkowaną PCR mutagenezę z primerami LV108 i LV97. Sekwencje primerów zastosowanych w tym badaniu przedstawiono w tabeli 1. Wytworzony fragment PCR poddano trawieniu Hpal i Pflml i insercji do genu ORF7 w pabv431, poddanym trawieniu tym samym enzymem. W ten sposób powstał plazmid pabv451. Cys-76 poddano mutacji do Leu przez ukierunkowaną PCR mutagenezę z primerami LV108 i LV100. Wytworzony fragment poddano trawieniu Hpal i ClaI i insercji do genu ORF7 w pabv431, poddanemu trawieniu tymi samymi enzymami. Spowodowało to powstanie pabv452. Zmutowane geny ORF7 przeniesiono następnie do klonu cdna o długości genomowej pabv437 (Meulenberg i wsp., 1998) z unikalnym miejscem Hpal (nt 14581) i PacI (nt 14981), w celu wytworzenia plazmidów pabv (Cys-27 Asn) i plazmidów pabv (Cys-76 Leu; fig. 1). 2. Mutageneza miejsc antygenowych B i D w białku N Miejsca antygenowe B (aminokwasy 25-30) i D (aminokwasy i 80-90) białka N PRRSV poddano mutacji przez substytucję aminokwasów, odpowiednio, EAV i LDV. Plazmidy pabv455, pabv463 i pabv453, zawierające te odpowiednie mutacje, opisali uprzednio Meulenberg i wsp. (1998). Ponadto Asp w pozycji 62 w regionie D białka N uległo mutacji do Tyr w PCR z primerami LV108 i LV188. Sekwencje tych primerów ukazano w tabeli 1. Fragment PCR poddano trawieniu Hpal

10 10 PL B1 i CiaI i insercji do genu ORF7 w pabv431, trawionym tymi samymi enzymami. Spowodowało to powstanie pabv582. Geny ORF7, zawierające mutacje, wprowadzono do pabv437 z zastosowaniem unikalnego Hpal (nt 14581) i PacI (nt 14981) (Fig. 1). 3. Tworzenie mutantów delecyjnych w klonie cdna pełnej długości PRRSV Dokonano kilku delecji w klonie cdna pełnej długości PRRSV (fig. 2). Najpierw delecji poddano ORF2, ORF3, ORF4, ORF5 i połowę 5' ORF6. pabv437 poddano trawieniu EcoRI i Nhel i miejscom nadano tępość" fragmentem Klenowa (Pharmacia Biotech). Fragment oczyszczono i poddano ligacji. Spowodowało to powstanie plazmidu klonu pabv594. Po drugie, ORF7 poddano delecji z zakaźnej kopii PRRSV. W tym celu zakaźny pełnej długości klon cdna pabv442, zawierający miejsce restrykcyjne Swal, bezpośrednio w kierunku końca 3' od kodonu stop ORF7 poddano trawieniu Hpal i Swal i ligacji. Spowodowało to powstanie plazmidu klonu pabv521. Po trzecie, w celu dokonania delecji końca 3' ORF6 przeprowadzono mutagenezę z primerami LV198 i LV199. Primery zastosowane w mutagenezie PCR wymieniono i opisano w tabeli 1. Wytworzony produkt poddano trawieniu Hpal i Nhel i ligacji w odpowiednich miejscach pabv437. Spowodowało to powstanie plazmidu pabv627. Po czwarte dokonano kilku delecji w kierunku końca 5' od regionu kodującego ORF7. Przeprowadzono mutagenezę PCR z primerami ku przodowi" LV lub LV i odwrotnym primerem LV112. Wytworzone produkty poddano trawieniu Hpal i PacI i ligacji w tych samych miejscach restrykcyjnych pabv437, w wyniku czego powstały plazmidy pabv i pabv Plazmidy przekształcono do DH5α Escherichia coli i hodowano w temperaturze 32 C w obecności 20 μg kanamycyny na ml. Dla każdego konstruktu dokonano sekwencjonowania dwóch klonów zawierających fragmenty dwóch niezależnych PCR dla potwierdzenia właściwej struktury klonów. Powstałe mutanty przedstawiono na Fig Mutageneza miejsca Ndel w pozycji w zakaźnym klonie cdna pabv437 PRRSV W celu zmutowania miejsca Ndel w pozycji 14265, powielono fragment 1,7 kb metodą PCR z zastosowaniem primerów LV27 (nt 12526) i LV182 (nt 14257; tabela 1). Primer LV182 zawiera miejsce Asel. Asel i Ndel mają kompatybilne końce, jednak ligacja ich końców wzajemnie ze sobą niszczy oba miejsca restrykcyjne. Fragment PCR poddano trawieniu Ndel i Asel i ligacji z pabv437 strawionym Ndel. Pełnej długości klon pabv575 (fig. 3), zawierający fragment PCR we właściwej orientacji, nie posiadał miejsca Ndel w pozycji i nie miał innych mutacji między a z uwagi na błędy PCR, wybrano do dalszej analizy. 5. Wytwarzanie pełnej długości mutantów cdna genomowego PRRSV, kodujących antygenowy tag HA Zastosowano mutagenezę PCR do wytworzenia mutantów w zakaźnym klonie PRRSV. Po pierwsze wprowadzono sekwencję 27 nukleotydów, kodujących epitop ludzkiej hemaglutyniny grypy A (tag HA; Kolodziej i wsp., 1991) bezpośrednio w kierunku końca 3' od kodonu start ORF7 w mutancie PacI klonu cdna długości genomu wirusa Lelystad (pabv437; Meulenberg i wsp., 1998). Przeprowadzono dwa sekwencyjne PCR z primerami LV192 i LV112 i z primerami LV193 i LV112. Primery zastosowane do wytworzenia fragmentów PCR wymieniono i opisano w tabeli 1. Po drugie zarówno ten tag HA, jak i sekwencja 51 nukleotydów kodujących proteazę 2A wirusa pryszczycy (Percy i wsp., 1994) wprowadzono bezpośrednio w kierunku końca 3' od kodonu start ORF7. Przeprowadzono dwie sekwencyjne reakcje PCR z primerami LV139 i LV112 i z primerami LV140 i LV112. Po trzecie, tag HA wprowadzono na końcu 3' genu 0RF7 w PCR z primerami LV108 i LV194. Trzy wytworzone fragmenty PCR poddano trawieniu Hpal i PacI i ligacji do pabv437, trawionego tym samym enzymem. Przeprowadzono standardowe procedury klonowania w sposób w zasadzie zgodny z opisem Sambrook i wsp. (1989). Plazmidy transformowano do DH5α Escherichia coli i hodowano w temperaturze 32 C w obecności 20 μg kanamycyny na ml. Dla każdego konstruktu dokonano sekwencjonowania dwóch klonów zawierających fragmenty dwóch niezależnych PCR dla potwierdzenia właściwej struktury klonów. Wprowadzenie epitopu HA na końcu 5' ORF7 spowodowało wytworzenie klonu pabv525, wprowadzenie zarówno tagu HA, jak i proteazy 2A na końcu 5' ORF7 spowodowało wytworzenie klonu pabv523, a wprowadzenie epitopu HA na końcu 3' ORF7 spowodowało powstanie klonu pabv526 (fig. 4). Analiza sekwencji Wytworzone klony cdna analizowano poprzez sekwencjonowanie oligonukleotydów. Sekwencje oligonukleotydów oznaczono zestawem do sekwencjonowania cyklicznego PRISM Ready Dye Deoxy Terminator i automatycznym urządzeniem do sekwencjonowania (Applied Biosystems).

