Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Bossowski A. i inni: Ocena ekspresji proapoptotycznych markerów TIAR Szewczyk i TIA-1 w L. tkance i inni Aktywność tarczycowej opioidowa młodocianych u dziewcząt pacjentów z nadczynnością z chorobą i niedoczynnością Gravesa Basedowa tarczycy Vol. 8/2009 Nr 4(29) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Ocena ekspresji proapoptotycznych markerów TIAR i TIA-1 w tkance tarczycowej młodocianych pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa Identification of Proapoptotic TIAR and TIA-1 Markers Detection in Thyroid Tissues from Adolescents with Graves Disease 1 Artur Bossowski, 2 Barbara Czarnocka, 3 Krzysztof Bardadin, 4 Anna Moniuszko, 2 Anna Łyczkowska, 3 Jolanta Czerwińska, 5 Jacek Dadan, 6 Marek Niedziela, 7 Anna Bossowska 1 Klinika Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii z Pododdziałem Kardiologii, 4 Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji, 5 I Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku, 2 Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej CMKP w Warszawie, 3 Zakład Patomorfologii CMKP w Warszawie, 6 Katedra Pediatrii, Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego UM w Poznaniu, 7 Oddział Kardiologii Szpitala MSWiA w Białymstoku. Adres do korespondencji: Artur Bossowski, Klinika Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii z Pododdziałem Kardiologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, ul. Waszyngtona 17,15-274 Białystok, Polska, tel.: 85 745 07 30, fax: 85 745 07 30, e-mail:abossowski@hotmail.com Słowa kluczowe: tyreocyty, apoptoza, choroba Gravesa Basedowa, TIAR Key words: thyrocytes, apoptosis, Graves Basedow disease, TIAR Praca prezentowana na XVIII Sympozjum PTED w Gdańsku. 04-06.09.2008. STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. Istotą choroby Gravesa-Basedowa są zaburzenia w układzie immunologicznym organizmu, cechujące się powstawaniem odpowiedzi na własne antygeny tarczycy (tyreoperoksydaza, tyreoglobulina, receptor dla TSH, symporter Na + /I - ). W wyniku aktywacji limfocyty T wykazują zdolność do syntezy i uwalniania cytokin, które przekazują sygnały aktywacji komórkom pęcherzykowym tarczycy, doprowadzając do wzrostu ekspresji wewnątrzkomórkowych markerów apoptozy: TIAR (TIA-1 related protein) i TIA-1 (T cell intracelullar antigen 1). Celem pracy była ocena ekspresji proapoptotycznych cząsteczek TIAR i TIA-1 u młodocianych pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa (GB) oraz wolem wieloguzkowym nietoksycznym (NTMG). Materiał i metody. Badania przeprowadzono w materiale tkankowym tarczycy izolowanym ze skrawków pooperacyjnych uzyskanych od 15 pacjentów w wieku 12 21 lat z chorobą GB oraz 15 pacjentów z NTMG w wieku 13 21 lat. Oznaczenie ekspresji cząsteczek proapoptotycznych w materiale tkankowym tarczycy przeprowadzono w oparciu o metodę immunohistochemiczną przy użyciu przeciwciał mab-tiar i anty-tia-1 w wizualizacji DAB i barwieniu hematoksyliną Mayera. Dodatkowo identyfikację TIAR i TIA-1 przeprowadzono metodą Western Blot przy zastosowaniu przeciwciał mab w wizualizacji białek z zastosowaniem chemiluminescencji. Identyfikacja białek apoptotycznych TIAR i TIA-1 wykazała ich znamienną ekspresję w komórkach tarczycy u pacjentów z chorobą GB (+++; +) w porównaniu z ekspresją w grupie z NTNG (+; 0). 17

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):17-26 Materiał tkankowy tarczycy poddano również analizie metodą Western-Blot, uzyskując u pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa obecność białka TIAR w trzech prążkach [p50, p42, p38 (kda)] oraz białka TIA-1 w dwu prążkach [p22, p17 (kda)]. U pacjentów z wolem guzkowym nietoksycznym stopień ekspresji obu białek apoptotycznych był mniejszy i dotyczył pojedynczych prążków: 42 (kda) dla TIAR i 17 (kda) dla TIA-1. Wnioski. Podsumowując można stwierdzić, iż w schorzeniach tarczycy dochodzi do zaburzeń przebiegu apoptozy w komórkach