Czas. Stomatol., 2008, 61, 10, 704-710 2008 Polish Dental Society http://www.czas.stomat.net Wpływ cynku na obraz ultrastrukturalny ślinianki podżuchwowej u szczura* Influence of zinc on the ultrastructural image of the submandibular gland in rats Ewa Dąbrowska 1, Beata Szynaka 2, Elżbieta Kulikowska-Karpińska 3, Joanna Łapińska 1 Zakład Stomatologii Społecznej i Profilaktyki Uniwersytet Medyczny w Białymstoku 1 Kierownik: dr hab. n. med. E. Dąbrowska Zakład Patomorfologii Uniwersytet Medyczny w Białymstoku 2 Kierownik: prof. dr hab. L. Zimnoch Zakład Toksykologii Uniwersytet Medyczny w Białymstoku 3 Kierownik: prof. dr hab. J. Moniuszko-Jakoniuk Summary Introduction: Zinc is a bioelement which is essential for proper functioning of human systems and organs of the human body. It takes active part in physiological and pathological tissue processes. Aim of the study: To evaluate the influence of zinc administered in drinking water on the ultrastructural image of the submandibular salivary gland in rats. Material and methods: The study was carried out on 30 male Wistar rats aged 5-6 weeks, with initial body weight of 180-200 g. Animals in the control group drank clear water without zinc, while those exposed to the metal drank solutions of zinc chloride (ZnCl 2 ) in concentrations of 30 mg Zn/dm 3 and 60 mg Zn/dm 3. Ultrastructural investigation was performed on submandibular gland prepared from rats exposed to zinc chloride for 12 months. Conclusions: On the basis of obtained results it can be concluded that damage to mitochondrial and intracellular membranes in salivary gland cells determines the toxic effect of concentrated zinc on investigated submandibular salivary gland. Streszczenie Wprowadzenie: cynk jest biopierwiastkiem niezbędnym do prawidłowej czynności układów i narządów ustroju człowieka. Bierze on aktywny udział w procesach fizjologicznych i patologicznych tkanek. Cel pracy: oceniono wpływ cynku podawanego z wodą do picia na obraz ultrastrukturalny ślinianki podżuchwowej szczura. Materiał i metody: badania wykonano na 30 szczurach, samcach rasy Wistar w wieku 5-6 tygodni, o początkowej masie ciała 180-200 g. Zwierzęta z grupy kontrolnej otrzymywały wodę do picia nie zawierającą cynku, natomiast szczury z grup badanych, tzn. eksponowane na metal, piły wodne roztwory chlorku cynku (ZnCl 2 ) w stężeniach: 30 mg Zn/dm 3 i 60 mg Zn/dm 3. Materiał do badań ultrastrukturalnych stanowiły wypreparowane ślinianki szczurów eksponowanych na chlorek cynku przez 12 miesięcy. Podsumowanie: na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że uszkodzenie błon mitochondrialnych, błon wewnątrzkomórkowych w komórkach ślinianki i plazmolemie stanowi o istocie toksycznego oddziaływania wysokiego stężenia cynku na badany gruczoł ślinowy. KEYWORDS: submandibular salivary gland, zinc, rat HASŁA INDEKSOWE: ślinianka podżuchwowa, cynk, szczur *Praca prezentowana na Konferencji Naukowej: Środowisko a stan jamy ustnej. Postępy w diagnostyce i leczeniu chorób przyzębia i błony śluzowej jamy ustnej zorganizowanej w Białymstoku przez Sekcję Periodontologii PTS w dniach 18-20.IX.2008 r. 704
2008, 61, 10 Cynk a ślinianka podżuchwowa u szczura Wstęp Cynk obok miedzi, magnezu i żelaza jest pierwiastkiem niezbędnym do prawidłowego przebiegu wielu procesów metabolicznych w ustroju. Wchłanianie cynku odbywa się głównie w jelicie cienkim. Transport przez błonę śluzową jelita ułatwia kwas pikolinowy, który jest czynnikiem wiążącym i transportującym cynk [4]. Zmniejszone wchłanianie cynku występuje przy nadmiernej podaży wapnia, miedzi, żelaza i selenu. Zaobserwowano udział cynku w procesach odpornościowych. Wykazano, że cynk wpływa na czynność limfocytów T, hamuje wydzielanie histaminy przez komórki tuczne oraz hamuje replikację wirusów