LTP i LTD: Długotrwałe wzmocnienie i osłabienie synaptyczne. Przemysław Borys Raport z 04.10.2011 Wydział Chemiczny Politechnika Śląska ul. ks. M. Strzody 9 44-100 Gliwice Przemyslaw.Borys@polsl.pl
Wprowadzenie W ostatnich latach postępy biologii dały wielki wkład w zrozumienie procesów uczenia się. W połowie XX wieku Jerzy Konorski (Konorski 1948) sformułował pojęcie plastyczności, a następnie Donald Olding Hebb (Hebb 1949) określił zasady uczenia się sieci neuronowych. Plastyczność zdefiniowana została jako własność, dzięki której w określonych układach neuronów powstają trwałe przekształcenia funkcjonalne w wyniku określonych bodźców lub ich kombinacji, natomiast zasada uczenia sieci neuronowej mówi, że gdy akson komórki A pobudza komórkę B i powtarzalnie bierze udział w jej aktywacji, to w komórkach A i B mogą zajść procesy wzrostu skutkujące zwiększeniem efektywności pobudzania B przez A. Na przełomie lat 60/70 XX wieku, dzięki badaniom Erica Kandela na ślimaku morskim Aplysia (Kandel 2000, Purves 2004) oraz badaniom na ssakach prowadzonym przez Tima Blissa oraz Terje Lomo (Bliss 1973), a w późniejszym okresie Masao Ito (Ito 1982) położono neurobiologiczne postawy tych teorii. Odkryto takie mechanizmy uczenia, jak długotrwałe wzmocnienie i osłabienie synaptyczne u ssaków (LTP Long Term Potentiation, LTD Long Term Depression) czy długotrwałe uwrażliwienie (sensytyzację 1 ) i habituację synaptyczną (LTF Long Term Facilitation, LTH Long Term Habituation) u ślimaka Aplysia. W 2000 roku Ericowi Kandelowi przyznano nagrodę Nobla (Kandel 2000), a w kolejnej dekadzie ustabilizowała się znaczna część wiedzy na temat długotrwałego wzmocnienia synaptycznego w hipokampie. Obecnie sporo też wiadomo o plastyczności komórek Purkinjego móżdżku, natomiast, paradoksalnie, najwięcej luk w wiedzy pojawia się w studiach procesów plastycznych ślimaka Aplysia, który przed laty miał być najprostszym organizmem modelowym (jedyne 20000 neuronów) (Hawkins 2008, Glanzman 2006). W następujących paragrafach chciałbym najpierw przedstawić procesy synaptyczne u ślimaka Aplysia Californica, a następnie przejść do omówienia LTP i LTD, odpowiadających za 1 Często można spotkać wymienne stosowanie terminów sensytyzacja i uwrażliwienie synaptyczne. Ściśle jednak, sensytyzacja odnosi się do uwrażliwienia behawioralnej reakcji odruchowej całego zwierzęcia, a uwrażliwienie synaptyczne opisuje jedynie zmiany w obrębie pojedynczej synapsy (Brunelli 1976). 1
pamięć epizodyczną w hipokampie ssaków (głównie gryzoni) oraz procesów LTD/LTP odpowiadających za pamięć motoryczną w móżdżku. Tekst nie zawiera z konieczności wszystkich dostępnych szczegółów (konieczna byłaby monografia o rozpiętości kilkuset stron), prowadzony jest natomiast w taki sposób, aby zaznajomić czytelnika ze strukturą zagadnienia w stopniu umożliwiającym łatwe wykorzystanie pozycji bibliograficznych w celu poszerzenia wiadomości. Szczególny nacisk położony jest na omówienie ścieżek transdukcji sygnałów w procesach plastycznych i uchwycenie ich całościowego obrazu. Tekst opatrzony jest ilustracjami i mam nadzieję, że okaże się dobrym uzupełnieniem dla starszych (i niestety nie wolnodostępnych) pozycji literaturowych w języku polskim, jak (Kossut 1994, Gorzelańczyk 2000). Pamięć ślimaka morskiego Ponad 40 lat temu Eric Kandel (Kandel 2000) odkrył, że jeśli u ślimaka Aplysia (rys. 1) dotknąć syfonu, to wycofuje on odruchowo skrzele w reakcji obronnej. Kilkakrotne podrażnienie wywołuje habituację i wielotygodniowy zanik tego odruchu. Jeśli u takiego niereaktywnego ślimaka podrażnić syfon równocześnie z elektryczną stymulacją ogona to odruch obronny powraca. Pojedyncza stymulacja przywraca go na godzinę, natomiast powtórzenie jej kilka razy utrwala odruch na kilka tygodni. Habituacja Rysunek 1: Aplysia Californica Badania mikroskopowe pokazały, że wczesnym etapom habituacji odpowiada zmniejszanie 2
się zdatnych do uwolnienia zasobów neuroprzekaźnika glutaminianu w synapsie między neuronem czuciowym a motoneuronem. Wiązano to z upośledzeniem wiązania pęcherzyków synaptycznych ze strefą aktywną synapsy 2 (Bailey 1988). Pogląd ten trwał do końca lat dziewięćdziesiątych, kiedy opublikowano pracę (Armitage 1998), w której wprawdzie potwierdzono, że wczesna habituacja następuje w obszarze presynaptycznym, ale równocześnie zaznaczono, że zubożenie warstwy aktywnej w pęcherzyki synaptyczne jest zbyt małe, by wygenerować odpowiednie zmiany potencjałów postsynaptycznych. Co więcej stwierdzono, że protokoły stymulacyjne Bailey'a są dalekie od fizjologicznych (zbyt intensywne) i trudno określić, czy jego wyniki można uogólnić na efekty zachodzące w żywym organizmie. Przeanalizowano też inne proponowane wcześniej mechanizmy habituacji, np. sygnalizację zmian plastycznych za pomocą prądu wapniowego, wnikającego do komórki podczas depolaryzacji. Możliwość ta została wykluczona w eksperymentach z powolnymi chelatorami, które unieczynniały wapń tuż po odegraniu roli w egzocytozie pęcherzyków synaptycznych. Procedura ta nie miała wpływu na habituację. Rozpatrzono również możliwość zwyczajnej inaktywacji kanału wapniowego z postępem habituacji. I tu również eksperyment (Armitage 1998) pokazuje, że nic takiego się nie dzieje, a przebieg prądu wapniowego pozostaje niezmieniony w przebiegu habituacji. W konsekwencji autorzy zaproponowali, że być może samo zajście fuzji pęcherzyka synaptycznego z membraną powoduje utrudnienia w wydzielaniu kolejnego pęcherzyka. Tematykę habituacji podejmowali następnie Gover i Abrams (Gover 2009). Oni również doszli do wniosku, że samo zubożanie strefy aktywnej w pęcherzyki synaptyczne prawdopodobnie nie decyduje o habituacji. Wykonali ważne doświadczenie, z którego wynikało, że depresja synapsy posiadającej początkowo małą wagę daje taki sam procentowy przebieg osłabienia względem ilości prób, jak depresja synapsy o dużej wadze początkowej (co nie powinno mieć miejsca, gdyż uwolnienie w pojedynczej strefie aktywnej synapsy pęcherzyka powoduje refrakcję strefy i opór 2 Strefa aktywna to specjalizowany obszar związany z błoną presynaptyczną, przystosowany do uwalniania neuroprzekaźnika. Jedną z cech charakterystycznych jest obecność kanałów przepuszczalnych dla wapnia, który za pomocą dalszych struktur ułatwiają fuzję pęcherzyka z membraną (Zhai 2004). 3