pęcherzykowych tarczycy, doprowadzających do przewagi procesu proliferacji nad śmiercią komórek, co w efekcie powoduje powiększenia gruczołu tarczowego. Dodatkowo zmiany ekspresji białek proapoptotycznych wskazują na udział apoptozy w patogenezie choroby Gravesa Basedowa. Endokrynol. Ped. 8/2009;4(29):17-26. Introduction. The course of Graves disease (GD) is associated with the inflow of lymphocytes to the thyroid gland and dysregulation of the immune system characterized by reaction to thyroid antigens (peroxidase, thyroglobulin, TSH receptors and Na + /I - symporter). After activation they shift to the inflamed thyroid gland, thus leading to the production of cytokines which can stimulate activity of thyrocytes and increase expression on intracellular proapoptotic markers such as TIAR (TIA-1 related protein) and TIA-1 (T cell intracelullar antigen 1). The aim of this study was to estimate the expression of TIAR and TIA-1 in thyroid tissues from patients with GD and no-toxic multinodular goitre (NTMG). Material and methods. The investigation was performed on thyroid cells isolated from postoperation thyroid tissues from 15 patients aged 12 21 years old with GD and 15 cases aged 13 21 years old with NTMG. Detection of proapoptotic molecules was performed by immunohistochemistry using mab-tiar and anti-tia-1 antibodies in DAB chromogene visuality and marked by Mayer s hematoxylin. In addition, TIAR and TIA-1 were identified by Western Blot method. The visualization of proteins was performed by chemiluminescence detection procedure. Identification of proapoptotic TIAR and TIA-1 molecules in the thyroid tissues revealed a higher expression of both proteins in patients with Graves disease (+++; +, respectively) in comparison to patients with NTNG (+; 0). In addition, TIAR expression was detected in three bands [p50, p42, p38 (kda)] and TIA-1 in two bands [p22, p17 (kda)] using Western Blot test in patients with thyroid autoimmune diseases. In patients with NTNG expression of both apoptotic proteins was lower and identified in single bands: 42 (kda) for TIAR and 17 (kda) for TIA-1. Conclusions. We conclude that alteration in the expression of proapoptotic proteins in thyroid follicular cells may play a role in the pathogenesis of thyroid autoimmune disorders. Pediatr. Endocrinol. 8/2009;4(29):17-26. Wstęp Apoptoza jest kluczowym czynnikiem patomechanizmu chorób tarczycy. Zaburzenia w układzie immunologicznym organizmu, charakteryzujące się powstawaniem odpowiedzi na własne antygeny tarczycy (tyreoperoksydaza, tyreoglobulina, receptor dla TSH, symporter Na + /I - ), są odpowiedzialne m.in. za rozwój choroby Gravesa Basedowa. W wyniku aktywacji limfocyty T wykazują zdolność do syntezy i uwalniania cytokin, które przekazują sygnały aktywacji komórkom pęcherzykowym tarczycy doprowadzając do wzrostu ekspresji wewnątrzkomórkowych markerów apoptozy: TIAR i TIA-1. Apoptoza może odbywać się drogą zewnątrzi wewnątrzpochodną. W pierwszym przypadku dochodzi do aktywacji kompleksu Fas/FasL, który inicjuje wewnątrzkomórkowy szlak przemian [1]. Ten cykl przemian odgrywa kluczową rolę w aktywacji cząsteczki TIAR (TIA-1 related protein) znajdującej się głównie w jądrze komórkowym i posiadającej zdolność rozpoznawania oraz wiązania się z RNA za pomocą trzech podjednostek zwanych RRMs (RNA recognition motifs). Uczynniona pod wpływem aktywacji receptora Fas cząsteczka TIAR przemieszcza się pomiędzy jądrem a cytoplazmą, uczestnicząc w defragmentacji zarówno DNA, jak i RNA [2]. Rola mtiar i mtia-1 nie jest do końca poznana. Przypuszcza się, iż są one efektorami apoptozy. TIAR jest przekazywany z jądra do cytoplazmy podczas procesu apoptozy przebiegającego za pośrednictwem Fas, natomiast TIA-1 jest specyficznym substratem dla białkowej kinazy serynowej/treoninowej aktywowanej przez Fas [3]. Obie cząsteczki TIA-1 i TIAR są zaangażowane w replikację wirusów. Są także niezbędne komórkom DT40 do zachowania żywotności. Na mysich modelach wykazano, iż zwierzęta pozbawione TIA-1 lub TIAR cechują się wyższym współczynnikiem embrionalnej śmiertelności, co wskazuje na istotną rolę tych cząsteczek podczas rozwoju embrionalnego [4]. Na mysich modelach zwierzęcych wykazano ich rolę w przetrwaniu komórek [5]. Przypuszcza się, że czynniki proapoptyczne wpływają na modyfikację aktywności TIA-1 i TIAR, prowadząc do zmian wzoru splicingu pre-mrna. Obie cząsteczki mają zdolność do łączenia się z mrna TNF-α, metaloproteinzy 13, cyklooksygenazy -2, mitochondrialnego receptora C, GADD45α [6]. 18

