Ekstrakcja nadkrytyczna jako metoda pozyskiwania karotenoidów z czerwonej papryki

Ekstrakcja nadkrytyczna jako metoda pozyskiwania karotenoidów z czerwonej papryki Dorota KOSTRZEWA, Edward RÓJ Instytut Nawozów Sztucznych, Al. Tysiąclecia Państwa Polskiego 13A, 24 110 Puławy STRESZCZENIE Celem pracy było przedstawienie wyników badań pozyskiwania karotenoidów z czerwonej papryki. Badania przeprowadzono na instalacji doświadczalnej w skali laboratoryjnej z użyciem nadkrytycznego ditlenku węgla oraz metodą Soxhleta. Ocenie poddano surowiec użyty do ekstrakcji oraz jakość otrzymanych ekstraktów z wykorzystaniem metody spektrofotometrycznej. Słowa kluczowe: papryka, ekstrakcja nadkrytyczna ditlenkiem węgla, ekstrakcja Soxhletem 1. Wstęp Czerwona papryka roczna (Capsicum annuum) należy do rodziny psiankowatych i jest bogatym źródłem węglowodanów, witamin: A i C, E, K, B1, B6, kwasu foliowego, potasu, naturalnych karotenoidów oraz tłuszczów [1, 2, 3]. Zawartość oleju w owocni papryki wynosi około 6 %, w mielonej papryce około 10 14 %, natomiast ziarna papryki zawierają nawet 20 30 %. Olej otrzymany z papryki zawiera niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe (linolowy, -linolenowy), mononienasycone kwasy tłuszczowe (kwas oleinowy) oraz nasycone kwasy tłuszczowe (kwas stearynowy, palmitynowy, arachidowy, behenowy, mirystynowy), z czego największy udział mają nienasycone kwasy tłuszczowe [4]. Barwa owoców papryki zależy od obecności karotenoidów oraz flawonoidów, a głównymi karotenoidami odpowiedzialnymi w 65-80 % za kolor czerwonej papryki są kapsantyna i kapsorubina. Ponadto w papryce występuje również zeaksantyna, luteina, kryptoksantyna, kapsoluteina, α- i β-karoten. Zawartość karotenoidów oraz witaminy C w surowcu zależy od rodzaju, fazy dojrzałości papryki i zwiększa się wraz z jej dojrzewaniem. Dlatego też czerwona papryka ma więcej przeciwutleniaczy i witamin niż inne odmiany. Ze względu na wysoką zawartość witaminy A, C i E papryka pozytywnie wpływa na stan skóry, paznokci czy włosów. Witamina B6 i kwas foliowy, zawarte w papryce, pomagają obniżyć poziom homocysteiny, co zmniejsza ryzyko udaru. Papryka jest także dobrym

źródłem błonnika pokarmowego, który wiąże cholesterol i pomaga wyeliminować jego nadmiar z organizmu. Wyjątkowo wysoka zawartość przeciwutleniaczy w papryce sprawia, że wzmacnia ona układ odpornościowy, zmniejsza ryzyko chorób sercowo-naczyniowych oraz bierze udział w profilaktyce raka. Karotenoidy charakteryzują się wysoką aktywnością wobec reaktywnych form tlenu, jak i wolnych rodników. W badaniach wykazano, że β-karoten w porównaniu z innymi antyoksydantami, witaminą C i E, wykazuje wyższą aktywność antyoksydacyjną wobec tlenu singletowego, powstającego w procesie fotosyntezy. Hamuje on fazę początkową, jak również etap propagacji peroksydacji lipoprotein. Równoczesne stosowanie β-karotenu oraz witamin C i E powoduje cofanie się miażdżycy [3]. Badania przeprowadzone przez Matsufuji ego wykazały, że kapsantyna, specyficzny dla czerwonej papryki barwnik karotenoidowy, była bardziej efektywnym antyoksydantem niż -karoten, a jej estry z kwasami nienasyconymi miały taką samą zdolność wychwytywania wolnych rodników, jak -karoten [5]. Badania nad karotenoidami potwierdzają, że likopen zawarty w czerwonej papryce zapobiega niektórym rodzajom nowotworów, m.in. prostaty, trzustki, pęcherza moczowego i szyjki macicy [1, 3, 6]. Potwierdzono również skuteczne działanie ochronne β-karotenu na skórę u pacjentów chorych na protoporfirię erytropoetyczną, którzy są nadwrażliwi na światło słoneczne. Choć współczynnik ochrony przeciwsłonecznej β-karotenu jest stosunkowo niski (SPF 2) to wykazuje on działanie zapobiegające oparzeniom skóry u osób zdrowych. Wiąże się to z jego właściwościami zmiatania wolnych rodników i reaktywnych form tlenu, powstających w wyniku ekspozycji skóry na promieniowanie UVA. Natomiast luteina i zeaksantyna zawarte w papryce, obecne również w wysokim stężeniu w plamce żółtej oka, są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania narządu wzroku. Stosowanie diety bogatej w te dwa karotenoidy może stanowić ochronę przed zaćmą i związanym z wiekiem zwyrodnieniem plamki żółtej, które prowadzi do utraty wzroku. Karotenoidy są szeroko wykorzystywane w przemyśle, szczególnie jako barwniki żywności i pasz oraz suplementy [7]. Preparaty z papryki stosowane są również do przedłużania trwałości produktów końcowych (mięsnych dań gotowych, zarówno chłodzonych, jak i mrożonych) [2]. Światowy rynek dodatków do żywności opiera się głownie na produkcji syntetycznych substancji dodatkowych, jednakże coraz większa świadomość konsumentów wymusza wzrost wykorzystania związków pochodzenia naturalnego [8, 9].