np. wirusa opryszczki Herpes simplex. Bierze też udział w stabilizowaniu błon komórkowych, dzięki czemu komórki stają się bardziej odporne na działanie toksyn [12, 13, 18]. Doniesienie Browninga [2] wskazuje na udział niedoboru cynku w patogenezie anoreksji. Do oceny wpływu metali ciężkich na organizm ludzki, ze względu na podobny metabolizm do metabolizmu ludzkiego, powszechnie wykorzystuje się model doświadczalny na zwierzętach, szczurach, samcach, rasy Wistar. Z punktu widzenia stomatologii szczególnie interesujące są metody oceniające morfologię komórek i tkanek, elementów narządu żucia w tym ślinianki podżuchwowej. Cynk jest pierwiastkiem, który uczestniczy w procesach zapalnych błony śluzowej tkanek przyzębia i zębów. Zęby mleczne z próchnicą zawierają więcej cynku w porównaniu z zębami bez próchnicy [14, 24]. Stwierdzone większe stężenia biopierwiastków cynku i magnezu w tkance dziąsłowej w zapaleniach przyzębia niż w zdrowej tkance dziąsłowej, mogą świadczyć o aktywnej roli cynku w procesach metabolicznych, zmienionych zapalnie tkanek miękkich, w tym miazgi zęba [5, 23]. Niedobór cynku może powodować zmiany w błonie śluzowej jamy ustnej w postaci zmian o typie parakeratozy [6]. Stąd należy przypisać rolę ochronną cynku w procesach zapalnych w jamie ustnej. Cel pracy Celem pracy była ocena wpływu cynku na obraz ultrastrukturalny ślinianki podżuchwowej szczura w zależności od stężenia i czasu jego ekspozycji. Materiał i metody Badania wykonano na 30 szczurach, samcach rasy Wistar w wieku 5-6 tygodni o początkowej masie ciała 180-200g. Przez cały okres doświadczenia szczury przebywały w tych samych warunkach środowiskowych. Były karmione pełnowartościową paszą granulowaną LSM o następującym składzie procentowym: białko ogólne 16%, popiół surowy 7,00%, włókno surowe 5,00%, tłuszcz surowy 2,80%, lizyna 0,80%, metionina + cystyna 0,50%, tryptofan 0,15%, wapń 1,10%, cynk 6,36x10-3%, fosfor 0,70%, sód 0,22%, kadm 1,2x10-5%. Zwierzęta miały nieograniczony dostęp do paszy i wody pitnej. Zwierzęta z grupy kontrolnej otrzymywały wodę do picia nie zawierającą cynku. Szczury z grup badanych, piły wodne roztwory chlorku cynku (ZnCl 2 ), w stężeniach 30 mg Zn/dm 3 i 60 mg Zn/dm 3. Zwierzęta badano w dwóch seriach w zależności od czasu ekspozycji na metal. Serię I stanowiły zwierzęta po 6 miesięcznej ekspozycji na cynk, serię II grupy zwierząt przy 12 miesięcznej ekspozycji na cynk. Zwierzęta badane podzielono na dwie grupy w zależności od stężenia podawanego cynku, w dwóch seriach badawczych zależnych 705
E. Dąbrowska i in. Czas. Stomatol., od czasu ekspozycji na metale (6 miesięcy i 12 miesięcy): grupa kontrolna (zwierzęta zdrowe) zwierzęta otrzymywały do picia wodę nie zawierającą cynku, grupa Zn30 zwierzęta otrzymywały cynk w stężeniu 30 mg/dm 3, grupa Zn60 zwierzęta otrzymywały cynk w stężeniu 60 mg/dm 3. Po zakończeniu ekspozycji w powyższych seriach, zwierzęta uśmiercano w stanie głębokiej narkozy wywołanej przez Vetbutal (Biovet, Polska), zgodnie z zaleceniami Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach. Na przeprowadzone badania uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach nr 3/2004. Materiał do badań stanowiły wypreparowane ślinianki podżuchwowe. Wykonano badania ultrastrukturalne pobranych tkanek. Natychmiast po uśpieniu szczurów ze ślinianki podżuchwowej pobierano po 4 skrawki o objętości około 1 mm 3. Utrwalano je w 3,6% roztworze aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym o ph 7,4, w temperaturze 4 C przez dwie godziny a następnie w 2% czterotlenku osmu na buforze Milloniga o ph 7,4. Wycinki odwadniano w mieszaninie roztworów etanolu i tlenku propylenu o wzrastającym gradiencie stężeń (do absolutnego) i zatapiano w Eponie 812. Eponowane bloczki skrawano na ultramikrotomie (Reichert-Yung Austria) do uzyskania półcienkich skrawków o grubości 0,5-1 µm. Preparaty barwiono błękitem metylenowym i dokonywano wstępnej oceny w mikroskopie świetlnym. Z wybranych wycinków sporządzano ultracienkie skrawki, które kontrastowano 2% octanem uranylu i cytrynianem ołowiu a następnie oceniano w mikroskopie elektronowym transmisyjnym OPTON 900 PC Germany [20]. Badania wykonano w Zakładzie Toksykologii i Zakładzie Patomorfologii Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Wyniki Grupa kontrola (zwierzęta zdrowe) Budowa ultrastrukturalna ślinianki podżuchwowej nie wykazywała odchyleń od normy. Komórki śluzowe miały owalne jądra zlokalizowane w przypodstawnej części komórki. W pobliżu jadra (N) znajdowały się równolegle ułożone kanały sieci endoplazmatycznej szorstkiej, aparat Golgiego oraz owalne lub wydłużone mitochondria (M) z licznymi grzebieniami oraz macierzą o średniej gęstości elektronowej. W centralnej i przyszczytowej części komórek znajdowały się liczne, zróżnicowane pod względem wielkości, jasne ziarnistości śluzowe wypełnione drobnoziarnistym materiałem. Błony komórkowe sąsiadujących komórek wpuklały się i zazębiały ze sobą tworząc liczne połączenia. Ponadto komórki łączyły się połączeniami desmosomalnymi (ryc. 1). Komórki pęcherzyków surowiczych miały jądra komórkowe okrągłe lub owalne położone centralnie lub przypodstawnie. Kanały sieci endoplazmatycznej szorstkiej były krótsze i mniej liczne niż w komórkach śluzowych. W Ryc. 1. Fragment komórki śluzowej ślinianki podżuchwowej szczura grupy kontrolnej serii I. Pow. 7000x. 706
2008, 61, 10 Cynk a ślinianka podżuchwowa u szczura pobliżu jadra komórkowego znajdowały się aparaty Golgiego oraz liczne nieco wydłużone w kształcie mitochondria. Większą część komórki wypełniały dość liczne ziarnistości wydzielnicze o wysokiej gęstości elektronowej. W zrębie pomiędzy pęcherzykami występowały liczne naczynka krwionośne i przewody wyprowadzające. Seria I (ekspozycja sześciomiesięczna) Grupa Zn30 W tej badanej grupie obraz ultrastruktury części gruczołowej i wyprowadzającej ślinianki podżuchwowej nie odbiegał od obrazu komórek ślinianki podżuchwowej z grupy kontrolnej. Grupa Zn60 Obraz ultrastrukturalny komórek ślinianki podżuchwowej tej grupy nie różnił się istotnie od obserwowanego w grupie kontrolnej. Zwracały jedynie uwagę liczne ziarnistości wydzielnicze, zarówno w komórkach cewek śluzowych jak i pęcherzyków surowiczych, skupione wokół świateł przewodów wyprowadzających o wygładzonej powierzchni szczytowej oraz mitochondria o nieco przejaśnionej macierzy M (ryc. 2). Seria II (ekspozycja dwunastomiesięczna) Grupy Zn30, Zn60 Obraz ultrastrukturalny komórek ślinianki podżuchwowej nie różnił się w sposób istotny od obserwowanego w grupie zwierząt kontrolnych. Zwracały uwagę nieco liczniejsze niż w grupie kontrolnej ziarnistości w komórkach cewek śluzowych oraz komórek pęcherzyków surowiczych. Obecne były również struktury parakrystaliczne ( ) charakterystyczne dla komórek śluzowych (ryc. 3). Omówienie wyników i dyskusja Cynk jest mikroelementem niezbędnym dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Istnieje duży margines między poziomem fizjologicznym i toksycznym cynku. W wyniku dodatkowej ekspozycji na cynk u zwierząt początkowo jest on deponowany w narządach miąższowych, wątrobie, trzustce, śledzionie, nieco później pojawia się w tkankach szkieletu, we włosach i paznokciach. Cynk po przedostaniu się z przewodu pokarmowego do krwi tworzy dwa rodzaje kompleksów: kompleks stały z alfa-2 makroglobuliną oraz luźny z albuminą, cysteiną i Ryc.2. Fragment komórki śluzowej ślinianki podżuchwowej szczura grupy Zn60 serii I. Pow. 3000x. Ryc. 3. Fragment komórki śluzowej ślinianki podżuchwowej szczura grupy Zn60 serii II. Pow. 4400x. 707