11 PL B1 11 Transkrypcja i transfekcja RNA in vitro Pełnej długości klony cdna genomowego i ich pochodne linearyzowano Pvul, znajdującym się bezpośrednio w kierunku końca 3' obszary poli(a). Linearyzowane plazmidy strącano etanolem i 1,5 μg tych plazmidów zastosowano do transkrypcji in vitro polimerazą T7 RNA sposobami opisanymi dla SFV przez Liljeströma i Garoffa (1991). RNA transkrybowane in vitro strącono izopropanolem, przemyto 70% etanolem i przechowywano w temperaturze -20 C do użycia. Komórki BHK-21 posiano w 35-mm zagłębieniach (około 10 6 komórek/zagłębienie) i transfekowano 2,5 μg RNA transkrybowanego in vitro, zmieszanego z 10 ml lipofektyny in optimem, jak to opisywano uprzednio (Meulenberg i wsp., 1998). Zamiast tego, RNA wprowadzano do komórek BHK-21 w 20-mm zagłębieniach z 0,5 μg transkrybowanego in vitro RNA, zmieszanego z 2 ml lipofektyny in optimem. Pożywkę zebrano 24 godziny po transfekcji i przeniesiono do komórek CL2621 lub PAM dla ocalenia zakaźnego wirusa. Transfekowane i zakażone komórki badano pod kątem ekspresji białek PRRSV w teście jednowarstwowej immunoperoksydazy (IPMA), w zasadzie w sposób opisany przez Wensvoort i wsp. (1986). Do barwienia w tym teście zastosowano przeciwciała monoklonalne (MAbs) , i skierowane, odpowiednio, przeciwko GP 3, GP 4, białku M (van Nieuwstadt i wsp., 1996). Do badania ekspresji białka N zastosowano panel MAbs (122.17, 125.1, 126.9, , 130.2, 130.4, 131.7, 131.9, , WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17, NS95 i NS99) skierowany przeciwko czterem różnym miejscom antygenowym A-D (Meulenberg i wsp., 1998). Do wykrywania ekspresji epitopu HA zastosowano Mab 12CA5, nabyte w firmie Boehringer Mannheim. Ponadto analizowaliśmy ekspresję białek PRRSV przez znakowanie metaboliczne transfekowanych lub zakażonych komórek i następnie immunoprecypitację z zastosowaniem swoistych przeciwciał monoklonalnych lub surowic peptydowych skierowanych przeciwko białkom strukturalnym PRRSV, jak to opisał Meulenberg i wsp., (1996). Analiza sekwencyjna RNA genomowego wirusów rekombinacyjnych Zastosowano nadsącz hodowli PAM zakażonych pasażem 3 wirusów wykazujących ekspresję HA do analizy RNA wirusowego przez RT-PCR. Do 500 μl nadsączu dodano objętość 500 μl bufora proteinazy K (100 mm Tris-HCl [ph 7,2], 25 mm EDTA, 300 mm NaCl, 2% [masa/obj.] soli sodowej siarczanu dodecylowego) i 0,2 mg proteinazy K. Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 C ekstrahowano RNA fenolem-chloroformem i strącono etanolem. RNA poddano odwrotnej transkrypcji primerem LV76. Następnie przeprowadzono PCR primerami LV37 i LV112 w celu powielenia fragmentów vabv523 i vabv525 i primerami LV37 i LV75 w celu powielenia fragmentów vabv526 (tabela 1). Przeprowadzono analizę sekwencyjną w celu określenia, czy zmutowane wirusy pasażu 4 nadal zawierają wprowadzone obce sekwencje. Wyniki 1. Mutacja Cys-27 i Cys-76 w pełnej długości klonie cdna pabv437 W sekwencji białka N obecne są dwie reszty Cys w pozycjach 27 i 76. Gen ORF7, kodujący białko N, poddano takiej mutacji, że reszty Cys podstawiono, odpowiednio, za reszty Asn i Leu. Mutacje Cys-27 i Cys-76 wprowadzono następnie do zakaźnego klonu izolatu wirusa Lelystad PRRSV, uzyskując plazmidy pabv (Cys-27 Asn) i pabv (Cys-76 Leu; fig. 1). RNA transkrybowano z tych zmutowanych klonów zakaźnych i transfekowano do komórek BHK-21. Komórki te barwiły się dodatnio N-swoistymi MAb w IPMA. Analiza białka N, syntetyzowanego przez pabv i pabv w immunoprecypitacji i SDS-PAGE wykazała, że jej widoczna masa cząsteczkowa była podobna do masy cząsteczkowej białka N typu dzikiego i przemieszczała się w 15 kda w warunkach redukujących. Następnie analizowaliśmy białko N w warunkach nieredukujących w nieobecności maleimidu N-metylowego i jodoacetamidu. W tych warunkach białko N, którego ekspresja pochodziła z pabv (Cys-76 Leu) przypominało białko N typu dzikiego i było wykrywane głównie jako dimer, natomiast białko N, którego ekspresja pochodziła z pabv (Cys-27 Asn) było wykrywane jako monomer. Wskazuje to, że reszta Cys w pozycji 27 była odpowiedzialna za tworzenie nieswoistych wiązań dwusiarczkowych. Wytwarzanie innych białek strukturalnych, takich jak GP 3, GP 4 i M, było również wykrywane w IPMA i immunoprecypitacja po transfekcji pełnej długości RNA z plazmidów pabv (Cys-27 Asn) i pabv (Cys-76 Leu; fig. 1). Ponieważ białka strukturalne ulegały ekspresji we właściwy sposób, te zmutowane RNA ulegały replikacji i syntetyzowano RNA subgenomowe. Jednakże nie dochodziło do wydzielania zakaźnych cząstek, ponieważ transfer nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM nie spowodował wytwarzania białek wirusowych w PAM ani indukcji cpe. Tak więc obie reszty Cys mają zasadnicze znaczenie dla właściwej struktury lub czynności, lub i struktury, i czynności, białka n w całości wirusa.

12 12 PL B1 2. Charakterystyka pełnej długości klonów cdna, zawierających mutacje w miejscach antygenowych białka N PRRSV Miejsca B (aminokwasy 25-30) i D (aminokwasy i 80-90) są dwoma regionami antygenowymi, zachowanymi w europejskich i północnoamerykańskich izolatach PRRSV. Kiedy poddajemy mutacji miejsce B i D przez substytucję ich sekwencji aminokwasowej odpowiednimi aminokwasami białka N LDV lub EAV, wiązanie białka N, odpowiednio, przez MAb B-swoiste i D-swoiste ulega zaburzeniu (Meulenberg i wsp., 1998). W celu wytworzenia wirusa PRRSV antygenowo różnego od wirusów dzikich PRRSV, wprowadziliśmy geny ORF7, zawierające zmutowany region B lub D, do naszego klonu zakaźnego pabv437. Spowodowało to powstanie pabv , zawierających zmutowane miejsce B (aminokwasy 25-30), i pabv zawierających zmutowaną domenę D (aminokwasy 80-90) (fig. 1). Po transfekcji RNA tych pełnej długości klonów do komórek BHK-21 komórki te barwiły się dodatnio N-swoistymi MAb w 24 godziny po transfekcji. Jak tego oczekiwano, białko N, którego ekspresję wykazywały pabv , było rozpoznawane przez A-, C- i D-swoiste MAb, lecz nie przez MAb B-swoiste. Z drugiej strony białko N, którego ekspresję wykazywały pabv i pabv były rozpoznawane przez MAb A-, B- i C-swoiste, lecz nie przez MAb B-swoiste. Barwienie komórek transfekowanych RNA pochodzącym z pabv , pabv i pabv przez MAb skierowane przeciwko GP 3, GP 4 i M, było podobne do barwienia obserwowanego w transfekcjach RNA pochodzącym z pabv437 typu dzikiego. Sugeruje to, że mutacje nie wpłynęły na replikację RNA i syntezę mrna subgenomowego. Kiedy nadsącz komórek transfekowanych RNA pochodzącym z pabv , pabv i pabv przeniesiono do PAM, nie dochodziło do wytwarzania cpe. Najprawdopodobniej mutacje w regionach B i D niszczyły czynność białka N w zakresie tworzenia prawidłowej struktury kapsydu. Ponieważ mutacja 4 aminokwasów w domenie B i 5 lub 9 aminokwasów w domenie D nie umożliwiła wytworzenia cząstek zakaźnych, dokonaliśmy bardziej subtelnej mutacji 1 aminokwasu w regionie D. Wprowadziliśmy Asp-62 do mutacji Tyr w białku N w zakaźnym klonie PRRSV. Aminokwas Asp-62 w białku N PRRSV zmutowano do Tyr przez kierowaną PCR mutagenezę i przeniesiono do pabv437, otrzymując pabv600. RNA transkrybowany z pabv600 transfekowano do komórek BHK-21. Komórki te barwiły się dodatnio MAb skierowanymi przeciwko GP 3, GP 4, M i N w 24 godziny po transfekcji, sugerując, że doszło do replikacji RNA i syntezy mrna subgenomowego. Po przeniesieniu nadsączu z komórek BHK-1 transfekowanych transkryptami z pabv600 do PAM, wykrywano cpe w 2-3 dni po tym przeniesieniu. Zakażone komórki barwiły się dodatnio MAB skierowanymi swoiście przeciwko PRRSV, co stanowiło dalsze potwierdzenie wytwarzania zakaźnego wirusa. Tak więc mutacja Asp-62 do Tyr w białku N jest tolerowana w wirusie i nie powoduje zniszczenia czynności białka N. Zmutowany wirus vab600 typowano dalej panelem N-Swoistych MAb (tabela 2). Nie tylko wiązanie D-swoistego MAb SDOW17, lecz również wiązanie D-swoistych MAb 130.2, 130.4, i i WBE1 do vabv600 było znacznie zmniejszone. Po rozcieńczeniu nadsączu hodowli hybrydoma tych MAb do 0,3-0,5 μg/ml obserwowano intensywne barwienie dla PRRSV typu dzikiego, jednak nie obserwowano barwienia dla vabv600. Jednakże po oczyszczeniu IgG MAb 130.2, 130.4, i i zastosowaniu ich w większym stężeniu (10 μg IgG/ml), obserwowano słabe barwienie. Barwienie vabv600 A- i B-swoistymi MAb było porównywalne z PRRSV. Dane te wskazują, że wytworzyliśmy wirus antygenowo odmienny od PRRSV typu dzikiego i północnoamerykańskich wirusów PRRS. 3. Identyfikacja sygnałów replikacji na końcu 3' genomu PRRSV W celu określenia sekwencji działających cis, będących zasadniczymi sygnałami replikacji RNA (synteza nici plus i/lub minus i/lub synteza mrna subgenomowego) dokonano kilku delecji w zakaźnym klonie cdna i transkrypty pochodzące z tych mutantów delecyjnych poddano analizie w kierunku replikacji w komórkach BHK-21. Po transfekcji transkryptów z pabv521, w których nie był obecny cały gen ORF7, do komórek BHK-21, nie można było wykryć ekspresji białka N w IPMA (fig. 2). Co ciekawe, transkrypty te były również defektywne w zakresie ekspresji innych białek strukturalnych, takich jak GP 3, GP 4 i M. Wskazuje to, że te RNA nie ulegały replikacji i nie wytwarzały mrna subgenomowych. Z drugiej strony delecja ORF2, ORF3, ORF4, ORF5 na końcu 5' ORF6 z zakaźnej kopii (pavb594) spowodowała to, że RNA wirusowe było nadal zdolne do replikacji. Tak więc sygnały replikacji są obecne w regionie kodującym ORF7, lecz nie w regionie kodującym ORF 2-6. W celu zbadania tego i dalszej lokalizacji regionów biorących udział w replikacji, wytworzono mutanty zawierające mniejsze delecje w ORF7. Transkrypty z tych konstruktów badano pod kątem ich zdolności do replikacji poprzez wykrywanie ekspresji białek PRRSV w IPMA transfekowanych komórek BHK (fig. 2).