Nowoczesną metodą pozyskiwania cennych składników roślin jest ekstrakcja w warunkach nadkrytycznych, gdzie czynnikiem ekstrahującym jest skompresowany pod wysokim ciśnieniem ditlenek węgla. Proces ten przebiega w stosunkowo niskich temperaturach, bez dostępu powietrza, przez co aktywne składniki roślin nie ulegają degradacji termicznej oraz przemianom oksydacyjnym, a tym samym nie powoduje to obniżenia ich jakości zdrowotnej i organoleptycznej. Jest to bardzo ważne, szczególnie w odniesieniu do pozyskiwania nietrwałych składników, takich jak karotenoidy. W wyniku ekstrakcji nadkrytycznej uzyskuje się ekstrakty roślinne o najwyższym poziomie czystości, które są czyste mikrobiologicznie i zachowują naturalne składniki aktywne. Tajemnicą czystości wyciągów roślinnych uzyskiwanych metodą ekstrakcji w warunkach nadkrytycznych jest ostatni etap procesu, w którym następuje obniżenie ciśnienia i cały rozpuszczalnik zostaje oddzielony od ekstraktu. Ekstrakcja nadkrytyczna jest procesem znacznie bardziej zaawansowanym technologicznie od tradycyjnych procesów ekstrakcji, gdzie temperatura i utlenianie towarzyszące procesom otrzymywania są szkodliwe dla witamin, enzymów, substancji lotnych oraz wielu innych substancji aktywnych. Wadą konwencjonalnych metod otrzymywania ekstraktów, w których stosuje się rozpuszczalniki organiczne są ścieki, emisja lotnych związków organicznych oraz możliwość zanieczyszczenia ekstraktów roślinnych śladami rozpuszczalników, które w nich pozostają [10]. Ponadto ekstrakcja z użyciem rozpuszczalników organicznych jest mało selektywna ze względu na ekstrahowane składniki. 2. Część eksperymentalna 2.1. Materiały Ditlenek węgla (czystość 99,8%) użyty do procesu ekstrakcji nadkrytycznej papryki z firmy Linde Gaz Polska" Sp. z o.o.. Surowcem do badań była papryka mielona z firmy KAMIS Przyprawy S.A. o natężeniu barwy ok. 160 ASTA (American Spice Trade Association). Odczynniki do oznaczeń spektrofotometrycznych oraz do ekstrakcji Soxhletem: aceton czda z firmy POCH S.A. Polska. 2.2. Aparatura i metodyka badań ekstrakcji Do badania procesu ekstrakcji nadkrytycznej papryki mielonej wykorzystano aparaturę firmy SITEC (SITEC-Sieber Engineering AG, Szwajcaria) znajdującą się w Instytucie Nawozów Sztucznych w Puławach. Instalacja jest wyposażoną w ekstraktor