przed uwalnianiem kolejnych pęcherzyków inna kinetyka powinna pojawić się w synapsie, gdzie taka refrakcja jest obserwowana, tj. o dużej wadze, a inna w synapsie o małej wadze, bez efektu refrakcji) (Gover 2002). Kolejne doświadczenie, pomiar stosunku amplitud odpowiedzi dla parowanych (bliskich sobie) impulsów (Paired Pulse Ratio, PPR wg wielu doświadczeń mierzący odwrotność prawdopodobieństwa uwolnienia neuroprzekaźnika) pokazywał, że synapsa o dużej wadze po depresji nie osiąga stanu synapsy o małej wadze w sensie PPR, choć wynikałoby to z pomiaru potencjałów postsynaptycznych. W konsekwencji autorzy zaproponowali model wyciszania obszarów synaptycznych, które stają się nieczynne w uwalnianiu pęcherzyków, choć same pęcherzyki są w nich obecne. Negatywnym mediatorem takiego wyciszania mogłoby być białko Arf, którego inaktywacja wywołuje osłabienie siły synapsy (Gover 2009). Sensytyzacja W odróżnieniu od habituacji, zasadniczo homosynaptycznej, (zachodzącej w obrębie jednej synapsy) wczesny efekt sensytyzacji (uwrażliwienia) jest heterosynaptyczny i wynika z uwolnienia serotoniny z interneuronu pośredniczącego między neuronem czuciowym ogona, a neuronem czuciowym syfonu (rys. 2). Sygnalizacja ta została potwierdzona w doświadczeniach in vitro, gdzie bodźce drażniące ogon zastąpiono stymulacją serotoniną (Hawkins 2006, Kandel 2000). Jednokrotne pobudzenie serotoniną powoduje krótkotrwałą sensytyzację, natomiast pięciokrotne sensytyzację długotrwałą (Lee 2008). Rysunek 2: Schemat badanego układu nerwowego Aplysii (na postawie Purves, 2004). 4
W sensytyzacji krótkotrwałej serotonina za pośrednictwem białka G 3 stymuluje produkcję camp, aktywującego kinazę PKA 4 (Protein Kinase A) (rys. 3), która fosforyluje kanały potasowe typu S, zmniejszając ich prawdopodobieństwo otwarcia i przedłużając depolaryzację (Lee 2008, Hawkins 2006, Kandel 2000). Przedłużona depolaryzacja umożliwia napływ większej ilości jonów wapnia do komórki, co ułatwia fuzję pęcherzyków synaptycznych z membraną (np. poprzez aktywację synaptotagminy, wiążącej pęcherzyk z membraną) (Purves 2004). Dłuższa czynność interneuronu, aktywuje kinazę PKC (Protein Kinase C) (rys. 12), która podobnie jak PKA zwiększa napływ wapnia do komórki, a ponadto zdejmuje z synapsy depresję (Hawkins 2006). Ten drugi efekt zachodzi niezależnie od regulacji napływu wapnia i opiera się na uruchomieniu nieczynnych pęcherzyków synaptycznych. Indukcja szlaku zależnego od PKC powoduje, że aktywność PKA przestaje mieć krytyczne znaczenie i sensytyzacja pojawia się nawet w obecności jej inhibitorów (Hawkins 2006). Ponadto, pojawia się zależność od postsynaptycznego wapnia, gdyż sensytyzację można pomniejszyć jego postsynaptyczną chelatacją (Hawkins 2006). Uwalnianie wapnia w motoneuronie zachodzi przy udziale wewnętrznych cystern IP 3 oraz rianodynowych i skutkuje osadzeniem nowych receptorów glutaminianu AMPA 5 w membranie (Glanzman 2006). Kilkukrotna stymulacja serotoniną (zazwyczaj 5 pulsów) (Kandel 2000, Lee 2008) 3 Białka G są specjalnymi wewnątrzkomórkowymi sygnalizatorami, kowalencyjnie związanymi z lipidami błony komórkowej. Wyróżnia się wśród nich dwie rodziny: białka trimeryczne, z podjednostkami αβγ oraz białka monomeryczne. Z receptorami membranowymi sprzęgają się raczej białka trimeryczne. Pod wpływem agonisty GTP wypiera GDP z podjednostki G α, i G α oddysocjowuje od G βγ. Obie podjednostki pozostają przy tym zakotwiczone w membranie, a G α może aktywować białko efektorowe, np. cyklazę adenylową. W tym okresie GTP hydrolizowany jest do GDP, białko efektorowe dezaktywuje i w krótkim czasie białko G tworzy powrotnie kompleks G αβγ.różnorodność wariantów podjednostek trimerycznych białek G umożliwia specyficzną sygnalizację. Drugą klasę białek G stanowią białka monomeryczne, np. Ras, które przyłączają się do aktywnego receptora dopiero z pomocą białka adaptorowego. Podobnie jak w przypadku białek trimerycznych, aktywacja polega na zamianie związanego GDP na GTP i oddysocjowaniu od receptora i aktywacji efektora. Odłączenie GTP wyłącza efektor (Hames 2010). 4 Kinazy to enzymy przyłączające grupy fosforanowe do białek. PKA jest szczególnym rodzajem takiego enzymu, aktywowanym camp 5 Receptory aktywowane kwasem α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowym, które są podstawowymi receptorami glutaminianu w synapsach pobudzajacych (Purves 2002, Dingledine 1999). Nazwa receptora pochodzi od zastępczego agonisty selektywnie aktywującego ten rodzaj receptora. Receptor składa się z czterech podjednostek GluR (warianty GluR1-4, zazwyczaj występują asocjacje GluR1/GluR2 lub GluR2/GluR3) (Shepard 2007). Obecność GluR2 w strukturze AMPA powoduje, że jest ona nieprzepuszczala dla jonów wapnia (Squire 2008). 5
przedłuża okres zwiększonej koncentracji camp i uruchamia czynniki transkrypcyjne (Kandel 2000). Umożliwiają onę ekspresję genów, które utrwalają zmiany w rozmiarach stref aktywnych synapsy (Bailey 1989) oraz stymulują wytwarzanie nowych żylakowatości synaptycznych (varicosities) (Bailey 1989, Hawkins 2006). Rysunek 3: Aktywacja PKA: serotonina wiążąc się z receptorem uwalnia białko G, stymulujące cyklazę adenylową, która produkuje camp, aktywujące PKA i odsłaniające jej centra katalityczne K. Regulacja ekspresji genów rozpoczyna się zależną od camp kinazą PKA, która rekrutuje kinazę mitogenową (MAPK, Mitogen Activated Protein Kinase) i przenika wraz z nią do jądra (Lee 2008). Z uwagi na znaczne odległości między synapsą i jądrem komórkowym, translokacja wymaga prawdopodobnie działania transporterów importynowych (Lee 2008, Thompson 2005). W jądrze kinazy oddziałują z czynnikami transkrypcyjnymi CREB (camp Response Element Binding Protein): PKA aktywuje nadrzędny czynnik transkrypcyjny CREB-1 (poprzez fosforylację jego domeny KID, Kinase Inducible Domain), natomiast MAPK unieczynnia jego represor CREB-2 (Kandel 2000, Lee 2008) oraz fosforyluje niezbędne do prawidłowego działania CREB-1 białko CBP (CREB Binding Protein) (Sharma 2004). CBP ułatwia dostęp do struktury DNA dzięki acetylacji histonów i bez niego transkrypcja inicjowana CREB jest mało efektywna (Alberini 2009). Ponadto poprzez helikazę RNA CBP pośrednio stymuluje polimerazę RNA typu II i może odwracalnie modyfikować lokalną strukturę chromatyny (Nakajima 1997). 6
