3. Elementy technologii liposomowej Liposomy, jak już wspomniano (s. 58), są zamkniętymi strukturami uzyskiwanymi podczas hydratacji fosfolipidów. Możliwość ich powstawania wynika z wyjątkowo korzystnych wartości HLB fosfolipidów jako amfifilów oraz kształtu ich cząsteczek, dzięki czemu większość fosfolipidów preferuje tworzenie agregatów dwuwarstwowych. Już podczas pierwszych badań przy użyciu najprymitywniejszych liposomów, czyli wielowarstwowych pęcherzyków (zwanych też ręcznie wytrząsanymi liposomami), stwierdzono, iż struktury te są w stanie zamykać i przechowywać roztwory solutów. Ponieważ skład błony liposomalnej można łatwo zmieniać, dlatego też początkowo liposomy stanowiły jeden z głównych układów modelowych w badaniach nad właściwościami i strukturą błon biologicznych. Z czasem model ten zaczął ulegać coraz dalej idącym zmianom i obecnie skład błon liposomowych coraz bardziej zbliża się do składu błon naturalnych. Liposomy tworzy się nie tylko z różnych typów, ale i klas lipidów, wbudowuje w ich błony Sterole, a także funkcjonalne cząsteczki białek błonowych. Liposomy służą nawet do badań, w których śledzi się izolowane procesy przebiegające w organellach, a nawet komórkach. Badania nad liposomami jako modelowymi błonami biologicznymi zaowocowały również wielością metod pozwalających na otrzymywanie różnorodnych rodzajów liposomów. Te poszukiwania coraz to nowych technik uzyskiwania liposomów wynikały z faktu, że nie znaleziono jeszcze sposobu uzyskiwania uniwersalnego liposomu. Jedne techniki są proste, lecz umożliwiają otrzymywanie liposomów składających się z wielu koncentrycznie zamkniętych przedziałów wodnych, inne natomiast dają wprawdzie twory otoczone tylko jedną dwuwarstwa, lecz o zbyt małych w porównaniu do komórki rozmiarach. Jeszcze innym powodem kontynuacji prac nad liposomami, które przekształciły się w oddzielną gałąź badań zwaną technologią liposomową, była chęć praktycznego wykorzystania zdolności zamykania solutów w strukturach utworzonych z naturalnych składników błon biologicznych, a więc obojętnych immunologicznie. Głównymi celami technologii liposomowej są: - Opracowanie postępowania umożliwiającego wprowadzanie solutów do wnętrza komórek w sposób ukierunkowany i kontrolowany. Tymi solutami mogą być np. przeciwciała, antygeny, fragmenty kwasów nukleinowych, a nawet całe chromosomy. Wprowadzanie tego typu solutów umieszczonych w strukturach zamkniętych typu liposomu zapobiega m.in. niepożądanym reakcjom ubocznym i równocześnie chroni je przed np. degradacją, której ulegałyby podczas bezpo-
3. l. Techniki preparacji liposomów 91 średniego podawania. Jednym z efektów badań nad wprowadzaniem solutów do komórek za pośrednictwem zamkniętych struktur błonowych było stwierdzenie, że również cienie erytrocytów mogą być używane do tego celu. - Opracowania takich technologii, dzięki którym dawki leków normalnie toksycznych w stanie wolnym mogłyby ulec obniżeniu przy zachowaniu tej samej lub wyższej skuteczności. Z drugiej strony niezmiernie ważnymi zagadnieniami są: poprawienie farmakodynamiki leków podawanych w liposomach, uczynienie liposomów niewykrywalnymi przez system makrofagów oraz opracowanie metody przechowywania liposomów w stanie nie zmienionym przez odpowiednio długi okres czasu. 