Bossowski A. i inni: Ocena ekspresji proapoptotycznych markerów TIAR i TIA-1 w tkance tarczycowej młodocianych pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa TIA-1, poza rolą jaką odgrywa w procesie apoptozy, jest niezbędne w adaptacji komórek do stresu metabolicznego i procesów zapalnych [7]. TIAR i TIAR są białkami wiążącymi RNA z rodziny białek rozpoznających motyw RNA(PMR)/ rybonukleoprotein (RNP), składającymi się z 3 100 aminokwasów na końcu domeny N oraz około 90 aminokwasów na końcu domeny C. Są one zaangażowane w metabolizm RNA zachodzący zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie, np. mrna translację. Wykazano, że mtia-1 i mtiar są podobne do siebie w 80% oraz w 90 99% podobne do htia-1 i mtiar. Struktury: egzon-intron genów kodujących mtiar i mtia-1 są zbliżone do siebie. Zbudowane są z 3 N-końcowych domen RPM, rozpoznających RNA, oraz jednej domeny C-końcowej, bogatej w glutaminę. Druga RPM domena mtiar i mtia-1 zawiera krótkie odcinki zbudowane z uracylu [8]. Wykazano, iż białka mtiar i mtia-1 znajdują się przede wszystkim w mózgu, jądrach i śledzionie. Celem pracy była próba odpowiedzi na pytania: 1. Czy u młodocianych pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa oraz z wolem wieloguzkowym nietoksycznym dochodzi do ekspresji cząsteczek TIA i TIAR w tkance gruczołu tarczowego? 2. Jaki stopień ekspresji cząsteczek proapoptotycznych występuje w schorzeniach immunologicznych, a jaki w nieimmunologicznych gruczołu tarczowego? Materiał i metody Badanie przeprowadzono w grupie pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa (n = 15, średni wiek 15,1±1,3 lat) oraz pacjentów z wolem wieloguzkowym nietoksycznym (n = 15, średni wiek 16,0±0,8 lat) hospitalizowanych w Klinice Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii z Pododdziałem Kardiologii, Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku oraz w Klinice Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Pacjenci byli poddani totalnej lub subtotalnej tyreoidektomii w Klinice Chirurgii Ogólnej Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku oraz Klinice Chirurgii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Rozpoznanie postawiono na podstawie obrazu klinicznego, badań laboratoryjnych, ultrasonograficznych gruczołu tarczowego i biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (FNAB). Pacjentów z nadczynnością tarczycy leczono metizolem w dawce początkowej 0,5 1,0 mg/kg m.c./dobę w połączeniu z propranololem (0,5 1,0 mg/kg m.c./dobę). Dawki leków redukowano (do 5 10 mg/dobę) w zależności od parametrów biochemicznych i klinicznych celem doprowadzenia do stanu eutyreozy przed zabiegiem operacyjnym. Pacjenci z wolem wieloguzkowym otrzymywali L-tyroksynę w dawce 25 75 μg/dobę przez okres 3 12 miesięcy od rozpoznania. Pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa kwalifikowano do badań na podstawie następujących kryteriów: obecności wola IIº, oftalmopatii, TRAb > 1, dodatnich mian przeciwciał anty-tpo i anty-tg oraz utrzymujących się ponad trzy miesiące od początku rozpoznania stężeń TSH < 0,45. Protokół badań został zatwierdzony przez Komisję Etyczną do spraw badań naukowych przy Uniwersytecie Medycznym w Białymstoku. Krew do badań pobierano na czczo w godzinach rannych z żyły odłokciowej. Odwirowywano w wirówce przez 10 minut przy 2000 obrotów na minutę. Do chwili zebrania odpowiedniej