CREB należy do rodziny czynników bzip (Lonze 2002, Alberini 2009, Borlikova 2009), charakteryzującej się obecnością suwaka leucynowego, umożliwiającego ich dimeryzację. Suwak (rys. 14) poprzedzony jest obszarem zasadowym, dopasowanym (w przypadku CREB) do sekwencji CRE w DNA (TGACGTCA) i razem z nim stanowi domenę bzip 6. Po podłączeniu do CRE, CREB z pomocą domen Q2, Q1 oddziałuje z ogólnymi czynnikami TFIID, TFIIB 7 (Alberini 2009), a za pośrednictwem helikazy RNA zaczepionej w CBP oddziałuje pośrednio z polimerazą RNA typu II (Nakajima 1997) i rozpoczyna transkrypcję (rys. 4). Kinaza MAPK równolegle z czynnością w jądrze fosforyluje też powierzchniowe białka adhezyjne apcam (Aplysia Cell Adhesion Molecule) prowadząc do ich internalizacji (Kandel 2000). W ten sposób rozluźniane są przebiegające równolegle pęki aksonów (Washbourne 2004) i możliwy staje się wzrost nowych żylakowatości (konieczna jest jeszcze jądrowa sygnalizacja, ograniczająca produkcję nowych apcam Squirre 2008). Rysunek 4: Schemat aktywacji transkrypcji przez CREB na podstawie (West 2001). RHA oznacza helikazę RNA typu A i wiąże pośrednio CBP z polimerazą RNA typu II. W kompleksie kasety TATA zaznaczone są tylko domeny istotne dla wyjaśnienia roli CREB. Transkrypcja w pierwszej fali generuje hydrolazę ubikwityny, która usuwa z PKA sekwencję regulatorową, utrwalając jej czynność katalityczną (Kandel 2000). Generowane są również czynniki 6 Skrót pochodzi od angielskich określeń obszaru zasadowego (Basal region) i suwaka leucynowego (leucine ZIPper). 7 Ogólne czynniki transkrypcyjne umożliwiają odpowiednie zamocowanie polimerazy RNA na nici DNA. Pierwszy przyłącza się TFIID, który zawiera domenę TBP (TATA box binding protein). Jego połączenie stabilizuje następnie TFIIA, po czym przyłącza się TFIIB, który umożliwia przyłączenie polimerazy RNA (uprzednio związanej z czynnikiem TFIIF). Ostatnie przyłączają się TFIIE oraz TFIIH inicjujące transkrypcję. Ten ostatni jest helikazą i rozplata DNA, a fosforylując polimerazę RNA umożliwia jej oddysocjowanie od kompleksu inicjacyjnego i rozpoczęcie transkrypcji (Hames 2010). 7
transkrypcyjne dla kolejnej fali transkrypcji. Są to białka C/EBP (czynniki transkrypcyjne oddziałujące z sekwencjami wzmacniającymi CCAAT CCAAT Enhancer Binding Protein), odpowiadające m.in. za ekspresję translacyjnych czynników elongacyjnych (np. EF1α), docelowo umożliwiających budowę nowych połączeń synaptycznych (Kandel 2000). Długotrwała habituacja Obecne badania długotrwałej habituacji pokazują (Esdin 2010, Glanzman 2009), że zjawisko to, podobnie jak długotrwała sensytyzacja, jest zależne od transkrypcji i syntezy białek, a oprócz zmian presynaptycznych wymaga aktywacji receptorów glutaminianergicznych NMDA 8 i AMPA, oraz fosfataz w motoneuronie (Glanzman 2006). Takie zdarzenia mogą prowadzić do długotrwałego osłabienia synaptycznego motoneuronu, podobnego jak w hipokampie (zob. paragraf o LTD w hipokampie). Osłabienie synaptyczne motoneuronu w jakiś sposób przenosi się następnie na neuron presynaptyczny, gdyż obserwacje pokazują zmiany w ilości kontaktów i pęcherzyków synaptycznych w toku LTH (Kandel 2000, Glanzman 2009). Obecnie niestety nie jest znany sygnalizator takiego przejścia (Glanzman 2009). 8 Aktywowanych kwasem N-metylo-D-asparaginowym. 8
LTP w hipokampie Hipokamp od kilkudziesięciu lat uważany jest za siedlisko pamięci. Już w 1957 Milner odkrył, że chirurgiczne usunięcie płatów skroniowych skutkuje pojawieniem się amnezji (Milner 1957). Późniejsze badania dokładnie określiły rolę hipokampa jako struktury, odpowiadającej za pamięć epizodyczną. Istnienie takiej pamięci o ograniczonej trwałości jest konieczne do buforowania nadchodzących informacji i umożliwia ich staranne (powolne) zakodowanie w korze mózgowej bez interferencji z poprzednimi wspomnieniami (Gluck 1997). Modele funkcjonowania hipokampa opierają się na asocjacyjnej, rekurencyjnej sieci neuronowej odpowiadającej układowi komórek piramidowych CA3 (rys. 7). Komórki CA3 przyjmują informację wejściową z włókien kiciastych, a ich wyjścia w 4% wykazują wymaganą dla sieci asocjacyjnej rekurencję (tzn. kierują się z powrotem do komórek CA3) (Gluck 1997). Badania plastyczności synaps w neuronach ssaków wiążą się nieodzownie z eksperymentami Tima Blissa i Terje Lomo, którzy jako pierwsi zaobserwowali efekt długotrwałego wzmocnienia synaptycznego u ssaka (królika) (Bliss 1973). Pomiarów dokonano w hipokampie żywego zwierzęcia, podłączając mikroelektrodę stymulującą do włókien kory węchowej, pobudzających komórki ziarniste w zakręcie zębatym, gdzie umieszczono elektrodę pomiarową. Eksperyment polegał na stymulacji włókien bodźcami o częstotliwości 15Hz przez 15 sekund. W przykładowym protokole 4 stymulacji rozdzielonych około godzinnymi odstępami, autorzy uzyskali wzmocnienie wyładowań grupowych 9 na poziomie 300% stanu wyjściowego przy równoczesnym spadku latencji wyładowania z 4 do 3ms (rys. 8, 9). Istotnie wzrosła szybkość narastania zbocza impulsu, a całe zjawisko wzmocnienia utrzymywało się przez kolejnych kilka godzin. Z dzisiejszej perspektywy wiemy, że efekty te należy przypisać usprawnieniu funkcjonowania glutaminergicznych kanałów jonowych neuronu; łatwiejsze ich otwieranie zwiększa liczbę wyładowań grupowych, a ułatwienie przepływu jonów zwiększa szybkość 9 W tej konfiguracji elektroda pomiarowa zbiera zewnątrzkomórkowo potencjały z sąsiadujących neuronów: rejestrowana amplituda jest tym większa im więcej aktywuje się neuronów. 9
narastania impulsu (Dingledine 1999). Rysunek 6: Schemat sieci neuronalnej hipokampa. Włókna wejściowe kory węchowej stymulują komórki ziarniste zakrętu zębatego, które poprzez włókna kiciaste pobudzają komórki piramidowe CA3. Komórki CA3 z kolei pobudzają komórki CA1, a także rekurencyjnie siebie same. Rysunek 7: Schemat neuronalnej sieci asocjacyjnej hipokampa W kolejnych latach trudności związane z podłączaniem elektrod do żywego królika skłoniły badaczy ku doświadczeniom na skrawkach mózgowych z hipokampa. Najdogodniejszym obszarem badań stały się synapsy kolaterali (bocznic) Schaffera (wybiegających z komórek CA3) z komórkami piramidowymi CA1 (Purves 2004, Byrne 2009). Synapsy te standardowo pobudzano do wzmocnienia synaptycznego kilkoma bodźcami tężcowymi (tetanic stimulation) na kolateralach o częstości 100Hz i czasie trwania 1s (Byrne 2009) lecz szybko zorientowano się, że taka stymulacja ma niewiele wspólnego z rzeczywistymi sygnałami w mózgu i opracowano bardziej fizjologiczne metody indukcji LTP. Należą do nich stymulacja o częstotliwości fal teta, TFS Theta Frequency Stimulation gdzie przez 30s podaje się bodziec o częstości 5Hz oraz TBS Theta Burst Stimulation w której wykorzystuje się pobudzanie seriami 4 pulsów częstości 100Hz z obwiednią 5Hz (Byrne 2009, Bermudez-Rattoni 2007, Lynch 2004). Podobne sygnały można zaobserwować w żywym hipokampie lecz wciąż trzeba pamiętać o tym, że w skrawkach warunki temperaturowe i środowiskowe (np. obecność modulujących związków chemicznych) są inne niż w żywym 10