o pojemności ok. 1 dm 3 i umożliwia prace pod ciśnieniem do 500 bar i w temperaturze do 200 o C. Próby ekstrakcji papryki z użyciem ditlenku węgla prowadzono w koszu, który umieszczano w ekstraktorze. Proces pozyskiwania karotenoidów z papryki przebiegał według schematu przedstawionego na rysunku 2. Załadunek surowca do ekstraktora Ekstrakcja papryki Redukcja ciśnienia od ciśnienia ekstrakcji do ciśnienia separacji Dekompresja ekstraktora Podgrzewanie mieszaniny CO 2 - ekstrakt Wyładunek pozostałości po ekstrakcji Separacja ekstraktu Skraplanie CO 2 Odbiór ekstraktu Sprężanie ciekłego CO 2 Podgrzewanie CO 2 Rys. 2. Schemat blokowy ekstrakcji nadkrytycznej papryki. Badania ekstrakcji nadkrytycznej czerwonej papryki mielonej prowadzono pod ciśnieniem 200 450 bar i w temperaturze 60 C oraz przy stałym obciążeniu CO 2 (ok. 20 kg/h). Warunki separacji ekstraktów były jednakowe w każdym z przeprowadzonych doświadczeń. W trakcie procesu pobierano próbki ekstraktu z separatora w stałych odstępach czasu, a następnie ważono je w celu określenia wydajności ekstrakcji. Porównawczo do ekstrakcji nadkrytycznej przeprowadzono ekstrakcje papryki mielonej w aparacie Soxhleta. Jako rozpuszczalnika do ekstrakcji użyto acetonu (300 ml), który utrzymywano w stanie wrzenia. Po zakończonym procesie ekstrakcji rozpuszczalnik oddzielono w wyparce próżniowej firmy Büchi, a ekstrakt zważono i poddano analizie.

2.3. Metody oceny analitycznej karotenoidów otrzymanych z papryki Badania natężenia barwy próbek surowca, ekstraktów i pozostałości po ekstrakcji papryki (ogólna zawartość karotenoidów) oznaczano metodą spektrofotometryczną. Do badań wykorzystano dwuwiązkowy spektrofotometr UV-Vis typ JASCO V-650. Oznaczenia prowadzono zgodnie z przepisami zamieszczonymi w Official Methods of Analysis 14 th Edition 1984 Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Przygotowanie próbki ekstraktu otrzymanego z papryki. Z homogenicznej próbki ekstraktu w zlewce wykonywano ok. 100 mg naważkę. Następnie do zlewki dawano aceton i umieszczano w płuczce ultradźwiękowej do rozpuszczenia próbki. Rozpuszczoną próbkę przenoszono ilościowo do kolby miarowej na 100 ml i uzupełniano acetonem do kreski. Kolbę z próbką krótko wytrząsano na wytrząsarce i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez ok. 2 minuty. Z tak otrzymanego roztworu odpipetowywano 10 ml do kolby miarowej na 100 ml i uzupełniano acetonem do kreski. Pomiar absorbancji otrzymanego roztworu wykonywano w kuwecie szklanej o długości drogi optycznej l = 10 mm w odniesieniu do czystego acetonu przy długości 460 nm. Przygotowanie próbki papryki. Z homogenicznej próbki papryki lub papryki po ekstrakcji wykonywano ok. 100 mg naważkę do kolby miarowej na 100 ml i uzupełniano acetonem do kreski. Kolbę wstawiano do wytrząsarki i krótko wytrząsano. Tak przygotowaną próbkę pozostawiano w temperaturze pokojowej na ok. 16 godzin. Po wyznaczonym czasie kolbę z próbką intensywnie wytrząsano przez ok. 2 minuty. Następnie roztwór sączono przez filterki 0.45 µm, po czym wykonywano pomiar absorbancji badanej próbki analogicznie jak wyżej. Barwę surowca, ekstraktu i pozostałości po ekstrakcji wyrażano w skali zabarwienia ASTA, która stanowi międzynarodowy wzorzec do określania koloru sproszkowanej papryki oraz ekstraktów z niej uzyskanych. Obliczenia natężenia barwy wykonano zgodnie z prezentowanymi poniżej równaniami (rów. 1, 2). ASTA A nm f dla ekstraktu z papryki (1) m 460 164 1 ASTA gdzie: A 460nm16, 4 m 2 f dla papryki lub papryki po ekstrakcji (2) A zmierzona absorbancja próbki, f współczynnik korekcji drogi optycznej, m 1, m 2 masa próbek użyta do badań, 164 i 16,4 współczynniki obliczeniowe.