3.1. Techniki preparacji liposomów W odpowiedzi na potrzeby uzyskiwania określonego typu liposomów wymaganych dla konkretnych zastosowań, w okresie ostatniej dekady metody preparacji różnych typów liposomów uległy szybkiemu rozwojowi. Wartość metody lub kombinacji metod zależy przede wszystkim od potrzeb badacza i zakładanego sposobu ich wykorzystania. Pewne metody są bardziej użyteczne dla jednych celów, podczas gdy inne dla drugich. Ocena różnych metod opierająca się na klasyfikacji i zastosowaniach różnorodnego typu liposomów będzie podana poniżej. Jeszcze innym kryterium jest stwierdzenie, czy dana metoda nadaje się szczególnie dla skali laboratoryjnej (1-100 ml liposomów o stężeniu 10-100 mg/ml), skali półprodukcyjnej (do 10l zawiesin o stężeniu 100-300 mg/ml), czy też skali produkcji przemysłowej (ponad 10l o stężeniu do 400 mg/ml). Mimo wielkiej liczby rozmaitych technik preparacji uzyskiwane liposomy można podzielić na trzy główne grupy: 1. liposomy wielowarstwowe (MLV), 2. małe jednowarstwowe liposomy (SUV), 3. duże jednowarstwowe liposomy (LUV). ad l. Jeżeli nie ma ograniczeń czy też preferencji w stosunku do rozmiarów i budowy, wielowarstwowe liposomy są szczególnie przydatne w przypadkach zamykania solutów lipofilowych lub też wtedy, gdy efektywność zamykania roztworów wodnych nie jest istotna. Na skalę laboratoryjną odpowiednią techniką jest klasyczna metoda hydratacji cienkiego filmu lipidowego (opisana już w poprzednim rozdziale), która może być uzupełniona wymiarowaniem" uzyskanych liposomów przez przeciskanie ich przez filtry membranowe o porach określonej średnicy. Gdy chodzi o większą skalę produkcji liposomów, należy stosować inne postępowania, takie jak liofilizacja, suszenie rozpylonej zawiesiny, czy też wstrzykiwania wraz z odparowywaniem rozpuszczalnika. Jeżeli wymagana jest wysoka zdolność enkapsulacyjna rozpuszczalnych w wodzie solutów, należy roz-
3. Elementy technologii liposomowej 92 1 mikrometr MLV 04-10 1.8-7 l/mol SUV 002-003 0.23-0.8 l/mol LUV 0.05-1.0 2.4-3.1 l/mol Rys. 24. Główne typy liposomów i ich podstawowe parametry ważyć zastosowanie następujących metod: (a) odparowywania fazami odwróconymi, (b) metodę zamrożeniowo-rozmrożeniową lub dehydratacyjno-rehydratacyjną w połączeniu z wymiarowaniem lub (c) wymiarowania, homogenizacji czy też wstrzykiwania i odparowywania rozpuszczalnika. Metoda (c) jest szczególnie przydatna do preparacji większych ilości liposomów (do objętości l 1). ad 2. Dla pewnych zastosowań wąski zakres rozmiarów i wysoki stosunek powierzchni do objętości małych jednowarstwowych liposomów czyni je bardzo przydatnymi, szczególnie gdy nie jest wymagana wysoka wydajność enkapsulacji wodorozpuszczalnych solutów. Do ich preparacji na skalę laboratoryjną stosuje się dezintegrację ultradźwiękami, prasę Frencha lub wstrzykiwanie roztworów etanolowych. Wybór pomiędzy tymi metodami zależy od dostępności sprzętu oraz istotności obecności w preparatach resztkowych (7-10%) ilości etanolu. ad 3. Duże jednowarstwowe liposomy są szczególnie przydatne do wydajnego zamykania rozpuszczalnych w wodzie solutów z powodu preferującej objętość przestrzeni wodnej wartości stosunku objętości do powierzchni. Liposomy tego typu są również pożądane do rekonstytucji białek błonowych, a także badań nad przepuszczalnością i fuzją błon. Do rekonstytucji białek błonowych najczęściej stosowane są metody usuwania detergentów, podczas gdy najbardziej wydajną metodą uzyskiwania wysokiego stopnia zamykania rozpuszczalnych w wodzie solutów, w tym makrocząsteczek, jest metoda odparowywania fazami odwróconymi. Metody te uzupełnia się kalibrowaniem uzyskanych liposomów. Gdy proces ten wykonywany jest pod wysokim ciśnieniem, przy dużych stężeniach lipidu i przy stosowaniu filtrów błonowych o małej średnicy porów, uzyskiwane liposomy są nie tylko homogenne w wielkości, ale również posiadają wysoką zdolność enkapsulacyjną. Powstawanie pęcherzyków liposomalnych opisują dwa główne modele: model