zwierzęciu, i wnioski z obydwu rodzajów eksperymentów nie muszą się pokrywać 10 (Byrne 2009). Rysunek 8: Ilustracja przebiegu LTP (na podstawie Bliss, 1973): widoczne ułatwienie Rysunek 9: Zmiany przebiegu przewodnictwa neuronalnego (ilości neuronów impulsu po LTP (na podstawie Bliss, uruchomianych stymulacją włókna wejściowego). 1973). Widoczne zwiększenie nachylenia zbocza po LTP (linia ciągła), oznaczające zwiększenie przewodności jonowej błony Molekularne zasady indukcji LTP postsynaptycznej. Długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w komórkach piramidowych CA1 hipokampa wywoływane jest skoordynowanym działaniem receptorów AMPA, biorących udział w ich depolaryzacji oraz działaniem receptorów NMDA, wykrywających Hebbowską koincydencję między aktywnością synapsy, a globalną depolaryzacją neuronu. Aktywność synaptyczna pobudza kanały jonowe receptorów AMPA do przewodzenia, umożliwiając podniesienie potencjału neuronu poprzez wprowadzenie do jego wnętrza jonów sodu. Pojedynczy receptor AMPA zmienia potencjał membrany w zakresie ułamków mv co powoduje, że do osiągnięcia pełnej depolaryzacji konieczna jest zgodna współpraca wielu receptorów oraz odpowiednio silna stymulacja synaptyczna. Gdy membrana komórki osiągnie odpowiedni potencjał, stymulacja glutaminianergiczna może włączyć kanały receptorów NMDA 11. Kanały te w stanie spoczynku blokowane są jonami magnezu 12, lecz 10 Już sam wpływ temperatury ciała, wyższej od temperatury laboratorium może znacznie zmieniać szybkość zachodzenia zmian plastycznych (Byrne 2009). 11 Aby zrozumieć zgodność tego mechanizmu włączania kanału receptora NMDA z regułą Hebba należy pamiętać, że depolaryzacja komórki może być dyktowana czynnością receptorów AMPA należących niekoniecznie do tej samej synapsy co NMDA. Dlatego depolaryzacja koreluje z aktywnością wyjściową neuronu i odzwierciedla sumaryczny wkład aktywności na wszystkich synapsach. Jeśli synapsa NMDA o małej wadze koreluje z takim sygnałem to jej waga stopniowo będzie powiększana. 11
w trakcie depolaryzacji zgromadzony w komórce ładunek dodatni wypycha magnez na zewnątrz i kanały w obecności glutaminianu otwierają się dla dla jonów wapnia, pełniących kluczową rolę w aktywacji przemian związanych z LTP (Dingledine 1999, Purves 2004). Rysunek 10: Schemat indukcji LTP. A. aktywność receptorów AMPA prowadzi do depolaryzacji komórki, B. dodatni ładunek zgromadzony w komórce wypycha blokujący jon magnezu receptora NMDA, C. kanał NMDA wprowadza do komórki wapń i D. wapń indukuje kaskady przemian plastycznych. Przebieg LTP może być dodatkowo uzupełniany czynnością receptorów metabotropowych mglur (Lynch 2004), które pod wpływem glutaminianu aktywują fosfolipazę PLC, odgrywającą istotną rolę w regulacji działania kinazy białkowej typu C (PKC, Protein Kinase C). Ten szlak sygnalizacyjny nie zawsze jest wymagany w indukcji LTP, ma natomiast znaczenie w długotrwałym wzmocnieniu synaptycznym receptorów NMDA (zob. też niżej role kinaz PKC i CAMKII) (Lynch 2004). E-LTP W początkowym okresie wzmocnienia (faza E-LTP, Early LTP), napływ wapnia do komórki aktywuje kinazy odpowiedzialne za potranslacyjne modyfikacje białek biorących udział w transmisji synaptycznej. Aktywacji podlegają przede wszystkim kinaza zależna od wapnia i kalmoduliny CAMKII oraz kinaza PKC, choć ważne role odgrywane są też przez PKA i kinazy tyrozynowe (Byrne 2009). CAMKII stanowi ok.1-2% całkowitej ilości białka w neuronie i jest 12 Średnica uwodnionego jonu to 0.64nm, średnica kanału 0.6nm (Dingledine 1999). 12
szczególnie obfita w zagęszczeniu postsynaptycznym (PSD, Post-Synaptic Density), co czyni z niej idealny cel dla napływających jonów wapnia (Fink 2002, Lynch 2004). Kinaza występuje w postaci holoenzymów, zawierających 10-12 jednostek enzymu połączonych częścią asocjacyjną i ułożonych w dwa pierścienie (Means 2000). Jej aktywacja zależy od kalmoduliny (CaM), która wiążąc cztery jony wapnia, odsłania hydrofobowe miejsca aktywne (McCue 2010), umożliwiające wyprowadzenie kinazy ze stanu autoinhibicji (rys. 11). Odsłonięta domena autoinhibitora może być fosforylowana sąsiednimi kinazami holoenzymu (na thr-286), a gdy tak się stanie, powinowactwo kinazy do CaM znacznie wzrasta i kinaza niechętnie się go pozbywa. Ponadto, nawet po utracie CaM bardzo utrudniony staje się powrót kinazy do stanu nieaktywnego. CAMKII może więc zapamiętywać przejściowe sygnały wapniowe i stanowi rodzaj,,pamięci molekularnej'' w indukcji LTP (Means 2000, Berridge 2008). PKC aktywowana jest inaczej i oddziałuje przy tym z membraną. Kinaza zawiera trzy ważne domeny: C 1, wiążącą diacyloglicerol, C 2, wiążącą wapń oraz domenę C 4 z centrum katalitycznym (rys. 12). Centrum katalityczne w stanie nieaktywnym jest blokowane pseudosubstratem, lecz związanie wapnia w domenie C 2 umożliwia kinazie przyłączenie do błony postsynaptycznej, gdzie może związać domenę C 1 z diacyloglicerolem (DAG). Związanie z DAG wymusza zmianę konformacyjną, która usuwa pseudosubstrat z miejsca katalitycznego PKC i aktywuje kinazę (Goedhart 2009, Berridge 2008). Rola DAG w aktywacji PKC umożliwia wskazanie szlaku sygnalizacji dla receptorów mglur, które są sprzężone z fosfolipazą typu C (PLC, Phospholipase C), rozkładającą membranowe fosfolipidy PIP 2 (4,5 difosforan fosfatydyloinozytolu) na dwie cząstki potomne: trifosforan inozytolu IP 3 i właśnie diacyloglicerol. 13