ilości surowic do oznaczeń przechowywano je w temperaturze -85ºC. W badanych surowicach oznaczano przeciwciała przeciwreceptorowe (TRAb) metodą radioreceptorową z użyciem zestawów TRAK human (Brahms Diagnostica GmbH, Berlin, Germany), w których wartość < 1 U/l była traktowana jako negatywna, 1,0 1,5 jako wątpliwa i > 1,5 jako pozytywna. Ocenę stężeń przeciwciał p/peroksydazie (anty-tpo) i p/tyreoglobulinie (anty-tg) przeprowadzono testem immunoenzymatycznym (Pharmacia GmBH, Germany). Za wartość prawidłową stężenia przeciwciał anty-tg i anty-tpo uznano < 50 IU/ml. Stężenia hormonów tarczycy oraz TSH w surowicy krwi były oznaczane metodą chemiluminescencji. Wartości prawidłowe: ft4 0,71 1,55 ng/dl, ft3 2,6-5,4 ng/dl, htsh 0,32 5 μiu/ml. Metoda Western Blot Zamrożone tkanki homogenizowano za pomocą homogenizatora nożowego w 5-krotnym nadmiarze buforu (0,25 M sacharoza, 0,02 M Tris, 0,001 M EDTA o ph 7,4) zawierającym inhibitory proteaz (PMSF 50 μm, aprotynina 1 μg/ml, leupeptyna 1 μg/ml, pepstatyna 1 μg/ml). Homogenaty wirowano przez 15 min. 1000 g, 4 C w celu odwirowania niezhomogenizowanych resztek tkanki. Osad odrzucono, zaś nadsącz przeniesiono do nowych probówek i wirowano 1 godz., 100000 g, 4 C. Nadsącz zlano, a osad (frakcja mikrosomalna) zawieszono w 20 mm Tris, zawierającym PMSF 19

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):17-26 o stężeniu 50 μm. Próbki przechowywano w -80 C. Osad 75 μg białka z frakcji mikrosomalnej rozdzielono metodą SDS-PAGE (12% żel poliakrylamidowy) i elektrotransferowano do błony PVDF (Bio- Rad). Błonę wysycano przez noc w 4 C, w PBS z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka. Następnie inkubowano ją przez 24 godz. w temp. 8 C z pierwszorzędowymi przeciwciałami monoklonalnymi (BD Biosciences Pharmingen) anty-tiar, anty- TIA-1 w rozcieńczeniu sugerowanym przez firmę. Po trzykrotnym płukaniu w PBST (po 10 min.) błonę inkubowano z drugim przeciwciałem (anty-mysim), znakowanym HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, Pa.,USA) 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po ponownym trzykrotnym płukaniu PBST reakcję przeprowadzono metodą SuperSignal West Pico (Pierce). Wizualizację białek przeprowadzono metodą chemiluminescencji z użyciem błony BioMax Ms (Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, Mo., USA). Przeprowadzono równolegle do każdego oznaczenia kontrolę ujemną oraz identyfikację β-aktyny z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych anty-β actin (Sigma). Metoda immunohistochemii Tkanki rozmrożone w temperaturze pokojowej, po wypłukaniu nadmiaru podłoża w wodzie destylowanej, utrwalano w 4% buforowanej formalinie przez 24 godziny. Następnie przeprowadzono odwodnienie tkanek w szeregu alkoholi, acetonie, ksylenie oraz zatapiano je w parafinie w sposób typowy. Skrawki 4 μm grubości krojono na silanizo-wane szkiełka, które następnie poddano suszeniu w temp. 60 C przez noc. Po odparafinowaniu i uwodnieniu preparatów w ksylenie i alkoholu wykonywano odkrywanie antygenu w buforze cytrynowym o ph 6,0 w łaźni wodnej temp. 95 99 C przez 5 minut. W następnym etapie wykonano blokowanie endogennej peroksydazy 3% H2O2. W preparatach skrojonych seryjnie przeprowadzano inkubację z monoklonalnymi przeciwciałami TIAR, TIA-1 (BD Biosciences Pharmingen) w temp. +4 C w komorze wilgotnej przez noc, następnie biotynylowym wtórnym przeciwciałem z KIT LSAB+ oraz streptawidyną znakowaną peroksydazą chrzanową. Wizualizacji dokonano chromogenem DAB, następnie przeprowadzono podbarwienie jąder hematoksyliną Mayera. Równolegle do każdego oznaczenia barwiono preparat z pominięciem pierwotnego przeciwciała jako kontrolę ujemną. Stopień pozytywnej identyfikacji TIAR i TIA-1: + obejmowało 10% komórek, ++ wielkość między 10 a 50% komórek, +++ odpowiednio > 50% komórek. Metoda fluorocytometrycznej oceny ekspresji Fas/FasL na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy Skrawki tkanki tarczycowej pooperacyjnej wielkości 1,0 cm/1,0 cm pobierano do probówki zawierającej podłoże RPMI-1640. Na początku materiał tkankowy rozdrabniano mechanicznie, a następnie po rozdrobnieniu dodano kolagenazę IV-S (Sigma). Tak przygotowaną zawiesinę komórek tarczycy rozcieńczano w proporcji 1:1 z podłożem RPMI 1640, następnie porcjowano po 50 ml i uzupełniono 10 ml roztworu zawierającego przeciwciała mysie monoklonalne (mab) skierowane przeciw ludzkiemu epitopowi 64 TPO. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do próbek dodawano przeciwciało królicze F(ab )2-FITC (DAKO, USA) i przeprowadzano dalszą inkubację przez dalszych 20 minut. Tak uzyskaną zawiesinę komórkową płukano 3-krotnie w PBS, po czym do każdej probówki dodawano po 10 ml przeciwciał anty-fas- PE lub anty-fasl-pe/fitc i poddano 20-minutowej inkubacji. Po dokładnym wymieszaniu próbki poddawano analizie w cytometrze przepływowym (Coulter EPICS XL). Analiza statystyczna. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, wyznaczając dla każdego parametru wartość średnią i odchylenie standardowe. Porównanie poszczególnych parametrów w badanych grupach przeprowadzono testem t-studenta, U Manna-Whitneya oraz Fishera. Za istotną statystycznie uznano wartość t, dla której wartość p była mniejsza od 0,05. Do oceny siły współzależności pomiędzy kolejnymi parametrami zastosowano współczynniki korelacji liniowej Persona i Spearmana. Obliczenia matematyczno-statystyczne wykonano opierając się na programie Statistica 8,0. Wyniki badań W tabeli I przedstawiono charakterystykę i badania laboratoryjne pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa oraz z wolem guzkowym nietoksycznym. U pacjentów ze stwierdzonymi w badaniu ultrasonograficznym zmianami guzkowymi większymi niż 1 cm przeprowadzono biopsję aspiracyjną cienkoigłową (BAC), która wykazała zmiany o charakterze łagodnym pod postacią wola guzkowego koloidowego. 20

Bossowski A. i inni: Ocena ekspresji proapoptotycznych markerów TIAR i TIA-1 w tkance tarczycowej młodocianych pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa Tabela I. Charakterystyka badanych grup pacjentów Table I. Clinical characteristics of the examined patients Wiek (lata) Age (years) Grupa z chorobą Gravesa Basedowa Group with GD Grupa z wolem wieloguzkowym nietoksycznym Group with NTMG 17,1 ± 4,3 16,0 ± 5,2 NS n 15 15 Waga (kg) Weight (kg) Wzrost (cm) Height (cm) 59 ± 7 63 ± 8 NS 1,75 1,76 NS BSA (m²) 1,68 1,7 NS anty-tpo (IU/ml) anti-tpo anty-tg (IU/ml) anti-tg 650 ± 250 55 ± 15 p < 0,025 360 ± 40 20 ± 5 p < 0,006 TRAb (U/l) (+) (-) ft4 (ng/dl) 2,04 ± 0,3 1,29 ± 0,2 NS ft3 (ng/dl) 3,8 ± 0,5 2,94 ± 0,21 NS TSH (µiu/ml) 0,3 ± 0,1 1,1 ± 0,5 p < 0,001 GD Graves disease, NTMG Non-toxic multinodular goiter Pooperacyjny materiał tkankowy tych grup pacjentów został poddany identyfikacji w kierunku proapoptotycznych białek regulatorowych apoptozy metodą immunohistochemii (IHCH) oraz Western Blot. Zastosowanie metody IHCH ujawniło w tyreocytach pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa znamienną obecność białka proapoptotycznego TIAR, której ekspresję określono na +++ (ryc. 1 a, b). Wykazano także, iż stopień ekspresji tej cząsteczki w lokalizacji jądrowo-cytoplazmatycznej komórek pęcherzykowych tarczycy był uzależniony od stopnia ekspresji cząsteczki FasL na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy, ocenionej przy użyciu cytometrii przepływowej. Przy wyższej ekspresji FasL uzyskano nadmierne gromadzenie cząsteczki TIAR w cytoplazmie komórek nabłonkowych, a przy niższej ekspresji FasL zwiększoną ekspresję w lokalizacji jądrowej cząsteczki TIAR (ryc. 2 a, b). Zaobserwowana zmienność lokalizacji cząsteczki proapoptotycznej przemawia za jej przemieszczaniem się w zależności od stopnia aktywności zewnątrzpochodnej drogi apoptozy. W grupie młodocianych z wolem guzkowym nietoksycznym stopień ekspresji był niższy i wynosił + (ryc. 3 a, b). Zwiększona ekspresja cząsteczki TIAR w tkance tarczycy pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa obejmowała przede wszystkim tyreocyty o wyższym nabłonku tzw. hiperfunkcyjnym. Obecność cząsteczki TIA-1 o stopniu ekspresji + wykazano jedynie u pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa w obszarze grudek chłonnych z ogniskami rozmnażania. Dodatkowo materiał tkankowy tarczycy poddano analizie metodą Western-Blot, uzyskując u pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa obecność białka TIAR w trzech prążkach [p50, p42, p38 (kda)] oraz białka TIA-1 w dwu prążkach [p22, p17 (kda)] (ryc. 4 a, b). U pacjentów z wolem guzkowym nietoksycznym stopień ekspresji obu białek apoptotycznych był mniejszy i dotyczył pojedynczych prążków: 42 (kda) dla TIAR i 17 (kda) dla TIA-1 (ryc. 5 a, b). Każdy materiał tkankowy tarczycy badanych przez nas pacjentów poddano ocenie na obecność białka ß-aktyny metodą Western Blot, 21

Praca oryginalna a) Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):17-26 b) Ryc. 1. Identyfikacja cząsteczki TIAR u pacjenta z chorobą Gravesa Basedowa metodą immunohistochemii: a) hematoksylina/ eozyna, b) ekspresja TIAR (+++) Fig. 1. Identification of TIAR molecule in Graves patient using immunohistochemistry method: a) hematoxylin/eosin, b) expression of TIAR protein (+++) którego ekspresja potwierdza, iż tkanki nie były zdegradowane i wskazuje na właściwą jakość wykonanych analiz. Dyskusja Apoptoza odpowiada za regulację homeostazy organizmu. W wielu doniesieniach została opisana rola zaprogramowanej śmierci komórek w patomechanizmie różnych jednostek chorobowych. Apoptoza zachodzi dwiema drogami: zewnątrzi wewnątrzpochodną. Na drodze zewnątrzpochodnej dochodzi do aktywacji kompleksu Fas/FasL, który aktywuje wewnątrzkomórkowy cykl przemian. Część cytoplazmatyczna aktywowanego receptora Fas wiąże białko adaptacyjne, np. FADD (Fas associated Heath domin protein). Powstały w ten sposób kompleks Fas-FADD aktywuje kaspazę 8 (FLICE-FADD-like interleukin 1ß-converting enzyme), co w konsekwencji aktywuje kilka proteaz cysternowych kompleksu kaspazy 3, uważanych za efektorowe w procesie apoptozy. Ten cykl przemian odgrywa kluczową rolę w aktywacji cząsteczki TIAR (TIA-1 related protein). TIAR znajduje się w jądrze komórkowym i ma zdolność rozpoznawania oraz wiązania się z RNA za pomocą trzech podjednostek, zwanych RRM (RNA recognition motif). Zaktywowana pod wpływem aktywacji receptora Fas cząsteczka TIAR przemieszcza się między jądrem a cytoplazmą, uczestnicząc w defragmentacji zarówno DNA, jak i RNA [9]. 22 Cytoplazmatyczna redystrybucja poprzedza fragmentację DNA oraz zmiany architektury jądra komórkowego ułatwiając ekstrakcję histonów. TIAR progresywnie znika z cytoplazmy, co dowodzi, że cząsteczki te nie są użyteczne przy dalszych przemianach. Cytoplazmatyczna translokacja TIAR jest specyficzna dla tego białka, ponieważ podobnych zmian ekspresji nie obserwowano w przypadku innych białek jądra komórkowego podczas apoptozy [10]. Cytoplazmatyczna akumulacja TIAR jest czynnikiem, który aktywuje apoptozę. Powoduje, iż cząsteczka ta uczestniczy w procesach z RNA i substratami białkowymi, które nie mogą zachodzić w jądrze. TIAR może także być czynnikiem docelowym dla p15-tia-1, białka będącego efektorem dla apoptozy cytotoksycznych limfocytów T [11]. W procesie apoptozy rolę odgrywa także TIA-1. Kinaza serynowo-treoniniowa FAST jest aktywowana podczas apoptozy zachodzącej za pośrednictwem Fas w komórkach Jurkat i fosforyzuje TIA-1 przed defragmentacją DNA. Wykazano, iż nadekspresja TIA-1 i TIAR prowadzi do tych samych efektów. Na mysich modelach zwierzęcych dowiedziono, że TIAR jest niezbędny do rozwoju komórek zarodka, w związku z czym można przypuszczać, iż jest on niezbędny w przeżycia komórek [5]. Czynniki proapotyczne modyfikują aktywność TIA-1 i TIAR, prowadząc do zmian procesu splicing pre-mrnas [12]. Wykazano, iż podczas apoptozy wywołanej niedokrwieniem dochodzi do wzrostu stężenia TIA-1 i TIAR [13].

