Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Transkrypt

1 Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa Basedowa... Vol. 10/2011 Nr 1(34) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa Basedowa i zapaleniem tarczycy typu Hashimoto Analysis of T Regulatory Cells in the Peripheral Blood in Children and Adolescents with Graves Disease and Hashimoto s Thyroiditis 1 Artur Bossowski, 2 Marcin Moniuszko, 3 Milena Dąbrowska, 4 Małgorzata Mrugacz, 1 Beata Sawicka, 5 Anna Bossowska, 2 Marta Jeznach, 2 Anna Bodzenta-Łukaszyk 1 Klinika Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii z Pododdziałem Kardiologii; 2 Klinika Alergologii i Chorób Wewnętrznych; 3 Zakład Diagnostyki Hematologicznej; 4 Klinika Okulistyki Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku; 5 Oddział Kardiologii i Szpital MSWiA w Białymstoku Adres do korespondencji: Artur Bossowski MD PhD, Klinika Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii z Pododdziałem Kardiologii, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska, ul. Waszyngtona 17, Białystok, tel , fax (085) , abossowski@hotmail.com Słowa kluczowe: Tregs, choroba Gravesa Basedow, zapalenie tarczycy typu Hashimoto Key words: Tregs, Graves disease, Hashimoto s thyroiditis STRESZCZENIE/ABSTRACT Schorzenia autoimmunizacyjne tarczycy (AITD) należą do jednych z najczęściej występujących narządowo-swoistych chorób immunologicznych. Współistnienie predyspozycji genetycznej, dysfunkcji immunologicznej oraz działanie czynników środowiskowych odpowiada za inicjację i rozwój AITD. W ostatnich latach podkreśla się istotną rolę komórek T regulatorowych (fenotyp CD4+CD25+) o właściwościach supresyjnych uczestniczących w regulacji obwodowej tolerancji immunologicznej. Celem pracy była ocena odsetka komórek T regulatorowych o fenotypie CD4+CD25 high, CD4+ CD25+CD127 low and CD4+ FoxP3 u pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa (GB) (n = 20, średni wiek 14,9 lat), zapaleniem tarczycy typu Hashimoto (n = 20, średni wiek 15,2 lat) i w grupie kontrolnej dzieci zdrowych z ujemnym wywiadem w kierunku chorób zapalnych, układowych i nowotworowych (n = 20, średni wiek 15,4 lat). Analiza subpopulacji komórek Tregs została przeprowadzona w oparciu o czterokolorową cystometrię przepływową z wykorzystaniem aparatu FACSCalibur (BD Biosciences). U pacjentów z chorobą GB i HT stwierdzono istotne statystycznie obniżenie odsetka komórek Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 (p < 0,007, p < 0,01) i CD4+CD25 high (p < 0,01, p < 0,048) w porównaniu z grupą kontrolną. Analiza populacji komórek CD4+CD25+CD127 low T nie wykryła istotnych różnic w obu schorzeniach autoimmunizacyjnych tarczycy w stosunku do dzieci zdrowych. Przeprowadzona ocena zależności pomiędzy stężeniem p/ciał przeciwtarczycowych a odsetkiem poszczególnych subpopulacji komórek Tregs wykazała w grupie z nowo rozpoznaną chorobą GB ujemną zależność pomiędzy odsetkiem komórek T CD4+CD25 high a mianem p/ciał anty-tsh-r (r = -0,43, p < 0,03). Można stwierdzić, że zmniejszenie odsetka subpopulacji limfocytów Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4+CD25 high we krwi obwodowej jest odpowiedzialne za 37

2 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48 utratę tolerancji immunologicznej i w konsekwencji rozwój schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy wieku rozwojowego. Endokrynol. Ped. 10/2011;1(34): Autoimmune thyroid disease (AITD) is the most common organ-specific autoimmune disorders. Genetic background, environmental and endogenous factors are play important roles in determining the activation of immune cells or the efficacy of the immunoregulatory pathways. In recent years underlined the immunosuppressive role of T lymphocytes with expression of CD4+CD25+ (Tregs) in regulation mechanisms of peripheral immune tolerance. The aim of the study was to estimate the expression of CD4+CD25 high, CD4+ CD25+CD127 low and CD4+ FoxP3 T cells in patients with Graves disease (GD) (n = 20, mean age 14.9 years old), in patients with Hashimoto s thyroiditis (HT) (n = 20, mean age 15.2 years old) in comparison