3.1 Techniki preparacji liposomów 93 pączkowania" oraz model fuzji fragmentów dwuwarstwy fosfolipidowej". W modelu pączkowania" pęcherzyki powstają w czasie stopniowego uwadniania suchych fosfolipidów. Suche, cienkie warstewki fosfolipidów posiadają strukturę warstwową identyczną z dwuwarstwa; podczas uwadniania roztwór wodny wnika pomiędzy poszczególne dwuwarstwy powodując ich rozdzielanie i powstawanie pączkujących zaczątków pęcherzyków, podobnych do obserwowanych w echinocytozie (echinocytoza - proces tworzenia wypustek błony plazmatycznej nadających krwinkom jeżopodobny kształt). Pęcherzyki podczas mechanicznego wytrząsania hydratowanego fosfolipidu odrywają się, a jako że powstały z wielu warstw suchego fosfolipidu, stają się wielowarstwowymi liposomami. Poddanie tych pęcherzyków drganiom rezonansowym ultradźwięków powoduje dalsze odpączkowywanie małych, jednowarstwowych pęcherzyków. Podobnie homogenizujące" i reorganizujące działać będzie przeciskanie dużych pęcherzyków przez małe pory filtrów membranowych. W modelu fuzji fragmentów dwuwarstwy fosfolipidowej" intermediatem, niezależnie od techniki stosowanej do uzyskania finalnych liposomów są mniej lub bardziej płaskie fragmenty dwuwarstwy, z których dopiero na drodze fuzji powstają zamknięte pęcherzyki, których wielkość zależy od wtórnej ich obróbki. Na Rys. 25 przedstawiono schemat klasyfikacji różnych metod preparacyjnych pęcherzyków liposomalnych opracowany zgodnie z założeniami omawianego modelu. Poniżej zostaną przedstawione niektóre z procedur stosowanych do uzyskania różnego rodzaju pęcherzyków liposomalnych. Do charakterystyki uzyskanych preparatów stosuje się m.in. określanie wartości tzw. objętości zamkniętej (captured volume) definiowanej jako objętość roztworu wodnego zamknięta przez daną ilość lipidu i jest wyrażana w litrach/mol lipidu całkowitego oraz tzw. wydajność zamykania (encapsulation efficiency) definiowana jako część roztworu, która jest zamknięta w liposomach. Ten drugi parametr jest wprost proporcjonalny do stężenia lipidu w preparacie liposomowym. Materiały, odczynniki i roztwory: chloroformowe roztwory lecytyny, cholesterolu, fosfatydyloetanolaminy, fosfatydyloseryny, kwasów tłuszczowych i innych lipidów o stężeniu 60 μmoli/ml; roztwór związku barwnego do określania parametrów zamykania w liposomach (zob. dośw. Samoorganizacja fosfolipidów"); 10% roztwór Tritonu X-100; eter etylowy; etanol absolutny; napęczniały żel Sephadex G-50 lub G-75. Sprzęt: wyparka próżniowa; dezintegrator ultradźwiękowy; ekstruder liposomowy; azot w butli.
3. Elementy technologii liposomowej 94 PĘCHERZYK LIPOSOMOWY (fuzja) dwuwarstwowe fragmenty fosfolipidowe mechaniczne rozbicie wcześniej istniejących w zawiesinie fosfolipidowej dwuwarstw elektrostatyczne chemiczne narastanie dwuwarstw przez zmianę rozpuszczalności fosfolipidów w zawiesinie poprzez usuwanie fazy organicznej ko-rozpuszczalnika bezpośrednie tworzenie w czasie pęcznienia na szablonie chemicznie ultradźwięki zmiany ph dodanie krótko- metody jony topografia indukowana łańcuchowych wstrzykiwania chaotropowe powierzchni fosfolipidów roztworów prasa Frencha usunięcie odparowanie detergentów jonów wapnia fazami odwróconymi przeciskanie przez filtry membranowe intensywne mieszanie Rys. 25. Klasyfikacja różnych metod preparacyjnych pęcherzyków liposomalnych opracowana zgodnie z założeniami modelu tworzenia pęcherzyków przez fuzję fragmentów dwuwarstwy fosfolipidowej 3.1.1. Efekt stosowanej techniki preparacyjnej na pojemność liposomów a) Klasyczne wielowarstwowe liposomy (MLV) (wg Bangham A. D., de Gier J., Greville G. D., Chem. Phys. Lipids l (1967) 225-246) W kolbce okrągłodennej do wyparki poj. 50-100 ml umieścić l ml roztworu lecytyny i odparować rozpuszczalnik do uzyskania cienkiego, suchego filmu lipidowego; kolbkę umieścić w eksykatorze próżniowym nad CaCl 2 na 2 godz. Dodać do kolbki l ml roztworu barwnika i zawiesić lipid przez energiczne