Bossowski A. i inni: Ocena ekspresji proapoptotycznych markerów TIAR i TIA-1 w tkance tarczycowej młodocianych pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa a ) bramkowanie komórek pęcherzykowych tarczycy a ) gating of thyroid follicular cells b ) bramkowanie komórek pęcherzykowych tarczycy b ) gating of thyroid follicular cells a ) ekspresja jądrowa cząsteczki TIAR a ) expression of TIAR molecule in nucleus b ) ekspresja cząsteczki TIAR w cytoplazmie b ) expression of TIAR molecule in cytoplasm a ) ekspresja cząsteczki FasL a ) expression of FasL protein b ) ekspresja cząsteczki FasL b ) expression of FasL protein Ryc. 2. Identyfikacja jądrowo-cytoplazmatyczna cząsteczki TIAR u pacjenta z chorobą Gravesa Basedowa Fig. 2. Identification of nucleo-cytoplasmatic TIAR molecule in patient with Graves disease 23

Praca oryginalna a) Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):17-26 b) Ryc. 3. Identyfikacja cząsteczki TIAR u pacjenta z wolem wieloguzkowym nietoksycznym metodą immunohistochemii: a) hematoksylina/eozyna, b) ekspresja TIAR (+) Fig. 3. Identification of TIAR molecule in patient with NTNG using immunohistochemistry method: a) hematoxylin/eosin, b) expression of TIAR protein (+) a) ekspresja białka TIAR / expression of TIAR protein b) ekspresja białka TIA-1 / expression of TIA-1 protein Ryc. 4. Identyfikacja białek apoptotycznych TIAR (a) i TIA-1 (b) metodą Western Blot w tkance gruczołu tarczowego u pacjenta z chorobą Gravesa Basedowa Fig. 4. Identification of apoptotic TIAR (a) and TIA-1 (b) proteins by Western Blot method in patients with Graves disease Rola omawianych cząsteczek była badana w odniesieniu do wielu narządów: mózgu, śledziony, jąder. Niewiele jest jednak publikacji na temat ekspresji TIA-1 i TIAR w chorobach tarczycy. Okamoto i wsp. wykazali, iż cząsteczki te uczestniczą w patogenezie chłoniaka tarczycy TCRa/b+ bez cech autoimmunologicznego uszkodzenia tego gruczołu [14]. Podobne obserwacje zostały poczynione 24 przez Yamaguchi i wsp. w przypadku chłoniaka TCRg/d+ [15]. W naszych badaniach wykazano zwiększoną ekspresję TIAR/TIA-1 w grupie pacjentów z chorobą GD, co sugeruje udział apoptozy w patogenezie procesu autoimmunologicznego przy szczególnym udziale aktywacji drogi zewnątrzpochodnej.