13 PL B1 13 Z wyników tych można wyciągnąć wniosek, że między nukleotydami a obecne są zasadnicze sygnały replikacji genomu PRRSV. RNA wirusowe nie zawierające tego regionu były defektywne w replikacji. 4. Analiza pełnej długości klonu cdna pabv575, nie posiadającego miejsca Ndel w ORF6 Wytworzono pełnej długości klon cdna - pabv575 - posiadający unikalne miejsce Ndel w pozycji z powodu mutacji drugiego miejsca Ndel w pozycji przez PCR. RNA wytwarzano z pabv575 i transfekowano do komórek BHK-21 wraz z RNA z jego klonu macierzystego pabv437. Po 24 godzinach po transfekcji RNA pabv575 i RNA pabv437 jednakowa liczba komórek barwiła się dodatnio w IPMA M-swoistymi i N-swoistymi MAb (fig. 3). Ponadto intensywność barwienia była podobna. Jednakże, kiedy nadsącz transfekowanych komórek BHK-21 przenoszono do PAM i inkubowano przez 24 godziny, liczba komórek zakażonych vabv575 była dużo mniejsza, niż obserwowana dla vabv437. Ponadto cpe rozwijał się znacznie wolniej w PAM zawierających vabv575, niż w PAM zawierających vabv437. Chociaż replikacja RNA i synteza RNA subgenomowych vabv575 w BHK-21 wydawała się pozostawać na poziomie właściwym dla typu dzikiego, wytworzony wirus był znacznie mniej zakaźny dla makrofagów. Było to najprawdopodobniej spowodowane mutacją aminokwasu w białku M (Thr Asn), która była wynikiem zniszczenia miejsca NdeI w pozycji Wprowadzenie tagu HA do zakaźnego klonu PRRSV Epitop hemaglutyniny grypy A (tag HA; Kolodziej i wsp., 1991) ulegał ekspresji w różnych rekombinacyjnych wirusach PRRSV. Epitop HA wybrano jako obcy antygen do ekspresji w PRRSV przede wszystkim z dwóch powodów. Po pierwsze tag ma ograniczoną wielkość (27 nukleotydów), co zmniejsza szansę na zaburzenie replikacji wirusa lub ekspresji lub czynności białka, z którym uległ fuzji. Po drugie, dostępne są przeciwciała do wykrywania ekspresji tego epitopu. Tag HA wprowadzono na końcu 5' ORF7 (pabv525) i na końcu 3' ORF7 (pabv526; fig. 4) tak, że nie indukował on mutacji w innych ORF. Spodziewaliśmy się uzyskania dużej ekspresji obcego antygenu przez insercję do niego genu ORF7, ponieważ przekaźnik subgenomowy RNA7 (kodujący ORF7) jest produkowany w największych ilościach w komórkach zakażonych. Ponieważ nie mogliśmy przewidzieć wpływu epitopu HA na czynność i strukturę białka N, dokonaliśmy dodatkowej insercji w ramce 16-aminokwasowej samorozszczepiającej się proteazy 2A wirusa pryszczycy (FMDV; Percy i wsp., 1994). Proteazę tę wprowadzono w kierunku końca 3' tagu HA na końcu 5' ORF7, w wyniku czego uzyskano klon pabv523 (fig. 4). Oczekiwaliśmy, że spowoduje to ekspresję poliproteiny, która mogłaby ulegać proteolitycznemu rozszczepieniu z uwolnieniem zarówno tagu HA, jak i białka N. 5. Analiza rekombinantów PRRSV wykazujących ekspresję epitopu HA Po pierwsze zbadano ekspresje białek strukturalnych przez różne transkrypty z rekombinacyjnych pełnej długości klonów cdna w IPMA. Komórki BHK-21, transfekowane transkryptami pabv523, 525 i 526, barwiły się dodatnio z MAb skierowanymi przeciwko GP 3, GP 4, białku M i białku N, co wskazuje, że te białka PRRSV ulegały ekspresji w sposób właściwy (fig. 4). Komórki barwiły się również dodatnio MAb skierowanym przeciwko HA, co wskazuje, że epitop HA ulegał ekspresji we wszystkich trzech RNA. Tak więc transkrypty wykazujące ekspresję HA ulegały replikacji w komórkach BHK-21. Ponadto białko N, z którym tag HA uległ fuzji, ulegało nadal ekspresji w zmutowanych RNA. W celu zbadania, czy transkrypty pabv523, 525 i 526 były zdolne do wytworzenia zakaźnych wirusów, zastosowano nadsącz hodowli transfekowanych komórek BHK-21 do zakażania PAM. PAM nie tylko barwiły się dodatnio MAb skierowanymi przeciwko białkom PRRSV GP 3, GP 4, białku M i białku N w IPMA, lecz również MAb 12CA5, skierowanym przeciwko epitopowi HA. Jednakże, jeżeli PAM barwiły się podwójnie, zarówno MAb skierowanymi przeciwko tagowi HA, jak i białku N, wykrywaliśmy również PAM, które barwiły się tylko MAb skierowanymi przeciwko białku N, lecz nie przeciwko tagowi HA. Dla wirusów pochodzących z pabv525 i pabv526 odsetek komórek, barwiących się tylko MAb N-swoistymi, był wyższy, niż dla wirusów pochodzących z pabv523, zawierających dodatkową proteazę 2A. Wskazuje to, że tag HA, bezpośrednio przyłączony do końca N lub C białka N, zaburzał w pewnym stopniu pakowanie RNA wirusowego lub zakaźność wirusa. Jednakże po wprowadzeniu proteazy 2A w celu odszczepienia tagu HA od białka N przez proteazę 2A, korzystne właściwości powstałego wirusa (vabv523) nie były zredukowane lub były zredukowane tylko w niewielkim stopniu (fig. 4). Wirusy rekombinacyjne oznaczono jako vabv523, vabv525 i vabv526. Analiza aktywności proteazy 2A w vabv523 Aktywność proteazy 2A analizowano dalej przez radioimmunoprecypitację. Oprócz białka 15 kda immunoprecypitacji poddano dodatkowe białko o masie około 18 kda z N-swoistym MAb

14 14 PL B1 z komórek transfekowanych transkryptami pabv523. Białko 15 kda miało podobną wielkość do białka N typu dzikiego; białko 18 kda przypominało oczekiwaną wielkość poliproteiny proteazy 2A-N HA. Dane te wskazują, że proteaza 2A FMDV jest zdolna do rozszczepienia proteazy HA poliproteiny 2A-N w komórce, czego skutkiem jest uwolnienie tagu HA z białka N. 5. Charakterystyka wzrostu w wirusach wykazujących ekspresję HA Ilość wirusa wytworzonego przez komórki BHK-21, transfekowane transkryptami z pabv437 i pabv523, była zwykle większa, niż ilość wirusa wytworzonego przez komórki BHK-21, transfekowane transkryptami z pabv525 i pabv526. Seryjny pasaż wirusów wykazujących ekspresję HA na PAM spowodował powstanie zapasów vabv523, vabv525 i vabv526 z mianami około 10 7 TCID 50 /ml. Należy wyjaśnić, czy wirusy wykazujące ekspresję HA mają takie same właściwości wzrostu, jak wirus typu dzikiego zakaźnej kopii PRR- SV (vabv437). Będzie to zbadane w krzywych wzrostu. 5. Analiza stabilności wirusów wykazujących ekspresję HA W celu określenia stabilności wirusów wykazujących ekspresję HA zbadano RNA wirusowe w pasażu 4. W tym celu przeprowadzono RT-PCR na izolowanym wirusowym RNA. Część genu ORF7, miejsce, w którym dokonano insercji tagu HA, powielono metodą PCR i uzyskane fragmenty analizowano na żelu agarozowym. Uzyskaliśmy dwa fragmenty dla vabv523 i vabv525 i jeden fragment dla vabv526. Analiza sekwencji fragmentu powielonego w największej ilości wykazała, że vabv523 w pasażu 4 nadal zawierał odpowiednio umieszczoną sekwencję nukleotydową, kodującą tag HA i gen proteazy 2A. Przeciwnie, zarówno vabv525, jak i vabv526 straciły wprowadzoną sekwencję nukleotydową wprowadzoną sekwencję nukleotydową, kodującą tag HA. 1. Mutacja Cys-27 i Cys-76 w białku N hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek PRRSV W badaniu tym stwierdziliśmy, że mutacja Cys-27 Asn i Cys-76 Leu w białku N PRRSV interferuje z wytwarzaniem cząstek zakaźnym w komórkach BHK-21. Wyciągnęliśmy wniosek, że reszty te mają zasadnicze znaczenie dla prawidłowej struktury lub czynności, lub i struktury, i czynności, białka n w zespole wirusa PRRSV. Białko N bierze udział w pierwszych etapach wytwarzania wirusa, wiązaniu wirusowego RNA genomowego i tworzeniu struktury kapsydowej. Ponieważ transkrypty klonów cdna długości genomowej, zawierające Cys-27 Asn i Cys-76 Leu ulegały replikacji na poziomie wirusa typu dzikiego, mutacje w resztach Cys niszczą wiązanie RNA przez białko N. Zamiast tego indukują one różną strukturę białka N, hamującą tworzenie się prawidłowych kapsydów. Defekt w tworzeniu kapsydów z wirusowym genomem RNA można uzupełnić białkiem N typu dzikiego, ulegającym przejściowo lub ciągle ekspresji w linii komórkowej (BHK-21). W ten sposób tworzy się wirus zdolny do ukończenia tylko jednego cyklu zakażenia/replikacji. Tak więc wirus taki uważa się za bardzo bezpieczną szczepionkę do ochrony świń przed PRRSV. 2. Wprowadzenie markera do białka N PRRSV Celem tego badania było wytworzenie zmutowanych wirusów PRRS, które można serologicznie odróżnić od wirusa typu dzikiego, są zatem obiecującymi mutantami do opracowywania szczepionki markerowej przeciwko PRRSV. Białko N dobrano jako pierwszego kandydata do mutagenezy w celu wytworzenia wirusa z markerem serologicznym, ponieważ wiele badań wykazało, że białko N jest najbardziej antygenowym białkiem PRRSV. Na przykład świnie zakażone PRRSV rozwijają silną reakcję przeciwciał przeciwko białku N PRRSV (Meulenberg i wsp., 1995). Ponadto białko N zawiera dwa regiony antygenowe, oznaczone B i D, zachowane w europejskich i północnoamerykańskich izolatach PRRSV, i dostępne są MAb skierowane na te regiony (Meulenberg i wsp., 1998). Tutaj wykazaliśmy, że mutacja 4 aminokwasów w miejscu B do odpowiednich aminokwasów białka N EAV i mutacja 5-9 aminokwasów w domenie D do odpowiednich aminokwasów białka n LDV hamuje wytwarzanie zakaźnych cząstek wirusa. Ponieważ replikacja RNA i synteza mrna subgenomowego wydawały się pozostawać na poziomie właściwym dla typu dzikiego, mutacje te najprawdopodobniej zapobiegały tworzeniu prawidłowych kapsydów przez białko N. Jednakże mutageneza pojedynczego aminokwasu w regionie D (Asp-62 Tyr) umożliwiła wytworzenie wirusa vabv600 o odmiennym od PRRSV i innych wirusów PRRSV profilu wiązania MAb. VABV600 indukuje różne spektrum przeciwciał u świń w porównaniu z tymi innymi izolatami PRRSV. Tak więc vabv600 można odróżnić od wirusa typu dzikiego na podstawie przeciwciał w surowicy i jest to mutant doskonale nadający się do dalszego opracowywania szczepionek markerowych przeciwko PRRSV.