E. Dąbrowska i in. Czas. Stomatol., histydyną. Cynk w osoczu występuje w różnych kompleksach: albuminowo-cynkowym, cynkowo-makroglobulinowym oraz w metalotioneinie [7, 15]. W homeostazie ustrojowej cynku dużą rolę odgrywają metalotioneiny (MT) białka wiążące cynk, których największa liczba znajduje się w błonie śluzowej jelita oraz wątrobie i nerkach [3]. Cynk indukując syntezę MT blokuje dalsze wchłanianie tego pierwiastka. W wątrobie gromadzi się tylko w formie kompleksów cynkowo- -białkowych. Cynk dzięki swej obecności w około 80 enzymach (oksydoreduktazach, transferazach i hydrolazach) wykazuje wielokierunkową aktywność biochemiczną [9]. Natomiast, według Piechoty [17] korzystne działanie cynku wynika także z jego powinowactwa do grup sulfhydrylowych -SH. Zatrucie ostre cynkiem zdarza się rzadko. Do objawów ostrego zatrucia cynkiem należy podrażnienie dróg oddechowych, gorączka, leukocytoza, bóle w klatce piersiowej, dreszcze oraz zlewne poty [16]. Przewlekłe zatrucie cynkiem u zwierząt wywołane toksyczną dawką tlenku cynku powoduje uszkodzenie trzustki, zmiany morfologiczne w mózgu oraz zmniejszenie masy ciała. U ludzi narażonych na pyły, zawierające tlenek cynku, stwierdzono niedokrwistość, bezsenność, upośledzenie pamięci, zaburzenia słuchu, nadmierną potliwość oraz nasiloną próchnicę zębów. Nie stwierdzono natomiast działania rakotwórczego tego pierwiastka w warunkach narażenia zawodowego na cynk. Według Kwapińskiej [10], brak zmian morfologicznych i histologicznych zębów i żuchwy przy ekspozycji na cynk świadczą o możliwości bezpiecznego stosowania cynku w celach terapeutycznych. Ślinianka podżuchwowa, w piśmiennictwie międzynarodowym nie była poddawana kompleksowej ocenie w trakcie intoksykacji metalami. Zastosowane w naszym doświadczeniu narażenie na cynk w wydłużonym interwale czasowym wynoszącym ¼ lub ½ przeciętnej długości życia zwierząt doświadczalnych i badanie struktury ślinianki podżuchwowej za pomocą mikroskopu elektronowego, nie znajdują odnośnika w piśmiennictwie naukowym stąd ograniczona możliwość dyskusji z innym badaczami. Komentując niewielkie zmiany strukturalne obserwowane na poziomie mikroskopu elektronowego w śliniance, w obecnych badaniach, trudno nazwać je charakterystycznymi, czy odbiegającymi od standardu ustaleń innych badaczy analizujących nie tylko działania toksyczne metali, lecz i innych ksenobiotyków na określone narządy [1, 21, 22]. W tego typu badaniach także dominuje uszkodzenie mitochondriów, siateczki śródplazmatycznej, aparatu Golgiego oraz pewne cechy wskazujące na zaburzenie uwalniania wydzieliny drogą egzocytozy z komórek surowiczych i śluzowych. Generalnie, odpowiedź strukturalna ślinianki podżuchwowej na badane metale nie jest specyficzna, zaś poziom uszkodzenia nie jest szczególnie zaawansowany, co więcej jest znacząco mniejszy niż obserwowany w wątrobie, nerkach, jelitach czy w niektórych strukturach ośrodkowego układu nerwowego [8, 11, 19, 25]. Podsumowanie Zmiany strukturalne w obrębie ślinianki podżuchwowej szczura zależały jedynie od stężenia cynku w wodzie pitnej. Przedłużenie ekspozycji na cynk w wodzie do picia nie wpłynęło na intensywność zmian w obrazie ultrastrukturalnym ślinianki podżuchwowej. 708
2008, 61, 10 Cynk a ślinianka podżuchwowa u szczura Piśmiennictwo 1. Bachanek T, Starosławska E, Wolańska E, Jarmolińska K: Heavy metal poisoning in glass worker characterised by severe dental changes. Ann Agric Environ Med 2000, 7,1: 51-53. 2. Browning J D, MacDonald R S, Thornton W H, O Dell B L: Reduced food intake in zinc deficient rats is normalized by megestrol acetate but not by insulin-like growth factor-i. J Nutr 1998, 128, 1: 136-142. 3. Cousins R J: Regulatory aspects of zinc metabolism in liver and intestine. Nutr Rev 1979, 37, 4: 97-103. 