3.1. Techniki preparacji liposomów 95 wstrząsanie zawartości do chwili zawieszenia całości fosfolipidu i uzyskania jednorodnej mlecznej zawiesiny. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w sposób opisany na końcu tej części rozdziału. b) Wielowarstwowe liposomy o zwiększonej pojemności. Technika zamrożeniowo-rozmrożeniowa (FAT-MLV) (wg Hope M. J, Bally M B., Mayer L. D., Janoff A. S., Culhs P. R., Chem. Phys. Lipids. 40 (1986)89-107) Przygotować wielowarstwowe liposomy w sposób opisany powyżej (pkt 1). Zawiesinę liposomów przenieść do plastikowej probówki i poddać ją 7-10 cyklom zamrażania w mieszaninie suchego lodu (stały CO 2 ) z acetonem i rozmrażania w ciepłej (ok. 40 0 C) wodzie. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. c) Wielowarstwowe liposomy otrzymywane przez dehydratację-rehydratację (wg Shew R. L., Deamer D. W., Biochim. Biophys. Acta 816 (1985) 1-10) Przygotować MLV w sposób opisany w pkt. l. Liposomy poddać procesowi liofilizacji. Suchy materiał po zliofilizowaniu rehydratować przez delikatne wytrząsanie z l ml wody destylowanej. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. d) Małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV) (wg Papahadjopoulos D., Miller N., Biochim. Biophys. Acta 135 (1967) 624-638) Przygotować MLV w sposób opisany w pkt. l. Umieścić uzyskane liposomy w cienkościennej probówce plastikowej i poddać działaniu ultradźwięków w dezintegratorze lub w zaadaptowanej myjce ultradźwiękowej przez okres konieczny do uzyskania klarownej próbki. W przypadku dezintegratora stosować cykle - 3 min. dezintegracji, 5 min przerwy. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach.
3. Elementy technologii liposomowej 96 e) Małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV), metodą wstrzykiwania roztworów etanolowych (wg Batzri S., Korn E. D., Biochim. Biophys. Acta 298 (1973) 1015-1019) Opisana metoda jest równie efektywna, jak ultradźwięki, ale szybsza i bezpieczniejsza (unika się oksydacji lipidów w czasie sonikowania). Uzyskane SUV w zależności od składu lipidowego mają średnice 20-60 nm. Materiały: 10-30 mm roztwory lipidów w czystym etanolu. Sprzęt: l ml strzykawka Hamiltona z cienką igłą umieszczona w aparacie do infuzji; naczynie szklane o średnicy ok. 2 cm i poj. ok. 15 ml otoczone płaszczem termostatującym; mieszadło magnetyczne z mieszadełkiem o wielkości odpowiedniej do naczynia szklanego; statyw z łapą. 250-750 μl etanolowego roztworu fosfolipidów wstrzykiwać szybko i równomiernie do naczynia zawierającego 10 ml odpowiedniego roztworu wodnego utrzymywanego w temperaturze wyższej od temperatury przejścia fazowego żel-ciekły kryształ używanego lipidu oraz intensywnie mieszanego. Końcowe stężenie etanolu nie może przekroczyć 7.5% (v/v). Etanol z gotowej zawiesiny usunąć przez 2-3-krotną dializę wobec l-litrowych porcji buforu. Uzyskane pęcherzyki można w razie potrzeby zagęszczać w aparacie Amicon przy użyciu błony XM-100A o odpowiedniej średnicy. W ten sposób można uzyskać preparaty o stężeniu 80-100 mm lipidu liposomowego. W czasie ultrafiltracji należy stosować intensywne mieszanie. Straty liposomów w tym procesie nie przekraczają 2%. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. f) Preparacja dużych jednowarstwowych liposomów (LUVET) (wg Hope M. J., Bally M. B., Webb G., Cullis P. R., Biochim. Biophys. Acta 812 (1985) 55-65) Postępowanie umożliwia uzyskanie dużych jednowarstwowych i o określonych wymiarach liposomów bez stosowania detergentów czy rozpuszczalników organicznych. Liposomy mają dużą wydajność zamykania i dobrze określoną średnicę; są szczególnie przydatne do badań wiązania białek metodami stosującymi wirowania.