Rysunek 11: Schemat aktywacji CAMKII. W obecności jonów wapnia kalmodulina ulega aktywacji i odsłania hydrofobowe łatki. Następnie wiąże się z CAMKII (w punkcie C), odwijając jej ramię, które utrzymywało miejsce katalityczne K w stanie autoinhibicji. Aktywna kinaza może fosforylować sąsiednią aktywną jednostkę CAMKII i zablokować czynność autoinhibitora A, uniezależniając się od wapnia. Rysunek 12: Aktywacja PKC: pod wpływem PLC, fosfolipid PIP2 rozpada się na IP3 oraz DAG. IP3 służy sygnalizacji do wewnętrznych cystern wapniowych, natomiast DAG bierze czynny udział w aktywacji PKC. PKC normalnie jest w stanie nieaktywnym. Po związaniu wapnia w jednostkę C2, może przyłączyć się do membrany, gdzie jednostka C1 może związać się z DAG. Kiedy to się stanie, pseudosubstrat usuwany jest z katalitycznej jednostki C4 i kinaza staje się aktywna. Uaktywnione kinazy fosforylują receptory glutaminianu AMPA i NMDA oraz regulują czynność fosfatazy PP1. Receptory AMPA podlegają fosforylacji na serynie-831 oraz 845 jednostki GluR1 (Byrne 2009). Seryna-831 regulowana jest czynnością PKC lub (zamiennie) CAMKII i odpowiada za zwiększanie przewodności kanału jonowego receptora. Seryna ta nie jest dobrze dopasowana ani do PKC ani do CAMKII i do aktywacji wymaga silnej stymulacji synaptycznej (Lee 2006, Dingledine 1999, Barria 1997, Byrne 2009). Seryna-845 może być fosforylowana za 14
pośrednictwem PKA (kinaza białkowa zależna od cyklazy adenylowej) i odpowiada za wydłużenie czasu otwarcia kanału receptora AMPA oraz ułatwienie w dostarczaniu cytoplazmatycznych receptorów AMPA do membrany (Lee 2006, Oh 2006, Dingledine 1999). Aktywność PKA wiąże się z czynnością receptorów NMDA, które na 10-15 minut po stymulacji podnoszą stężenie camp w dendrycie (Roberson 1996). Receptory NMDA są fosforylowane kinazami tyrozynowymi (głównie src), zwiększającymi czas otwarcia podlegających im kanałów jonowych oraz PKC, która zwiększa prawdopodobieństwo otwarcia tych kanałów i zmniejsza ich powinowactwo do jonów magnezu 13 (Dingledine 1999, Lynch 2004). Czynność fosfataz regulowana jest pośrednio za pomocą inhibitora I-1, aktywowanego czynnością PKA (rys. 13) (Byrne 2008). Aktywny inhibitor blokuje fosfatazę PP1 (Protein Phosphatase 1), ułatwiając na pół godziny fosforylację kinaz CAMKII, receptorów AMPA i czynników transkrypcyjnych (Genoux 2002). L-LTP Rysunek 13: Współzawodnictwo między PKA i PP2B w aktywacji I-1, a tym samym w regulacji czynności fosfatazy PP1. Zależne od kinaz E-LTP rozpoczyna się ok 10-20 minut po pojawieniu bodźca i utrzymuje się przez następne 2 godziny, po czym zaczyna wygasać (Bermudez-Rattoni 2007, Lynch 2004, Frey 1988). Do dalszego podtrzymania wzmocnienia synaptycznego konieczna jest synteza białek (do 4 dni, LTP2) i synteza połączona z transkrypcją (do 23 dni, LTP3) (Lynch 2004). Zjawiska te określane są ogólnie mianem LTP późnej fazy, L-LTP (Late LTP) i generują zmiany utrzymujące się przez wiele tygodni, a nawet miesięcy (Squire 2008). W tym okresie zachodzi konsolidacja 13 Wyjaśnia to wspomniany wcześniej efekt modulacji LTP receptorów NMDA przez PKC. 15
systemowa pamięci i trwałe przepisanie jej z hipokampa do kory mózgowej. Proces ten uwidacznia się już po tygodniu od indukcji LTP a kończy się po upływie miesiąca w przypadku kontekstowego warunkowania strachem u szczura 14 (Dudai 2004). Transkrypcja, podobnie jak w przypadku Aplysia, wiąże się z uruchomieniem czynnika CREB w jądrze, lecz jego aktywacja nie następuje wyłącznie dzięki PKA i MAPK, a dochodzi do tego zależność od kinaz kalmodulinowo wapniowych CAMKIV i CAMKII (Smolen 2006, Davies 2004). CAMKIV aktywuje się podobnie do CAMKII (wiązanie CaM, następnie autofosforylacja wzmagająca aktywność katalityczną), lecz aby uzyskać niezależność od kalmoduliny i wapnia, kinaza ta musi zostać fosforylowana (na thr-177) pomocniczą kinazą aktywowaną obecnością kalmoduliny/wapnia CAMKK (CAMK Kinase) (Davies 2004, Means 2000). MAPK (kinaza mitogenowa, podtypy ERK1 i ERK2; External Responese Kinase) aktywuje się wieloetapowo: wapń i fosfataza SHP2, aktywują białko Ras (Pagani 2009, Yamamoto 1999), aktywujące kinazę Raf, aktywującą kinazę MEK (MAP-ERK Kinase), która aktywuje końcowe kinazy ERK1 i ERK2 15 (Extracellular Regulated Kinase) (Bronchud 2008, Molina 2006). Po przejściu do jądra CAMKIV fosforyluje CREB (na serynie 133 domeny KID 16 ) i CBP, umożliwiając im utworzenie kompleksu. Kompleksy CREB-CBP inicjują transkrypcję, lecz do ukończenia procesu wymagana jest jeszcze obecność kinazy MAPK, która ze względu na powolną aktywację, pojawia się w jądrze (z pomocą PKA) później niż CAMKIV i prawdopodobnie przedłuża fosforylację CREB w końcowych fazach transkrypcji (Davies 2004). Produkty transkrypcji rozchodzą się następnie po całej komórce, wywołując w aktywnych synapsach zmiany plastyczne. Selektywność wobec synaps aktywnych (a nie wszystkich możliwych) wyjaśnia hipoteza znakowania synaptycznego (Lonze 2002, Smolen 2006), wedle której w tych synapsach po 14 Jakość przepisania pamięci z hipokampa do kory mierzona była w odpowiedzi na uszkodzenie hipokampa. 15 Co ciekawe, początkowy etap indukcji MAPK w LTP jest czuły na zakłócanie kolejnymi cyklami uczenia (u muszki owocowej w parowaniu zapachu z podrażnieniem elektrycznym). Kolejna prezentacja bodźca powoduje wyzerowanie poziomu MAPK i rozpoczęcie procesu narastania jej koncentracji od nowa. W ten sposób Pagani (Pagani 2009) dotarł do jednej z molekularnych przyczyn efektu powtórki. 16 CAMKII nie nadaje się do tego, gdyż równocześnie fosforyluje hamującą serynę 142 16
pobudzeniu pojawia się znacznik zezwalający na dokonywanie w nich zmian strukturalnych. Takiego znacznika nie ma w synapsach nieaktywnych. Badania (cytowane za Smolen 2006) wskazały przynajmniej trzy kinazy generujące znaczniki: są to CAMKII, MAPK i PKA 17. W ten sposób odnajdujemy miejsce dla CAMKII w L-LTP. Długotrwałe osłabienie synaptyczne w hipokampie: LTD zależne od NMDA Oprócz wzmocnienia synaptycznego, w hipokampie możliwe jest również długotrwałe osłabienie synaptyczne (Long Term Depression, LTD) (Dudek 1992, Byrne. 2009, Purves 2004). Wywołać je można za pomocą dwóch ścieżek: lepiej poznanej, zależnej od receptorów NMDA oraz słabiej poznanej, zależnej od metabotropowych receptorów mglur (Byrne 2009). LTD zależne od aktywności NMDA wywołuje się przedłużoną stymulacją niskoczęstotliwościową, np. w przypadku synaps kolaterali Schaffera z neuronami CA1 stosowana jest stymulacja 1Hz przez 10-15 minut (Dudek 1992, Purves 2004). Taka powolna stymulacja nie wywołuje depolaryzacji błony postsynaptycznej (utrudnione jest sumowanie czasowe sygnałów), co odzwierciedla anty-hebbowskie warunki uczenia (Lisman 1989, Bryne 2009). Podniesienie częstotliwości ponad 10Hz przy tej samej ilości impulsów wywołuje LTP (Dudek 1992, Byrne 2009). Ta dualność w kierunku przemian plastycznych przewidziana była już w 1982 roku przez teorię BCM (sformułowaną przez Bienenstocka, Coopera i Munro), rozwiniętą w genialny sposób przez Lismana. Według niej zmiany plastyczne w neuronie skutkują wzmocnieniem siły synapsy tylko jeśli jej pobudzenie postsynaptyczne (stężenie jonów wapnia) przekracza pewną wartość progową. Jeśli pobudzenie jest podprogowe (ale niezerowe), siła synapsy ulega osłabieniu (Lisman 1989). Doświadczenia pokazały, że stężenie wapnia rzeczywiście wpływa na kierunek zmian plastycznych, a wapń pojawia się w komórce w odpowiedzi na aktywację receptorów NMDA (Dudek 1992). Wydawało się zatem, że teoria BCM została potwierdzona, a jednak bez 17 CAMKII i MAPK fosforylują znane substraty, a substrat PKA nie jest obecnie znany (Smolen 2006). 17