with sex- and age-matched healthy control subjects (n = 20, mean age 15.4 years old). The expression of the immune cells populations were analyzed by the four-color flow cytometry using a FACSCalibur (BD Biosciences) cytometer. In untreated patients with Graves disease and HT we observed a significant decrease of CD4+FoxP3 (p < 0.007, p < 0.01) and CD4+CD25 high (p < 0.01, p < 0.048) T lymphocytes in comparison to the healthy control subjects. The analysis of CD4+CD25+CD127 low T cells in the peripheral blood revealed comparable percentages of these cells in patients with thyroid autoimmune diseases to the controls. In untreated Graves patients negative correlation between percentage of CD4+CD25 high T cells and serum level of anti-tsh-r (r = -0.43, p < 0.03) antibodies was found, while no such correlation were detected in relation to CD4+CD25+CD127 low or CD4+ FoxP3 T cells. We conclude that the reduction number of Treg cells with expression of CD4+CD25 high and CD4+FoxP3 could be responsible for loses immune tolerance and development of autoimmune process in thyroid disorders. Pediatr. Endocrinol. 10/2011;1(34): Wstęp Wśród narządowo-swoistych chorób immunolo-gicznych dużą grupę stanowią choroby układu dokrewnego, a zwłaszcza autoimmunizacyjne choroby tarczycy (AITD), tj. choroba Gravesa Basedowa i przewlekłe limfocytarne zapalenie tarczycy typu Hashimoto. Choroby te, wraz z innymi schorzeniami autoimmunizacyjnymi tarczycy, stanowią około 30% wszystkich chorób autoimmunizacyjnych [1]. Regulacja stopnia nasilenia antygenowo-swoistej odpowiedzi immunologicznej zachodzi w organizmie na wiele różnych sposobów. Właściwie zróżnicowana reakcja immunologiczna ma kluczowe znaczenie dla efektywnego rozpoznawania i usuwania obcych antygenów, zapewniając tym samym bezpieczeństwo tkankom i narządom gospodarza. W grasicy dochodzi do delecji klonalnej autoreaktywnych limfocytów, natomiast w obwodowych narządach układu immunologicznego tolerancja uzyskiwana jest przez anergię lub aktywną supresję z udziałem limfocytów T regulatorowych (supresorowych) Tregs, które poprzez swoją funkcję utrzymują homeostazę immunologiczną [2]. Limfocyty T regulatorowe stanowią 5 10% populacji limfocytów CD4+ i cechują się swoistą ekspresją czynnika transkrypcji FoxP3, odpowiedzialnego za hamowanie nadmiernej reakcji układu odpornościowego. Dodatkowo FoxP3 kodujący skurfinę, negatywny czynnik transkrypcji, blokuje ekspresję cytokin prozapalnych zaangażowanych w aktywację limfocytów Th1 [3]. Oznaczanie jednak czynnika FoxP3 wiąże się z długotrwałą procedurą laboratoryjną (permeabilizacja) oraz brakiem możliwości użycia komórek do dalszych badań, np. funkcjonalnych. Ostatnio wykryto silną korelację pomiędzy wewnątrzkomórkową ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 a powierzchniową niską ekspresją antygenu CD127 (IL-7R), dlatego też można przyjąć, że komórki T regulatorowe mogą prezentować fenotyp CD4 + /CD25 ++ /CD127 low. Jak dotąd najwięcej uwagi poświęcono badaniom limfocytów: CD4+CD25+, pomocniczych typu 3 (Th3), regulatorowych typu 1 (Tr1) oraz limfocytów typu naturalnego zabójcy (NKT). Limfocyty CD4+CD25+ są identyfikowane przez ekspresję na powierzchni komórek łańcucha α receptora interleukiny 2 (IL-2R) czyli CD25+ [3]. Badania przeprowadzone na myszach dowiodły, że brak tego receptora na limfocytach T prowadzi do zaburzeń w stabilności subpopulacji limfocytów T regulatorowych (Treg), co skutkuje rozwojem schorzeń autoimmunologicznych [4]. Badania in vitro i in vivo ostatnich lat potwierdziły regulatorowe działanie limfocytów CD4+CD25+, a tym samym ich kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej [2]. Zasadniczy mechanizm supresyjnego działania opiera się na ich bezpośrednim wpływie na komórkę docelową. Po pobudzeniu receptora limfocytów T komórki CD4+CD25+ czynnie hamują proces aktywacji i proliferacji limfocytów CD4+ i CD8+ [5]. 38