4. Evans G W, Grace C I, Votava H J: A proposed mechanism of zinc absorption in the rat. Am J Physiol. 1975, 228, 2: 501-505. 5. Gerson S J, Meyer J, Gandor D: Decreased zinc concentration does not lead to atrophy of rat oral epithelium. J Nutr 1985, 115, 6: 820- -823. 6. Giunta J L, Hutchinson M, Wallwork J C: Parakeratosis of the labial mucosa in zinc-deficient rats. J Oral Pathol 1988, 17, 4: 186- -190. 7. Giroux E L, Henkin R I: Competition for zinc among serum albumin and amino acids. Biochim Biophys Acta 1972, 273, 1: 64-72. 8. Koyu A, Gokcimen A, Ozguner F, Bayram D S, Kocak A: Evaluation of the effects of cadmium on rat liver. Mol Cell Biochem 2006, 284, 1-2: 81-85. 9. Kulikowska E, Moniuszko-Jakoniuk J, Miniuj K: Rola cynku w procesach fizjologicznych i patologicznych organizmu. Pol Tyg Lek 1991, XLVI, 24-26: 470-473. 10. Kwapińska H: Makroskopowa i mikroskopowa ocena rozmieszczenia cynku w twardych tkankach narządu żucia szczura białego. Folia Med Cracov 1991, 32, 3-4: 299-308. 11. Méndez-Armenta M, Villeda-Hernández J, Barroso-Moguel, Nava-Ruíz C, Jiménez- Capdeville M E, Ríos C: Brain regional lipid peroxidation and metallothionein levels of developing rats exposed to cadmium and dexamethasone. Toxicol Lett 2003, 144, 2: 151- -157. 12. Mishima A, Kaji T, Yamamoto C, Sakamoto M, Kozuka H: Zinc-induced tolerance to cadmium cytotoxicity without metallothionein induction in cultured bovine aortic endothelial cells. Toxicol Lett 1995, 75, 1-3: 85-92. 13. Mishima A, Yamamoto C, Fujiwara Y, Kaji T: Tolerance to cadmium cytotoxicity is induced by zinc through non-metallothionein mechanisms as well as metallothionein induction in cultured cells. Toxicology 1997, 118: 85-92. 14. Niedzielska K, Strużak Wysokińska M, Wujec Z: Analiza zależności pomiędzy zawartościami wybranych pierwiastków w twardych tkankach zębów mlecznych z próchnicą i bez próchnicy. Czas Stomatol 1990, 43: 316-322. 15. Parisi A F, Vallee B L: Isolation of zinc alpha2-macroglobulin from human serum. Biochemistry 1970, 9: 2421-2434. 16. Pasternak K: Cynk i selen. Mag Med 1998, 5: 34-35. 17. Piechota W: Cynk: znaczenie fizjologiczne i zburzenia gospodarki. Diagn Lab 1983, 19: 216-222. 18. Powell S R: The antioxidant properties of zinc. J Nutr 2000, 130: 1447-1454. 19. Sabolic I, Herak-Kramberger C M, Antolovic R, Breton S, Brown D: Loss of basolateral invaginations in proximal tubules of cadmium- -intoxicated rats is independent of microtubules and clathrin. Toxicology 2006, 218, 2-3: 149-163. 20. Sjonstrand F S: Electron Microscopy of Cells and Tissues Vol I Instrumentation and Techniques. Academic Press New York and London 1967. 21. Stokowska W, Andrzejewska A, Szynaka B: Wpływ zatrucia ołowiem na obraz ultrastrukturalny ślinianki przyusznej. Czas Stomatol 1994, 47: 461-463. 22. Stokowska W, Cylwik D, Wilczko M: Obrót kostny a choroby przyzębia. Mag Stomatol 2005, 15, 4: 11-14. 709
E. Dąbrowska i in. Czas. Stomatol., 23. Szuster-Ciesielska A, Stachura A, Słotwińska M, Kamińska T, Śnieżko R, Paduch R, Abramczyk D, Filar J, Kandefer-Szerszeń M: The inhibitory effect of zinc on cadmium induced cell apoptosis and reactive oxygen species (ROS) production in cell cultures. Toxicology 2000, 145: 159-171. 24. Tvinnereim H M, Eide R, Riise T: Heavy metals in human primary teeth: some factors influencing the metal concentrations. Sci Total Environ 2000, 255: 21-27. 25. Zhao Z, Hyun J S, Satsu H, Kakuta S, Shimizu M: Oral exposure to cadmium chloride triggers an acute inflammatory response in the intestines of mice, initiated by the over-expression of tissue macrophage inflammatory protein-2 mrna. Toxicol Lett 2006, 164, 2: 144- -154. Otrzymano: dnia 20.IX.2008 r. Adres autorów: 15-267 Białystok, ul. Akademicka 3 Tel.: 085 7485795 Fax: 085 7485796 e-mail: helpdent@umwb.edu.pl 710