Bossowski A. i inni: Ocena ekspresji proapoptotycznych markerów TIAR i TIA-1 w tkance tarczycowej młodocianych pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa a) ekspresja białka TIAR / expression of TIAR protein (kda) p42 b) ekspresja białka TIA-1 / expression of TIA-1 protein (kda) p17 Ryc. 5. Identyfikacja białek apoptotycznych TIAR (a) i TIA-1 (b) metodą Western Blot w tkance gruczołu tarczowego u pacjenta z wolem wieloguzkowym nietoksycznym Fig. 5. Identification of apoptotic TIAR (a) and TIA-1 (b) proteins by Western Blot method in patients with non-toxic nodular goiter Wnioski 1. Wykazano obecność białka związanego z mrna TIAR i TIA-1 w tkance gruczołu tarczowego u pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa przy nieznacznej jej ekspresji w wolu guzkowym nietoksycznym. 2. Przewaga ekspresji białek TIAR/TIA-1 w chorobie Gravesa Basedowa względem jego ekspresji w schorzeniach nieimmunologicznych wskazuje na zwiększoną aktywność apoptozy w procesie immunologicznym. 3. Znamienna ekspresja białka TIAR w tkance gruczołu tarczowego wskazuje na wzmożoną aktywność zewnątrzpochodnej drogi aktywacji apoptozy. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Andrikoula M., Tsatsoulis A.: The role of Fas-mediated apoptosis in thyroid disease. European Journal of Endocrinology, 2001:144, 561-568. [2] Guiner C., Gesnel M.C., Breathnach R.: TIA-1 and TIAR is required for DT40 cell viability. The Journal of Biological Chemistry, 2003: 278(21), 10465-10476. [3] Beck A.R., Medley Q.G., O Brien S. et al.: Structure, tissue distribution and genomic organization of the murine RRM-type RNA binding proteins TIA-1 and TIAR. Nucleic Acids Res., 1996:24(19), 3829-3835. [4] Piecyk M., Wax S., Beck A.: TIA-1 is a translational silencer that selectively regulates the expression of TNF-α EMBO J., 2000:19, 4154-4163. [5] Beck A., Miller I.J., Anderson P.: RNA-binding protein TIAR is essential for primordial germ cell development. Proc. Natl. Acad. Sci., 1998:95, 2331-2336. [6] Izquierdo J.M., Valcarcel J.: Two isoforms of the T-cell intracellular antigen (TIA-1) splicing factor display distinct splicing regulation activities. J. Biol. Chemistr., 2007:27, 19410-19417. [7] Lal A., Abdelmohsen K., Pullmann R.: Posttranscriptional derepression of GADD45alpha by genotoxic stress. Mol Cell., 2006:22, 117-128. [8] Gatto-Konczak F., Bourgeois C.F., Le Guner C. et al.: Tha RNA Binding protein TIA-1 is a novel mammalian splicing regulator acting through intron sequences adjacent to a 5 splice site. Molecular and Cellular Biology., 2000:7, 6287-6299. [9] Bossowski A., Moniuszko A.: Apoptoza i jej rola w funkcjonowaniu wybranych gruczołów endokrynnych [w:] E. Otto-Buczkowska, Endokrynologia wieku rozwojowego co nowego? Cornetis, Wrocław 2008, 57-70. [10] Taupin J.C., Tian Q., Kederahat N. et al.: The RNA-binding protein TIAR is translocated from the nucleus to the cytoplasm during Fas-mediated apoptotic cell death. Cell. Biology, 1995:2, 1629-1633. [11] Kawakami A., Tian Q., Duan X., Streuli M. et al.: Identification and functional characterization of a TIA-1-related nucleolysin. Proc. Natl. Acad. Sci., 1992:89, 8681-8685. 25

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 8/2009;4(29):17-26 [12] Gatto-Konczak F., Bourgeois C.F., Le Guiner C. et al.: The RNA-Binding Protein TIA-1 Is a Novel Mammalian Splicing Regulator Acting through Intron Sequences Adjacent to a 5 Splice Site. Molecular and Cellular Biology, 2000:9, 6287-6299. [13] Osborne N.N., Cazevieille C., Pergande G. et al.: Induction of apoptosis in cultured human retinal pigment epithelial cells is counteracted by flupirtine. Invest Ophthalmol Vis. Sci., 1997:38, 1390-1400. [14] Okamoto A., Namura K., Uchiyama H. et al.: Cytotoxic T-cell non-hodgkin s lymphoma of the thyroid gland. American Journal of Hematology, 2005:1, 77-78. [15] Yamaguchi M., Ohno T., Kita K.: g/d T-cell lymphoma of the thyroid gland. New Engl. J. Med., 1997:336, 1391-1392. 26