3 Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa Basedowa... Natomiast mechanizm pośredni polega na ich wpływie na komórki prezentujące antygen (np. dendrytyczne) oraz wytwarzaniu cytokin supresorowych, takich jak: IL-10 czy TGF-β [5]. Ponadto zaobserwowano, że na limfocytach Tregs występuje przejściowa ekspresja receptora z rodziny TNF-α (cząsteczka CD134), który uczestniczy w kontrolowaniu liczebności oraz regulacji aktywności limfocytów T pomocniczych [6]. Znaczenie udziału limfocytów T regulatorowych w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych tarczycy u człowieka nie jest do końca poznane, a publikacje dotyczące dzieci są wręcz nieobecne w literaturze światowej. Wyniki niektórych badań in vitro oraz pojedyncze doniesienia o próbach immunoterapii, wpływających na funkcję limfocytów T regulatorowych, wskazują na ich istotną rolę w zaburzeniach tolerancji immunologicznej na antygeny własne. Jednoznacznie wykazano, że u zwierząt istnieje silny związek między utratą czynności limfocytów T regulatorowych a występowaniem zapalenia tarczycy [7]. Badania przeprowadzone na myszach, które w trzecim dniu życia pozbawiono grasicy, wykazały ich podatność na rozwój chorób autoimmunologicznych tarczycy, natomiast transfer limfocytów od zdrowych, dorosłych myszy zapobiegał ich rozwojowi. Podanie zaś myszom puli limfocytów niezawierających komórek CD4+CD25+ sprzyjało autoimmunizacji, a obecność tych komórek prowadziła do zahamowania tego procesu [8]. Celem pracy była więc próba odpowiedzi na następujące pytania: 1. Czy w grupie osób młodych z nowo zdiagnozowaną postacią choroby Gravesa Basedowa oraz zapaleniem tarczycy typu Hashimoto dochodzi do zaburzeń liczby limfocytów T regulatorowych w porównaniu z grupą dzieci zdrowych? 2. Jak zachowują się proporcje limfocytów T regulatorowych w dynamice chorób autoimmunizacyjnych po zastosowaniu leczenia? 3. Czy istnieją zależności pomiędzy stężeniem przeciwciał przeciwtarczycowych i hormonów tarczycy a populacją komórek T (CD4+CD25 high, CD4+ CD25+ CD127 low i CD4+ FoxP3)? Materiał i metody Badaniem objęto 40 dzieci i młodzieży (8 chłopców i 32 dziewcząt) w wieku 8 19 lat (średni wiek 15,5 roku) z rozpoznanymi chorobami autoimmunizacyjnymi tarczycy (AITD): zapaleniem tarczycy typu Hashimoto n = 20 przed i w trakcie leczenia L-tyroksyną, chorobą Gravesa Basedowa n = 20 nowo rozpoznaną i w trakcie 3 6 mies. leczenia tyreostatykiem. Rozpoznanie ustalono w oparciu o badania kliniczne, wyniki badań laboratoryjnych oraz ultrasonograficznych gruczołu tarczowego. U pacjentów ze współistniejącymi guzkami dodatkowo przeprowadzono biopsję aspiracyjną cienkoigłową pod kontrolą USG (BACC). W leczeniu nadczynności tarczycy zastosowano terapię metizolem, stosując początkowo 0,5 1,0 mg/kg/dobę (maks. do 30 mg/m 2 /dobę) łącznie z propranololem w dawce 0,5 1,0 mg/kg m.c./dobę. Po uzyskaniu klinicznej eutyreozy dawki metizolu odpowiednio redukowano o 5 10 mg, dochodząc do dawki podtrzymującej 5 10 mg. Pacjenci z zapaleniem tarczycy typu Hashimoto otrzymywali leczenie wyłącznie L-tyroksyną (średnio 75 ± 25 μg/dobę) w okresie 6 12 miesięcy (średnio 8 miesięcy) od rozpoznania. Funkcję gruczołu tarczowego oceniono na podstawie badania hormonalnego, które zostało przeprowadzone łącznie z oznaczeniem stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych oraz z analizą cytometryczną odsetka poszczególnych populacji limfocytów T (CD4+CD25 high, CD4+ CD25+ CD127 low i CD4+ FoxP3) u pacjentów z nowo rozpoznanym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto (grupa C) oraz w trakcie 6 12 mies. leczenia L-tyroksyną (grupa D). Takie analizy przeprowadzono także u dzieci ze świeżą nadczynnością tarczycy (grupa A) przed rozpoczęciem leczenia metizolem, a następnie powtórzono w okresie remisji kliniczno-biochemicznej po 3 6 miesiącach terapii (grupa B). Wszyscy pacjenci spełniali następujące kryteria: prawidłowa funkcja wątroby i nerek w wywiadzie nie ustalono obecności chorób alergicznych nie stosowano leków antyarytmicznych z III grupy według Williamsa (amiodaron) w badaniu fizykalnym nie zaobserwowano cech infekcji. Grupę dzieci badanych z autoimmunizacyjnymi schorzeniami tarczycy porównano z grupą kontrolną dzieci zdrowych z prawidłową czynnością gruczołu tarczowego, zgodną pod względem płci, wieku i masy ciała oraz z ujemnym wywiadem w kierunku chorób zapalnych, autoimmunologicznych i nowotworowych. Badania uzyskały zgodę lokalnej Komisji do Spraw Etyki Nadzoru nad Badaniami na Ludziach i Zwierzętach przy UM w Białymstoku. Metodyka dotycząca oceny stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych oraz hormonów tarczycy Krew do badań pobierano na czczo w godzinach rannych z żyły odłokciowej. Odwirowywano ją 39