3. Wyniki badań i dyskusja Podczas procesu ekstrakcji papryki mielonej określano wydajność i barwę otrzymywanych ekstraktów. Warunki prowadzenia eksperymentów prezentuje tabela 1, zamieszczona poniżej. Tabela 1. Warunki prowadzenia doświadczeń. Ekstrakcja papryki Wsad Warunki ekstrakcji g Barwa, ASTA T, 0 C P, bar Czas, min ekstrakcja nadkrytyczna nr 1 150,8 158 60 200 240 ekstrakcja nadkrytyczna nr 2 150.2 158 60 350 240 ekstrakcja nadkrytyczna nr 3 150.0 158 60 400 240 ekstrakcja nadkrytyczna nr 4 146.9 158 60 450 240 ekstrakcja metodą Soxhleta 15.4 158 - - 180 Wyniki ekstrakcji papryki uzyskane dla poszczególnych doświadczeń, dotyczące odzysku ekstraktu w stosunku do masy wyjściowej wsadu oraz analizy ekstraktu i pozostałości po ekstrakcji papryki, przedstawia tabela 2. Tabela 2. Wyniki ekstrakcji czerwonej papryki. Ekstrakcja papryki Sumaryczny odzysk ekstraktu Natężenie barwy ekstraktu Natężenie barwy pozostałości po ekstrakcji g % wag. ASTA ASTA ekstrakcja nadkrytyczna nr 1 12,1 8,0 484 21,5 ekstrakcja nadkrytyczna nr 2 12,7 8.5 1677 19,1 ekstrakcja nadkrytyczna nr 3 12,6 8.4 1799 22,6 ekstrakcja nadkrytyczna nr 4 12,2 8,2 1909 18,5 ekstrakcja metodą Soxhleta 2,1 13,6 1215 1,6 Jak wynika z tabeli 2 podczas doświadczeń prowadzonych z użyciem ditlenku węgla w warunkach nadkrytycznych uzyskano dużo mniejszą wydajność ekstrakcji papryki niż metodą Soxhleta. Niezależnie od zastosowanego ciśnienia ekstrakcji wydajność ekstrakcji nadkrytycznej kształtowała się na poziomie 8,0 8,5 % wag. Natomiast w wyniku ekstrakcji papryki mielonej w aparacie Soxhleta uzyskano wydajność procesu na poziomie 14 % wag. Analiza pozostałości po ekstrakcji papryki potwierdziła wysoki stopień wyekstrahowania

Natężenie barwy w skali ASTA złoża dla ekstrakcji prowadzonej metodą Soxhleta. Jednak podczas omawianego doświadczenia nie uzyskano wysokiej wartości natężenia barwy ekstraktu. Wartość barwy otrzymanego ekstraktu wynosiła zaledwie 1215 ASTA, ponieważ ekstrakcja metodą Soxhleta jest mało selektywna. W wyniku ekstrakcji papryki z użyciem acetonu uzyskano związki nierozpuszczalne w warunkach prowadzenia ekstrakcji ditlenkiem węgla, które znacznie obniżyły stężenie karotenoidów w otrzymanym ekstrakcie. W przypadku ekstrakcji nadkrytycznej papryki natężenie barwy otrzymywanych ekstraktów wzrastało wraz ze wzrostem ciśnienia ekstrakcji. Najwyższe natężenie barwy ekstraktu uzyskano dla ekstrakcji papryki z użyciem ditlenku węgla pod ciśnieniem 450 bar. Podczas ekstrakcji papryki ditlenkiem węgla pod ciśnieniem 450 bar i w temperaturze 60 o C wykonano również pomiar natężenia barwy ekstraktu na poszczególnych etapach procesu ekstrakcji. Wyniki oznaczeń przedstawiono na rysunku 3. 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 30 60 120 180 240 Czas, min Rys. 3: Zmiana natężenia barwy ekstraktu podczas ekstrakcji nadkrytycznej papryki. Kontrola analityczna procesu wykazała, że natężenie barwy ekstraktu w trakcie procesu ekstrakcji papryki mielonej pod ciśnieniem 450 bar rosło od wartości ok. 1400 ASTA do wartości ok. 2400 ASTA. Na rysunku 4 zamieszczono przykładowe widma UV-Vis dla ekstraktu z papryki otrzymanego w temperaturze 60 o C i pod ciśnieniem 400 bar oraz pozostałości po ekstrakcji