dodatkowych modyfikacji nie mogła objaśnić otrzymanych kilka lat później wyników zespołu Zuckera, w których krótkie impulsy wapnia o niskiej koncentracji (np. 0.7µmoll -1, przez 10s) z podobnym prawdopodobieństwem indukowały LTP lub LTD (Yang 1999). Rozwiązanie problemu wiązało się z uwzględnieniem szybkości sygnalizacji wapniowej. LTP najskuteczniej można wywołać bodźcami 10µmoll -1 o czasie trwania 3 sekund, natomiast LTD bodźcami 0.7µmoll -1, utrzymującymi się przez 60 sekund (Byrne 2009, Yang 1999). Takie charakterystyki czasowe stężenia wapnia mogą być w neuronie generowane dzięki obecności dwóch podtypów receptorów NMDA: szybkich NR1-NR2A oraz wolnych NR1-NR2B (Bliss 2004). NR1-NR2B charakteryzują się stałą czasową inaktywacji ok. 300ms, natomiast NR1-NR2A 50ms. Z tych dwóch tylko receptory NR2B nadają się do sumowania wolnych sygnałów, wywołujących LTD (tylko one pamiętają poprzedni impuls gdy nadchodzi następny). Ponieważ tych receptorów jest mniej niż NR2A, ich aktywacja skutkuje mniejszym napływem wapnia. Z kolei NR2A, choć aktywowane na krótko, przeważają w ilości nad NR2B i umożliwiają napływ większych ilości wapnia, promujących rozwój LTP. Przy niskich stężeniach wapnia w neuronie postsynaptycznym uaktywnia się kalcyneuryna (fosfataza białkowa PP2B). Mechanizm jej aktywacji podobny jest do CAMKII i również opiera się na przyłączeniu kalmoduliny związanej z jonami wapnia, lecz w porównaniu do CAMKII kalcyneuryna ma do kalmoduliny wyższe powinowactwo i łatwiej się aktywuje przy niskich stężeniach wapnia (Lisman 1989, Malenka,1995). Aktywna kalcyneuryna zdejmuje inhibitor I-1 z fosfatazy PP1, która defosforyluje seryny-845 jednostek GluR1 receptorów AMPA (normalnie fosforylowane przez PKA), umożliwiając ich internalizację. Defosforylacji podlegają także seryny- 831 18, lecz zabieg ten nie skutkuje LTD, a jedynie depotencjacją, tj. odwróceniem efektów poprzednio zaaplikowanego LTP (fosforylującego serynę-831 w celu zwiększenia przewodności AMPA) (Byrne 2009, Kemp 2001). Przy wysokich stężeniach wapnia sygnalizacja fosfatazami 18 Selektywność fosfataz względem substratów jest znacznie mniejsza niż w przypadku kinaz 18
przestaje funkcjonować być może dlatego, że występuje wówczas silna hiperfosforylacja CAMKII, wysycająca fosfatazę PP1 i redukująca jej aktywność (Miller 2005). Przeważa wtedy mechanizm LTP. LTD zależne od mglur Hipokampowe LTD zależne od receptorów metabotropowych mglur jest zjawiskiem zbadanym stosunkowo niedawno. Znane było wcześniej w komórkach Purkinjego w móżdżku, ale jego postać w hipokampie znacznie różni się od LTD w komórkach Purkinjego. Oprócz różnic w transdukcji sygnałów postsynaptycznych mechanizm ten opiera się na odmiennych elementach sygnalizacji presynaptycznej. Receptory mglur można podzielić na 3 grupy. Receptory grupy I (mglur1, mglur5), receptory grupy II (mglur2, mglur3) i receptory grupy III (mglur4,6,7,8 wśród których znaczenie dla LTD ma jedynie mglur7). Receptory grup II i III zlokalizowane są w błonach presynaptycznych (grupa II również postsynaptycznie) i reagują na emisję glutaminianu hamując (poprzez białko G i/o ) czynność cyklazy adenylowej (a co za tym idzie PKA) oraz aktywność kanałów wapniowych (Gladding 2009, Bellone 2008, zob. też Anjaneyulu 2008, Siegel 2006). Zmiany te prowadzą w konsekwencji do zmniejszenia prawdopodobieństwa uwolnienia neuroprzekaźnika z błony presynaptycznej. W tym procesie czułość receptorów grupy II na glutaminian jest wyższa niż receptorów grupy III. Receptory grupy I znajdują się w błonie postsynaptycznej. Zlokalizowane są na obrzeżach zagęszczenia poststynaptycznego (Bellone 2008) i wymagają aktywacji przez rozlanie neuroprzekaźnika poza szczelinę synaptyczną. Można to osiągnąć stymulacją wolnoczęstotliwościową sparowanych impulsów 19 (Glading 2009, Bellone 2008) albo cyklami wysokoczęstotliwościowej stymulacji w zakresie nawet do 300Hz. Ten rodzaj LTD można również wywołać poprzez parowanie stymulacji niskoczęstotliwościowej z depolaryzacją neuronu 19 900 sparowanych pulsów podanych częstotliwością 1Hz z odstępem między pulsami równym 50ms (Gladding 2009). 19
postsynaptycznego (jak w komórkach Purkinjego w móżdżku) (Bellone 2008). Z badań nad myszami wynika, że dla indukcji LTD w komórkach CA1 konieczna jest obecność mglur5 i w małym stopniu mglur1 20. Doświadczalne unieczynnienie mglur5 uniemożliwia rozwój LTD (Bellone 2008, Gladding 2009, Gereau 2008) natomiast blokada mglur1 osłabia wczesną fazę LTD (Gladding 2009) i upośledza wsteczną sygnalizację do neuronu presynaptycznego za pomocą endokanabinoidów (Gereau 2008). Sygnalizacja receptorów grupy I przebiega za pomocą białek G q w kierunku PLC, która stymuluje produkcję IP 3 i DAG. IP 3 uwalnia wapń z wewnętrznych cystern, a DAG aktywuje PKC (Bellone 2008). Zaskakujące jest jednak to, że LTD zależne od mglur wywoływane DPHG (dihydroksyfenyloglicyna, agonista receptorów mglur typu I) nie zależy od aktywności PKC (nic nie zmieniają inhibitory PKC) ani od zwiększonej koncentracji wapnia (wprowadzenie chelatorów wapnia nie wpływa na rozwój LTD) (Gladding 2009, Gereau 2008). Jednak w warunkach fizjologicznej transmisji synaptycznej zarówno obecność wapnia jak i aktywność PKC są dla indukcji LTD niezbędne (Bellone 2008, Gladding 2009). PKC może wówczas osłabiać synapsę poprzez stymulację kinaz mitogenowych, aktywację fosfolipazy D lub A 2 albo modulację czynności kanału kationowego (Gladding 2009). PKC może również fosforylować serynę 901 mglur5, utrudniając za pomocą CaM jego ekspresję w membranie (Gladding 2009). Niezależnie od PKC i wapnia, ścieżki sygnalizacyjne LTD mogą wykorzystywać białka łącznikowe, takie jak Homer (zob. tabela w paragrafie o IEG). Homer może wiązać mglur z kinazą tyrozynową receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGF, epidermal growth factor), która uaktywnia kinazę tyrozynową src, biorącą udział w aktywacji kinaz mitogenowych ERK (Gladding 2009). Homer może też łączyć mglur z GTP-azą PIKE 21, aktywującą kinazę PI3K 22, inicjującą 20 Dla porównania, w komórkach Purkinjego w móżdżku jest odwrotnie. Decydującą rolę odgrywa mglur1 (zob. paragraf o LTD w móżdżku). 21 PI3K Enhancer, aktywator kinazy PI3K 22 Kinaza fosfatydyloinozytolu. 20