4 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48 w wirówce przez 10 min. przy 2000 obrotów na min. Do chwili zebrania odpowiedniej ilości surowic do oznaczeń przechowywano je w tem. -85 C. W badanych surowicach oznaczano przeciwciała antyperoksydazowe (anty-tpo), antytyreoglobulinowe (anty-tg) i anty-tsh receptorowi (TRAK) za pomocą analizatora Modular Analytics E170 (moduł Elecsys) firmy Roche Diagnostics Polska, metodą elektrochemiluminescencji ECLIA. Wartości prawidłowe stężeń przeciwciał wynosiły odpowiednio: anty-tpo 0 34 IU/mL, czułość metody < 5,0 IU/ml; anty-tg IU/mL, czułość metody < 10 IU/ml oraz anty-tshr 0 1,75 IU/l, czułość metody 0,3 IU/l. Oznaczenie stężeń wolnej tyroksyny (ft4), wolnej trójjodotyroniny (ft3) i TSH w surowicy krwi przeprowadzono za pomocą analizatora Cobas e 411 firmy Roche Diagnostics Polska, metodą elektrochemiluminescencji ECLIA. Wartości prawidłowe hormonów wynosiły odpowiednio: ft4 0,9 1,8 ng/dl, czułość metody 0,023 ng/dl; ft3 2,0 5,2 pg/ml, czułość metody 0,26 pg/ml oraz TSH 0,27 4,2 µiu/ml, czułość metody 0,005 µiu/ml. Metodyka dotycząca analizy cytofluorometrycznej detekcji komórek T regulatorowych Krew do badań pobierano na czczo w godzinach rannych z żyły odłokciowej. Próbki krwi pełnej (100 µl) z użyciem EDTA jako antykoagulantu poddano inkubacji przez 30 min. w temperaturze pokojowej z użyciem przeciwciał monoklonalnych znakowanych fluorochromem w objętości 20 µl [anti-cd4 FITC/PerCP (BD PharMingen), anti-cd25 PE-Cy5 (IL-2R, BD PharMingen), anti-cd127 PE (IL-7R, Immunotech) oraz anti-foxp3 PE lub Alexa Fluor 647 i odpowiadających im kontroli izotopowych (BD PharMingen)]. W celu dokonania lizy erytrocytów próbki umieszczono na okres 5 min. w roztworze BD FACSLysing Solution (BD Biosciences). Po dwukrotnym płukaniu komórki zostały utrwalone w roztworze CellFix (BD Biosciences). Dodatkowo przed barwieniem przeciwciałami anti-foxp3 próbki zostały poddane trwającej 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej z buforem Permeabilizing Solution (BD Biosciences), po której przeprowadzono dwukrotne płukanie komórek. Ocenę ekspresji markerów powierzchniowych przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences). Populację Tregs wyselekcjonowano na podstawie kombinacji charakterystycznych dla limfocytów cech morfotycznych (forward scatter, side scatter) oraz wysokiej ekspresji CD4 i CD25 oraz niskiej ekspresji CD127 (komórki CD4 + CD25 + CD127 - ) (ryc. 1). Wewnątrzkomórkową ekspresję FoxP3 oceniono po ustawieniu bramki analizy na populacji limfocytów CD4+ oraz CD4 + CD25 + (ryc. 2). Analiza instrumentalna została przeprowadzona za pomocą oprogramowania CellQuest (BD Biosciences). Każdorazowo oceniano po 10 4 komórek. Wyniki podano jako wartości odsetkowe lub wartość średniej intensywności fluorescencji (MFI, mean fluorescencje intensity). Czas od pobrania krwi do wykonania badań morfologicznych i oznaczeń cytometrycznych nie przekraczał 5 godzin. Analiza statystyczna Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej w oparciu o program Statistica 9.0 for Windows. Wobec braku cech rozkładu normalnego wyniki analizowano za pomocą testów nieparametrycznych. Porównania poszczególnych parametrów immunologicznych w grupach badanej i kontrolnej dokonano za pomocą testu U Manna Whitneya. Za istotną statystycznie uznano wartość p < 0,05. Do oceny siły współzależności między kolejnymi parametrami zastosowano współczynniki korelacji liniowej Persona i Spearmana. Wyniki W tabeli I przedstawiono charakterystykę pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa przed leczeniem (grupa A) i po 3 6-miesięcznej terapii metizolem (grupa B) oraz z nowo rozpoznanym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto przed leczeniem (grupa C) oraz w trakcie 6 12 mies. terapii L-tyroksyną (grupa D), a także grupy kontrolnej dzieci zdrowych (grupa K). Wiek badanych i parametry antropometryczne nie wykazywały różnic istotnych statystycznie. Rozpoznanie chorób autoimmunologicznych ustalono w oparciu o badanie kliniczne, wyniki badań laboratoryjnych oraz badanie ultrasonograficzne gruczołu tarczowego, a w przypadku 6 pacjentów ze współistniejącymi zmianami guzkowymi powyżej i równymi 10 mm dodatkowo o biopsję aspiracyjną cienkoigłową (BACC), uzyskując we wszystkich przypadkach postać zmian o charakterze łagodnym. W poddanej ocenie subpopulacji limfocytów T regulatorowych u pacjentów z nowo rozpoznaną chorobą Gravesa Basedowa stwierdzono istotne statystycznie obniżenie odsetka limfocytów T 40

5 Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa Basedowa... Ryc. 1. Identyfikacja wybranych subpopulacji komórek T regulatorowych (Tregs) wyselekcjonowanych na podstawie kombinacji charakterystycznych dla limfocytów cech morfotycznych (forward scatter, side scatter) oraz wysokiej ekspresji CD4 i CD25 oraz niskiej ekspresji CD127 (komórki CD4+CD25+CD127-) Fig. 1. Identification of chosen Treg cell subpopulations selected according to characteristic of morphological features for lymphocytes (forward scatter, side scatter) and higher expression of CD4 and CD25 or low expression of CD127 (fenotype CD4+CD25+CD127-) 41

6 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48 Ryc. 2. Identyfikacja wewnątrzkomórkowej ekspresji czynnika transkrypcji FoxP3 na podstawie ustawienia bramki analizy na populacji limfocytów CD4+ oraz CD4+CD25+ Fig. 2. Identification of intracellular expression of transcription factor FoxP3 due to gating of population of CD4 and CD4+CD25+ T cells CD4+FoxP3 (p < 0,007) i CD4+CD25high (p < 0,01) w porównaniu do grupy kontrolną. Po 3 6 miesiącach terapii metizolem w stanie kliniczno-biochemicznej eutyreozy wartości odsetka powyższych populacji komórek pozostawały nadal znamiennie statystycznie obniżone (p < 0,001; p < 0,01) w stosunku do grupy kontrolnej. W przypadku pacjentów z nowo rozpoznanym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto obserwowano także niższe wartości odsetka limfocytów Tregs, zarówno CD4+FoxP3 (p < 0,01), jak i CD4+CD25high (p < 0,048) we krwi obwodowej w porównaniu do dzieci zdrowych (ryc. 3a, b). Dodatkowo przeprowadzona ocena obu subpopulacji limfocytów Tregs w trakcie 6 12 mies. terapii 42 L-tyroksyną wykazała znamienny wzrost ich odsetka, który nie wykazywał znamiennych statystycznie różnic w wobec grupy kontrolnej. W odniesieniu do populacji limfocytów CD4+CD25+CD127low i CD4+CD25int nie obserwowano istotnych statystycznie różnic w grupie pacjentów z autoimmunizacyjnymi chorobami tarczycy przed jak i w trakcie stosowanej terapii w porównaniu do dzieci zdrowych (ryc. 4). W badanym przez nas materiale brano pod uwagę zależności pomiędzy przeciwciałami przeciwtarczycowymi a odsetkiem poszczególnych subpopulacji limfocytów Tregs. U pacjentów z nieleczoną chorobą Gravesa Basedowa stwierdzono istotną

7 Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa Basedowa... Tabela 1. Dane pacjentów z chorobą Gravesa Basedowa (GB) przed leczeniem metizolem (grupa A), po 3 6 miesiącach terapii (grupa B), w nowo rozpoznanym zapaleniu tarczycy typu Hashimoto (HT) (grupa C) oraz HT po 6 12 miesiącach terapii L-tyroksyną (grupa D) oraz w grupie kontrolnej dzieci zdrowych (grupa K) Table 1. Data of patients with Graves disease [prior to methimazole treatment (group A), after 4 6 months of thyrostatic therapy (group B)], with newly diagnosed Hashimoto s thyroiditis (group C), with Hashimoto s thyroiditis during 6 12 months of L-thyroxine therapy (group D) and healthy control subjects (group K) Wiek/Age (lata/years) Grupa A z nieleczoną chorobą GB Group A with untreated GD (n = 20) Grupa B po 3 6 mc terapii metizolem Group B with GD after 3 6 months of methimazole treatment (n = 12) Grupa C z nieleczonym HT L-tyroksyną Group C with HT untreated with L thyroxine (n = 20) Grupa D z HT leczona L-tyroksyną przez 6 12 mc Group D with HT