15 PL B Wyjaśnienie sygnałów replikacji ORF7 wirusa Lelystad Dla wielu wirusów nici dodatniej RNA wykazano, że ich regiony niekodujące 5' i/lub 3' zawierają zasadnicze sygnały, kontrolujące zapoczątkowanie syntezy RNA nici plus i minus. Dla PRRSV nie ustalono jeszcze, czy same te sekwencje wystarczają do replikacji. Wytwarzanie klonu zakaźnego umożliwiło nam zanalizowanie sygnałów replikacji w genomie PRRSV. W badaniu tym mapowaliśmy elementy sekwencji o działaniu cis, konieczne do replikacji, przez wprowadzanie delecji do klonu zakaźnego. Wykazaliśmy, że transkrypty pochodzące z klonów cdna, nie zawierających genu ORF7, nie ulegają replikacji. Bardziej systematyczna analiza delecji wykazała, że ważne znaczenie dla replikacji RNA PRRSV miał region 44 nukleotydów między nukleotydami a w genie ORF7. Było to bardzo interesujące odkrycie, ponieważ sekwencje o zasadniczym znaczeniu dla replikacji u większości wirusów RNA nici dodatniej znajdują się w regionach niekodujących 5' i 3'. Jest to również stwierdzenie interesujące dla badań, których celem jest opracowanie replikonów wirusowych, które można ocalić jedynie poprzez uzupełnienie linii komórkowych, wykazujących ekspresje ORF, które uległy delecji. Minimalnymi wymaganiami dla tych RNA są region niekodujący 5' -ORF1a- -ORF1b-region niekodujący 3'. Wirusowe RNA lub replikony, zawierające te elementy sekwencji, uzupełnione wyborem fragmentów z innych otwartych ramek odczytu PRRSV lub fragmentów otwartych ramek odczytu, wykazujących ekspresję antygenów innych (heterologicznych) patogenów, można upakować do cząstek wirusa, gdy białka zasadnicze dla wytworzenia wirusa obecne są w postaci trans. Przy podawaniu tych cząstek świniom, na przykład w postaci szczepionki, będą one wchodzić do swoistych komórek gospodarza, takich jak makrofagi i antygeny wirusowe lub heterologiczne ulegają ekspresji i indukują reakcje immunologiczne z powodu replikacji RNA. Jednakże, ponieważ RNA nie wykazuje ekspresji (wszystkich) białek koniecznych do pakowania i wytwarzania nowych cząstek, replikon nie może szerzyć się dalej, stanowi więc bardzo skuteczną, lecz bezpieczną i nieszerzącą się szczepionkę rekombinacyjną, skuteczną przeciwko PRRSV i/lub patogenom heterologicznym. 4. Wytwarzanie atenuowanego wirusa PRRSV przez delecję miejsca Ndel w ORF6 W badaniu tym wytworzyliśmy zmutowany wirus PRRSV vabv575 o charakterystyce wzrostu w PAM innej, niż dla szczepu macierzystego vabv437. Nie obserwowano różnicy w ekspresji białek strukturalnych w komórkach BHK-21 przez RNA vabv575 lub vabv437, wirus vabv575 wytwarzany w komórkach BHK-21 zakażał PAM wolniej, niż vabv437. Konieczna jest dalsza analiza kinetyki wzrostu vabv575 przez krzywe wzrostu w PAM. W klonie cdna pabv575, który zastosowano do wytworzenia vabv575, mutacji poddano miejsce NdeI w pozycji w ORF6. Spowodowało to zmianę aminokwasów Thr-59 Asn w białku M. Zmutowane białko M nadal ulegało wiązaniu z M-swoistym MAb Białko M jest najbardziej zachowanym białkiem strukturalnym wśród arteriwirusów i koronawirusów. Białko jest integralnym białkiem błonowym, zawierającym trzy N-końcowe hydrofonowe domeny obejmujące błony (Rottier, 1995). Białko przechodzi przez błonę trzy razy, pozostawiając krótką domenę N-końcową na zewnątrz wirionu i krótką domenę C-końcową wewnątrz wirionu. Wykazano, że białko M koronawirusów odgrywa istotną rolę w tworzeniu wirusa (Vennema i wsp., 1996). Mutacja Thr-59 Asn umiejscowiona jest między drugim a trzecim rozciągającym się na błony fragmentem M w vabv575. Mutacja ta wpływa na tworzenie się wirusa, stabilność wirusa lub wchodzenie wirusa do PAM. 5. Ekspresja epitopu HA w rekombinacyjnych wirusach PRRSV W badaniu tym z powodzeniem stosowaliśmy PRRSV jako wektor do ekspresji obcego antygenu, epitopu HA hemaglutyniny wirusa grypy A. Wytworzono rekombinacyjne wirusy PRRSV, wytwarzające tag HA, połączony z końcem N lub C białka N. Ponadto wytworzono mutant PRRSV, zawierający tag HA, jak również proteazę 2A FMDV, poddany fuzji z końcem N białka N. Proteaza 2A była funkcjonalnie czynna w kontekście wirusa PRRSV i odszczepiała tag HA od białka N. Powodowało to wytworzenie białka N, identycznego z białkiem N typu dzikiego, z wyjątkiem aminokwasów pierwszego i drugiego (Met i Ala), których w mutancie nie ma. Analiza genetyczna pasażu 4 wirusów rekombinacyjnych wskazała, że zmutowany wirus, zawierający zarówno tag HA, jak i proteazę 2A był bardziej stabilny, niż zmutowane wirusy, wykazujące ekspresję białek fuzyjnych HA-N. Można zauważyć, że brak pierwszej metioniny i mutacja drugiego aminokwasu na końcu N białka N są lepiej tolerowane przez wirusa, niż addycja tagu HA z 9 aminokwasów do końca N lub C białka N. Konieczne są dalsze analizy genetyczne i czynnościowe w celu wyjaśnienia różnic stabilności, obserwowanych dla tych wirusów. Ponadto w celu ustalenia, czy indukowane są reakcje przeciwciał przeciwko epitopowi HA, konieczne jest zakażenie świń tymi mutantami wykazującymi ekspresję HA.