translację białek poprzez fosforylację modulatorów 4E-BP 23 (Ronesi 2008, Gladding 2009). Poprzez kaskadę Rap, mglur może również aktywować kinazę p38mapk (Gladding 2009). Inną, bardziej lokalną możliwością sygnalizacji może być regulacja wiązania mglur1/5 z tratwami lipidowymi za pomocą kaweoliny, umożliwiająca internalizację jednostek mglur1/5 (Gladding 2009). 21 Czynność kinaz z rodziny MAPK i PI3K jest dla rozwoju LTD niezbędna i warunkuje endocytozę receptorów AMPA. Głównym ich zadaniem jest regulacja transkrypcji i translacji białek, co pokazywano na przykładzie myszy z nieobecnym białkiem FMRP (funkcjonującym jako represor translacji), u której LTD uległo wzmocnieniu (przy okazji stało się niezależne od syntezy białek Gereau 2008). Translacji podlegają m.in. białko Arc uczestniczące w endocytozie klatrynowej, fosfataza tyrozynowa STEP 24, która defosforyluje jednostkę GluR2 i promuje jej internalizację poprzez dyfuzję w grubości membrany (Gladding 2009), białko MAP1B (microtubule associated protein 1B białko 1B związane z mikrotubulami) wiążące się z GRIP 25 w celu oderwania go od receptora AMPA, Homer1a (białko tworzące niefunkcjonalny skielet Homer dla receptora mglur), białka wspomagające translację (białko rybosomowe S6, czynnik elongacyjny EF1A) oraz jednostki GluR2 receptora AMPA (Bellone 2008). Szlaki MAPK mogą ponadto aktywować kinazę białka rybosomowego S6 26 oraz już poza tematyką translacji m-kalpainy 27 skracające C-końce iglur 28, a być może proteolizujące receptory AMPA (Gladding 2009). LTD generowane przez receptory grupy I może być też wzmagane aktywnością receptorów grupy II, które istnieją zarówno w błonie presynaptycznej jak i postsynaptycznej. Ich aktywacja ze względu na własności obniżające aktywność PKA może wpływać na defosforylację receptorów AMPA (Bellone 2008). Ponadto, depresja synaptyczna zależy od wysyłania z neuronu 23 Białko 4E-BP jest białkiem wiążącym się z eukariotycznym inicjatorem translacji eif4e. Po związaniu, czynność eif4e zostaje zablokowana co blokuje translację. Fosforylacja 4E-BP umożliwia jego oddysocjowanie od eif4e (Sonenberg 1998). 24 Striatal enriched tyrosine phosphatase. 25 Glutamate Receptor Interacting Protein białko oddziałujące z receptorem glutaminianu 26 Może tego dokonywać również PI3K (Gladding, 2009) 27 W przebiegu LTD jest również miejsce dla proteaz serynowych: subtylizyny i kadepryny (Gladding, 2009). 28 iglur jonotropowy GluR
postsynaptycznego (aktywowanego receptorami typu I) do presynaptycznego endokanabinoidów, prowadzących do depresji presynaptycznej. Zazwyczaj czas takiego osłabienia synapsy jest mierzony ułamkami sekundy (Bellone 2008, Kano 2008). Aktywacja i modulacja czynności CREB Fosforylowany czynnik CREB po połączeniu z CBP przyłącza się do sekwencji CRE w DNA (TGACGTCA Lonze 2002) i poprzez interakcję domeny Q2 z TFIID/B oraz CBP z RHA umożliwia aktywację polimerazy RNA typu II (Alberini 2009, Nakajima 1997, zob. też rys. 4). Ponieważ jednostki CREB funkcjonują jako dimery, połączone suwakiem leucynowym, (rys. 14) ich aktywność może być modulowana pochodzącymi z tej rodziny 29 czynnikami CREM (camp Response Element Modulator) (Lonze 2002, Kaczmarek 2002). Rysunek 14: Struktura bzip: suwak leucynowy odpowiada za dimeryzację jednostek natomiast część zasadowa odpowiada za wiązanie z DNA Struktura genu CREM umożliwia ekspresję czterech podstawowych wariantów tego czynnika transkrypcyjnego. CREMτ jest aktywatorem transkrypcji, natomiast CREMα, CREMβ i CREMγ są jej inhibitorami (nie posiadają domen Q odpowiedzialnych za aktywację transkrypcji) (Silva 1998). Dodatkowym inhibitorem pochodzącym z genu CREM jest ICER (Inducible camp Early Repressor), który różni się od pozostałych swoją,,indukowalnością'', tzn. ekspresją w 29 CREB/ATF 22
odpowiedzi na aktywację CREB. Pozostałe modulatory CREM są ogólnodostępne w komórce. Ekspresja ICER osiąga maksimum po 2-6 godzinach od momentu indukcji, podobnie jak pozostałe białka kodowane genami odpowiedzi wczesnej (IEG, Immediate Early Genes). Czas utrzymywania się podwyższonej konentracji ICER jest dosyć długi, nawet powyżej 24h (Borlikova 2009). Po pierwszej fazie transkrypcji, w jądrze pojawiają się należące do klasy bzip czynniki transkrypcyjne C/EBP (czynniki wiążące się z sekwencją CCAAT, CCAAT Enhancer Binding Proteins, wspominane już u Aplysii). Rodzina ta zawiera sześciu członków C/EBPα,β,γ,δ,ε,ζ. Struktura tych białek na C-końcu zawiera suwak leucynowy, natomiast część N-końcowa różni się w zależności od izoformy i z reguły zawiera rozmaite domeny aktywujące transkrypcję (Ramji 2002). U ssaków bardzo ważnymi formami wydają się C/EBPβ oraz C/EBPδ, których koncentracja u szczurów zwiększa się po treningu reakcji unikania kontekstu związanego z podrażnieniem łapki. Ekspresja pojawia się w 6-9 godzin po treningu i utrzymuje się przynajmniej przez 28 godzin, opadając do poziomu wyjściowego dopiero po dwóch dobach (Alberini 2009). C/EBPβ jest niezbędny dla formowania pamięci długoterminowej w hipokampie, a jego blokada nawet w okresie powyżej jednego dnia od indukcji LTP uniemożliwia formowanie takiego rodzaju pamięci. C/EBPδ pełni hamującą rolę w kontekstowym warunkowaniu strachu (mutant nie posiadający tego genu uczy się szybciej) (Alberini 2009). C/EBPζ przez zniekształcenie w domenie bzip nie może wiązać się z sekwencją C/EBP w DNA, lecz zachowuje pełną zdolność dimeryzacji z pozostałymi członkami rodziny, pełniąc rolę inhibitora transkrypcji. W warunkach stresu może on się jednak przyłączać do alternatywnej sekwencji DNA, otwierając nową ścieżkę transkrypcji (Alberini 2009, Ramji 2002). C/EBPγ, podobnie jak C/EBPζ jest inhibitorem i nie zawiera domen aktywujących transkrypcję (Ramji 2002). C/EBP podlega wielostopniowej regulacji. Do funkcjonowania potrzebuje camp, który warunkuje jego translokację z cytoplazmy do jądra oraz fosforylacji, dokonywanej za pomocą kinaz MAPK, CAMKII-IV, PKC (Alberini 2009). Możliwa jest również autoregulacja transkrypcji, 23