treated with L-thyroxine for 6 12 months (n = 12) Grupa K grupa kontrolna Group K healthy controls (n = 20) 14.9 ± ± ± ± ± 2 BMI (kg/m²) ± ± ± ± ± 3.8 TSH(µIU/ml) 0.22 ± ± ± ± ± 0.87 ft4 (ng/dl) 2.48 ± ± ± ± ± 0.06 ft3 (pg/ml) 5.75 ± ± ± ± ± 0.34 TRAb (U/l) ± ± ± ± ± 0.48 anti-atg (IU/ml) anti-tpo (IU/ml) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 3 p* p** p*** p**** NS* NS** NS*** NS**** p < 0.001* NS** NS*** NS**** p < 0.001* NS** p < *** NS**** p < 0.002* NS** NS*** NS**** p < 0.008* NS** NS*** NS**** p < * p < NS*** NS**** p < * p < 0.01** p < *** p < 0.013**** p < 0.001* p < 0.014** p < 0.001*** p < 0.03**** 43

8 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48 p) istotność statystyczna pomiędzy poszczególnymi grupami p) istotność statystyczna pomiędzy poszczególnymi grupami Ryc. 3. Odsetek limfocytów o fenotypie CD4+FoxP3 (a) i CD4+CD25 high (b) w badanych grupach dzieci Fig. 3. Percentage of lymphocyte subpopulations CD4+FoxP3 (a) i CD4+CD25 high (b) in examined groups 44

9 Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa Basedowa... Ryc. 4. Odsetek limfocytów o fenotypie CD4+CD25 int oraz CD4+CD25+CD127 low w badanych grupach dzieci Fig. 4. Percentage of lymphocyte CD4+FoxP3 and CD4+CD25 high subpopulations in examined groups Ryc. 5. Krelacje zachodzące pomiędzy % limfocytów CD+25high a stężeniem p/ciał TRAb u pacjentów z nowo rozpoznaną chorobą Gravesa Basedowa Fig. 5. Correlation between percentage of CD4 + CD25 high T cells and serum level of anti-thyroid receptor antibodies (anti- TSH-R) in patients with untreated GD 45

10 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48 statystycznie ujemną korelację pomiędzy odsetkiem limfocytów T regulatorowych o fenotypie CD4+CD25 high we krwi obwodowej a stężeniem p/ciał TRAb (r = -0,43, p < 0,03) (ryc. 5) oraz korelację dodatnią pomiędzy stężeniem TSH a odsetkiem limfocytów Tregs CD4+FoxP3 (p < 0,01) i CD4 +CD25 high (p < 0,05). Takich zależności w tej grupie nie obserwowano w odniesieniu do stężenia hormonów tarczycy oraz do przeciwciał anty-tpo, anty-tg. Poddana z kolei ocenie zależność stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych i hormonów tarczycy w odniesieniu do poszczególnych subpopulacji komórek Tregs (poza stwierdzoną w nieleczonym zapaleniu tarczycy typu Hashimoto ujemną korelacją pomiędzy stężeniem przeciwciał anty-tpo a odsetkiem limfocytów CD4+CD25 high ; r = -0,56, p < 0,03) nie wykazała istotnych korelacji zarówno u pacjentów przed, jak i w trakcie leczenia zapalenia tarczycy typu Hashimoto. Dyskusja Przebieg schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy wiąże się z napływem limfocytów do gruczołu tarczowego oraz z dysregulacją układu odpornościowego, którą charakteryzuje powstawanie odpowiedzi na własne antygeny tarczycy (peroksydaza, tyreoglobulina, receptory dla TSH oraz symporter Na+/I-) [9,10]. W ostatnich latach coraz większą rolę przypisuje się niewielkiej populacji limfocytów T o fenotypie CD4+CD25+FoxP3 (Tregs) w regulacji funkcjonowania mechanizmów tolerancji obwodowej i zapobieganiu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T. Niedobór liczby i/lub upośledzenie funkcji tych komórek może stać się przyczyną wzbudzenia reakcji autoimmunologicznej w związku z brakiem hamującego ich działania w nadmiernej reakcji układu odpornościowego [7]. Obecnie trwają intensywne badania nad rolą komórek Tregs w patogenezie schorzeń autoimmunizacyjnych (cukrzycy typ 1, toczniu, łuszczycy, zapaleniu autoimmunizacyjnym wątroby) oraz miażdżycy, niewiele jest jednak takich badań co do chorób tarczycy [11 14]. W naszych badaniach u dzieci z nowo rozpoznanymi schorzeniami autoimmunizacyjnymi tarczycy ocenialiśmy odsetek komórek T regulatorowych oraz ekspresję czynnika transkrypcji FoxP3 w limfocytach T CD4. Wykazaliśmy istotne statystycznie obniżenie odsetka limfocytów Tregs (poza populacjami CD4+CD25 int i CD4 + CD25 ++ CD127 - ) w grupie badanej z nowo zdiagnozowanymi chorobami autoimmunizacyjnymi tarczycy w porównaniu do grupy dzieci zdrowych. Podobnie Nakano i wsp. odkryli, że odsetek komórek T regulatorowych wśród wewnątrztarczycowych