3.l. Techniki preparacji liposomów 97 Materiały i odczynniki: zawiesina FAT-MLV liposomów (zob. pkt 2); suchy lód; aceton. Sprzęt: ekstruder liposomowy; filtry membranowe z poliwęglanu - Nucleopore (400-100 nm pory); butla z azotem. Przygotować ekstruder do pracy (zob. instrukcja obsługi). Zawiesinę FAT liposomów przepuścić 10-krotnie przez pory błony kalibrującej ich rozmiary. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. g) Duże jednowarstwowe liposomy, metodą odparowywania faz odwróconych (wg Szoka F., Papahadjopoulos D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75(1978)4194-4198) Umieścić l ml roztworu lipidu w kolbie do wyparki i odparować chloroform. Lipid rozpuścić w 6 ml mieszaniny chloroformu z eterem izopropylowym (1:2) lub w 6 ml eteru etylowego i przenieść do zlewki poj. 50 ml, dodać 3 ml roztworu wodnego barwnika (doprowadzić ph roztworu do 7.4). Zlewkę umieścić w myjce ultradźwiękowej wypełnionej ogrzaną do ok. 40 0 C wodą i poddać działaniu ultradźwięków przez 5-10 min do utworzenia mlecznej emulsji. Uzyskaną emulsję przenieść do kolbki o poj. 100 ml i umieścić w wyparce (łaźnia wyparki wypełniona wodą o temperaturze ok. 50 0 C). Odparowywać rozpuszczalnik z emulsji zwiększając próżnię w aparacie stopniowo, gdyż emulsja wykazuje tendencję do silnego pienienia się i zarzucania". Po osłabnięciu pienienia zwiększyć próżnię do maksimum (ok. 2.5 x l0 4 Pa) i kontynuować odparowywanie jeszcze przez 5 min. Przenieść liposomy do oddzielnego naczynia i oznaczyć w nich wielkość objętości zamkniętej.
3. Elementy technologu liposomowej 98 3.1.2. Duże jednowarstwowe liposomy obciążone" sacharozą, metodą solubilizacji detergentem niejonowym i dializy (wg Mimms L. T., Zampighi T., Nozaki Y., Tanford C., and Reynolds J. A., (1981) Biochemistry 20 (1081) 83-841) Jedno- lub kilkuwarstwowe duże (średnica 150-300 nm) pęcherzyki fosfolipidowe tworzy się poprzez solubilizację fosfolipidów w łatwo usuwalnym, tzn. charakteryzującym się wysokim CMC, łagodnym detergencie, takim jak dezoksycholan lub oktyloglukozyd. Następnie usuwa się detergent metodą dializy lub sączenia molekularnego na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-50. Uzyskane pęcherzyki lipidowe wypełnione są roztworem, w którym zrównoważona jest kolumna. Technikę tę można stosować do rekonstytucji błon z wyizolowanych białek i lipidów, do analizy oddziaływań białek i innych związków z błonami. Materiały i roztwory: roztwory chloroformowe lipidów; 150 mm NaCl, l mm EGTA w 10 mm buforze Tris-HCl, ph 7.5; ten sam bufor zawierający 300 mm sacharozę. 10 mg lipidów np. fosfatydylocholina/cholesterol 9:1, po dokładnym odparowaniu rozpuszczalnika organicznego rozpuścić w 0.5 ml buforu do rekonstytucji zawierającym 300 mm sacharozę oraz 30 mg/ml oktyloglukozyd (n-oktylο-β-d-glukopyranozyd) lub 15 mg/ml dezoksycholan sodowy. Całość nanieść na kolumnę wypełnioną żelem Sephadex G-50 (medium, l x 25 cm) zrównoważoną buforem do rekonstytucji zawierającym 300 mm sacharozę. Chromatografię prowadzić najlepiej w 4 C z szybkością wypływu 0.2-0.5 ml/min. Frakcje zawierające pęcherzyki lipidowe charakteryzują się znaczną mętnością i mogą być rozpoznane bez użycia spektrofotometru. Aby usunąć roztwór znajdujący się poza pęcherzykami należy połączone frakcje zawierające pęcherzyki rozcieńczyć dziesięciokrotnie w buforze do rekonstytucji (bez sacharozy) i odwirować przy 30 000 x g. 3.2. Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach Przygotować kolumnę o rozmiarach 10-15 x 300-500 mm wypełnioną napęczniałym żelem Sephadex G-50 i zrównoważyć ją roztworem, w którym był rozpuszczony barwnik zamykany w liposomach.