papryki. Próbki ekstraktu i pozostałości po ekstrakcji papryki rozpuszczono w acetonie i wykonano pomiar widm absorpcyjnych w zakresie 190 800 nm. Rys. 4. Widmo absorpcyjne dla próbki ekstraktu otrzymanego z papryki (kolor zielony) i pozostałości po ekstrakcji papryki (kolor pomarańczowy). Na otrzymanym widmie wyraźnie widoczne są pasma absorpcyjne charakterystyczne dla barwników karotenoidowych w zakresie 390 550 nm. Dla karotenu maksimum absorpcji w acetonie występuje przy długości fali 451 i 477 nm. Natomiast dla głównych karotenoidów zawartych w papryce, kapsantyny i kapsorubiny, maksimum absorpcji występuje przy długości 460 nm. 4. Podsumowanie W pracy przedstawiono wyniki badań ekstrakcji czerwonej papryki mielonej za pomocą ditlenku węgla o parametrach nadkrytycznych oraz metodą Soxhleta. Największą wydajność procesu w stosunku do masy wsadu uzyskano dla ekstrakcji papryki mielonej metoda Soxhleta. Natomiast najwyższe natężenie barwy ekstraktu otrzymano podczas ekstrakcji nadkrytycznej ditlenkiem węgla pod ciśnieniem 450 bar. Wartość natężenia barwy wynosiła wówczas 1909 ASTA. W badanym zakresie parametrów nie stwierdzono wpływu ciśnienia na szybkość i wydajność ekstrakcji nadkrytycznej papryki, ale obserwowano wpływ ciśnienia na barwę otrzymanych ekstraktów i ogólną zawartość karotenoidów z nią związaną.

W wyniku podniesienia ciśnienia ekstrakcji papryki od 200 do 450 bar uzyskano prawie 4-krotny wzrost natężenia barwy ekstraktu. LITERATURA 1. G. Maiani, M.J. Periago Castón, G. Catasta, E. Toti, I. Go ni Cambrodon, A. Bysted, F. Granado-Lorencio, B. Olmedilla-Alonso, P. Knuthsen, M. Valoti, V. Böhm, E. Mayer- Miebach, D. Behsnilian, U. Schleme, Carotenoids: actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans, Molecular Nutrition and Food Research, 2009, 53, 194 218. 2. I. Perucka, M. Materska, L. Jachacz, Ocena jakości preparatów otrzymanych z wysuszonych owoców papryki (Capsicum annuum l.), Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2010, 1 (68), 30 39. 3. A. Gryszczyńska, B. Gryszczyńska, B. Opala, Karotenoidy. Naturalne źródła, biosynteza, wpływ na organizm ludzki, Postępy Fitoterapii, 2011, 2, 127-143. 4. Li Guoliang, Song Cuihua, You Jinmao, Sun Zhiwei, Xia Lian, Suol Yourui, Optimisation of red pepper seed oil extraction using supercritical CO 2 and analysis of the composition by reversed-phase HPLC-FLD-MS/MS, International Journal of Food Science and Technology, 2011, 46, 44 51. 5. H. Matsufuji, H. Nakamura, M. Chino, M. Takeda, Antioxidant activity of capsantin and the fatty acid esters in paprika (Capsicum annuum), J. Agric Food Chem., 1998, 46, 3468-3472. 6. H. Nishino, Cancer prevention by carotenoids, Mutation Research, 1998, 402, 159 163, 7. P.D. Fraser, P.M. Bramley, The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids, Progress in Lipid Research, 2004, 43, 228-265. 8. A. Rutkowski, S. Gwiazda., K. Dobrowski, Kompendium dodatków do żywności, 2003. 9. J. Pokorny, Are natural antioxidants better and safer than synthetic antioxidants, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2007, 109, 629-642. 10. N. Aleksandra N. Tepić, Gordana R. Dimić, Biserka L. Vujičić, Žarko S. Kevrešan, Marika Varga and Zdravko M. Šumić, Quality of commercial ground paprika and its oleoresins, APTEFF, 2008, 39, 1-212.