limfocytów był niższy u osób z autoimmunizacyjnymi chorobami tarczycy niż w zdrowej grupie kontrolnej. Komórki te ulegały przyspieszonej apoptozie, co doprowadzało do rozwoju choroby [15]. W modelu zwierzęcym McLachlan i wsp. obserwowali rozwój zapalenia autoimmunizacyjnego tarczycy po usunięciu limfocytów Tregs przy zastosowaniu przeciwciał anty-cd25 i anty-cd122 [16]. Z kolei w badaniach Marazuela i wsp. odnotowali wzrost liczby komórek T CD4+ wykazujących jednak zaburzoną ekspresję m.in. IL-10, TGF-β, genów dla czynników transkrypcyjnych (FoxP3, STAT1, STAT3) oraz genów krytycznych dla komórek Tregs (OX40, 4-1BB, ICOS, GITR, CTLA-4) wśród jednojądrzastych komórek krwi obwodowej pacjentów z AITD w porównaniu z grupą kontrolną. Podobne komórki z zaburzoną ekspresją powyższych cząsteczek infiltrowały tkankę tarczycową w zapaleniu typu Hashimoto, co sugeruje niekompletną supresyjną funkcję komórek Tregs w tej grupie pacjentów. Dodatkowo obserwowano zmieniony odsetek komórek wykazujących ekspresję genów typową dla Tregs we krwi i gruczole tarczowym pacjentów z chorobą Hashimoto [17]. Wyniki tych badań nasuwają wniosek, że komórki Tregs występujące w ilości prawidłowej lub podwyższonej mają upośledzoną funkcję, co prowadzi do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych tarczycy [17]. Wydaje się prawdopodobny także fakt, że dochodzi do opóźnienia pojawienia się Tregs w miejscu toczącego się już procesu immunologicznego [18]. W naszych badaniach u dzieci i młodzieży z nowo rozpoznanymi chorobami autoimmunizacyjnymi tarczycy obserwowaliśmy zmniejszenie odsetka limfocytów CD4 z ekspresją czynnika FoxP3. Uznano, że Tregs dzięki swym właściwościom odgrywają istotną rolę w utrzymaniu tolerancji immunologicznej, chronią przed wystąpieniem zaburzeń autoimmunologicznych bądź prowadzą do ich remisji (u ciężarnych z chorobą Gravesa Basedowa), jak również mogą hamować odpowiedź limfocytów T na antygeny egzogenne [19]. Zdecydowanym potwierdzeniem tej hipotezy i wskazaniem roli limfocytów Tregs w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych tarczycy jest fakt uzyskania w naszych badaniach istotnie statystycznej ujemnej korelacji, zachodzącej pomiędzy odsetkiem komórek Tregs o fenotypie CD4+CD25 high a stężeniem przeciwciał przeciw 46

11 Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa Basedowa... receptorowi TSH (anty-tshr) w grupie pacjentów z nowo rozpoznaną chorobą Gravesa Basedowa oraz ujemnej z przeciwciałami anty-tpo u pacjentów z nieleczonym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto. Zrozumienie zatem regulacji procesu immunologicznego na poziomie molekularnym może przyczynić się nie tylko do lepszego poznania patogenezy schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy, ale także stwarza nowe możliwości diagnostyczne i prognostyczne. Zastosowanie w terapii metizolu, którego rola immunomodulująca była podkreślana przez Weetmana i wsp. w związku ze stabilizacją śródbłonka naczyń oraz błon komórkowych tyreocytów w odniesieniu do uwalniania przez nie cytokin, doprowadza do normalizacji zaburzeń dystrybucji limfocytów CD4/CD8 po uzyskaniu kliniczno-biochemicznej eutyreozy [20]. W naszych badaniach wprowadzenie w leczeniu nadczynności tarczycy metizolu nie doprowadzało do normalizacji odsetka limfocytów Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4+CD25 high, co mogło być prawdopodobnie związane ze zbyt krótkim okresem (3 6 mies.) obserwacji w trakcie leczenia tyreostatykiem oraz utrzymującym się podwyższonym stężeniem przeciwciał przeciwtarczycowych. Znamienne zaś obniżenie odsetka limfocytów Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4 +CD25 high na początku procesu chorobowego wskazywać może na potrzebę wprowadzenia bardziej agresywnej terapii w leczeniu choroby Gravesa Basedowa, a także na konieczność jej wydłużenia ponad standardowy okres 2 3 lat. Dalsze badania nad rolą komórek Tregs są niezwykle potrzebne wobec coraz większej ilości publikacji dotyczących wykorzystania ich w immunoterapii np. w cukrzycy typu 1 [21]. W przyszłości będzie to być może nowa droga w terapii procesów