3 2. Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach 99 Nanieść na kolumnę badaną zawiesinę liposomów i, po jej całkowitym wniknięciu do żelu, eluować kolumnę czystym roztworem do chwili wymycia liposomów. Z zawiesiny uwolnionych od nie zamkniętego w nich barwnika liposomów pobrać dwie jednakowej wielkości próbki. W jednej oznaczyć ilość lipidu poprzez fosfor, a do drugiej dodać równą objętość 10% Tritonu X-100, zmieszać i zmierzyć jej absorbancję przy długości fali równej E max stosowanego barwnika. Oznaczyć również absorbancję (po odpowiednim rozcieńczeniu) roztworu barwnika używanego do eksperymentów. Objętość zamkniętą obliczyć wg wzoru: objętość zamknięta (l/mole lipidu) = [lipid] w l ml liposomów Wyniki przedstawić w formie tabeli porównującej preparaty uzyskane różnymi metodami. 3.2.1. Wpływ składu lipidowego na objętość zamkniętą Zmieszać odpowiednie ilości roztworów lipidów dla uzyskania mieszanin o podanym poniżej stosunku molowym: 1. PC 2. PC - Chol 90:10 3. PC - Chol 70:30 4. PC - PS 50:50 5. PC - l8:0 FA 80:20 6. PC - l8:0 FA 50:50 W kolbkach do wyparki umieścić po l ml tych mieszanin i odparować z nich rozpuszczalnik. Do każdej mieszaniny dodać po l ml roztworu barwnika i przygotować z nich liposomy metodą FAT-MLV (zob. pkt 2). Oczyścić uzyskane preparaty od nie zamkniętego barwnika poprzez sączenie na kolumnie z żelem Sephadex i oznaczyć objętość zamykania uzyskanych liposomów. Wyniki przedstawić w tabeli.
3. Elementy technologii liposomowej l00 3.3. Określanie trwałości i stabilności liposomów Użyteczność wprowadzania wodorozpuszczalnych leków w postaci zamkniętej w liposomach, tak in vivo, jak in vitro, zależy istotnie od stabilności nośnika liposomowego, tj. szybkości, z jaką zamknięte w liposomie rozpuszczone w roztworze wodnym cząsteczki (leki, enzymy itp.) będą wyciekać w zależności od warunków zewnętrznych. Jest to szczególnie istotne w trakcie opracowywania nowych technologii, gdzie np. stabilne in vitro w roztworach soli liposomy okazują się całkowicie niestabilne w obecności surowicy lub też odwrotnie. Do badania stabilności liposomów używa się metod, w których oznacza się poziom wycieku cząsteczek markerowych zamkniętych w liposomach. Takimi cząsteczkami mogą być enzymy, związki drobnocząsteczkowe znakowane izotopowe, a także niektóre barwniki fluorescencyjne. Poniżej przedstawimy metodę badania stabilności liposomów przy użyciu karboksyfluoresceiny (CF). 3.3.1. Uwalnianie karboksyfluoresceiny jako miernik stabilności liposomów (wg Weinstein J. N., Ralston E., Leserman L. D., Klausner R. D., Dragsten P., Henkart P., Blumenthal R., w: Liposome Technology (Gregonadis G. red.) CRC Press, Boca Raton, 1984, vol. III, s. 183-204) Zasada metody opiera się na zjawisku tzw. samowygaszania fluorescencji. Pewne barwniki fluorescencyjne tracą zdolność do fluorescencji, gdy znajdują się w roztworze w odpowiednio wysokich stężeniach. Tak więc fluorofor zamknięty w liposomach w takich stężeniach będzie emitował jedynie kilka procent światła z tej ilości, którą emituje po uwolnieniu i rozcieńczeniu w otaczającym medium, czy też cytosolu komórki. Autorzy wykazali, że dobrze rozpuszczalny w wodzie fluorofor, 5(6)-karboksyfluoresceina (CF) zamknięta w liposomach w stężeniu 100-200 mm, praktycznie nie fluoryzuje, tak że cała obserwowana fluorescencja zawiesiny