16 16 PL B1 Gen ORF7 dobrano do insercji tagu HA przede wszystkim z dwóch powodów (I) subgenomowe RNA7, wykazujące ekspresję tego genu, jest występującym w największej ilości RNA subgenomowym, wytwarzanym w zakażonych komórkach i (II) tag HA można wprowadzać bez poddawania mutacji innych ORF, ponieważ ORF7 w bardzo małym stopniu zachodzi na ORF6 na końcu 5' i nie zachodzi na inne ORF na końcu 3'. Jednakże można wytwarzać podobne konstrukty poprzez wprowadzenie tagu HA i proteazy 2A na końcu 5' ORF2 i na końcu 5' ORF5 bez wpływu na inne ORF. Dokonana z powodzeniem ekspresja tagu HA w połączeniu z proteazą 2A na końcu 5' ORF7 tworzy nowe możliwości ekspresji innych obcych antygenów, takich jak białko E2 cholery świń lub epitopy limfocytów B parwowirusa, w PRRSV. Ponieważ PRRSV swoiście zakaża makrofagi, komórki układu immunologicznego o zdolności do prezentowania antygenu i obróbki, PRRSV mógłby być doskonałym wektorem do ekspresji antygenów i indukcji odporności na te antygeny u świń. Opis rysunków Fig. 1. Właściwości pełnej długości klonów cdna PRRSV, zawierających mutacje w genie ORF7. Zmutowane geny ORF7 wprowadzono do zakaźnego klonu cdna pabv437 z unikalnymi miejscami Hpal i PacI, które wskazano. Ukazano liczbę plazmidów (pabv) powstałych konstruktów. Oznaczono replikację RNA poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych w IPMA po transfekcji transkryptów pełnej długości klonów cdna w komórkach BHK-21. Wytwarzanie białka N oznaczono w IPMA lub immunoprecypitacji. Wytwarzanie zakaźnego wirusa osiągnięto przez przeniesienie nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM i wykrywanie cpe. Fig. 2. Właściwości pełnej długości klonów cdna PRRSV, zawierających delecje w regionie kodującym białka strukturalne LV w celu wyjaśnienia obecności sygnałów replikacji w tym regionie. Ukazano regiony, które uległy delecji (słupki kropkowane), nadal obecne regiony ORF7 (słupki zamalowane) i liczbę plazmidów (pabv) powstałych klonów. Ustalono replikację RNA poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych i w szczególności ekspresję białka N, obu w IPMA. Wytwarzanie zakaźnego wirusa ustalono poprzez zakażenie PAM nadsączem z transfekowanych komórek BHK-21. Przeprowadzono IPMA celem wykrycia ekspresji białek LV. Fig. 3. Właściwości zakaźnego klonu cdna pabv575. Klon ten skonstruowano poprzez mutację miejsca Ndel w pozycji w ORF6. Replikację RNA oznaczono poprzez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych w IPMA po transfekcji transkryptów pełnej długości klonów cdna w komórkach BHK-21. Wytwarzanie zakaźnego wirusa ustalono poprzez przeniesienie nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM i wykrywanie cpe. Fig. 4. Wprowadzenie markera antygenowego do zakaźnego klonu PRRSV. Wskazano insercję tagu HA i sekwencji proteazy 2A w plazmidach pabv 525, 523 i 526. Replikację RNA określono przez wykrywanie ekspresji białek strukturalnych w IPMA po transfekcji transkryptów pełnej długości klonów cdna. Ekspresję N i HA również ustalono w IPMA. Wytwarzanie zakaźnego wirusa ustalono poprzez przeniesienie nadsączu transfekowanych komórek BHK-21 do PAM i wykrywanie cpe. Piśmiennictwo 1. Liljeström, P. and Garoff, H. (1991). A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon. Biotechnol. 9, Kolodziej, P.A. and Young, R.A. Epitope tagging and protein surveillance Methods Enzymol. 194, Meulenberg, J.J.M., Bende, R.J., Pol, J.M., Wensvoort, G., and Hoormann, R.J.M. (1995). Nucleocapsid protein N of Lelystad virus: expression by recombinant baculovirus, immunological properties, and suitability for detection of serum antibodies. Clin. Diagn. Laboratory Immunol. 2, Meulenberg, J.J.M., Hulst, M.M., de Meijer, E.J., Moonen, P.L.J.M., den Besten, A., de Kluyver, E.P., Wensvoort, G., i Moormann, R.J.M. (1993). Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS) is related to LDV and EAV. Virology 192, Meulenberg, J.J.M., and Petersen-den Besten, A. (1996). Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad wirus: The glycoprotein GPZ encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology 225, Meulenberg, J.J.M., Bos-de Ruijter, J.N.A, van de Graaf, R., i Wensvoort, G., i R.J.M. Moormann. (1998) Infectious transcripts from cloned genome-length cdna of porcine reproductive and respiratory syndrome wirus. J. of Virology 72,

17 PL B Meulenberg, J.J.M., van Nieuwstadt, A.P., van Essen-Zandbergen, A., Bos-de Ruijter, J.N.A.,Langeveld, J.P.M., i Meloen, R.H. (1998) Localization and fine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies. Virology, 252, Murtaugh, M.P., Elam, M.R., i Korkach, L.T., (1995). Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS wirus. Arch. Virol. 140, Percy, N., Barclay, W.S., Garcia-Sastre, A. and Palese, P. Expression of a foreign protein by influenza A virus J. Virol. 68: Rottier, P.J.M. (1995) The coronavirus membrane protein, p In: S.D. Siddell (ed.), The coronaviridae. Plenum Press, New York N.Y. 11. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual wydanie II, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 12. van Nieuwstadt, A.P., Meulenberg, J.J.M., van Essen15 Zandbergen, A., Petersen-den Hesten, A., Bende, R.J., Moormann, R.J.M., and Wensvoort, G. (1996). Proteins encoded by ORFs 3 and 4 of the genome of Lelystad wirus (Arteriviridae) are structural proteins of the virion. J. Virol. 70, Wensvoort, G., Terpstra, C, Pol, J.M.A., Ter Laak, E.A., Bloemraad, M., de Kluyver, E.P., Kragten, C, van Buiten, L., den Besten, A., Wagenaar, F., Broekhuijsen, J.M., Moonen, P.L.J.M., Zetstra, T., de Boer, E.A., Tibben, H.J., de Jong, M.F., van 't Veld, P., Groenland, G.J.R., van Gennep, J.A., Voets, M.Th., Verheijden, J.H.M., and Braamskamp, J. (1991). Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad wirus. Vet. Quart. 13, Vennema, H., Godeke, G.-J., Rossen, J.W.A., Voorhout, W.F., Horzinek, M.C., Opstelten, D.-J.E., and Rottier, P.J.M. (1996) Nucleocapsid-independent assembly of coronavirus-like patricales by viral envelope protein genes. EM80 J. 15, Wensvoort, G., Terpstra, C, Boonstra, J., Bloemraad, M., and van Zorane, D. (1986). Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12,

18 18 PL B1

19 PL B1 19 T a b e l a 2. Barwienie LV4.2.1, vabv600 (mutacja Asp-62 Tyr), ATCCVR2332-podobny PRRSV, zawierający mutację Asp61 Tyr w białku N, i ATCC-YR2332 z rozmaitymi N-swoistymi MAb w IPMA. MAb Miejsce LV4.2.1 vabv600 (Asp-62 Tyr) ATCCVR2332- podobny (Asp-61 Tyr) ATCC-VR A NS99 B D D ) D ) D ) D ) - + SDOW17 D ) - 1) + + WBE1 D WBE4 D WBE5 D WBE6 D VO17? ) brak barwienia w IPMA przy rozcieńczeniu nadsączu hodowli hybrydoma do 0,3-0,5 μg/ml, słabe barwienie IgG oczyszczonym z nadsączu hodowli rozcieńczonego do 10 μg/ml. Zastrzeżenia patentowe 1. Replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), znamienny tym, że co najmniej niektóre z jego oryginalnych kwasów nukleinowych PRRSV uległy delecji, przy czym replikon ten zdolny jest do replikacji RNA in vivo i zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5' ORF1a-ORF1b-ORF7-regionu niekodującego 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi między nukleotydami z ORF7 PRRSV. 2. Replikon według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego drobnoustroju heterologicznego. 3. Replikon według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że zawiera ponadto substytucje lub delecje kwasu nukleinowego w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N. 4. Replikon według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego, polegającą na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub Replikon według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. 6. Replikon według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że wprowadzono marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. 7. Replikon według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera ponadto modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N. 8. Replikon według zastrz. 6, albo 7, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub Replikon według zastrz. 1, abo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV.

20 20 PL B1 10. Replikon według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującą przezbłonowe białko M. 11. Replikon według zastrz. 10, znamienny tym, że ta modyfikacja modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. 12. Zastosowanie replikonu jak zdefiniowano w zastrz. od 1 do 11 do wytwarzania szczepionki. 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką nierozprzestrzeniającą się. 14. Zastosowanie według zastrz. 12 albo 13, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką markerową. 15. Szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano w zastrz od 1 do Zastosowanie szczepionki jak zdefiniowano w zastrz. 15 do szczepienia świń. 17. Replikon wirusa zespołu reprodukcyjnego i oddechowego świń (PRRSV), zdolny do replikacji RNA in vivo, znamienny tym, zawiera co najmniej elementy sekwencji z regionu niekodującego 5'-ORF1a-ORF1b-ORF7-region niekodujący 3' PRRSV i kwas nukleinowy, odpowiadający regionowi nukleotydom między nukleotydami z regionu ORF7 PRRSV i ponadto zawierający kwas nukleinowy pochodzący z co najmniej jednego heterologicznego drobnoustroju. 18. Replikon według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera ponadto substytucje lub delecje w genie ORF7, kodującym białko N, powodujące, że jest niezdolny do tworzenia kapsydu białka N. 19. Replikon według zastrz. 18, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego, polegającą na delecji cysteiny w białku N w pozycjach 27 i/lub Replikon według zastrz. 18, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasu regionu B, zawierającego aminokwasy 25-30, i regionu D, zawierającego aminokwasy i/lub aminokwasów białka N. 21. Replikon według zastrz. 17, albo 18, albo 19, albo 20, znamienny tym, że wprowadzono marker umożliwiający rozróżnienie serologiczne. 22. Replikon według zastrz. 21, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów oryginalnej reszty asparaginowej w pozycji 62 białka N. 23. Replikon według zastrz. 21, albo 22, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego prowadzącą do zmiany aminokwasów w ORF2, 3, 4, 5 i/lub Replikon według zastrz. 21, abo 22, albo 23, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w markerze wirulencji PRRSV. 25. Replikon według zastrz. 24, znamienny tym, że zawiera modyfikację kwasu nukleinowego w ORF6, kodującą białko M przechodzące przez błonę. 26. Replikon według zastrz. 25, znamienny tym, że ta modyfikacja modyfikuje białko M między jego drugim a trzecim fragmentem przechodzącym przez błonę. 27. Replikon według zastrz. 17, znamienny tym, że drobnoustrój heterologiczny zawiera patogen. 28. Replikon według zastrz. 27, znamienny tym, że patogenem tym jest wirus. 29. Zastosowanie replikonu jak zdefiniowano w zastrz. od 17 do 28 do wytworzenia szczepionki. 30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką nie rozprzestrzeniającą się. 31. Zastosowanie według zastrz. 29 lub 30, znamienne tym, że szczepionka jest szczepionką markerową. 32. Szczepionka zawierająca replikon jak zdefiniowano w zaostrz. od 17 do Zastosowanie szczepionki jak zdefiniowano w zastrz. 31 do szczepienia świń.