autoimmunologicznych, w tym choroby Gravesa Basedowa, w związku z ograniczeniem napływu komórek immunokompetentnych do objętego procesem zapalnym gruczołu tarczowego. Obecnie w badaniach doświadczalnych na zwierzętach znane są pojedyncze doniesienia wskazujące na możliwość zastosowania komórek Tregs w leczeniu autoimmunizacyjnych chorób tarczycy [22]. Podsumowując można stwierdzić, że zmniejszenie odsetka subpopulacji limfocytów Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4+CD25 high we krwi obwodowej jest odpowiedzialne za utratę tolerancji immunologicznej i w konsekwencji rozwój schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy wieku rozwojowego. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Brown R.S.: Autoimmune thyroid disease: unlocking a complex puzzle. Curr Opin Pediatr., 2009:26, 1-7. [2] Holm T., Nielsen J., Claesson M.: CD4CD25 regulatory T cells: Phenotype and physiology. APMIS, 2004:112, [3] Baecher-Allan C., Viglietta V., Hafler D.A.: Human CD4+CD25+ regulatory T cells. Semin. Immunol., 2004:16, [4] Antony P.A., Restifo N.P.: CD4+CD25+ T regulatory cells, immunotherapy of cancer and interleukine 2. J. Immunother., 2005:28, [5] Boehmer von H.: Mechanisms of suppression by suppressor T cells. Nature Immunology, 2005:5, [6] So T. et al.: Immune regulation and control of regulatory T cells by OX40 and 4-1BB. Cytokine Growth Factor Rev., 2008:19, [7] Lan R., Ansarib A., Liana Z. et al.: Regulatory T cells: Development, function and role in autoimmunity. Autoimmunity Rev., 2005:4, [8] Mason D., Powrie F.: Control of immune pathology by regulatory T cells. Curr. Opin. Immunol.,1998, 6, [9] Brand O.J., Gough S.C.: Genetics of thyroid autoimmunity and the role of the TSHR. Mol Cell Endocrinol., 2010 Jun 30:322(1-2), [10] Weetman A.P.: The genetics of autoimmune thyroid disease. Horm. Metab. Res., 2009:41(6), [11] Longhi M.S., Meda F., Wang P., Samyn M. et al.: Expansion and De Novo Generation of Potentially Therapeutic Regulatory T Cells in Patients with Autoimmune Hepatitis. Hepatology, 2008:47, [12] Atfy M., Amr G.E., Elnaggar A.M. et al.: Impact of CD4+CD25high regulatory T-cells and FoxP3 expression in the peripheral blood of patients with systemic lupus erythematosus. Egypt J. Immunol., 2009:16(1), [13] Chentoufi A.A., Binder N.R., Berka N. et al.: Advances in type I diabetes associated tolerance mechanisms. Scand. J. Immunol., 2008 Jul:68(1), [14] Ait-Oufella H., Taleb S., Mallat Z., Tedgui A.: Cytokine network and T cell immunity in atherosclerosis. Semin. Immunopathol., 2009 Jun:31(1), [15] Nakano A., Watanabe M., Iida T. et al.: Apoptosis-induced decrease of intrathyroidal CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in autoimmune thyroid diseases. Thyroid, 2007:17,

12 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48 [16] McLachlan S.M., Nagayama Y., Pichurin P.N., Mizutori Y. et al.: The link between Graves disease and Hashimoto s thyroiditis: a role for regulatory T cells. Endocrinology, 2007 Dec:148(12), [17] Marazuela M., Garcia-Lopez M.A., Figueroa-Vega N. et al.: Regulatory T cells in human autoimmune thyroid disease. 2006, J. Clin. Endocrinol. Metab., 2006:91, [18] Feunou P., Paulin L., Habran C. et al.: CD4+CD25+ and CD4+CD25- T cells act respectively as inducer and effector T suppressor cells in superantigen-induced tolerance. J. Immunol., 2003:171, [19] Weetman A.P.: Immunity, thyroid function and pregnancy: molecular mechanisms. Nat. Rev. Endocrinol., 2010:6(6), [20] Weetman A.P., Tandon N., Morgan B.P.: Antithyroid drugs and release of inflammatory mediators by complement-attracted thyroid cells. Lancet, 1992:340, 633. [21] Gagliani N., Ferraro A., Roncarolo M.G., Battaglia M.: Autoimmune diabetic patients undergoing allogeneic islet transplantation: are we ready for a regulatory T-cell therapy? Immunol. Lett., 2009 Dec 2:127(1), 1-7. [22] Morris G.P., Brown N.K., Kong Y.C.: Naturally-existing CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells are required for tolerance to experimental autoimmune thyroiditis induced by either exogenous or endogenous autoantigen. J. Autoimmun., 2009 Aug:33(1),