stwierdzona na przykład dla C/EBPβ (Ramji 2002). Fos, Jun Wśród wtórnych czynników transkrypcyjnych obok C/EBP jądro komórkowe uwalnia również transkrypty z rodzin Fos i Jun, kodujące czynniki c-fos i c-jun. c-jun pojawia się w odpowiedzi na doświadczenia nowości, boleści i nagrody (zanika przy powtarzalnej prezentacji bodźca). Według badań, jego obecność jest obojętna dla uczenia przestrzennego i zadań warunkowania strachu (Alberini 2009). c-fos natomiast podlega ekspresji w uczeniu przestrzennym motywowanym apetytem, w uczeniu niechęci do smaku i w uczeniu pasywnego unikania. Podobnie jak c-jun, c-fos aktywuje się najsilniej w pierwszych próbach, a w kolejnych jego koncentracja systematycznie spada (Alberini 2009). Białka kodowane w rodzinach Fos i Jun należą do klasy bzip, mogą więc ze sobą dimeryzować. Dimery stają się aktywne transkrypcyjnie, tworząc klasę czynników transkrypcyjnych AP-1, rozpoznających w DNA sekwencję TGAC/GTCA. Zależnie od kombinacji dimerów, czynniki AP-1 mogą tak aktywować jak i hamować transkrypcję (Kaczmarek 1997). Zif268 mrna dla Zif268 pojawia się w zakręcie zębatym 30-60 minut po tężcowej stymulacji włókien kory węchowej, a jego ekspresja towarzyszy uczeniu asocjacyjnemu, warunkowaniu strachem, uczeniu przestrzennemu i wydaje się towarzyszyć doświadczeniu nowości. Wywołane mutacją wyłączenie genu Zif268 upośledza pamięć długoterminową, lecz deficyt ten można nadrobić intensywnym treningiem co sugeruje istnienie kompensujących szlaków sygnalizacyjnych (Alberini 2009, Knapska 2004). Zif268 należy do klasy czynników z palcami cynkowymi (rys. 15), które rozpoznają w DNA sekwencję GCGC/GGGGCG. Jego transkrypcja może być stymulowana poprzez CREB lub ELK- 1, który należy do grupy czynników aktywowanych surowicą (SRE Serum Response Element) (Knapska 2004). Wśród białek, które mogą być regulowane przez Zif268 wymienić można 24
synapsynę, lekkie łańcuchy neurofilamentów, receptory czynnika wzrostu nerwowego p75 i wiele enzymów zestawienie można znaleźć w (Knapska 2004). Aktywność transkrypcyjna Zif268 może być ograniczana w ujemnym sprzężeniu zwrotnym przez transkrypcję inhibitora NAB2 (Knapska 2004). Rysunek 15: Struktura palca cynkowego wg (Krishna 2003). Jon cynku stabilizuje jedną alfa helisę i dwie beta harmonijki. Obszar alfa-helisy wnika w szeroką bruzdę DNA. Zif268 i c-fos uzupełniają się w reagowaniu na zmiany w poziomie stymulacji komórki (Kaczmarek 1997). c-fos aktywuje się w doświadczeniu nowości, ma niską koncentrację wyjściową i niewrażliwy jest na zanikanie bodźców tła docierających do komórki, natomiast zif268 ma wysoką koncentrację wyjściową, która opada, gdy zanikają bodźce tła (np. po usunięciu wibrysów u szczura, Knapska 2004). NFκB NFκB jest czynnikiem transkrypcyjnym powszechnie obecnym w cytoplazmie. Normalnie jest zablokowany białkiem IκB, uniemożliwiającym lokalizowanie jądra komórkowego, ale po stymulacji blokujące białko degraduje (przypuszczalnie za pośrednictwem CAMKII) i NfκB może przedostać się do jądra. W jądrze aktywuje transkrypcję CAMKIIδ, BDNF (Brain Derived Neutrophic Factor), NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule; por. ApCAM w Aplysia), Nos (NO Synthetase), a także bierze udział w regulacji struktury chromatyny (Alberini 2009). IEG IEG, czyli Immediate Early Genes geny odpowiedzi wczesnej, podlegające 25
natychmiastowej transkrypcji w odpowiedzi na stymulację komórki. Wśród nich znajdują się omówione wyżej czynniki transkrypcyjne jak C/EBP, c-fos, c-jun czy zif268, ale również białka bezpośrednio biorące udział w przebudowie synaps. Białka pojawiające się w związku z LTP zestawione są w Tabeli 1 (wg Loebrich 2009 z uzupełnieniami). Białko SNK (Serum Regulated Kinase-kinaza regulowana serum) RGS2 (regulators of G protein Signaling regulatory sygnalizacji białkami G) BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor neurotropowy czynnik pochodzenia mózgowego) Narp (Neuronal activity regulated pentraxin, pentraksyna regulowana aktywnością neuronalną) CPG15 (Candidate plasticity gene 15 gen kandydujący plastyczności nr 15) Arkadlina (Activityregulated cadherin like protein regulowane aktywnością białko podobne do kadheryny) 26 Rola Reorganizacja cytoszkieletu F-aktyny w kolcach dendrytycznych, hamowanie reorganizacji cytoszkieletu przez SPAR, w efekcie eliminowanie kontaktów synaptycznych. SPAR, Spine Associated RapGAP (Rap GTP-ase Activating Protein) białko inaktywujące GTP-azę Rap, biorącą udział w zmniejszaniu ilości kolców synaptycznych (Pak 2001, Spilker 2010)] Wygłuszają sygnalizację białkami G. Hamują aktywację MAPK zależną od nikotynowych receptorów acetylocholiny (nachr), zwiększają presynaptyczne prawdopodbieństwo uwolnienia pęcherzyka synaptycznego przez osłabienie sygnalizacji zamykania kanałów wapniowych. Brak BDNF u mutantów osłabia LTP, czynnik wywołuje fosforylację receptorów NMDA. Receptory TrkB pod wpływem BDNF mogą aktywować CAMKIV i MAPK, a w konsekwencji CREB (zarówno post-, jak i presynaptycznie). (Bermudez-Rattoni 2007) Zwiększa siłę synapsy poprzez zewnątrzkomórkowe klastrowanie receptorów AMPA. Klastry są bardziej stabilne w membranie niż pojedyncze receptory ze względu na kompensującą się wzajemnie ruchliwość podjednostek (Shepherd 2007) Promuje wzrost dendrytów i aksonów, a także dojrzewanie synaps przez osadzanie funkcjonalnych receptorów AMPA Arkadlina należy do rodziny kadheryn (białek odpowiedzialnych za adhezję międzykomórkową) lecz posiada odcinek wewnątrzkomórkowy, oddziałujący z maszynerią postsynaptyczną. Po dostarczeniu do membrany arkadlina wiąże się z n-kadheryną i dzięki swemu zakończeniu wewnątrzkomórkowemu umożliwia internalizację białka. Nie ma jednoznacznego stanowiska odnośnie wpływu na pamięć: z jednej strony blokowanie arkadliny blokuje LTP, a z drugiej strony internalizacja promuje wzrost kolców dendrytycznych. (Yasuda 2007) Cyklooksygenaza 2 (COX-2) Produkuje cząstki dyfundujące poza membrane neuronu w celu dalszej sygnalizacji Arc (activity regulated cytoskeleton-associated protein-- białko związane z cytoszkieletem, regulowane Jego nieobecność wzmaga wczesną fazę LTP i niszczy późną fazę. We wczesnej fazie arc prowadzi do internalizacji receptorów AMPA, służąc prawdopodobnie jako adaptor, łączący receptor AMPA z białkami maszynerii endocytującej (Shepherd 2007). W