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna Podstawy

Biologia Molekularna Podstawy Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

(54) Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne

(54) Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 319878 (22) Data zgłoszenia: 30.10.1995 (86) Data 1 numer zgłoszenia międzynarodowego

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie SCENARIUSZ LEKCJI OPRACOWANY W RAMACH PROJEKTU: INFORMATYKA MÓJ SPOSÓB NA POZNANIE I OPISANIE ŚWIATA. PROGRAM NAUCZANIA INFORMATYKI Z ELEMENTAMI PRZEDMIOTÓW MATEMATYCZNO-PRZYRODNICZYCH Autorzy scenariusza:

Bardziej szczegółowo

Przeciwciała poliklonalne przeciwko białkom Helicobacter pylori oraz sposób ich wytwarzania. (74) Pełnomocnik:

Przeciwciała poliklonalne przeciwko białkom Helicobacter pylori oraz sposób ich wytwarzania. (74) Pełnomocnik: RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201982 (21) Numer zgłoszenia: 361069 (22) Data zgłoszenia: 03.07.2003 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/40 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych aspekty praktyczne dr Małgorzata Kozłowska Ekspert

Bardziej szczegółowo

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa dr Bartosz Walter Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna Co może byd wynalazkiem Wynalazek biotechnologiczny Ochrona patentowa Procedura zgłoszenia patentowego Gdzie, kiedy i jak warto patentowad

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21960 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21960 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197408 (21) Numer zgłoszenia: 346772 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 21.09.1999 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

Biologia molekularna wirusów. Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

Biologia molekularna wirusów. Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Biologia molekularna wirusów Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Co to jest wirus? Cząsteczka złożona z kwasu nukleinowego (DNA

Bardziej szczegółowo

Geny i działania na nich

Geny i działania na nich Metody bioinformatyki Geny i działania na nich prof. dr hab. Jan Mulawka Trzy królestwa w biologii Prokaryota organizmy, których komórki nie zawierają jądra, np. bakterie Eukaryota - organizmy, których

Bardziej szczegółowo

Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją).

Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją). Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją). Czym jest życie? metabolizm + informacja (replikacja) 2 Cząsteczki organiczne mog y powstać w atmosferze pierwotnej

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 172133. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego 29.03.1991, PCT/US91/02225

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 172133. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego 29.03.1991, PCT/US91/02225 RZECZPOSPOLITA PO LSKA U rząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 172133 (21 ) Numer zgłoszenia 296329 (22) Data zgłoszenia 29.03.1991 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 310126 (22) Data zgłoszenia: 26.01.1994 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Bardziej szczegółowo

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Wektory DNA - klonowanie molekularne Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany

Bardziej szczegółowo

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska Dane mikromacierzowe Mateusz Markowicz Marta Stańska Mikromacierz Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka (o maksymalnych wymiarach 2,5 cm x 7,5 cm) z naniesionymi w regularnych

Bardziej szczegółowo

6. Z pięciowęglowego cukru prostego, zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego, jest zbudowany A. nukleotyd. B. aminokwas. C. enzym. D. wielocukier.

6. Z pięciowęglowego cukru prostego, zasady azotowej i reszty kwasu fosforowego, jest zbudowany A. nukleotyd. B. aminokwas. C. enzym. D. wielocukier. ID Testu: F5679R8 Imię i nazwisko ucznia Klasa Data 1. Na indywidualne cechy danego osobnika ma (maja) wpływ A. wyłacznie czynniki środowiskowe. B. czynniki środowiskowe i materiał genetyczny. C. wyłacznie

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU Czy priony zawsze są szkodliwe? SPIS TREŚCI: Wprowadzenie. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. Karty pracy. 1.

Bardziej szczegółowo

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 Spis treści Przedmowa 11 1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 1.1. Wprowadzenie 13 1.2. Biotechnologia żywności znaczenie gospodarcze i społeczne 13 1.3. Produkty modyfikowane

Bardziej szczegółowo

Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii

Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii chroń swoje pomysły 3 Kongres Świata Przemysłu Farmaceutycznego Poznań, 16-17 czerwca 2011 Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii dr Izabela Milczarek Czym jest biotechnologia? Biotechnologia,

Bardziej szczegółowo

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Mutacja Mutacja (łac. mutatio zmiana) - zmiana materialnego

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności

Bardziej szczegółowo

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego Przykładowe zadania z BIOLOGii przygotowujące do egzaminu maturalnego Prezentowane zadania są zgodne z podstawą programową kształcenia ogólnego w zakresie rozszerzonym i podstawowym. Prócz zadań, które

Bardziej szczegółowo

Zadanie 2. (2 pkt) Na schemacie przedstawiono namnażanie się retrowirusa HIV wewnątrz limfocytu T (pomocniczego) we krwi człowieka.

Zadanie 2. (2 pkt) Na schemacie przedstawiono namnażanie się retrowirusa HIV wewnątrz limfocytu T (pomocniczego) we krwi człowieka. Zadanie 1. (3 pkt) W aptekach dostępne są bez recepty różnego rodzaju preparaty lecznicze podnoszące odporność, zwane immunostymulatorami. Przeważnie zawierają substancje pochodzenia roślinnego, np. z

Bardziej szczegółowo

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Drożdżowe systemy ekspresyjne Drożdże Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki Duża biomasa W przypadku hodowli

Bardziej szczegółowo

HIV A UKŁAD ODPORNOŚCIOWY CZ. II

HIV A UKŁAD ODPORNOŚCIOWY CZ. II HIV A UKŁAD ODPORNOŚCIOWY CZ. II Sposoby zakażenia Wirus HIV występuje głównie we krwi i nasieniu chorego mężczyzny lub wydzielinie pochwy chorej kobiety. Aby doszło do zainfekowania następnej choroby

Bardziej szczegółowo

PL 208956 B1. Sposób wykrywania i różnicowania chorób należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii

PL 208956 B1. Sposób wykrywania i różnicowania chorób należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 208956 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 381219 (22) Data zgłoszenia: 05.12.2006 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

Właściwości szlaku sygnalizacyjnego białka p53 ujawnione podczas analizy skutków traktowania komórek rezweratrolem.

Właściwości szlaku sygnalizacyjnego białka p53 ujawnione podczas analizy skutków traktowania komórek rezweratrolem. Właściwości szlaku sygnalizacyjnego białka p53 ujawnione podczas analizy skutków traktowania komórek rezweratrolem. Streszczenie Ogólnym celem niniejszej pracy było lepsze zrozumienie funkcjonowania szlaku

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

PL 204536 B1. Szczepanik Marian,Kraków,PL Selmaj Krzysztof,Łódź,PL 29.12.2003 BUP 26/03 29.01.2010 WUP 01/10

PL 204536 B1. Szczepanik Marian,Kraków,PL Selmaj Krzysztof,Łódź,PL 29.12.2003 BUP 26/03 29.01.2010 WUP 01/10 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 204536 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 354698 (22) Data zgłoszenia: 24.06.2002 (51) Int.Cl. A61K 38/38 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus. 25 października 2006

Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus. 25 października 2006 Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus 25 października 2006 Dr Tobias J. Tuthill Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytet Leeds Leeds LS2 9JT www.fbs.leeds.ac.uk

Bardziej szczegółowo

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Wektory DNA - klonowanie molekularne Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany

Bardziej szczegółowo

Dobierając optymalny program szczepień, jesteśmy w stanie zapobiec chorobom, które mogą być zagrożeniem dla zdrowia Państwa pupila.

Dobierając optymalny program szczepień, jesteśmy w stanie zapobiec chorobom, które mogą być zagrożeniem dla zdrowia Państwa pupila. SZCZEPIENIA KOTÓW Działamy według zasady: Lepiej zapobiegać niż leczyć Wychodząc naprzeciw Państwa oczekiwaniom oraz dbając o dobro Waszych pupili opisaliśmy program profilaktyczny chorób zakaźnych psów,

Bardziej szczegółowo

DNA musi współdziałać z białkami!