liposomów pochodzi od cząsteczek fluoroforu uwolnionych z wnętrza pęcherzyków do środowiska. Te właściwości karboksyfluoresceiny stały się podstawą w badaniach nie tylko stabilności liposomów, ale i do określania ich objętości zamykania, interakcji liposomów z komórkami, właściwości barierowych błon liposomalnych, a także procesów fuzji. Materiały i roztwory: roztwory chloroformowe lipidów (30 mm); 5(6)-karboksyfluoresceina (CF), (MW 377, Ex 490, Em 520); 0.14 M NaCl w 10 mm buforze Hepes (lub Tris-HCl) ph 7.4; 10% roztwór Tritonu X-100;
3.3. Określanie trwałości i stabilności liposomów 101 10 mm bufor Tris-HCl, ph 7.4; 6 M NaOH; napęczniały w buforze Tris-HCl, ph 7.4, żel Sephadex LH 20. Oczyszczanie karboksyfluoresceiny 7.5 g CF umieścić w zlewce o poj. 50 ml, umieścić w łaźni wodnej (45-50 C) ustawionej na mieszadle magnetycznym i powoli przy stałym mieszaniu oraz kontrolowaniu ph pehametrem dodawać 6 M NaOH tak, by nie przekroczyć ph 7.5 i uzyskać całkowite rozpuszczenie fluoroforu (ok. 10 ml). Uzyskany roztwór CF nanieść na szczyt wypełnionej żelem Sephadex LH 20 zrównoważonej buforem Tris-HCl kolumny (25 x 400 mm) i eluować 10 mm buforem Tris-HCl o ph 7.4, zbierając 2 ml frakcje. Barwnik wypływa zwykle we frakcjach 8-10, co określa się przez badanie fluorescencji 20-krotnie rozcieńczonych próbek. Stężenie barwnika w połączonych frakcjach określić używając współczynnika ekstynkcji molowej E 487 = 7.5 x l0 4, rozcieńczyć buforem do stężenia 100 mm. Pozostałe na kolumnie zanieczyszczenia wymyć przez jej przemycie kolejno 5 obj. układów: etanol/bufor (1:1), etanol, etanol/chloroform (1:1), chloroform, a następnie powrócić do buforu stosując te same roztwory, lecz w odwrotnej kolejności. Przygotowanie liposomów do badań Z roztworów lipidów przygotować mieszaniny zawierające: 1. ΡC (60 μmoli); 2. PC (30 μmoli) - Chol (30 μmoli); 3. PC (30 μmoli) - PS (30 μmoli). Odparować rozpuszczalnik i przygotować w sposób opisany wcześniej liposomy (FAT-MLV) w 2 ml roztworu CF. Oddzielić liposomy od nie zamkniętej w nich karboksyfluoresceiny przez sączenie molekularne na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-50 i eluowanej 0.14 M NaCl w 10 mm buforze Tris-HCl ph 7.4. 3.3.2. Badanie wpływu surowicy na trwałość liposomów W kuwecie spektrofluorymetru umieścić 2 ml roztworu zawierającego surowicę o różnych rozcieńczeniach w 0.14 M NaCl - 10 mm Tris-HCl ph 7.4, odczekać na ustabilizowanie temperatury (42 C). Włączyć rejestrator i rozpocząć rejestrację zmian fluorescencji. Do kuwety wstrzyknąć 10 μl liposomów z CF i rejestrować wzrost fluorescencji przez 10 min.
3. Elementy technologii liposomowej 102 Dla wyznaczenia całkowitej fluorescencji CF zamkniętej w liposomach wstrzyknąć do kuwety 10 μl roztworu Tritonu X-100. Detergent spowoduje uwolnienie pozostałej w nich CF. Uzyskany poziom fluorescencji będzie określać 100% możliwej do uzyskania w danych warunkach fluorescencji. Przeprowadzić w identyczny sposób pomiary uwalniania CF z liposomów w roztworach zawierających wzrastające stężenia surowicy. Powtórzyć doświadczenie używając liposomów o innym składzie lipidowym. Uzyskane wyniki przedstawić w postaci zależności czasowej procentu uwalniania CF z liposomów inkubowanych w obecności różnych stężeń surowicy. W podobny sposób można badać też wpływ temperatury na stabilność liposomów.