DNA musi współdziałać z białkami! DNA musi współdziałać z białkami! Specyficzność oddziaływań między DNA a białkami wiążącymi DNA zależy od: zmian konformacyjnych wzdłuż cząsteczki DNA zróżnicowania struktury DNA wynikającego z sekwencji

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2007420. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04.2007 07755417.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2007420. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04.2007 07755417. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 074 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04.07 077417.8 (97)

Bardziej szczegółowo

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Wykład 5 Droga od genu do

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1960427. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 13.12.2006 06828004.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1960427. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 13.12.2006 06828004. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1960427 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 13.12.06 06828004.9

Bardziej szczegółowo

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych dr Małgorzata Kozłowska Ekspert w UPRP dr Ewa Waszkowska

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 175610

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 175610 R ZECZPO SPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 175610 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 300038 (22) Data zgłoszenia: 07.11.1991 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1924600. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.09.2006 06791878.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1924600. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.09.2006 06791878. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1924600 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.09.06 06791878.9

Bardziej szczegółowo

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7.2. Metody biologii molekularnej (technika PCR, sekwencjonowanie DNA) wykorzystywane w taksonomii roślin Autor: Magdalena Dudek

Bardziej szczegółowo

Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie

Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie DEFINICJA Mikroorganizm (drobnoustrój) to organizm niewidoczny gołym okiem. Pojęcie to nie jest zbyt precyzyjne lecz z pewnością mikroorganizmami są: bakterie,

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

Wprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej.

Wprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej. Wprowadzenie DNA i białka W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej. Białka: łańcuchy złożone z aminokwasów (kilkadziesiąt kilkadziesiąt

Bardziej szczegółowo

Screening, klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białek

Screening, klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białek Screening, klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białek Kiedy gen jest znany Dostępna sekwencja DNA sekwencjonowanie genomu, biblioteki Dostępna sekwencja białka sekwencjonowanie białka Techniki pozyskania

Bardziej szczegółowo

Zaoczne Liceum Ogólnokształcące Pegaz

Zaoczne Liceum Ogólnokształcące Pegaz WYMAGANIA EGZAMINACYJNE ROK SZKOLNY 2015/2016 Semestr jesienny TYP SZKOŁY: liceum ogólnokształcące PRZEDMIOT: biologia SEMESTR: II LICZBA GODZIN W SEMESTRZE: 15 PROGRAM NAUCZANIA: Program nauczania biologii

Bardziej szczegółowo

Pamiętając o komplementarności zasad azotowych, dopisz sekwencję nukleotydów brakującej nici DNA. A C C G T G C C A A T C G A...

Pamiętając o komplementarności zasad azotowych, dopisz sekwencję nukleotydów brakującej nici DNA. A C C G T G C C A A T C G A... 1. Zadanie (0 2 p. ) Porównaj mitozę i mejozę, wpisując do tabeli podane określenia oraz cyfry. ta sama co w komórce macierzystej, o połowę mniejsza niż w komórce macierzystej, gamety, komórki budujące

Bardziej szczegółowo

PIC Polska rekomendacje weterynaryjne

PIC Polska rekomendacje weterynaryjne Choroby a Ekonomia Około 65% stad w Polsce jest zakażonych wirusem PRRS, a ponad 95% Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp). Choroby układu oddechowego, zwłaszcza o charakterze przewlekłym, są dziś główną przyczyną

Bardziej szczegółowo

Podstawy mikrobiologii. Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej

Podstawy mikrobiologii. Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej Podstawy mikrobiologii Wykład 3 Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej Budowa wirusów Wirusy nie mają budowy komórkowej, zatem pod względem biologicznym nie są organizmami Ŝywymi! Są to twory nukleinowo

Bardziej szczegółowo

Zakład Chorób Ryb. PIWet. Zastosowanie molekularnych metod do diagnostyki wirusowych chorób ryb, wirusa krwotocznej posocznicy

Zakład Chorób Ryb. PIWet. Zastosowanie molekularnych metod do diagnostyki wirusowych chorób ryb, wirusa krwotocznej posocznicy PIWet Zakład Chorób Ryb Zastosowanie molekularnych metod do diagnostyki wirusowych chorób ryb, wirusa krwotocznej posocznicy łososiowatych o (VHS), wirusa zakaźnej a martwicy układu krwiotwórczego (IHN)

Bardziej szczegółowo

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny Analizy wielkoskalowe wykorzystujące mikromacierze DNA Genotypowanie: zróżnicowane wewnątrz genów RNA Komórka eukariotyczna Ekspresja genów: Które geny? Poziom

Bardziej szczegółowo

Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało. Mariusz Kaczmarek

Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało. Mariusz Kaczmarek Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało Mariusz Kaczmarek Antygeny Immunogenność - zdolność do wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej; Antygenowość - zdolność do reagowania

Bardziej szczegółowo

Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624. Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku

Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624. Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku Warszawski Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny Oddział Analityki Medycznej Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624 Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008

Bardziej szczegółowo

Materiał i metody. Wyniki

Materiał i metody. Wyniki Abstract in Polish Wprowadzenie Selen jest pierwiastkiem śladowym niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Selen jest wbudowywany do białek w postaci selenocysteiny tworząc selenobiałka (selenoproteiny).

Bardziej szczegółowo

Informacje ogólne o grypie

Informacje ogólne o grypie ABY ZMNIEJSZYĆ RYZYKO ZACHOROWANIA NA PTASIĄ GRYPĘ Jako światowy lider w opracowywaniu rozwiązań zapewniających właściwe warunki sanitarne, Ecolab przyjął aktywną postawę mającą na celu ochronę naszych

Bardziej szczegółowo

Europejska Komisja ds. Kontrolowania Pryszczycy (EUFMD) Vademecum wykrywania ogniska pryszczycy i dochodzenia Wersja 1 (12/2009)

Europejska Komisja ds. Kontrolowania Pryszczycy (EUFMD) Vademecum wykrywania ogniska pryszczycy i dochodzenia Wersja 1 (12/2009) Europejska Komisja ds. Kontrolowania Pryszczycy (EUFMD) Vademecum wykrywania ogniska pryszczycy i dochodzenia Wersja 1 (12/2009) Wstęp: Poniższy dokument został sporządzony przez Sekretariat Komisji aby

Bardziej szczegółowo

Wymagania edukacyjne Biologia na czasie zakres podstawowy

Wymagania edukacyjne Biologia na czasie zakres podstawowy Wymagania edukacyjne Biologia na czasie zakres podstawowy Dział programu Temat Poziom wymagań konieczny (K) podstawowy (P) rozszerzający (R) dopełniający (D) I. Od genu do cechy Budowa i funkcje kwasów

Bardziej szczegółowo

Tematyka zajęć z biologii

Tematyka zajęć z biologii Tematyka zajęć z biologii klasy: I Lp. Temat zajęć Zakres treści 1 Zapoznanie z przedmiotowym systemem oceniania, wymaganiami edukacyjnymi i podstawą programową Podstawowe zagadnienia materiału nauczania

Bardziej szczegółowo

Ocena ekspresji genu ABCG2 i białka oporności raka piersi (BCRP) jako potencjalnych czynników prognostycznych w raku jelita grubego

Ocena ekspresji genu ABCG2 i białka oporności raka piersi (BCRP) jako potencjalnych czynników prognostycznych w raku jelita grubego Aleksandra Sałagacka Ocena ekspresji genu ABCG2 i białka oporności raka piersi (BCRP) jako potencjalnych czynników prognostycznych w raku jelita grubego Pracownia Biologii Molekularnej i Farmakogenomiki

Bardziej szczegółowo

WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII PRACOWNIA GENETYKI MOLEKULARNEJ I WIRUSOLOGII

WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII PRACOWNIA GENETYKI MOLEKULARNEJ I WIRUSOLOGII UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI W KRAKOWIE WYDZIAŁ BIOCHEMII, BIOFIZYKI I BIOTECHNOLOGII PRACOWNIA GENETYKI MOLEKULARNEJ I WIRUSOLOGII KIEROWNIK PROF. DR HAB. HANNA ROKITA 12 marca 2012 r. Recenzja pracy doktorskiej

Bardziej szczegółowo

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7 Poznań, dnia 28.04.2014 r. BioVentures Institute Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością ul. Promienista 83 60 141 Poznań Zapytanie ofertowe nr 01/2014 Projekt Nowa technologia wytwarzania szczepionek

Bardziej szczegółowo

OCENA Rozprawy doktorskiej mgr Aksany Varabyovej Biogeneza dysmutazy ponadtlenkowej 1 w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej

OCENA Rozprawy doktorskiej mgr Aksany Varabyovej Biogeneza dysmutazy ponadtlenkowej 1 w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej prof. dr hab. Barbara Zabłocka Pracownia Biologii Molekularnej Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN ul. Pawińskiego 5, 02-106 Warszawa tel: 22-60 86 486 e-mail: bzablocka@imdik.pan.pl

Bardziej szczegółowo

DYREKTYWA KOMISJI 2009/120/WE

DYREKTYWA KOMISJI 2009/120/WE 15.9.2009 Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 242/3 DYREKTYWY DYREKTYWA KOMISJI 2009/120/WE z dnia 14 września 2009 r. zmieniająca dyrektywę 2001/83/WE Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie wspólnotowego

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 13.12.1999,PCT/EP99/09864 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 13.12.1999,PCT/EP99/09864 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 202483 (21) Numer zgłoszenia: 349335 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 13.12.1999 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Instrukcja 2 2.3 Specyfikacja

Bardziej szczegółowo

(54) Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny),

(54) Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny), RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)184617 (21) Numer zgłoszenia: 319078 (22) Data zgłoszenia: 11.09.1995 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 01.06.1995, PCT/US95/06915

(12) OPIS PATENTOWY. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 01.06.1995, PCT/US95/06915 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (21 ) Numer zgłoszenia: 317874 (19) PL (11) 180639 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 01.06.1995 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

Generator testów 1.3.1 Biochemia wer. 1.0.5 / 14883078 Strona: 1

Generator testów 1.3.1 Biochemia wer. 1.0.5 / 14883078 Strona: 1 Przedmiot: Biochemia Nazwa testu: Biochemia wer. 1.0.5 Nr testu 14883078 Klasa: zaoczni_2007 IBOS Odpowiedzi zaznaczamy TYLKO w tabeli! 1. Do aminokwasów aromatycznych zalicza się A) G, P oraz S B) L,

Bardziej szczegółowo

MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA

MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA 1. AMPLIFIKACJA FRAGMENTU DNA METODĄ PCR Otrzymywanie dużej liczby kopii określonego fragmentu DNA możliwe jest przy zastosowaniu procedur klonowania lub znacznie

Bardziej szczegółowo

Wymagania edukacyjne z przedmiotu Biologia. Podręcznik Biologia na czasie wyd. Nowa Era, zakres podstawowy Rok szkolny 2013/2014

Wymagania edukacyjne z przedmiotu Biologia. Podręcznik Biologia na czasie wyd. Nowa Era, zakres podstawowy Rok szkolny 2013/2014 Wymagania edukacyjne z przedmiotu Biologia. Podręcznik Biologia na czasie wyd. Nowa Era, zakres podstawowy Rok szkolny 2013/2014 Dział programu I. Od genu do cechy Lp. Temat Poziom wymagań dopuszczający

Bardziej szczegółowo

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny.

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. 1 Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i

Bardziej szczegółowo

Mam Haka na Raka. Chłoniak

Mam Haka na Raka. Chłoniak Mam Haka na Raka Chłoniak Nowotwór Pojęciem nowotwór określa się niekontrolowany rozrost nieprawidłowych komórek w organizmie człowieka. Nieprawidłowość komórek oznacza, że różnią się one od komórek otaczających

Bardziej szczegółowo

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Czas trwania lekcji: 2x 45 minut Cele lekcji: 1. Ogólny zapoznanie

Bardziej szczegółowo

Model Marczuka przebiegu infekcji.

Model Marczuka przebiegu infekcji. Model Marczuka przebiegu infekcji. Karolina Szymaniuk 27 maja 2013 Karolina Szymaniuk () Model Marczuka przebiegu infekcji. 27 maja 2013 1 / 17 Substrat Związek chemiczny, który ulega przemianie w wyniku

Bardziej szczegółowo

SZCZEPIENIA OCHRONNE U DOROSŁYCH lek. Kamil Chudziński Klinika Anestezjologii i Intensywnej Terapii CSK MSW w Warszawie 10.11.2015 Szczepionki Zabite lub żywe, ale odzjadliwione drobnoustroje/toksyny +

Bardziej szczegółowo

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO Załącznik nr 2 SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO CZĘŚĆ I STRESZCZENIE DOKUMENTACJI I A Wniosek o dopuszczenie

Bardziej szczegółowo

Interpretacja wyników testów serologicznych

Interpretacja wyników testów serologicznych Interpretacja wyników testów serologicznych Dr hab. Kazimierz Tarasiuk Główny Lekarz Weterynarii PIC Polska i Europa Centralna VI FORUM PIC, Stryków, 18.11.09 Systematyczne monitorowanie statusu zdrowia

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.07.2004 04740699.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.07.2004 04740699. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1658064 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.07.2004 04740699.6 (51) Int. Cl. A61K31/37 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII ĆWICZENIA Z BIOCHEMII D U STUDENTfiW WYDZIAŁU LEKARSKIEGO Pod redakcją Piotra Laidlera, Barbary Piekarskiej, Marii Wróbel WYDAWNICTWO UNIWERSYTETU JAGIELLOŃSKIEGO ĆWICZENIA Z BIOCHEMII DLA STUDENTÓW WYDZIAŁU

Bardziej szczegółowo

WYSOCE ZJADLIWA GRYPA PTAKÓW D. POMÓR DROBIU

WYSOCE ZJADLIWA GRYPA PTAKÓW D. POMÓR DROBIU WYSOCE ZJADLIWA GRYPA PTAKÓW D. POMÓR DROBIU Wysoce zjadliwa grypa ptaków (Highly pathogenic avian influenza, HPAI) jest wirusową chorobą układu oddechowego i pokarmowego ptaków. Objawy mogą także dotyczyć

Bardziej szczegółowo

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie Nazwa modułu: Genetyka molekularna Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3 Wydział: Elektrotechniki, Automatyki, Informatyki i Inżynierii Biomedycznej Kierunek: Inżynieria Biomedyczna

Bardziej szczegółowo

Światowy Dzień Pamięci o Zmarłych na AIDS

Światowy Dzień Pamięci o Zmarłych na AIDS Światowy Dzień Pamięci o Zmarłych na AIDS Przypada w dniu 17 maja każdego roku Warszawa, 2013 HIV- ludzki wirus niedoboru odporności powoduje AIDS- zespół nabytego niedoboru odporności Z kart historii

Bardziej szczegółowo

Francisella tularensis

Francisella tularensis Z notatnika terrorysty... bakterie powszechnie dostępne istnieje naturalny rezerwuar bardzo zakaźna ID 50 = 10-50 bakterii testowana przez Japonię, opracowana doświadczalnie jako broń przez USA i ZSRR,

Bardziej szczegółowo

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

Mikrosatelitarne sekwencje DNA Mikrosatelitarne sekwencje DNA Małgorzata Pałucka Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w jądrowym DNA drzew leśnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w postępowaniu sądowym 27.09.2012

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 09.12.2005 05077837.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 09.12.2005 05077837. RZECZPSPLITA PLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EURPEJSKIEG (19) PL (11) PL/EP 1671547 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 09.12.2005 05077837.2 (51) Int. Cl. A23B7/154 (2006.01) (97)

Bardziej szczegółowo

Spis treści. Przedmowa... XI. Wprowadzenie i biologiczne bazy danych. 1 Wprowadzenie... 3. 2 Wprowadzenie do biologicznych baz danych...

Spis treści. Przedmowa... XI. Wprowadzenie i biologiczne bazy danych. 1 Wprowadzenie... 3. 2 Wprowadzenie do biologicznych baz danych... Przedmowa... XI Część pierwsza Wprowadzenie i biologiczne bazy danych 1 Wprowadzenie... 3 Czym jest bioinformatyka?... 5 Cele... 5 Zakres zainteresowań... 6 Zastosowania... 7 Ograniczenia... 8 Przyszłe

Bardziej szczegółowo

POLIOMYELITIS. (choroba Heinego Medina, nagminne porażenie dziecięce, porażenie rogów przednich rdzenia, polio)

POLIOMYELITIS. (choroba Heinego Medina, nagminne porażenie dziecięce, porażenie rogów przednich rdzenia, polio) W latach 50. na chorobę Heinego-Medina chorowało w Europie i USA jedno na 5000 dzieci. Po wdrożeniu w Polsce masowych szczepień przeciw poliomyelitis, już w 1960 roku zarejestrowano mniej zachorowań. W

Bardziej szczegółowo

Białko jako marker molekularny

Białko jako marker molekularny Białko jako marker molekularny Markery białkowe: - obecność lub brak (lub zmiana ilości) określonego białka wskazuje na istnienie określonej zmiany fizjologicznej lub chorobowej (np. pojawienie się we

Bardziej szczegółowo

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO Załącznik nr 2 SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO CZĘŚĆ I - STRESZCZENIE DOKUMENTACJI I A IB I B 1 I

Bardziej szczegółowo

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 20 izolacji Nr kat. 895-20D Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 100 µg 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Immunologia komórkowa

Immunologia komórkowa Immunologia komórkowa ocena immunofenotypu komórek Mariusz Kaczmarek Immunofenotyp Definicja I Charakterystyczny zbiór antygenów stanowiących elementy różnych struktur komórki, związany z jej różnicowaniem,

Bardziej szczegółowo

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość* Poznao, 6 lutego 2012 r. Zapytanie ofertowe nr 001 /2012 dotyczące zakupu odczynników chemicznych do izolacji DNA i reakcji PCR GENESIS Polska Sp. z o.o Ul. Za Cytadelą 19, 61-659 Poznao NIP 778 13 56

Bardziej szczegółowo

Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO)

Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO) Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO) Organizmy modyfikowane genetycznie Organizm zmodyfikowany genetycznie (międzynarodowy skrót: GMO Genetically Modified Organizm) to organizm o zmienionych cechach,

Bardziej szczegółowo

(19)PL (12) OPIS PATENTOWY PL 175143 B1 (11) 175143 (13) B1 C12N 15/63

(19)PL (12) OPIS PATENTOWY PL 175143 B1 (11) 175143 (13) B1 C12N 15/63 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) 175143 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 297945 (51) IntCl6: C12N 15/63 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 04.03.1993 (54)

Bardziej szczegółowo

Diagnostyka HIV 1. Na czym polegają testy HIV? a) testy przesiewowe

Diagnostyka HIV 1. Na czym polegają testy HIV? a) testy przesiewowe Diagnostyka HIV 1. Na czym polegają testy HIV? a. testy przesiewowe b. test Western blot 2. Kto powinien zrobić sobie test na HIV? 3. Kiedy wykonywać testy HIV? 4. Dzieci kobiet zakażonych HIV 5. Gdzie

Bardziej szczegółowo

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Agnieszka Gładysz Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Akademia Medyczna Prof.

Bardziej szczegółowo